CN101880323A - 一种抗手足口病特异性鸡卵黄抗体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗手足口病特异性鸡卵黄抗体的制备及其提纯方法，该抗体可以由下述方法制备：1.采用超声波粉碎法将灭活纯化的EV71的B型、C型以及CoxA16三个病毒株制备成可溶性抗原，获得针对手足口病的复合抗原；2.用制得的手足口病复合抗原对产蛋母鸡进行注射免疫，获得抗手足口病免疫蛋；3.提取抗手足口病特异性鸡卵黄抗体粗品，并对其进行纯化、过滤处理后，即制得抗手足口病特异性鸡卵黄抗体(Immunoglobulin of Egg Yolk，IgY)成品。所得的抗手足口病卵黄抗体成本低、产量高，具有高特异性，利用这些特异性IgY可以制成各种预防、治疗手足口病的制剂。
Description
技术领域
本发明属于免疫学技术领域，具体涉及一种抗手足口病特异性鸡卵黄抗体的制备方法。
背景技术
手足口病(Hand-Foot and Mouth Disease，HFMD)于1957年在新西兰首次报道，1958年分离出柯萨奇病毒，1959年提出HFMD命名，60年代以后，许多国家和地区多次报道该病的流行。早期发现的手足口病的病原体主要是CoxA16型，1969年分离出EV71病毒并首次被确认。此后CoxA16感染和EV71感染交替出现，成为手足口病的主要病原体。20世纪70年代中期，保加利亚、匈牙利相继暴发以中枢神经系统为主要临床特征的EV71流行。20世纪90年代后期，EV71开始在东南亚地区流行。我国于1981年在上海首次报道本病。此后，北京、河北、天津、福建、吉林和广东等10几个省市均有报道。1995年武汉病毒研究所从手足口病人中分离出EV71，1998年深圳市卫生防疫站从患者标本中分离出EV71病毒。近年来EV71病毒的流行呈上升趋势，不断引起严重的中枢神经系统症状，导致儿童死亡。
手足口病是由多种肠道病毒引起的急性传染病，最主要的病原体是EV71和柯萨奇病毒A16型(CoxA16)，多发生于婴幼儿，成人也偶见发生，可引起发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹，具有很强的传染性，可以通过玩具、食具、鼻咽分泌物、飞沫等多种途径传染。其症状表现为：急性起病，发热，手掌或脚掌部出现斑丘疹和疱疹，臀部或膝盖也可出现皮疹。皮疹周围有炎性红晕，疱内液体较少；口腔粘膜出现散在的疱疹，疼痛明显。部分患儿伴有咳嗽、流涕、食欲不振、恶心、呕吐和头疼等症状。手足口病的症状较重，而且可并发无菌性脑膜炎、脑炎、瘫痪等与神经系统相关的疾病以及心肌炎、肺水肿等严重并发症，个别重症患儿病情进展快，易发生死亡。所以，积极治疗HFMD，防止其继发感染、暴发流行均具有重要价值，而且研发一种有效预防、治疗手足口病的新型药物成为世界医药卫生领域的一个新的课题和挑战。
目前，虽然已有针对预防HFMD的疫苗，但是尚无特异性药物，临床用药主要有抗病毒药、中药和抗菌药等，治疗效果不理想，而且有副作用，影响儿童健康，预防传染和治疗HFMD成为医学上的难题。本发明所制备的抗手足口病IgY是治疗手足口病的特异性生物制品，不但能有效治疗手足口病，而且没有副作用，不会损害儿童身体健康，同时还有鉴别诊断和紧急预防接种等作用，当免疫缺陷、疫苗缺乏及免疫失败时，可利用卵黄抗体注射、口服替代主动免疫接种，发挥抗病作用，因此抗手足口病IgY的发明具有重大的社会意义。
发明内容
到目前为止，尚未出现应用IgY技术治疗手足口病的研究报道，本发明首次提供一种新的治疗手足口病的特异性方法，即应用抗手足口病特异性IgY。
本发明涉及一种抗手足口病特异性鸡卵黄抗体的制备方法，其特征在于：通过超声波粉碎法将灭活纯化的EV71的B型、C型以及CoxA16三个病毒株制备成可溶性抗原，获得针对手足口病的复合抗原；用该抗原注射免疫产蛋母鸡，获得抗手足口病免疫蛋；提取抗手足口病特异性卵黄抗体粗品，并对其进行纯化处理后，获得抗手足口病特异性IgY纯品；对所述抗手足口病特异性IgY纯品进行过滤处理，以滤除各种细菌和病毒，得到抗手足口病特异性IgY成品。
本发明所制备的鸡卵黄抗体，具有安全方便、简单易得、产率高、成本低、特异性强、不与IgG发生交叉血清学反应；且耐热、耐酸，巴氏灭菌温度下不会失活且在pH值小于3时也能保持稳定活性，这些独特的优点使鸡卵黄抗体在临床和基础科学的应用中起着重要的作用。因此鸡卵黄抗体在医学领域的应用越来越受到人类的关注，抗手足口病特异性鸡卵黄抗体的研制对手足口病的预防与治疗具有重要意义。
具体实施方式
下面的实施实例进一步说明本发明。
实施方式一：抗手足口病特异性鸡卵黄抗体的制备
(1)手足口病抗原的制备
通过超声波粉碎法将灭活纯化的EV71的B型、C型以及CoxA16三个病毒株制备成可溶性抗原，获得针对手足口病的复合抗原。将冷冻干燥的抗原用0.01mol/L磷酸盐缓冲液PBS(pH＝7.2)稀释成1mg/ml，并且与福氏佐剂按照1∶1(V/V)充分乳化后制得免疫抗原。
(2)用手足口病复合抗原免疫产蛋母鸡
取20周龄产蛋母鸡15只，将乳化好的手足口病复合抗原经鸡双翼或胸肌处多点注射；首次免疫采用福氏完全佐剂，其余采用福氏不完全佐剂；首次免疫前收集未免疫蛋作为阴性对照品，9天后免疫第二次，以后每隔8天免疫一次，每次免疫剂量为0.5ml/只；第二次免疫22天后收集鸡蛋，连续收集3个月(收集的鸡蛋编号)，存放于4℃。
(3)抗手足口病特异性IgY的提纯
敲破获得的抗手足口病免疫蛋，去除蛋清及蛋黄膜，留取蛋黄部分，测定所收集的蛋黄体积，边磁力搅拌边加入16％的氯化钠，体积为蛋黄体积的9倍，充分搅拌后，4℃条件下静置过夜，9000r/min离心30min，取上清液，并用纱布过滤，测定滤液的体积；
在上述滤液中稍慢速度搅拌下加入40％的PEG6000，体积为滤液体积的0.5倍，充分搅拌半个小时后，将此混合物分装于10ml离心管中，置于高速冷冻离心机中，在10℃下以9690r/min，离心30min，倾去上清液，沉淀部分即为抗手足口病特异性IgY粗提物；
用0.8％磷酸盐缓冲液PBS溶解沉淀至上清液初体积，再在缓慢搅拌下加入初体积一半的饱和度为33％的硫酸铵溶液，静置3h，再次离心，弃去上清液，将沉淀部分在-60℃下真空冷冻干燥12h，干粉成品即为制得的抗手足口病特异性鸡卵黄抗体纯品；
将抗手足口病特异性IgY纯品进行过滤处理，以滤除各种细菌和病毒，得到抗手足口病特异性IgY成品，将所制得的IgY成品分装后于-20℃保存。
实施方式二：抗手足口病特异性IgY的效价检测
采用ELISA(酶联免疫吸附试验)法检测本发明工艺制取的抗手足口病特异性IgY的效价。检测结果表明，抗手足口病特异性IgY的效价达到了1∶6400。
实施方式三：抗手足口病特异性IgY的纯度鉴定
采用SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶)电泳法，使用5％浓缩胶，12％分离胶，对以上工艺所制取的抗手足口病特异性IgY的粗提物进行检测，结果含IgY 52-60％。IgY粗提物经过饱和度为33％的硫酸铵盐析纯化后，经SDS-PAGE分析，纯度达到92-95％。
实施方式四：体外抑菌试验
取5支装有10mL液体培养基的试管，分别加入1mL指示菌悬液，使细菌浓度为108cfu/mL。向其中4支试管各加入1mL不同浓度的抗手足口病IgY，使抗体的终浓度分别为2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和16mg/mL，剩下的一支作为对照，加入1mL无菌的PBS。将5支试管置于37℃的恒温培养箱中培养，分别在第2h、4h和6h取培养液，用稀释平板法计算活菌数。结果证明，制备的抗手足口病IgY的浓度达到8mg/mL时，对手足口病的生长具有明显的抑制作用。
实施方式五：抗手足口病特异性IgY的应用
利用抗手足口病特异性IgY，可以制成各种预防、治疗手足口病的制剂，包括干粉制剂、液态制剂、颗粒制剂、胶囊或片剂等，可应用于制备预防和治疗手足口病感染的药物、保健品、饮品。
另一种应用是在制备免疫检测试剂中的应用，具体包括：免疫电泳、ELISA、免疫沉淀、免疫印迹、抗体芯片、时间分辨荧光免疫分析和免疫细胞学等一系列免疫诊断技术，用以检测相应的手足口病抗原。
Claims (3)
1.一种制备抗手足口病特异性IgY的方法，其特征在于，采用超声波粉碎法将将灭活纯化的EV71的B型、C型以及CoxA16三个病毒株制备成可溶性抗原，获得针对手足口病的复合抗原。
2.将上述步骤(1)中所获得的抗原用0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffered Saline，PBS pH＝7.2)稀释，并且与福氏佐剂按照1∶1(V/V)充分乳化后制得免疫抗原。用乳化好的抗原双翼或胸肌处多点注射免疫20周龄产蛋母鸡；首次免疫采用福氏完全佐剂，其余采用福氏不完全佐剂；首次免疫前收集未免疫蛋作为阴性对照品，8-10天后免疫第二次，以后每隔7-9天免疫一次，每次免疫剂量为0.4-0.6ml/只；第二次免疫22天后收集鸡蛋，连续收集2-3个月(收集的鸡蛋编号)，于4℃保存。
3.将获得的抗手足口病免疫蛋，去除蛋清及蛋黄膜，留取蛋黄部分，通过14-16％氯化钠稀释获得水溶性组分，并用40-50％聚乙二醇6000(polyethyleneglycol 6000，PEG6000)提取获得卵黄抗体粗提物，上述粗提物用饱和度为30-33％的硫酸铵溶液或140g/L的硫酸钠溶液进行纯化后，得到抗手足口病特异性IgY纯品，将IgY纯品进行过滤处理，以滤除各种细菌和病毒，得到抗手足口病特异性IgY成品，将所制得的IgY成品分装后于-20℃保存。
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|---|---|---|---|---|
| CN104497138A (zh) * | 2014-12-08 | 2015-04-08 | 广东京豪医药科技开发有限公司 | 抗手足口病病毒鸡卵黄抗体的制备方法及应用 |
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2010
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