CN114903932B - 改进的金喉健药物组合物、微乳雾化吸入剂及制法和应用 - Google Patents

改进的金喉健药物组合物、微乳雾化吸入剂及制法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了改进的金喉健药物组合物、微乳雾化吸入剂及制法和应用，属于药物技术领域，解决现有技术中金喉健喷雾剂不能到达下呼吸道或肺部发挥治疗作用问题，并充分利用了艾纳香的药材。本发明的组合物包括以下原料：艾纳香油1‑10份，大果木姜子油1‑10份，薄荷脑0.3‑2份，艾纳香醇提取物0.2‑2份；艾纳香醇提取物为提取艾纳香油后的艾纳香药材的乙醇提取物。本发明的微乳雾化吸入剂由包括上述组合物制成，还包括矫味剂1‑5份或/和乳化剂10‑30份或/和助乳化剂15‑35份或/和稳定剂1‑5份。本发明充分利用了药材资源，不仅可用于口腔，还可以雾化后吸入，进入气管、支气管或肺部发挥治疗作用，并具有良好的抗多种甲型和乙型流感病毒，以及柯萨奇病毒的作用。

Description

改进的金喉健药物组合物、微乳雾化吸入剂及制法和应用
技术领域
本发明属于药物技术领域，具体涉及改进的金喉健药物组合物、微乳雾化吸入剂及制法和应用。
背景技术
金喉健喷雾剂是以艾纳香油、大果木姜子油、薄荷脑为原料，以甘草酸单胺盐、乙醇为辅料制成的。其具有祛风解毒，消肿止痛，清咽利喉的作用，用于风热所致咽痛、咽干、咽喉红肿、牙龈肿痛、口腔溃疡。使用方法为直接喷于患处。
其中艾纳香油为由艾纳香药材中提取的挥发油。艾纳香药材除了富含挥发油类成分外，还含有大量的其他类的化合物。申请人的前期研究发现，艾纳香提取挥发油后的药材中富含大量的黄酮类化合物，该黄酮类化合物具有显著的抗流感病毒和柯萨奇病毒的作用。而原金喉健喷雾剂仅采用了艾纳香的挥发油，黄酮类化合物丢弃，十分可惜。此外，金喉健喷雾剂的作用部位一般仅限于口腔，不能进入气管、支气管或肺部发挥治疗作用，治疗途径有限。
因此，提供一种能充分利用药材资源、发挥多样治疗作用的药物组合物，以及利用该药物组合物制成的药物制剂，不仅能用于口腔，还能进入气管、支气管或肺部发挥治疗作用，成为了本领域技术人员亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种改进的金喉健药物组合物，解决现有技术中药材资源利用不充分的问题。
本发明的目的之二在于，提供以改进的金喉健药物组合物为原料的微乳雾化吸入剂。
本发明的目的之三在于，提供该微乳雾化吸入剂的制备方法。
本发明的目的之四在于，提供改进的金喉健药物组合物及微乳雾化吸入剂的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明所述的改进的金喉健药物组合物，由包括以下重量份的原料制成：艾纳香油1-10份，大果木姜子油1-10份，薄荷脑0.3-2份，艾纳香醇提取物0.2-2份；所述艾纳香醇提取物为提取艾纳香油后的艾纳香药材的乙醇提取物。
本发明的部分实施方案中，由包括以下重量份的原料制成：艾纳香油1-5份，大果木姜子油1-5份，薄荷脑0.3-1份，艾纳香醇提取物0.2-1.5份；
优选为艾纳香油2.5份，大果木姜子油2.5份，薄荷脑0.6份，艾纳香醇提取物0.5份；
优选为艾纳香油5份，大果木姜子油5份，薄荷脑1份，艾纳香醇提取物1份。
本发明的部分实施方案中，艾纳香醇提取物中总黄酮的质量百分含量大于等于18.56％，小于等于38.48％；优选为24-29％。
本发明所述的金喉健微乳雾化吸入剂，由包括权利要求1或2所述的组合物制成，还包括矫味剂1-5份或/和乳化剂10-30份或/和助乳化剂15-35份或/和稳定剂1-5份。
本发明的部分实施方案中，还包括矫味剂2.5份或/和乳化剂17.5份或/和助乳化剂22.5份或/和稳定剂2.5份。
本发明的部分实施方案中，所述矫味剂包括甘草酸单铵盐；
或/和所述乳化剂包括吐温类乳化剂、聚山梨酯类乳化剂；优选为吐温类乳化剂，更优为吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中的任意一种或几种；最优选为吐温-80；
或/和所述助乳化剂包括甘油或/和乙醇；优选为甘油和乙醇；更优选为甘油和95％乙醇；其中甘油的用量为5-15份，95％乙醇的用量为10-20份。
或/和所述稳定剂包括维生素e。
本发明所述的金喉健微乳雾化吸入剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1.按处方准备各原料；
步骤2.取矫味剂用适量纯化水加热溶解，得到第一溶液，备用；
步骤3.取艾纳香醇提取物用95％乙醇超声使其完全溶解，再加入大果木姜子油、艾纳香油、薄荷脑，混匀，得到第二溶液；
步骤4.向第二溶液中加入处方量的甘油、乳化剂、稳定剂，再次混匀；再将第一溶液缓慢加入其中，搅拌均匀，加水补足至规定量，即可。
本发明所述的微乳雾化吸入剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.按处方准备各原料；
S2.取矫味剂用纯化水加热溶解，得到第一溶液，备用；
S3.取艾纳香醇提取物用95％乙醇超声使其完全溶解，再加入大果木姜子油、艾纳香油、薄荷脑，混匀，得到第二溶液；
S4.将甘油、乳化剂、稳定剂混匀均匀后，得到第三溶液；
S5.将第二溶液加入第三溶液中，混匀，再向混合溶液中加入第一溶液，混匀，加水补足至规定量，即可。
本发明所述的组合物或微乳雾化吸入剂在制备抗流感病毒、或/和抗柯萨奇病毒的药物中的应用。
本发明的部分实施方案中，所述流感病毒包括A型流感病毒或/和B型流感病毒；
优选地，所述A型流感病毒包括H1N1病毒、或/和H3N2病毒；
优选地，所述B型流感病毒包括Yamagata、或/和Victoria病毒。
本发明的组合物能应用到抗多种甲型和乙型流感病毒、以及柯萨奇病毒中。
本发明所述的艾纳香醇提取物为以提取了艾纳香油的艾纳香药材为原料，以50-95％的乙醇为溶剂，采用超临界CO2提取法、冷浸法、超声提取法、冷浸与超声提取法、渗漉法或回流法提取所得。
本发明的在先研究(申请号为2021100820212的专利申请《一种具有抗流感病毒作用的艾纳香提取物及其制备方法》)表明，本发明的艾纳香乙醇提取物具有良好的抗A型流感病毒(H1N1病毒、H3N2病毒)、B型流感病毒(Yamagata、Victoria病毒)的作用。
此外，实验表明，本发明的艾纳香醇提取物具有抗柯萨奇病毒的作用，因而本发明可用于治疗小儿手足口病；本发明的微乳雾化吸入剂具有抗H1N1病毒、H3N2病毒的作用。
本发明所述的艾纳香醇提取物的提取方法与申请号为2020110687133的专利申请《一种具有抗流感病毒作用的艾纳香提取物及其制备方法》中艾纳香提取物的制备方法相同，仅是将艾纳香药材替换为提取了艾纳香油后的艾纳香药材。
本发明的艾纳香醇提取物中总黄酮的测定方法与2020110687133的专利申请《一种具有抗流感病毒作用的艾纳香提取物及其制备方法》中艾纳香乙醇提取物中总黄酮的测定方法相同。
本发明中艾纳香油、大果木姜子油的提取方法均为现有技术。其中，艾纳香油为艾纳香药材以水蒸汽蒸馏法提取所得，大果木姜子油为大果木姜子药材采用CO2超临界提取法或水蒸汽蒸馏法提取所得。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明设计科学，构思巧妙，在原金喉健喷雾剂的基础上改进，利用提取了艾纳香油后的艾纳香药材制备艾纳香乙醇提取物，充分利用了药材资源，增加了药物的功效。
本发明的药物组合物具有良好的抗多种病毒作用。本发明的药物组合物在较低剂量时就具有明显的抗H1N1病毒作用，且抗H1N1病毒药果与剂量大小呈正相关。此外，本发明还具有抗柯萨奇病毒的作用，可用于治疗小儿手足口病。
本发明的创造性地将原金喉健喷雾剂制备成了微乳雾化吸入剂，其不仅可用于口腔，还可以雾化后吸入，进入气管、支气管或肺部发挥治疗作用。
附图说明
附图1为加药处理实验设计图；
附图2为处方1～4的金喉健微乳雾化吸入剂样品对MDCK细胞的活力影响结果图；
附图3为处方1～4的金喉健微乳雾化吸入剂样品对H1N1病毒抑制活性结果图；
附图4为艾纳香醇提取物抗柯萨奇病毒(CVB5)活性测试结果图；
附图5为CVB5-艾纳香样品抗柯萨奇病毒半数抑制浓度结果图；
附图6样品1抗A型流感病毒(A/WSN/33(H1N1))活性测试结果图；
附图7样品2样品1抗A型流感病毒(A/WSN/33(H1N1))活性测试结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明实施例中所述的艾纳香油为艾纳香药材以水蒸汽蒸馏法提取所得，大果木姜子油为大果木姜子药材以水蒸汽蒸馏法提取所得或二氧化碳超临界提取所得。
本发明实施例中，采用二氧化碳超临界提取果木姜子油的具体方法为：取大果木姜子粗粉投入超临界提取罐，萃取温度40℃，萃取压力20MPa，萃取时间2h，分离釜参数为分离Ⅰ压力7MPa，分离Ⅰ温度45℃，分离Ⅱ温度30℃，提取至无油馏出为止。
本发明实施例中采用水蒸汽蒸馏法制备艾纳香油，具体为：取药材适量，加入30倍水，煮沸，保持微沸状态，提取5小时，收集冷凝液，采用油水分离器进行分离。
本发明实施例中采用水蒸汽蒸馏法制备大果木姜子油，具体为：取药材适量，加入25倍水，煮沸，保持微沸状态，提取5小时，收集冷凝液，采用油水分离器进行分离。
实施例1
本实施例公开了本发明的金喉健微乳雾化吸入剂的处方组成，每100g金喉健微乳雾化吸入剂的处方具体为：
表1
本实施例中的艾纳香油、大果木姜子油均水蒸汽蒸馏法提取所得。
本实施例中艾纳香醇提取物(醇提取)的制备方法为：取提取了艾纳香油后的艾纳香药材，按料液比1：10加60％的乙醇，加热回流提取，保持微沸，提取2h，过滤，收集滤液，挥去乙醇，得艾纳香醇提取物，其总黄酮含量为29wt％。
本实施例中艾纳香醇提取物(超临界)的制备方法为：取提取了艾纳香油后的艾纳香药材，置于超临界CO2提取装置中，以95％乙醇为夹带剂，其用量为艾纳香药材的6倍(体积/质量，质量为g时，体积为mL)。
萃取温度为45.0℃，萃取压力为22.0MPa；分离釜一温度为50.0℃，压力为6MPa；分离釜二温度为50.0℃，压力为5MPa；萃取时间为120min。所得产物挥去乙醇，得艾纳香醇提取物，其总黄酮含量为27.5wt％。
本实施例中用于艾纳香醇提取物(醇提取)与艾纳香醇提取物(超临界)的原料为同一批提取了艾纳香油后的艾纳香药材。实施例2
本实施例公开了本发明所述的金喉健微乳雾化吸入剂的制备方法，包括以下步骤：
步骤1.按处方准备各原料；
步骤2.取矫味剂用适量纯化水加热溶解，得到第一溶液，备用；
步骤3.取艾纳香醇提取物用95％乙醇超声使其完全溶解，再加入大果木姜子油、艾纳香油、薄荷脑，混匀，得到第二溶液；
步骤4.向第二溶液中加入处方量的甘油、乳化剂、稳定剂，再次混匀；再将第一溶液缓慢加入其中，搅拌均匀，加水补足至规定量，即可。
实施例3
本实施例公开了本发明所述的金喉健微乳雾化吸入剂的制备方法，包括以下步骤：
S1.按处方准备各原料；
S2.取矫味剂用纯化水加热溶解，得到第一溶液，备用；
S3.取艾纳香醇提取物用95％乙醇超声使其完全溶解，再加入大果木姜子油、艾纳香油、薄荷脑，混匀，得到第二溶液；
S4.将甘油、乳化剂、稳定剂混匀均匀后，得到第三溶液；
S5.将第二溶液加入第三溶液中，混匀，再向混合溶液中加入第一溶液，混匀，加水补足至规定量，即可。
实施例4
本实施例公开了本发明的金喉健微乳雾化吸入剂的制备方法，每100g的处方具体为：
艾纳香油1g，大果木姜子油5g，薄荷脑0.3g，艾纳香醇提取物0.2g，甘草酸单铵盐1g，吐温-40 10g，甘油5g，95％乙醇10g，维生素e 1g。
金喉健微乳雾化吸入剂的制备方法按实施例3中的方法进行。
本实施例中的艾纳香油为水蒸汽蒸馏法提取所得。
本实施例中大果木姜子油为二氧化碳超临界提取所得。
本实施例中的艾纳香醇提取物的制备方法为：取提取了艾纳香油后的艾纳香药材，按料液比1：20加95％的乙醇，冷浸48小时，过滤，收集滤液，挥去乙醇，得艾纳香提取物，其总黄酮含量为22wt％。
实施例5
本实施例公开了本发明的金喉健微乳雾化吸入剂的制备方法，每100g的处方具体为：
艾纳香油5g，大果木姜子油1g，薄荷脑2g，艾纳香醇提取物2g，甘草酸单铵盐2.5g，吐温-60 30g，甘油10g，95％乙醇20g，维生素e 2g。
金喉健微乳雾化吸入剂的制备方法按实施例3中的方法进行。
本实施例中的艾纳香油为水蒸汽蒸馏法提取所得。
本实施例中大果木姜子油为二氧化碳超临界提取所得。
本实施例中的艾纳香醇提取物的制备方法为：取提取了艾纳香油后的艾纳香药材，超声提取(100W，40kHz)2次，每次加20倍量95％乙醇，常温下超声60min后过滤，收集滤液，挥去乙醇，得艾纳香提取物，其总黄酮含量为18.5wt％。
实施例6
本实施例公开了本发明的金喉健微乳雾化吸入剂的制备方法，每100g的处方具体为：
艾纳香油10g，大果木姜子油5g，薄荷脑1g，艾纳香醇提取物1g，甘草酸单铵盐2.5g，吐温-80 20g，甘油15g，95％乙醇20g，维生素e 5g。
金喉健微乳雾化吸入剂的制备方法按实施例2中的方法进行。
本实施例中的艾纳香油、大果木姜子油均水蒸汽蒸馏法提取所得。
本实施例中的艾纳香醇提取物的制备方法为：取提取了艾纳香油后的艾纳香药材，按料液比1：20加95％的乙醇，冷浸48小时后超声(100W，40kHz)2小时，过滤，收集滤液，挥去乙醇，得艾纳香提取物，其总黄酮含量为30.5wt％。
实施例7
本实施例公开了本发明的金喉健微乳雾化吸入剂的制备方法，每100g的处方具体为：
艾纳香油1g，大果木姜子油10g，薄荷脑1g，艾纳香醇提取物1.5g，甘草酸单铵盐5g，吐温-80 15g，甘油7.5g，95％乙醇15g，维生素e 3g。
金喉健微乳雾化吸入剂的制备方法按实施例3中的方法进行。
本实施例中的艾纳香油、大果木姜子油均水蒸汽蒸馏法提取所得。
本实施例中的艾纳香醇提取物的制备方法同实施例6。
实施例8
本实施例公开了对本发明的微乳雾化吸入剂的抗流感病毒活性评价。本实施例中所述的微乳雾化吸入剂为实施例1的处方按实施例2的方法制得。
研究测试方法：
1.病毒株：流感病毒减毒活毒株A/WSN/33(H1N1)
2.细胞：MDCK细胞(Madin-Daby canine kidney cells)
3.病毒培养与毒力测定
将病毒接种于9～11日龄的鸡胚尿囊腔，35℃培育72h，无菌操作收获尿囊液。3000rpm离心15min以除去沉淀，收集上清液。将收集的病毒液做10倍系列稀释为10-1至10-8共8个稀释度，加入已贴壁的96孔板MDCK细胞中，每个浓度8个孔，每孔细胞大约3×104个，同时设空白对照组。各孔中MDCK细胞于35℃吸附病毒2h后换用培养液，置于培养箱中继续培养(37℃，5％CO2)，48h后在显微镜下观察细胞病变效应，根据按Reed-Muench法计算病毒的半数细胞培养物感染量TCID50/mL＝10-6.25。本实验MOI＝0.05。
4.加药处理:
给药方式如附图1所示：B2-G9区域每一竖排分别加不同的待测样品，B10-G10区域加阳性对照奥司他韦，B11-G11区域加阴性对照DMSO；黑线下面的三横排再加入病毒。这样的给药方式既可以检测出样品的抗病毒活性，又可以检测其细胞毒性。
5分组与剂量设计
(1)用培养基稀释样品，将处方1～4制成的微乳雾化吸入剂分别配置成以下三个浓度剂量100μg/mL、10μg/mL和1μg/mL，以相同的条件和方法重复实验。
(2)阳性药物对照：奥司他韦(OSV)，加药剂量设计为100μM/mL；
(3)阴性对照：1％DMSO。
6.细胞病变与细胞活力检查：
流感病毒能引起MDCK细胞发生病变，称之为CPE效应，细胞活力显著降低。阴性对照DMSO组加入病毒后能看到明显的CPE效应，而化合物如能有效抑制流感病毒的感染，因此加入等量病毒后细胞状态依旧良好。
实验采用试剂盒检测细胞活力。以空白对照(DMSO)组的化学发光值对应的细胞活力定义为100％，
相对细胞活力＝各组细胞的检测值/空白对照组细胞的检测值×100％
7.数据处理
抑制率是指化合物起到抑制病毒生长的作用的比率。反映了化合物抗病毒活性。
病毒抑制率＝1－(雾化剂对细胞作用检测值－雾化剂对病毒作用检测值)/(空白组检测值－病毒对照检测值)×100％
研究测试结果：
1.不同剂量各处方样品细胞毒性对比
四个测试处方在1μg/mL，10μg/mL和100μg/mL剂量时对细胞毒性的对比见表2和图2。随着剂量降低，细胞活力增加，细胞毒性降低。
表2四个处方样品不同剂量对MDCK细胞活力的影响
2.不同剂量各处方样品抗H1N1病毒活性对比
四个测试处方在1μg/mL和10μg/mL剂量时对H1N1病毒抑制率的对比比见表3。
表3四个处方样品不同剂量提取物对H1N1病毒的抑制对比
在1μg/mL加药剂量时，处方1～4对H1N1病毒的抑制率分别为39.9％，57.9％，46.1％和39.7％；在10μg/mL加药剂量时，处方1～4对H1N1病毒的抑制率分别为52.2％，50.5％，56.2％和51.9％。
小结：
处方1～4在降低剂量后，细胞毒毒性降低，也保留了一定的抗H1N1病毒活性。
实施例9
本实施例公开了本发明的艾纳香醇提取物抗柯萨奇病毒活性评价。本实施例中所述的艾纳香醇提取物为实施例1表1中处方1的艾纳香醇提取物。
具体的研究测试方法：
1.病毒株：柯萨奇病毒B组5型(Coxsakievirus B5，CVB5)。本实验所用病毒(CVB5)的半数细胞培养物感染量TCID50/mL＝10-8.37，MOI＝0.08。
注：柯萨奇病毒(Coxsackievirus)是一种肠病毒(enterovirus)，分为A和B两类，是一类常见的经呼吸道和消化道感染人体的病毒，感染后人会出现发热、打喷嚏、咳嗽等感冒症状。
柯萨奇病毒B组5型(CVB5)引起的轻症包括上呼吸道感染,腹泻及手足口病(hand-footmouth disease，HFMD)，也可引起病毒性脑炎，无菌性脑膜炎，胰腺炎，弛缓性麻痹，扩张性心肌炎等多种重症疾病，其中无菌性脑膜炎及病毒性脑炎呈全球范围分布，发病年龄主要集中于18岁以下的青少年人群，多发于夏秋季节。
2.细胞：RD细胞(人横纹肌肉瘤细胞)
3.加药处理
给药方式如附图1所示：B2-G9区域每一竖排分别加不同的待测样品，B10-G10区域加阳性对照奥司他韦，B11-G11区域加阴性对照DMSO；黑线下面的三横排再加入病毒。这样的给药方式既可以检测出样品的抗病毒活性，又可以检测其细胞毒性。
4.分组与剂量设计
(1)将艾纳香醇提取物用DMSO溶解，并用培养基稀释为50、25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39μg/mL；
(2)阳性药物对照：氟西汀(Flu)，终浓度为2μM；
(3)阴性对照：1％DMSO。
5.细胞病变与细胞活力检查
CVB5病毒能引起RD细胞发生病变，称之为CPE效应，细胞活力显著降低。阴性对照DMSO组加入病毒后能看到明显的CPE效应，而化合物如能有效抑制病毒的感染，则加入等量病毒后细胞状态依旧良好。
实验在加药处理24小时后，采用试剂盒检测细胞活力。以空白对照(DMSO)组的化学发光值对应的细胞活力定义为100％。
相对细胞活力＝各组细胞的检测值/空白对照组细胞的检测值×100％
6.数据处理
抑制率是指化合物起到抑制病毒生长的作用的比率。反映了化合物抗病毒活性。
提取物对病毒抑制率＝1－(艾纳香醇提取物对细胞作用检测值－艾纳香醇提取物对病毒作用检测值)/(空白组检测值－病毒对照检测值)×100％
研究测试结果：
艾纳香醇提取物样品对CVB5的抑制活性测试结果如图4所示，以氟西汀(Flu，2μM)作为阳性对照，DMSO作为阴性对照。当样品浓度大于等于6.25μg/mL时，具有显著抑制柯萨奇病毒感染宿主细胞的活性。当剂量浓度为6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL时，对CVB5病毒的抑制率分别为20.4％，77.6％，80.0％和78.7％。
通过Probit回归分析计算提取物对病毒的半数抑制浓度(IC50)为7.26μg/mL(图5)。
小结：
在本实验条件下，艾纳香醇提取物对样品的抗柯萨奇病毒(CVB5)具有抗病毒活性，半数抑制浓度(IC50)为7.261μg/mL。当剂量浓度为6.25μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL时，对CVB5病毒的抑制率分别为20.4％，77.6％，80.0％和78.7％。
实施例10处方
本实施例对本发明的微乳雾化吸入剂及不含艾纳香醇提取物的微乳雾化吸入剂进行抗流感病毒活性评价。
本实施例中所述的样品1为实施例1的处方2按实施例2的方法制得；样品2与样品1相比，不含艾纳香醇提取物，其余条件均相同。
1.病毒株：流感病毒减毒活毒株A/WSN/33(H1N1)
2.细胞：MDCK细胞(Madin-Daby canine kidney cells)
3.病毒培养与毒力测定
将病毒接种于9～11日龄的鸡胚尿囊腔，35℃培育72h，无菌操作收获尿囊液。3000rpm离心15min以除去沉淀，收集上清液。将收集的病毒液做10倍系列稀释为10-1至10-8共8个稀释度，加入已贴壁的96孔板MDCK细胞中，每个浓度8个孔，每孔细胞大约3×104个，同时设空白对照组。各孔中MDCK细胞于35℃吸附病毒2h后换用培养液，置于培养箱中继续培养(37℃，5％CO2)，48h后在显微镜下观察细胞病变效应，根据按Reed-Muench法计算病毒的半数细胞培养物感染量TCID50/mL＝10-6.25。本实验MOI＝0.05。
4.加药处理:
给药方式如附图1所示：B2-G9区域每一竖排分别加不同的待测样品，B10-G10区域加阳性对照奥司他韦，B11-G11区域加阴性对照DMSO；黑线下面的三横排再加入病毒。这样的给药方式既可以检测出样品的抗病毒活性，又可以检测其细胞毒性。
5分组与剂量设计
(1)用培养基稀释样品，将样品1与样品2分别配置成以下五个浓度剂量，100μg/mL、20μg/mL、4μg/mL、0.8μg/mL、0.16μg/mL；
(2)阳性药物对照：奥司他韦(OSV)，加药剂量设计为100μM/mL；
(3)阴性对照：1％DMSO。
6.细胞病变与细胞活力检查：
流感病毒能引起MDCK细胞发生病变，称之为CPE效应，细胞活力显著降低。阴性对照DMSO组加入病毒后能看到明显的CPE效应，而化合物如能有效抑制流感病毒的感染，因此加入等量病毒后细胞状态依旧良好。
实验采用试剂盒检测细胞活力。以空白对照(DMSO)组的化学发光值对应的细胞活力定义为100％，
相对细胞活力＝各组细胞的检测值/空白对照组细胞的检测值×100％
7.数据处理：
抑制率是指化合物起到抑制病毒生长的作用的比率。反映了化合物抗病毒活性。
提取物对病毒抑制率＝1－(提取物对细胞作用检测值－提取物对病毒作用检测值)/(空白组检测值－病毒对照检测值)
研究测试结果：
样品1的细胞的毒性与抗A型流感病毒(A/WSN/33(H1N1))活性测试结果如表4和图6所示。在本实验条件下，样品1在100μg/mL的剂量下表现出细胞毒性，在大于等于0.16μg/mL的剂量下便表现出抗病毒活性。
表4.样品1对抗A型流感病毒(A/WSN/33(H1N1))的测试对比
注：1)与DMSO空白组细胞相比，*P<0.05，**P<0.01。
2)抑制率大于100％的情况均表内均标识为“>100”。
样品2的细胞的毒性与抗A型流感病毒(A/WSN/33(H1N1))活性测试结果如表5和图7所示。样品2在大于等于20μg/mL剂量下表现出细胞毒性，在大于等于0.8μg/mL剂量下表现出抗病毒活性。
表5.样品2对抗A型流感病毒(A/WSN/33(H1N1))的测试对比
注：1)与DMSO空白组细胞相比，*P<0.05，**P<0.01。
2)抑制率大于100％的情况均表内均标识为“>100”。
小结：
样品1与样品2均具有抗A型流感病毒(A/WSN/33(H1N1))活性，在本实验条件下，样品1在100μg/mL的剂量下表现出细胞毒性，在大于等于0.16μg/mL的剂量下便表现出抗病毒活性；样品2在大于等于20μg/mL剂量下表现出细胞毒性，在大于等于0.8μg/mL剂量下表现出抗病毒活性。
由此可见，本发明的组合物降低剂量后，细胞毒性降低，抗病毒效果更好。并且较未加入艾纳香醇提取物的样品2，本发明的组合物样品1在同等剂量下，具有更低的细胞毒性，以及更好的抗病毒活性。
最后应说明的是：以上各实施例仅仅为本发明的较优实施例用以说明本发明的技术方案，而非对其限制，当然更不是限制本发明的专利范围；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围；也就是说，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内；另外，将本发明的技术方案直接或间接的运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (17)

1.一种金喉健微乳雾化吸入剂，其特征在于，由改进的金喉健药物组合物组合物制成，还包括辅料矫味剂1-5份或/和乳化剂10-30份或/和助乳化剂15-35份或/和稳定剂1-5份；所述改进的金喉健药物组合物由以下重量份的原料制成：艾纳香油1-10份，大果木姜子油1-10份，薄荷脑0.3-2份，艾纳香醇提取物0.2-2份；所述艾纳香醇提取物为以提取了艾纳香油后的艾纳香药材为原料，以50-95％的乙醇为溶剂，采用超临界CO2提取法、冷浸法、超声提取法、冷浸与超声提取法、渗漉法或回流法提取所得；
艾纳香醇提取物中总黄酮的质量百分含量大于等于18.56％，小于等于38.48％；
所述金喉健微乳雾化吸入剂用于口腔，或雾化后吸入，进入气管、支气管或肺部发挥治疗作用。
2.根据权利要求1所述的金喉健微乳雾化吸入剂，其特征在于，所述改进的金喉健药物组合物由以下重量份的原料制成：艾纳香油1-5份，大果木姜子油1-5份，薄荷脑0.3-1份，艾纳香醇提取物0.2-1.5份。
3.根据权利要求1所述的金喉健微乳雾化吸入剂，其特征在于，所述改进的金喉健药物组合物由以下重量份的原料制成：艾纳香油2.5份，大果木姜子油2.5份，薄荷脑0.6份，艾纳香醇提取物0.5份。
4.根据权利要求1所述的金喉健微乳雾化吸入剂，其特征在于，所述改进的金喉健药物组合物由以下重量份的原料制成：艾纳香油5份，大果木姜子油5份，薄荷脑1份，艾纳香醇提取物1份。
5.根据权利要求1或2所述的金喉健微乳雾化吸入剂，其特征在于，艾纳香醇提取物中总黄酮的质量百分含量为24-29％。
6.根据权利要求1所述的金喉健微乳雾化吸入剂，其特征在于，包括矫味剂2.5份或/和乳化剂17.5份或/和助乳化剂22.5份或/和稳定剂2.5份。
7.根据权利要求1或6所述的金喉健微乳雾化吸入剂，其特征在于，所述矫味剂包括甘草酸单铵盐；
或/和所述乳化剂包括吐温类乳化剂、聚山梨酯类乳化剂；
或/和所述助乳化剂包括甘油或/和乙醇；
或/和所述稳定剂包括维生素e。
8.根据权利要求7所述的金喉健微乳雾化吸入剂，其特征在于，所述乳化剂为吐温类乳化剂。
9.根据权利要求7所述的金喉健微乳雾化吸入剂，其特征在于，所述乳化剂为吐温-20、吐温-40、吐温-60、吐温-80中的任意一种或几种。
10.根据权利要求7所述的金喉健微乳雾化吸入剂，其特征在于，所述乳化剂为吐温-80。
11.根据权利要求7所述的金喉健微乳雾化吸入剂，其特征在于，所述助乳化剂为甘油和乙醇。
12.根据权利要求7所述的金喉健微乳雾化吸入剂，其特征在于，所述助乳化剂为甘油和95％乙醇。
13.权利要求1-12任意一项所述的金喉健微乳雾化吸入剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1.按处方准备各原料；
步骤2.取矫味剂用适量纯化水加热溶解，得到第一溶液，备用；
步骤3.取艾纳香醇提取物用95％乙醇超声使其完全溶解，再加入大果木姜子油、艾纳香油、薄荷脑，混匀，得到第二溶液；
步骤4.向第二溶液中加入处方量的甘油、乳化剂、稳定剂，再次混匀；再将第一溶液缓慢加入其中，搅拌均匀，加水补足至规定量，即可。
14.权利要求1-12任意一项所述的微乳雾化吸入剂在制备抗流感病毒、或/和抗柯萨奇病毒的药物中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述流感病毒包括A型流感病毒或/和B型流感病毒。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述A型流感病毒包括H1N1病毒、或/和H3N2病毒。
17.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述B型流感病毒包括Yamagata、或/和Victoria病毒。
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