CN104402995A - 抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法，通过制备流感病毒复合免疫抗原、免疫产蛋母鸡，获得免疫鸡蛋、从免疫鸡蛋蛋黄液提取抗流感病毒鸡卵黄抗体粗品，并对粗品进行超滤纯化、除菌过滤、超低温喷雾干燥处理后，制得抗流感病毒鸡卵黄抗体。该产品成本低、产量高、具有高特异性，可实现产业化。本发明还提供了所述的抗流感病毒鸡卵黄抗体在各种消毒喷雾剂、湿巾、免洗洗手液、牙膏中的应用。

Description

抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法及应用。

背景技术

流感是流行性感冒（Influenza）的简称，是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，可通过感染者咳嗽和打喷嚏等方式导致传播，正常人也可能通过接触带有流感病毒的物体，再接触自己的口鼻而导致感染，具有发病率高、流行广泛、传播迅速等特点。世界卫生组织（WHO）的报告显示，全球人口的5%-15%会感染流感，全世界每年流感会导致300万-500万的严重病例，其中受伤害最大的是老年人、儿童和患有慢性疾病的患者，严重危害人类的身体健康及给社会造成巨大经济损失。

目前，预防流感最广泛的措施之一是注射疫苗。临床使用的流感疫苗有两种：一种为流感病毒灭活疫苗，最早于1945 年在美国上市，现在世界各国广泛使用；另一种为流感病毒减毒活疫苗，目前仅在美国、俄罗斯等少数国家使用。在中国，目前普遍推广使用的是流感病毒灭活疫苗。流感病毒灭活疫苗：流感病毒灭活疫苗主要是针对H1N1，H3N2 和B型流感病毒的三联灭活疫苗，这包括全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。由于灭活疫苗具有较好的免疫效果和临床安全性，且生产成本低，在全世界范围普遍使用。然而，灭活疫苗存在许多缺点，这主要表现在：(1) 灭活疫苗为一种死病毒疫苗，皮下接种不同于病毒的自然感染过程，只能刺激机体产生相应的IgG 抗体，不能刺激呼吸道粘膜产生分泌型免疫球蛋白A(sIgA)，因此不能有效地阻止病毒在呼吸道内的繁殖；(2) 由于病毒变异，需要每年接种，皮下注射伴随的疼痛和潜在的感染风险不易被人们所接受；(3) 其保护作用未达到期望水平，尤其对低龄儿童保护效果较差；(4) 交叉保护作用很弱。由于流感疫苗对于流感的预防不具有广谱性和速效性，所以研发一种能够有效预防流感的新型产品就显得非常重要。

鸡卵黄抗体，是母鸡在卵的发育过程中血清中的IgY有效地转移到卵黄中而得。卵黄抗体具有安全方便、简单易得、产量高、不与IgG发生交叉血清学反应；不与类风湿因子或Fc受体相结合，在免疫检测过程中可避免产生假阴性或假阳性结果的优点，且耐热、耐酸，巴氏灭菌温度下不会失活且在pH值小于3时也能保持稳定活性，这些独特的优点使鸡卵黄抗体在临床和基础科学的应用中起着重要的作用，因此卵黄抗体在医学预防领域的应用越来越受到人类的关注，抗流感病毒鸡卵黄抗体的研制也将带来流感预防的新突破。

发明内容

本发明的目的提供一种安全、有效的主动性预防流感的抗流感病毒鸡卵黄抗体。

本发明的另一个目的是提供所述抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法。

本发明还有一个目的是利用抗流感病毒鸡卵黄抗体，可以制成各种预防流感的制剂，包括各种消毒喷雾剂、湿巾、免洗洗手液、牙膏等。

本发明采用如下技术方案：甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒和乙型流感病毒，确定TCID50值，稀释后等比例混合、乳化制成流感病毒复合免疫抗原；用该抗原注射免疫产蛋母鸡，获得免疫鸡蛋；提取抗流感病毒鸡卵黄抗体粗品；对所述粗品进行超滤纯化，截留相对分子量30KD~150KD，将超滤截留液进行除菌过滤，滤液再经过超低温喷雾干燥，制得抗流感病毒鸡卵黄抗体成品，4℃保存。并进行纯度、活性检测。

具体实施方式

下面的实施例进一步说明本发明。

实施方式一：抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备。

（1）制备流感病毒复合免疫抗原。

制备出甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒和乙型流感病毒，确定其TCID50值，进行病毒灭活；根据病毒的TCID50值，将甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒和乙型流感病毒分别与0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.2）按比例进行稀释，再取等量的稀释好的甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒和乙型流感病毒进行等比例混合均匀，与弗氏完全佐剂按照1:1（V/V）充分乳化后制得流感病毒复合免疫抗原。

（2）用流感病毒复合免疫抗原免疫产蛋母鸡。

取健康适龄的产蛋母鸡，在鸡双翅轴骨头下的臂三角肌、背部等位置用乳化好的复合免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使蛋鸡产生更好的免疫反应；首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；首次免疫前收集未免疫蛋作为阴性对照品，21天后免疫第二次，以后每隔21天免疫一次，每次免疫剂量为0.2~1ml/只，共免疫4~6次；用ELISA 跟踪检测免疫鸡蛋中抗流感病毒鸡卵黄抗体的效价，收集高效价免疫鸡蛋（1:1024），将每日收集的免疫鸡蛋编号，4℃下保存。

（3）抗流感病毒鸡卵黄抗体的提取和纯化。

S1将获得的免疫鸡蛋用0.1%新洁尔灭消毒，纯化水冲洗干净，敲破，去除蛋清及蛋黄膜，留取蛋黄部分，测定所收集的蛋黄体积，水稀释法提取：按比例1：6~12比例加入纯化水，用1mol/L 盐酸溶液调节PH为5.2~5.6，4℃条件下静置过夜，6000~10000r/min离心，取上清液，测定所收集上清液的体积。

S2在S1步骤制得的上清液中稍慢速度搅拌下加入PEG6000或者硅藻土，充分搅拌后，置于高速冷冻离心机中，在10℃下以6000~10000r/min r/min，离心，倾去上清液，沉淀部分即为抗流感病毒鸡卵黄抗体粗品。

S3用纯化水溶解抗流感病毒鸡卵黄抗体粗品至上清液初体积，用超滤膜进行超滤浓缩，超滤膜截留相对分子量为30KD~150KD滤液，将超滤截留液进行除菌过滤，以滤除各种细菌，即可制得抗流感病毒鸡卵黄抗体纯品。

S4 将抗流感病毒鸡卵黄抗体纯品进行超低温喷雾干燥，制得抗流感复合鸡卵黄抗体成品，4℃保存。

实施方式二：抗流感病毒鸡卵黄抗体的纯度检测。

采用醋酸纤维膜电泳分离并测定抗流感病毒鸡卵黄抗体纯度，醋酸纤维膜电泳是以醋酸纤维膜为支持物的电泳方法。醋酸纤维膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一泡沫样的结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速，样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点，目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白、糖蛋白、同工酶的分离和鉴定。检测结果表明：纯度≥40%。

实施方式三：抗流感病毒鸡卵黄抗体的ELISA效价活性检测。

采用“ELISA法”（酶联免疫吸附试验）检测本发明的工艺制取的抗流感病毒鸡卵黄抗体的ELISA效价。检测结果表明，效价达到了1:1280。

实施方式四：抗流感病毒鸡卵黄抗体的应用。

将上述抗流感病毒鸡卵黄抗体按一定的比例加入辅料可制成各种消毒喷雾剂、湿巾、免洗洗手液、牙膏等产品。抗流感病毒鸡卵黄抗体与相应的流感病毒粒子呈现特异性结合，阻止流感病毒对人体敏感细胞的吸附，或抑制其侵入，能够有效阻止病毒进一步扩散，使病毒失去感染能力，从而发挥预防流感作用。

Claims (2)

1.一种抗流感病毒鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）流感病毒复合免疫抗原的制备：

制备出甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒和乙型流感病毒，确定其TCID50值，进行病毒灭活；根据病毒的TCID50值，将甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒和乙型流感病毒分别与0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH=7.2）按比例进行稀释，再取等量的稀释好的甲型H1N1流感病毒、甲型H3N2流感病毒和乙型流感病毒进行等比例混合均匀，并与弗氏完全佐剂按照1:1（V/V）充分乳化后制得流感病毒复合免疫抗原；

（2）用制得的流感病毒复合免疫抗原对产蛋母鸡进行免疫，获得免疫鸡蛋：

取健康适龄的产蛋母鸡，在鸡双翅轴骨头下的臂三角肌、背部等位置用乳化好的复合免疫抗原进行肌肉、皮下多点注射，以使蛋鸡产生更好的免疫反应；首次免疫采用弗氏完全佐剂，其余采用弗氏不完全佐剂；首次免疫前收集未免疫蛋作为阴性对照品，21天后免疫第二次，以后每隔21天免疫一次，每次免疫剂量为0.2~1ml/只，共免疫4~6次；用ELISA 跟踪检测免疫鸡蛋中抗流感病毒鸡卵黄抗体的效价，收集高效价免疫鸡蛋（1:1024），将每日收集的免疫鸡蛋编号，4℃下保存；

（3）提取、纯化：将获得的免疫鸡蛋消毒、去除蛋清及蛋黄膜，留取蛋黄部分，通过水稀释法离心分离获得水溶性组分，并用聚乙二醇6000或者硅藻土提取获得抗流感病毒鸡卵黄抗体粗品；将粗品用纯化水溶解后，进行超滤纯化，截留相对分子量30KD~150KD滤液，将超滤截留液进行除菌过滤，再经过超低温喷雾干燥，制得抗流感病毒鸡卵黄抗体成品，4℃保存。

2.根据权利要求1所述的方法制备得到的抗流感病毒鸡卵黄抗体的应用，其特征在于应用于制备预防流感的各种消毒喷雾剂、湿巾、免洗洗手液及牙膏等产品。