CN104870007A - 新的抗病毒大环化合物 - Google Patents

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Abstract

描述环孢菌素衍生物、制造环孢菌素衍生物的方法以及用于通过施用环孢菌素衍生物治疗被包括肝炎病毒或HIV的某些病毒感染的受试者的方法。

Description

新的抗病毒大环化合物
领域
本文公开环孢菌素衍生物、包含其的组合物、用于其制备的工艺、在其合成中有用的中间体、其作为治疗剂如抗病毒剂的用途、用选择的环孢菌素衍生物抑制亲环蛋白的方法、以及治疗具有慢性丙型肝炎和其他病毒的受试者的方法(包括使用与干扰素和任选地利巴韦林组合的选择的环孢菌素衍生物)。
背景
环孢菌素A由于其免疫抑制活性和一系列治疗用途是熟知的，包括抗真菌活性、抗寄生虫活性和抗炎活性以及抗HIV活性。环孢菌素A和某些衍生物已经被报告为具有抗HCV活性，参见Watashi等人，Hepatology，2003，38：1282-1288；Nakagawa等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.2004，313：42-47；以及Shimotohno和K.Watashi，2004，American TransplantCongress,摘要第68号(American Journal of Transplantation，2004，第4卷，第8期增刊，第1-653页)。
概述
在一方面中，本文提供环孢菌素A衍生物，其中3-肌氨酸位置被基团-S-CH2C[CH2(CH2)n]NR2R3取代，其中R2是氢或具有从一个至四个碳原子的烷基链，并且当烷基链具有3个或4个碳原子时，链是直链或支链的；R3是具有从一个至四个碳原子的烷基链，并且当烷基链具有3个或4个碳原子时，链是直链或支链的；并且n是1或2。
在此方面中，本文提供式(I)的化合物：
其中：
A是(E)-CH＝CHCH3或-CH2CH2CH3；
B是乙基、1-羟基乙基、异丙基或正丙基；
n是1或2；
X是氢或羟基；
R1是氢或任选地被可以是相同或不同的一个或更多个基团R4取代的含有从一个至四个碳原子的直链或支链的烷基；
R2是氢或具有从一个至四个碳原子的烷基链，并且当烷基链具有3个或4个碳原子时，链是直链或支链的；
R3是具有从一个至四个碳原子的烷基链，并且当烷基链具有3个或4个碳原子时，链是直链或支链的；并且
R4是任选地被选自由以下组成的组的可以是相同或不同的一个至五个基团取代的苯基：烷基、卤代烷基、卤素、羟基、烷氧基、氨基、N-烷基氨基、N,N-二烷基氨基、羧基和烷氧基羰基；
或其药学上可接受的盐。
在某些情况下，取代基A、B、R2和R3可以有助于光学和/或立体异构现象。所有这样的形式由本文描述的示例性实施方案涵盖。
在另一方面中，提供包含式(I)的化合物连同药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂的组合物。
在又另一方面中，本文提供使用式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物以治疗或预防感染的方法。示例性的感染包括由病毒引起的感染。示例性的病毒包括HCV(丙型肝炎病毒)、HBV(乙型肝炎病毒)和HIV(人类免疫缺陷病毒)感染、流行性感冒病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、西尼罗病毒、登革热病毒和本文详细描述的其他病毒。方法通常包括向具有病毒的受试者施用对治疗或预防病毒有效的某种量的化合物或组合物。
在又另一方面中，本文提供用于治疗的式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物。
在另一方面中，本文提供在制造药物中的式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物。
在另一方面中，提供用于制造用于治疗或预防病毒的药物的式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物。
本文提供的化合物在其性质的某些方面例如其在红细胞和血浆之间的分布性质和其在诸如人类外周血单核细胞的HCV感染细胞中诱导IL29的能力上示出超过已知化合物的优点。
详述
定义
当提及本文公开的化合物和络合物时，除非另外指示，否则以下的术语具有以下的含义。
“环孢菌素”指的是本领域的技术人员已知的环孢菌素化合物或其衍生物。参见例如Ruegger等人,1976,Helv.Chim.Acta.59：1075-92；Borel等人,1977,Immunology 32：1017-25页；其内容特此通过引用以其整体并入。式(I)的化合物是环孢菌素衍生物。除非另外注明，否则本文描述的环孢菌素是环孢菌素A。
下文使用的环孢菌素命名法和编号系统是由J.Kallen等人,“Cyclosporins:Recent Developments in Biosynthesis,Pharmacology andBiology,and Clinical Applications”,Biotechnology,第二版,H.-J.Rehm和G.Reed编辑,1997，第535-591页使用的那些并且在下文中示出：
其中“Bmt”指的是2(S)-氨基-3(R)-羟基-4(R)-甲基-6(E)-辛烯酸。
环孢菌素A是11个氨基酸的环状非核糖体肽，并且含有单个D-氨基酸。
环孢菌素A
这对应于如下文示出的式(I)的化合物中的饱和的碳原子环：
其中A、B、R1、R2、R3、n和X如上文所定义。
“亲环蛋白抑制剂”是能够抑制亲环蛋白的活性的化合物。亲环蛋白抑制剂可以结合亲环蛋白并且抑制亲环蛋白的活性。亲环蛋白结合的化合物是亲环蛋白抑制剂。示例性的化合物可以包括对治疗某些适应症有用并且呈现出有益性质的环孢菌素。例如，这样的有益性质包括干扰素类行为。
“烷基”指的是具有多达4个碳原子的单价饱和脂肪族烃基。烃链可以是直链或支链的。此术语通过基团甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基来例证。
“离去基团”指的是离核体，是当其被亲核体替代时带走结合的电子对的基团。
“药学上可接受的盐”指的是保留其生物学性质并且是无毒的或以其他方式对药物用途不是不合意的本文公开的化合物的任何盐。这些盐可以源自本领域中已知的多种有机和无机的抗衡离子。这样的盐包括：(1)与有机酸或无机酸形成的酸加成盐，所述有机酸或无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、氨基磺酸、乙酸、三氟乙酸、三氯乙酸、丙酸、己酸、环戊基丙酸、乙醇酸、戊二酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、山梨酸、抗坏血酸、苹果酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、苦味酸、肉桂酸、扁桃酸、邻苯二甲酸、月桂酸、甲磺酸、乙磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡萄糖酸、苯甲酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、环己基氨基磺酸、奎宁酸、粘康酸、以及类似的酸。
通过仅实例的方式，盐还包括无毒的有机酸或无机酸的盐，例如，氢卤化物(例如盐酸盐和氢溴酸盐)、硫酸盐、磷酸盐、氨基磺酸盐、硝酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、三氯乙酸盐、丙酸盐、己酸盐、环戊基丙酸盐、乙醇酸盐、戊二酸盐、丙酮酸盐、乳酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、山梨酸盐、抗坏血酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、柠檬酸盐、苯甲酸盐、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸盐、苦味酸盐、肉桂酸盐、扁桃酸盐、邻苯二甲酸盐、月桂酸盐、甲磺酸盐(methanesulfonate)(甲磺酸盐(mesylate))、乙磺酸盐、1,2-乙烷-二磺酸盐、2-羟基乙磺酸盐、苯磺酸盐(benzenesulfonate)(苯磺酸盐(besylate))、4-氯苯磺酸盐、2-萘磺酸盐、4-甲苯磺酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸盐、葡庚糖酸盐、3-苯基丙酸盐、三甲基乙酸盐、叔丁基乙酸盐、月桂基硫酸盐、葡萄糖酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、羟基萘甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐、环己基氨基磺酸盐、奎宁酸盐、粘康酸盐、以及类似的盐。
应当理解的是，具有相同分子式但在它们的原子的结合性质或顺序上或在它们的原子在空间中的布置上不同的化合物被称为“异构体”。在它们的原子在空间中的布置上不同的异构体被称为“立体异构体”。
不是彼此的镜像的立体异构体被称为“非对映异构体”并且作为彼此的不可重叠的镜像的那些被称为“对映体”。当化合物具有不对称中心时，例如当其被结合到四个不同的基团时，一对对映体是可能的。对映体可以通过其不对称中心的绝对构型被表征并且根据Cahn和Prelog的规则(Cahn等人,1966,Angew.Chem.78：413-447,Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.5：385-414(勘误表：Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.5：511)；Prelog和Helmchen,1982年,Angew.Chem.94：614-631,Angew.Chem.Internal.Ed.Eng.21：567-583；Mata和Lobo,1993,Tetrahedron:Asymmetry 4：657-668)被指定为(R)或(S)或可以通过其中分子使偏振光的平面旋转并且被指定为右旋或左旋(即，分别为(+)-或(-)-异构体)的方式被表征。手性化合物可以作为单独的对映体或作为其混合物存在。包含相等比例的对映体的混合物被称为“外消旋混合物”。
在某些实施方案中，本文公开的化合物可以具有一个或更多个不对称中心；这样的化合物可以因此作为单独的(R)-或(S)-对映体或作为其混合物被生产。例如，除非另外指示，否则通过在式的任何位置指定立体化学，描述或命名说明书和权利要求中的特定的化合物被意图包括单独的对映体和其混合物(外消旋的或以其他方式的)两者。用于确定立体化学并且分离立体异构体的方法在本领域中是熟知的。在特定的实施方案中，本文提供的化合物的立体异构体在用碱处理后被描绘。
在某些实施方案中，本文公开的化合物是“立体化学纯的”。立体化学纯的化合物具有被本领域的技术人员公认为是“纯的”立体化学纯度水平。当然，此纯度水平将小于100％。在某些实施方案中，“立体化学纯的”指定大体上没有即至少约85％或更多地没有可选择的异构体(alternateisomer)的化合物。在特定的实施方案中，化合物至少约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、约99.5％或约99.9％地没有其他的异构体。
“肌氨酸(sarcosine)”或“肌氨酸(Sar)”指的是具有结构-N(Me)CH2C(＝O)-的本领域技术人员已知的氨基酸残基。本领域技术人员可以将肌氨酸识别为N-甲基甘氨酸。
如本文所使用，术语“受试者”和“患者”在本文中被可互换地使用。术语“受试者(subject)”和“受试者(subjects)”指的是灵长类(例如，猴诸如食蟹猴(cynomolgous monkey)、黑猩猩和人类)。在一个实施方案中，受试者是人类。
如本文所使用，术语“治疗剂(therapeutic agent)”和“治疗剂(therapeuticagents)”指的是可以被用于治疗、控制或改善紊乱或其一种或更多种症状的任何试剂。在某些实施方案中，术语“治疗剂”指的是本文公开的化合物。在某些其他的实施方案中，术语“治疗剂”不指本文公开的化合物。在一个实施方案中，治疗剂是被认为对治疗、控制、预防或改善紊乱或其一种或更多种症状有用或已经被或目前被用于治疗、控制、预防或改善紊乱或其一种或更多种症状的试剂。
“治疗有效量”意指当被施用到受试者用于治疗疾病时足以产生对疾病的此类治疗的化合物或络合物或组合物的量。“治疗有效量”可以取决于特别地化合物、疾病及其严重度、以及待被治疗的受试者的年龄、体重等而变化。
在一个实施方案中，任何疾病或紊乱的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指的是改善存在于受试者中的疾病或紊乱。在另一个实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指的是改善至少一种身体参数或大体上抑制可以是受试者难识别的症状。在又另一个实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指的是调节身体上(例如稳定可识别的症状)或生理上(例如稳定身体参数)或两者的疾病或紊乱。在又另一个实施方案中，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指的是延迟疾病或紊乱的发作。
如本文所使用，如使用的术语“预防剂(prophylactic agent)”和“预防剂(prophylactic agent)”指的是可以被用于预防紊乱或其一种或更多种症状的任何试剂。在某些实施方案中，术语“预防剂”指的是本文公开的化合物。在一个实施方案中，预防剂是被认为对预防或阻碍紊乱的发作、发展、进展和/或严重度有用或已经被或目前被用于预防或阻碍紊乱的发作、发展、进展和/或严重度的试剂。
如本文所使用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”或“预防(prevention)”指的是由施用治疗(例如预防剂或治疗剂)或施用治疗的组合(例如预防剂或治疗剂的组合)产生的对受试者中紊乱的一种或更多种症状的复发、发作或发展的预防。
如本文所使用，措辞“预防有效量”指的是足以产生对与紊乱相关的一种或更多种症状的发展、复发或发作的预防或增强或改进另一种治疗(例如另一种预防剂)的预防效果的治疗(例如预防剂)的量。
术语“标签”指的是在制品的直接容器上的书面、打印或图形内容(例如在含有药学活性剂的小瓶上展示的书面资料)的展示。
术语“标记物(labeling)”指的是在任何制品或其容器或包装器中的任何一种上或伴随这种制品的所有标签和其他书面、打印或图形内容，例如与药学活性剂的容器相伴随或相关的包装说明书或指导录像带或DVD。
化合物
在一个实施方案中，X是羟基。
在一个实施方案中，A是(E)-CH＝CHCH3。
在另一个实施方案中，B是乙基。
在又另一个实施方案中，n是1。
在又另一个实施方案中，R1是氢或苄基。
在另外的实施方案中，R2是氢、甲基或乙基。在另一个实施方案中，R2是甲基或乙基。
在还另外的实施方案中，R3是甲基、乙基或异丙基。
在又另外的实施方案中，提供了式(I)的化合物，其中：
A是(E)-CH＝CHCH3；
B是乙基；
n是1或2；
R1是氢或苄基；并且
R2是氢或C1-C4烷基；并且
R3是C1-C4烷基。
在某些实施方案中，提供了式(I)的化合物，其中：
A是(E)-CH＝CHCH3；
B是乙基；
n是1或2；
R1是氢或苄基；并且
可以是相同或不同的R2和R3各自是C1-C4烷基。
在一个实施方案中，本文提供的(I)的化合物选自以下：
字母A至H被用于在下文中识别上文的化合物。
化合物A
化合物B
化合物C
化合物D
化合物E
化合物F
化合物G
化合物H
式(I)的化合物可以通过对本领域技术人员是明显的任何方法制备、分离或获得。在下文的实施例中详细描述示例性的制备方法。
在一个实施方案中，式(I)的化合物可以通过使式(II)的化合物：
其中R1、A、B和X如上文所描述，与式(III)的化合物反应被制备：
其中R2、R3和n如上文所定义并且R10是离去基团，例如对甲苯磺酸酯、甲磺酸酯和季铵或卤化物。式(III)的化合物和其盐是新颖的并且本身形成另外的实施方案。
上文的式(II)的化合物在文献中是已知的；参见例如欧洲专利第484,281号和WO2009/148615。
上文的式(III)的化合物可以通过使式(IV)的化合物：
其中R20是卤素(例如溴化物)，与式R10S-X+的化合物反应被制备，其中R10如上文所定义并且X是阳离子。合适的阳离子的实例包括碱金属(例如钠和钾)。反应通常在非质子溶剂(例如乙腈)中并且在诸如碳酸钾的碱的存在下进行。式(IV)的化合物是已知的或通过应用或调整已知的方法制备。
药物组合物和施用方法
在某些实施方案中，可以使用包含单独使用或以与一种或更多种相容的并且药学上可接受的载体例如稀释剂或佐剂或与另外的治疗剂的组合的形式使用的至少一种通式(I)的化合物(如果适合，以盐形式)的药物组合物来施用本文公开的方法中使用的式(I)的化合物。在临床实践中，示例性环孢菌素化合物可以通过任何常规的途径特别地口服、肠胃外、直肠或通过吸入(例如以气溶胶的形式)来施用。在一个实施方案中，本文公开的化合物被口服施用。
给药途径和形式
施用途径的实例包括但不限于口服的、肠胃外的，例如静脉内的、皮内的、皮下的、肌内的、皮下的、口腔的、舌下的、吸入的、鼻内的、透皮的、局部的、透粘膜的、肿瘤内的、滑液内的和直肠的施用。在特定的实施方案中，根据常规程序将组合物配制为适于静脉内、皮下、肌内、口服、鼻内或局部施用到人类的药物组合物。在实施方案中，根据常规程序将药物组合物配制成用于皮下施用到人类。通常，用于静脉内施用的组合物是呈无菌的等渗的含水缓冲液的溶液。在必要的情况下，组合物还可以包括增溶剂和局部麻醉剂例如利诺卡因以缓解注射部位的疼痛。
剂型的实例包括但不限于：片剂；囊片；胶囊例如软的弹性明胶胶囊；扁囊剂；锭剂；糖锭；分散体；栓剂；软膏；巴布剂(膏状药(poultice))；糊剂；粉末；敷料；霜剂；硬膏剂；溶液；贴剂(patch)；气溶胶(例如鼻喷雾剂或吸入剂)；凝胶；适用于口服或粘膜施用到受试者的液体剂型，包括悬浮液(例如含水或不含水的液体悬浮液、水包油乳液或油包水液体乳液)、溶液和酏剂；适用于肠胃外施用到受试者的液体剂型；和可以被重构以提供适用于肠胃外施用到受试者的液体剂型的无菌固体(例如结晶的或无定形的固体)。
本文提供的剂型的组成、形状和类型将通常取决于它们的用途而变化。例如，用于初始治疗病毒感染的剂型可以含有比用于相同感染的维持治疗的剂型更大的量的其包含的一种或更多种活性成分。相似地，肠胃外剂型可以含有比用于治疗相同疾病或紊乱的口服剂型更小的量的其包含的一种或更多种活性成分。其中被示例性的实施方案涵盖的特定的剂型将彼此不同的这些和其他方式对于本领域技术人员将是容易显而易见的。参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第20版,Mack Publishing,Easton PA(2000)。
口服剂型
适用于口服施用的本文公开的药物组合物可以作为离散的剂型存在，所述离散的剂型例如但不限于片剂(例如咀嚼片)、囊片、胶囊和液体(例如调味的糖浆)。这样的剂型含有预定的量的活性成分并且可以通过本领域技术人员熟知的药剂学方法制备。通常参见Remington's PharmaceuticalSciences,第20版,Mack Publishing,Easton PA(2000)。
可以利用片剂、丸剂、硬明胶胶囊、粉末或颗粒作为用于口服施用的固体组合物。在这些组合物中，活性产品与一种或更多种惰性稀释剂或佐剂例如蔗糖、乳糖或淀粉混合。这些组合物可以包含除了稀释剂以外的物质，例如，润滑剂比如硬脂酸镁、或被意图用于控制释放的包衣。
可以利用含有惰性稀释剂例如水或液体石蜡的药学上可接受的溶液、悬浮液、乳液、糖浆和酏剂作为用于口服施用的液体组合物。这些组合物还可以包含除了稀释剂以外的物质例如增湿、增甜或调味的产品。
如上文的部分中详细地描述，在某些实施方案中，口服剂型是固体并且在无水条件下用无水成分来制备。然而，剂型的范围延伸超过无水的固体口服剂型。同样地，本文描述另外的形式。
典型的口服剂型根据常规药物混合技术通过在基本的掺合物中将活性成分与至少一种赋形剂组合来制备。赋形剂可以取决于施用所期望的制剂的形式而采用多种形式。例如，适用于在口服液体或气溶胶剂型中使用的赋形剂包括但不限于水、二醇、油、醇、调味剂、防腐剂和着色剂。适用于在固体口服剂型(例如粉末、片剂、胶囊和囊片)中使用的赋形剂的实例包括但不限于淀粉、糖、微晶纤维素、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂
因为它们容易施用，片剂和胶囊代表最有利的口服单位剂型，在所述情况下利用固体赋形剂。如果需要，片剂可以通过标准的含水或非水技术来包覆。这样的剂型可以通过药剂学方法中的任一种来制备。通常，药物组合物和剂型通过将活性成分与液体载体、细分的固体载体或两者均匀并且完全地掺合并且然后如果需要使产品成形为期望的外观来制备。
例如，片剂可以通过压缩或模制来制备。压缩的片剂可以通过在适当的机器中将活性成分压缩为自由流动形式例如粉末或颗粒(任选地与赋形剂混合)来制备。模制的片剂可以通过在适当的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物制成。
可以被用于口服剂型的赋形剂的实例包括但不限于粘合剂、填充剂、崩解剂和润滑剂。适用于药物组合物和剂型的粘合剂包括但不限于玉米淀粉、马铃薯淀粉或其他淀粉、明胶、天然和合成的树胶例如金合欢树胶、藻酸钠、藻酸、其他藻酸盐、粉末状黄蓍胶、瓜尔胶、纤维素及其衍生物(例如乙基纤维素、醋酸纤维素、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠)、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纤维素、预胶凝淀粉、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、以及其混合物。
适用于本文公开的药物组合物和剂型的填充剂的实例包括但不限于滑石、碳酸钙(例如颗粒或粉末)、微晶纤维素、粉末状纤维素、葡萄糖结合剂(dextrates)、高岭土、甘露醇、硅酸、山梨糖醇、淀粉、预胶凝淀粉、以及其混合物。药物组合物中的粘合剂或填充剂通常以药物组合物或剂型中的从约50至约99重量百分比存在。
崩解剂被用于本文提供的组合物以提供当被暴露于含水环境时崩解的片剂。含有太多崩解剂的片剂可以在储存中崩解，然而含有太少崩解剂的那些可以不以期望的速率或不在期望的条件下崩解。因此，既不太多也不太少以致有害地改变活性成分的释放的足够量的崩解剂应该被用于形成固体口服剂型。使用的崩解剂的量基于制剂的类型而变化，并且对本领域的普通技术人员是容易辨别的。典型的药物组合物包含从约0.5至约15重量百分比的崩解剂、特别地从约1至约5重量百分比的崩解剂。可以被用于本文提供的药物组合物和剂型的崩解剂包括但不限于琼脂、藻酸、碳酸钙、微晶纤维素、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、波拉克林钾、淀粉乙醇酸钠、马铃薯淀粉或木薯淀粉、预胶凝淀粉、其他淀粉、粘土、其他藻胶(algin)、其他纤维素、树胶、以及其混合物。
可以被用于本文提供的药物组合物和剂型的润滑剂包括但不限于硬脂酸钙、硬脂酸镁、矿物油、轻矿物油、甘油、山梨糖醇、甘露醇、聚乙二醇、其他二醇、硬脂酸、月桂基硫酸钠、滑石、氢化植物油(例如花生油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油)、硬脂酸锌、油酸乙酯、月桂酸乙酯、琼脂、以及其混合物。如果在任何情况下使用，润滑剂通常以小于其被掺入的药物组合物或剂型的约1重量百分比的量被使用。
肠胃外剂型
用于肠胃外施用的组合物可以是乳液或无菌溶液。可以利用丙二醇、聚乙二醇、植物油特别地橄榄油或可注射的有机酯例如油酸乙酯作为溶剂或媒介物。这些组合物还可以含有佐剂特别地增湿剂、等渗剂、乳化剂、分散剂和稳定剂。灭菌可以以若干种方式进行，例如使用细菌学过滤器、通过辐射或通过加热。它们还可以以可以在使用时溶解于无菌水或任何其他可注射的无菌介质中的无菌固体组合物的形式被制备。
其他剂型
用于直肠施用的组合物是含有除了活性成分之外的赋形剂例如可可脂、半合成甘油酯或聚乙二醇的栓剂或直肠胶囊。
组合物还可以是气溶胶。为了以液体气溶胶形式使用，组合物可以是稳定的无菌溶液或在使用时溶解于非致热的无菌水、溶解于盐水或任何其他药学上可接受的媒介物中的固体组合物。为了以被意图被直接吸入的干气溶胶形式使用，活性成分被细分并且与水溶性的固体稀释剂或媒介物例如右旋糖酐、甘露醇或乳糖组合。
在一个实施方案中，本文公开的组合物是药物组合物或单个单位剂型。本文提供的药物组合物和单个单位剂型包含治疗有效量的一种或更多种治疗剂(例如式(I)的化合物或其他治疗剂)、以及通常一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂。在特定的实施方案中以及在此上下文中，术语“药学上可接受的”意指由联邦或州政府的管理机构批准的或在美国药典或用于动物以及更特别地用于人类的其他通常公认的药典中列出的。术语“载体”指的是治疗剂与其一起施用的稀释剂、佐剂(例如弗氏佐剂(完全和不完全))、赋形剂或媒介物。这样的药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物和合成来源的那些，诸如花生油、豆油、矿物油、芝麻油以及类似物。在某些实施方案中，当药物组合物被静脉内施用时，水是载体。盐水溶液和含水右旋糖和甘油溶液也可以被用作液体载体，特别地用于可注射溶液。适当的药物载体的实例在Remington'sPharmaceutical Sciences,第16、18和20版,Mack Publishing,Easton PA(1980,1990&2000)中描述。
典型的药物组合物和剂型包含一种或更多种赋形剂。适当的赋形剂对于药剂学领域技术人员是熟知的，并且适当的赋形剂的非限制性实例包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙二醇、水、乙醇、以及类似物。特定的赋形剂是否适合用于掺入到药物组合物或剂型中取决于本领域中熟知的多种因素，包括但不限于剂型将被施用到受试者的方式和剂型中特定的活性成分。如果需要，组合物或单个单位剂型，还可以包含少量的增湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。
本文提供的组合物可以没有乳糖并且可以包含本领域中熟知并且列于例如美国药典(USP)SP(XXI)/NF(XVI)中的赋形剂。通常，没有乳糖的组合物包含以药学上相容并且药学上可接受的量的活性成分、粘合剂/填充剂和润滑剂。示例性的没有乳糖的剂型包含活性成分、微晶纤维素、预胶凝淀粉和硬脂酸镁。
在实施方案中，本文提供包含活性成分的无水药物组合物和剂型，因为水可以促进某些化合物的降解。例如，添加水(例如5％)作为模拟长期储存以便确定诸如保存期限或制剂随时间的稳定性的特性的手段在药物领域中被广泛接受。参见例如Jens T.Carstensen,Drug Stability:Principles&Practice,第二版,Marcel Dekker,NY,NY,1995，第379-380页。实际上，水和热加速某些化合物的分解。因此，水对制剂的影响可以具有很大的重要性，因为在制剂的制造、处理、包装、储存、装运和使用期间通常会遇到水分和/或湿气。
本文提供的无水药物组合物和剂型可以使用无水或含有低水分的成分和低水分或低湿度条件来制备。在某些实施方案中，如果预期在制造、包装和/或储存期间与水分和/或湿气大体上接触，包含乳糖和至少一种活性成分(其包含伯胺或仲胺)的药物组合物和剂型是无水的。
应当制备并且保存无水药物组合物，使得保持其无水性质。因此，使用已知防止暴露于水的材料来包装无水组合物，使得它们可以被包含在适当的制剂试剂盒中。适当的包装的实例包括但不限于密闭地密封的箔、塑料、单位剂量容器(例如小瓶)、起泡包装和条状包装。
示例性的实施方案还涵盖包含减少活性成分将分解的速率的一种或更多种化合物的药物组合物和剂型。本文被称为“稳定剂”的这样的化合物包括但不限于抗氧化剂例如抗坏血酸、pH缓冲剂或盐缓冲剂。
药物组合物和单个单位剂型可以采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放制剂、以及类似剂型的形式。口服制剂可以包含标准载体例如制药级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。在一个实施方案中，这样的组合物和剂型将包含预防或治疗有效量的以纯化形式的预防剂或治疗剂连同适当的量的载体，以便提供用于适合施用到受试者的形式。制剂应当适合施用方式。在一个实施方案中，药物组合物或单个单位剂型是无菌的并且呈用于施用到受试者例如动物受试者(在一个实施方案中哺乳动物受试者比如人类受试者)的适当形式。
本文提供的药物组合物可以被配制为与其被意图的施用途径相容。
通常，本文提供的组合物的成分在密闭地密封的容器例如指示活性剂的数量的安瓿或小药囊中在单位剂型中例如作为干燥的冻干粉末或无水浓缩物被单独地供应或被混合在一起。在组合物通过输注施用的情况下，其可以用含有无菌制药级别的水或盐水的输注瓶来分配。在组合物通过注射施用的情况下，可以提供具有用于注射的无菌水或盐水的安瓿瓶，以便在施用之前可以将成分混合。
典型的剂型包含在早上作为单个一天一次的剂量被给予或在全天作为通过分剂量被给予的位于从约50mg每天至约1500mg每天的范围内的本文公开的化合物或其药学上可接受的盐。在某些实施方案中，组合物可以随着食物摄取。在某些实施方案中，剂型具有约50mg、约100mg、约200mg、约250mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约750mg或约1000mg的式(I)的化合物。剂型可以取决于另外的测试的结果而包含其他量的式(I)的化合物。
在某些实施方案中，可以使用静脉输注、可植入渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其他施用方式来施用药物。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Sefton,1987,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等人,1980,Surgery 88：507；Saudek等人,1989,N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，可以使用聚合物材料。在又另一个实施方案中，控制释放系统可以在由技术从业者确定的适合的部位放置在受试者中，即因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,Medical Applications of ControlledRelease,第2卷,115-138(1984))。其他的控制释放系统在Langer的综述(Langer,1990,Science 249：1527-1533)中讨论。活性成分可以被分散在被不溶于身体流体的外部聚合物膜包围的固体内部基体中，所述固体内部基体例如聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸丁酯、增塑或未增塑的聚氯乙烯、增塑的尼龙、增塑的聚对苯二甲酸乙二酯、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅氧烷、硅酮碳酸酯共聚物、亲水性聚合物例如丙烯酸和甲基丙烯酸的酯的水凝胶、胶原蛋白、交联的聚乙烯醇和交联的部分水解的聚乙酸乙烯酯，所述外部聚合物膜例如聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、硅酮橡胶、聚二甲基硅氧烷、氯丁橡胶、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯与乙酸乙烯酯、偏二氯乙烯、乙烯和丙烯的共聚物、离聚物聚对苯二甲酸乙二酯、丁基橡胶表氯醇橡胶、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三聚物、和乙烯/乙烯基氧基乙醇共聚物。然后活性成分在释放速率控制步骤中扩散经过外部聚合物膜。在这样的肠胃外组合物中，活性成分的百分比在很大程度上取决于其特定的性质以及受试者的需求。
延迟释放剂型
诸如式(I)的化合物的活性成分可以通过控制释放手段或通过本领域普通技术人员熟知的递送装置来施用。这样的剂型可以被用于提供一种或更多种活性成分的缓慢释放或控制释放，这使用例如羟丙基甲基纤维素、其他聚合物基体、凝胶、可渗透的膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体、微球、或其组合以提供以不同比例的期望的释放简况。本领域普通技术人员已知的适当的控制释放制剂(包括本文描述的那些)，可以被容易地选择用于与本文提供的活性成分一起使用。因此，本文提供适用于口服施用的单个单位剂型，比如但不限于适于控制释放的片剂、胶囊、软胶囊和囊片。
所有控制释放的药物产品具有改进药物治疗以超过通过它们的非控制的相应物实现的药物治疗的共同目的。理想地，在医学治疗中使用最佳设计的控制释放制剂的特征是利用最小量的药物物质在最小的时间量内治愈或控制状况。控制释放制剂的优点包括药物的延长的活性、减少的给药频率和增加的受试者依从性。此外，控制释放制剂可以被用于影响作用开始的时间或其他特性例如药物的血液水平，并且可以因此影响副(例如不良)作用的发生。
大部分控制释放制剂被设计以初始地释放迅速产生期望的治疗效果的某种量的药物(活性成分)，并且逐渐地且连续地释放其他量的药物以在延长的时间段期间维持此水平的治疗效果或预防效果。为了在体内维持此恒定的药物水平，药物必须以将代替被代谢并且从身体排泄的药物的量的速率从剂型释放。活性成分的控制释放可以通过多种条件刺激，包括但不限于pH、温度、酶、水或其他生理学条件或化合物。
肠胃外剂型
虽然可以使用固体无水口服剂型，本文提供肠胃外剂型。肠胃外剂型可以通过多种途径施用到受试者，包括但不限于皮下、静脉内(包括弹丸注射(bolus injection))、肌内和动脉内。因为它们的施用通常绕开受试者对污染物的自然防御，在一个实施方案中肠胃外剂型是无菌的或能够在施用到受试者之前被灭菌。肠胃外剂型的实例包括但不限于准备好用于注射的溶液、准备好被溶解或悬浮在用于注射的药学上可接受的媒介物中的干燥产品、准备好用于注射的悬浮液、以及乳液。
可以被使用以提供肠胃外剂型的适当的媒介物对本领域技术人员是熟知的。实例包括但不限于：注射用水USP；含水媒介物，例如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液、以及乳酸林格氏注射液；水混溶的媒介物，例如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；和不含水的媒介物，例如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
增加本文公开的活性成分中的一种或更多种的溶解度的化合物也可以被掺入到本文提供的肠胃外剂型中。
透皮的、局部的&粘膜的剂型
在一个实施方案中，可以使用固体无水口服剂型。在另一方面中，本文提供透皮的、局部的和粘膜的剂型。透皮的、局部的和粘膜的剂型包括但不限于眼用溶液、喷雾剂、气溶胶、霜剂、洗液、软膏、凝胶、溶液、乳液、悬浮液和本领域技术人员已知的其他形式。参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences,第16、18和20版,Mack Publishing,Easton PA(1980,1990&2000)和Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms,第4版，Lea&Febiger,Philadelphia(1985)。适用于治疗口腔内的粘膜组织的剂型可以被配制为漱口剂或口服凝胶。此外，透皮的剂型包括可以被应用到皮肤并且被穿用持续特定的时间段以允许期望的量的活性成分的穿透的“储库型”或“基体型”贴剂。
可以被用于提供透皮的、局部的和粘膜的剂型的适当的赋形剂(例如载体和稀释剂)和其他材料对药学领域的技术人员是熟知的并且取决于给定的药物组合物或剂型将被应用到的特定的组织。考虑到该事实，典型的赋形剂包括但不限于水、丙酮、乙醇、乙二醇、丙二醇、丁1,3二醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、矿物油、以及其混合物以形成无毒的并且药学上可接受的洗液、酊剂、霜剂、乳液、凝胶或软膏。如果需要，保湿霜或保湿剂还可以被添加到药物组合物和剂型中。这样的另外的成分的实例在本领域中是熟知的。参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16、18和20版,Mack Publishing,Easton PA(1980,1990&2000)。
还可以调整药物组合物或剂型的pH或药物组合物或剂型被应用到的组织的pH以改进一种或更多种活性成分的递送。相似地，可以调整溶剂载体的极性、其离子强度或张力(tonicity)以改进递送。化合物例如硬脂酸酯也可以被添加至药物组合物或剂型以有利地改变一种或更多种活性成分的亲水性或亲油性以便改进递送。在这点上，硬脂酸酯可以充当用于制剂的脂质媒介物、充当乳化剂或表面活性剂、并且充当递送增强剂或穿透增强剂。活性成分的不同的盐、水合物和溶剂化物可以被用于另外调整产生的组合物的性质。
治疗或预防受试者中的疾病的方法
式(I)的化合物可以作用于被称为亲环蛋白的酶并且抑制其催化活性。因此，在另一方面中，本文提供抑制亲环蛋白的方法，所述方法包括将本文公开的化合物或组合物例如式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物施用到需要其的受试者。亲环蛋白存在于广泛种类的不同的有机体中，包括人类、酵母、细菌、原生动物、后生动物、昆虫、植物或病毒。在感染性有机体的情况下，通过本文提供的化合物抑制亲环蛋白的催化活性常常导致对有机体的抑制效果。此外，在人类中，亲环蛋白的催化活性在多种不同的疾病情境中都起作用。此催化活性的抑制常常与治疗效果有关。因此，本文描述的某些化合物可以被用于治疗包括由例如HCV、HBV和HIV的病毒引起的那些的感染。可以使用本文描述的化合物治疗的其他病毒的实例包括但不限于流行性感冒(例如流行性感冒A H1N1、流行性感冒A H3N2或流行性感冒B)、呼吸道合胞病毒(RSV)、西尼罗病毒和登革热病毒。
治疗或预防受试者中的HCV、HBV和/或HIV感染的方法
丙型肝炎
肝炎是由肝脏炎症定义的疾病。肝炎的症状包括黄疸、厌食症(食欲不振)和萎靡(malaise)。当肝炎持续少于六个月时，其是急性的并且当其持续较长时其是慢性的。慢性肝炎可以导致肝硬化和肝癌，所述肝硬化和肝癌导致肝功能衰竭和对肝移植的需求。
被称为肝炎病毒的一组病毒引起世界范围内大部分的肝炎病例。丙型肝炎由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起。HCV被分为六种不同的基因型，即基因型1-6，且每种基因型类别中具有多种亚型。在美国基因型1是最常见的丙型肝炎基因型，并且是最难以治疗的。
乙型肝炎
世界范围内有多于350,000,000的人被HBV慢性感染。在宿主没有察觉到感染的两个至三个月的潜伏期(incubation period)之后，HBV感染可以导致急性肝炎和肝损伤，包括肝硬化、肝功能衰竭和肝细胞性肝癌。暴露于HBV的大部分新生儿和5岁以下的儿童以及成人人口中的5％发展为慢性感染。持续感染是对HBV的不充分的免疫应答的结果并且连续的HBV复制是免疫介导的肝损伤和疾病进展的关键驱动器。HBV可以引起暴发性肝炎，其中肝脏的各个部分被毁坏的迅速进展的经常致死的疾病形式。HBV的目前治疗是用干扰素或直接作用剂例如合成的核苷。存在对可以改进现有的治疗的限制的新治疗剂的需求，所述限制包括形成对核苷的抗性、中止治疗后HBV复制的回升、以及低的HBsAg清除率。
在细胞核中通过HBV共价地闭合的环状DNA(cccDNA)促进持续的DNA复制。cccDNA在HBV生命周期中具有基本的功能并且被需要用于产生病毒蛋白并且以产生用于HBV DNA聚合酶的RNA模板。有限的聚乙二醇化干扰素-α(IFN-α)治疗或用抑制HBV-DNA聚合酶的口服核苷类似物的长期治疗控制大部分患者中的HBV DNA复制并且改进肝炎症状。然而，存在对新颖的策略和治疗靶标的需求，因为目前的治疗不消除cccDNA并且已经证实在诱导HBsAg损失和HBsAg血清转化上的低效率。
治愈慢性乙型肝炎需要恢复抗HBV适应性免疫应答以消除肝细胞中的功能性cccDNA并且以产生对HBsAg的中和抗体。确定HBV特异性免疫控制或慢性感染的发展的病毒-宿主相互作用未曾被表征。持续性感染通过没有有效的CD4+和CD8+T细胞应答而突出。
若干HBV蛋白可以干扰对HBV的固有免疫应答和适应性免疫应答。它们阻止产生对Toll样受体(TLR)配体应答的I型干扰素，抑制干扰素的应答能力并且损害树突细胞(DC)的固有免疫功能和适应性免疫功能。HBV和HBsAg通过TLR9激活的浆细胞样DC(pDC)干扰产生IFN-α和抗病毒细胞因子，并且通过髓样DC抑制抗原呈递。
亲环蛋白特别地亲环蛋白A(CypA)与HBsAg缔合(Tian等人，2010，JVirol.；84：3373)。作为CypA抑制剂的本发明的化合物可以改善HBsAg的致耐受性效果并且恢复DC功能以增强固有和适应性抗HBV免疫应答。与其在HCV中的免疫调节作用相似，CypA抑制剂可以恢复感染的肝细胞中的干扰素应答能力。因此，与聚乙二醇化IFN-α或抗病毒核苷组合的本发明的化合物可以恢复对HBV感染的免疫控制。
亲环蛋白抑制剂
亲环蛋白是辅助在细胞内合成的其他蛋白的折叠和转运的酶的家族。蛋白折叠或错误折叠在大量的严重疾病例如病毒性疾病、中枢神经系统紊乱、癌症和心血管疾病的病理生理学中起中心作用。数十年来，亲环蛋白抑制剂例如环孢菌素A一直被用于在移植患者中预防器官排斥。
已经报告环孢菌素A和某些衍生物具有抗HCV活性，参见Watashi等人，2003，Hepatology 38：1282-1288；Nakagawa等人,2004,Biochem.Biophys.Res.Commun.313：42-47；以及Shimotohno和K.Watashi,2004,American Transplant Congress,摘要第648号(American Journal ofTransplantation 2004,第4卷,第8期增刊,第1-653页)。具有HCV活性的环孢菌素衍生物在国际专利公布第WO2005/021028号、第WO2006/039668号、第WO2006/038088号、第WO2007/041631号、第WO2008/069917号、第WO2010/002428号、第WO2010/076329号、第WO2010/088573号中描述。已经被评估用于治疗HCV的亲环蛋白抑制剂包括阿拉泊韦(Alisporivir)([8-(N-甲基-D-丙氨酸)、9-(N-乙基-L-缬氨酸)]环孢菌素，也被称为阿拉泊韦或Debio 025)、(melle-4)环孢菌素(也被称为NIM-811)和3-[(R)-2-(N,N-二甲基氨基)乙硫基-肌氨酸]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素(也被称为SCY-635)。
示例性的实施方案提供使用本文公开的化合物或组合物例如式(I)的化合物或包含式(I)的化合物的组合物用于治疗或预防需要其的受试者中的病毒感染的方法。方法通常包括向受试者施用有效量的化合物或组合物以治疗或预防病毒感染的步骤。在某些实施方案中，病毒感染是HCV感染、HBV或HIV感染、或HCV、HBV和HIV共感染。
在某些实施方案中，受试者可以是受HCV感染或处于受HCV感染的风险中的任何受试者。感染或感染的风险可以根据由本领域的技术从业者认为适当的任何技术来确定。在某些实施方案中，受试者是受HCV感染的人类。
HCV可以是本领域技术人员已知的任何HCV。存在本领域技术人员目前已知的HCV的至少六种基因型和至少50种亚型。HCV可以具有技术人员已知的任何一种基因型或亚型。在某些实施方案中，HCV具有尚未表征的基因型或亚型。在某些实施方案中，受试者受单种基因型的HCV感染。在某些实施方案中，受试者受多种亚型或多种基因型的HCV感染。
在某些实施方案中，方法或组合物在肝移植之后被施用到受试者。在美国，丙型肝炎是肝移植的主要原因，并且经历肝移植的许多受试者在移植之后仍然是HCV阳性。在一方面中，提供用本文公开的化合物或组合物治疗这样的复发的HCV受试者的方法。在其他实施方案中，提供在肝移植之前、期间或之后治疗受试者以防止复发HCV感染的方法。
在某些实施方案中，受试者可以是受HIV感染或处于受HIV感染的风险中的任何受试者。感染或感染的风险可以根据由本领域的技术从业者认为适当的任何技术来确定。在某些实施方案中，受试者是受HIV感染的人类。HIV可以是本领域技术人员已知的任何HIV。
在某些实施方案中，受试者从未接受用于HIV感染的治疗或预防。在另外的实施方案中，受试者先前已经接受用于HIV的治疗或预防。例如，在某些实施方案中，受试者对HIV治疗没有应答。在某些实施方案中，受试者可以是接受治疗但继续经受病毒感染或其一种或更多种症状的受试者。在某些实施方案中，受试者可以是接受治疗但未能实现持续的病毒学应答的受试者。
某些实施方案提供治疗对用于HIV的治疗耐受的受试者的方法。例如，在某些实施方案中，受试者可以是未能对用用于HIV的一种或更多种治疗剂的治疗应答的受试者。在某些实施方案中，受试者可以是对用用于HIV的一种或更多种治疗剂的治疗较差地应答的受试者。
在某些实施方案中，受试者具有HCV和HIV的共感染或处于HCV和HIV的共感染的风险中。例如，在美国，30％的HIV受试者与HCV共感染，并且证据指示受HIV感染的人具有迅速得多的他们的丙型肝炎感染过程。Maier和Wu,2002,World J Gastroenterol 8：577-57。本文提供的方法可以被用于治疗或预防这样的受试者中的HCV感染。相信的是在这些受试者中消除HCV将降低由于末期肝病的死亡率。实际上，在具有严重的ADIS定义的免疫缺陷的受试者中的进行性肝病的风险比没有严重的ADIS定义的免疫缺陷的受试者更高。参见例如Lesens等人,1999,J.Infect.Dis.179：1254-1258。有利地，本文提供的化合物已经被示出压制HIV受试者中的HIV。参见例如美国专利第5,977,067号、第5,994,299号、第5,948,884号和第6,583,265号以及国际申请公布第WO99/32512号和第WO99/67280号，这些专利的内容特此通过引用以其整体并入。因此，在某些实施方案中，本文提供治疗或预防需要其的受试者中的HIV感染和HCV感染的方法。
剂量和单位剂型
在人类治疗中，医生将根据预防性或治愈性治疗并根据年龄、体重、感染的阶段和对待被治疗的受试者特定的其他因素来确定他认为最合适的剂量学。通常，剂量是用于成人的从约50mg每天至约1500mg每天、用于成人的从约50mg每天至约500mg每天、或从约100mg每天至约750mg每天。
在另外的方面中，本文提供通过向需要其的受试者施用有效量的对HIV和/或HCV具有高的治疗指数的本文公开的化合物或其药学上可接受的盐来治疗或预防受试者中的HIV和/或HCV感染的方法。治疗指数可以根据本领域技术人员已知的任何方法例如在下文的实施例中描述的方法来测量。在某些实施方案中，治疗指数是化合物有毒的浓度与化合物有效抵抗HIV和/或HCV的浓度的比率。毒性可以通过技术人员已知的任何技术来测量，包括细胞毒性(例如IC50或IC90)和致死剂量(例如LD50或LD90)。同样地，有效浓度可以通过技术人员已知的任何技术来测量，包括有效浓度(例如EC50或EC90)和有效剂量(例如ED50或ED90)。在某些实施方案中，类似的测量以比率的形式对比(例如，IC50/EC50、IC90/EC90、LD50/ED50或LD90/ED90)。在某些实施方案中，治疗指数可以是高达2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、125.0、150.0或更高。
在预防或治疗紊乱或其一种或更多种症状中将是有效的化合物或组合物的量将随着疾病或状况的性质和严重度以及施用活性成分的途径而变化。频率和剂量也将根据对于每个受试者特定的因素，取决于施用的特定的治疗(例如治疗剂或预防剂)、紊乱、疾病或状况的严重度、施用途径以及受试者的年龄、体重、应答和既往病史而变化。
不同的治疗有效量对于不同的疾病和状况可以是可适用的，如本领域普通技术人员将容易知道的。相似地，足以预防、控制、治疗或改善这样的紊乱但不足以引起与本文提供的组合物有关的不良反应或足以减少与本文提供的组合物有关的不良反应的量也被上文描述的剂量的量和给药频率方案涵盖。此外，当受试者被施用多种剂量的本文公开的组合物时，所有剂量不必相同。例如，向受试者施用的剂量可以被增加以改进组合物的预防或治疗效果或其可以被减小以减少特定受试者经历的一种或更多种副作用。
在某些方面中，提供的单位剂量包含以适用于施用的形式的本文公开的化合物或其药学上可接受的盐。这样的形式在上文中详细讨论。在某些实施方案中，单位剂量包含约25mg至约1500mg活性成分。在特定的实施方案中，单位剂量包含约50mg、约100mg、约125mg、约250mg、约500mg、约750mg或约1500mg活性成分。这样的单位剂量可以根据本领域技术人员熟悉的技术制备。
组合治疗
在某些实施方案中，本文公开的化合物以与一种第二试剂的组合被施用。在另外的实施方案中，第二试剂以与两种第二试剂的组合被施用。在还另外的实施方案中第二试剂以与两种或更多种第二试剂的组合被施用。
适当的第二试剂包括小分子、HCV酶的口服生物可利用的抑制剂、攻击病毒RNA的基于核酸的试剂、可以调节宿主免疫应答的试剂。示例性的第二试剂包括：(i)目前批准的治疗(peg-干扰素加上利巴韦林)，(ii)HCV-酶靶向化合物，(iii)病毒基因组靶向治疗(例如RNA干扰或RNAi)和(iv)免疫调节剂，例如利巴韦林、干扰素(INF)和Toll受体激动剂。
在某些实施方案中，第二试剂是NS3-4A蛋白酶的调节剂。NS3-4A蛋白酶是异源二聚体蛋白酶，包含NS3蛋白的氨基末端结构域和小的NS4A辅因子。其活性对于产生病毒RNA复制复合体的组分是基本的。
有用的NS3-4A蛋白酶的实例包括特拉匹韦(telaprevir)(Vertex/Janssen/Mitsubishi)、波西普韦(boceprevir)(Merck&Co.)、司美匹韦(simeprevir)(Johnson&Johnson)、ABT-450(Abbott)、ACH-1625(Achillion)、asunaprevir(BMS)、BI-201335(Boehringer-Ingelheim)、GS-9451(Gilead)、丹诺普韦(danoprevir)(Roche)和MK-5172(Merck&Co)。
在某些实施方案中，第二试剂是HCV NS5B的调节剂，RNA依赖的RNA聚合酶(核苷聚合酶抑制剂)。核苷聚合酶抑制剂的实例包括GS-7977(Gilead,也被称为索非布韦(sofosbuvir))、INX-189(BMS)、mericitabine(Roche)、IDX-184(Idenix)和ALS-2200(Vertex)。在另外的实施方案中，第二试剂是NS5B的非核苷调节剂。NS5B的有用的非核苷调节剂的实例包括ABT-333(Abbott)、BMS-791325(BMS)、BI-217(Boehringer-Ingelheim)、tegobuvir(Gilead)、setrobuvir(Roche)和VX-222(Vertex)。
在另外的实施方案中，第二试剂是NS5A的非核苷调节剂。NS5B的有用的非核苷调节剂的实例包括ABT-267(Abbott)、达卡他韦(daclatasvir)(BMS)、GS-5885(Gilead)、ACH-3102(Achillion)和IDX-719(Idenix)。
在另外的实施方案中，第二试剂是调节受试者的免疫应答的试剂。例如，在某些实施方案中，第二试剂可以是用于HCV感染的目前被批准的治疗，例如干扰素(IFN)、聚乙二醇化IFN、IFN加上利巴韦林或聚乙二醇化IFN加上利巴韦林。在某些实施方案中，干扰素包括IFNα、IFNα2a和IFNα2b以及特别地聚乙二醇化IFNα2a或聚乙二醇化IFNα2b
在另外的实施方案中，第二试剂是Toll样受体(TLR)的调节剂。拒信，TLR是用于刺激固有抗病毒应答的靶标。适当的TLR包括但不限于TLR3、TLR7、TLR8和TLR9。拒信，toll样受体感测到存在入侵微生物，例如细菌、病毒和寄生虫。它们通过包括巨噬细胞、单核细胞、树突细胞和B细胞的免疫细胞表达。刺激或激活TLR可以通过诱导抗微生物基因和前炎症细胞因子和趋化因子引发急性炎症应答。
在某些实施方案中，提供施用以与对治疗或预防HIV感染有效的第二试剂的组合的式(I)的化合物的方法。第二试剂可以是对治疗HIV感染有效的本领域技术人员已知的任何试剂。第二试剂可以是目前已知的或以后开发的。
在某些实施方案中，提供施用以与对治疗或预防HBV感染有效的第二试剂的组合的式(I)的化合物的方法。第二试剂可以是对治疗HBV感染有效的本领域技术人员已知的任何试剂。第二试剂可以是目前已知的或以后开发的。第二HBV试剂的实例包括：干扰素例如干扰素α-2b和聚乙二醇化干扰素α-2a；HBV治疗疫苗；抗体治疗；或HBV直接抗病毒剂，其意指干扰乙型肝炎病毒(HBV)复制周期中的特定步骤的试剂。抑制HBV复制的直接抗病毒剂可以是例如目前批准用于治疗HBV的任何抗HBV试剂，即替比夫定、拉米夫定、恩曲他滨、恩替卡韦、阿德福韦、克拉夫定和替诺福韦。
在某些实施方案中，第二试剂可以与式(I)的化合物一起配制或包装。当然，根据本领域技术人员的判断，仅当这样的共制剂不应该干扰任一种试剂的活性或施用方法时，第二试剂将与式(I)的化合物一起配制。在某些实施方案中，式(I)的化合物和第二试剂被单独地配制。为了本领域技术从业者的方便，它们可以被包装在一起、或被单独地包装。
第二试剂的剂量将被用于组合治疗。在某些实施方案中，低于已经或目前被使用以预防或治疗感染的那些的剂量被用于组合治疗。第二试剂的推荐的剂量可以从技术人员的知识获得。对于被批准用于临床用途的那些第二试剂，推荐的剂量在例如Goodman&Gilman’s The PharmacologicalBasis Of Basis Of Therapeutics第9版,Hardman等人,编辑,Mc-Graw-Hill,New York(1996)；Physician’s Desk Reference(PDR)第57版,MedicalEconomics Co.,Inc.,Montvale,NJ(2003)中描述，其内容特此通过引用以其整体被并入。
在某些实施方案中，式(I)的化合物和第二试剂被周期地施用。周期治疗包括：施用第一治疗(例如第一预防剂或治疗剂)持续某个时间段，随后施用第二治疗(例如第二预防剂或治疗剂)持续某个时间段，随后施用第三治疗(例如第三预防剂或治疗剂)持续某个时间段等等，并且重复此顺序的施用(即周期)以便减少对试剂中的一种的抗性的形成，以避免或减少试剂中的一种的副作用和/或以改进治疗的效力。
在某些实施方案中，式(I)的化合物和第二试剂以使得式(I)的化合物可以与其他试剂一起起作用以提供比如果它们以其他方式被施用的增加的益处的顺序并且在使得式(I)的化合物可以与其他试剂一起起作用以提供比如果它们以其他方式被施用的增加的益处的时间间隔内被施用到患者，例如诸如人类的哺乳动物。例如，第二活性剂可以被同时施用或以任何次序在不同时间点被顺序地施用；然而，如果不被同时施用，它们应该在足够近的时间被施用以便提供期望的治疗效果或预防效果。在一个实施方案中，式(I)的化合物与第二活性剂在重叠的时间施加其作用。每种第二活性剂可以单独地、以任何合适的形式并且通过任何适当的途径被施用。在其他实施方案中，式(I)的化合物在施用第二活性剂之前、同时或之后被施用。
在某些实施方案中，式(I)的化合物和第二试剂被周期地施用到患者。周期治疗包括：施用第一试剂持续某个时间段，随后施用第二试剂和/或第三试剂持续某个时间段，并且重复此顺序的施用。周期治疗可以减少对治疗中的一种或更多种的抗性的形成，避免或减少治疗中的一种的副作用和/或改进治疗的效力。
在其他实施方案中，治疗的过程被同时施用到患者，即单独地但在使得式(I)的化合物可以与第二活性剂一起起作用的时间间隔内施用单独剂量的第二试剂。例如，可以将与可以每两周一次或每三周一次施用的其他组分组合的一种组分每周一次施用。换句话说，给药方案可以同时进行，即使治疗剂不被同时施用或不在同一天期间被施用。
第二试剂可以与式(I)的化合物附加地或协同地起作用。在一个实施方案中，式(I)的化合物与一种或更多种第二试剂在相同的药物组合物中同时施用。在另一个实施方案中，式(I)的化合物与一种或更多种第二试剂在单独的药物组合物中同时施用。在还另一个实施方案中，式(I)的化合物在施用第二试剂之前或之后施用。在一方面中，本文提供通过相同或不同的施用途径(例如口服和肠胃外)施用式(I)的化合物和第二试剂。在某些实施方案中，当式(I)的化合物与潜在地产生包括但不限于毒性的不良副作用的第二试剂同时施用时，第二活性剂可以有利地以落在引起不良副作用的阈值之下的剂量施用。
试剂盒
提供用于治疗HIV和/或HCV感染和/或HBV感染的方法的试剂盒。试剂盒可以包括本文公开的药物化合物或组合物和向保健提供者提供关于用于治疗或预防细菌感染的用法的信息的使用说明。使用说明可以以打印的形式或以电子介质例如软盘、CD或DVD的形式或以可以获得这些使用说明的网站地址的形式提供。单位剂量的本文公开的化合物或组合物可以包括使得当被施用到受试者时化合物或组合物的治疗或预防有效的血浆水平可以在受试者中被维持持续至少一天的剂量。在某些实施方案中，可以包括作为无菌含水药物组合物或干粉(例如冻干的)组合物的本文公开的化合物或组合物。在一个实施方案中，化合物是根据式(I)的。
在某些实施方案中，提供适当的包装。如本文所使用，“包装”指的是通常在系统中使用并且能够将适用于施用到受试者的本文公开的化合物或组合物保持在固定的极限内的固体基体或材料。这样的材料包括玻璃和塑料(例如聚乙烯、聚丙烯和聚碳酸酯)瓶、小瓶、纸、塑料和塑料-箔层压的封套、以及类似物。如果利用电子束灭菌技术，包装应当具有足够低的密度以允许对内容物的灭菌。
除了本文公开的化合物或组合物之外，试剂盒还可以包括用于与如在上文的方法中描述的化合物或组合物一起使用的第二试剂或包含第二试剂的组合物。
合成
以下的实施例例证使用例证中间体的合成的中间体1-15合成代表性的式(I)的化合物。这些实施例既不被意图限制本文公开的实施方案的范围，它们也不被理解为限制本文公开的实施方案的范围。将清楚的是，多个实施方案可以除了如本文特别描述的之外地实践。考虑到本文的教导，大量的修改和变型是可能的，并且因此在本发明的范围内。
用于产生式(I)的化合物的中间体的合成
中间体1
1-[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙烷羧酸甲酯的制备
将二碳酸二叔丁酯(671.4g，3.08摩尔)添加至被冷却到4℃以下的二氯甲烷(2700mL)中的1-氨基环丙烷羧酸甲酯盐酸盐(453.1g，2.99摩尔)。将氢氧化钠(2M，1700mL)以将温度维持在7℃以下的这样的速率添加。反应被保持持续18小时并且氯化钠(200g)被添加。然后将反应保持持续另外的18小时。在保持时期之后，将相分离。将水相用二氯甲烷(500mL)萃取。将合并的有机萃取物用无水硫酸钠干燥，过滤并且浓缩。然后将浓缩物在庚烷(600mL)中制浆。将固体过滤并且用庚烷洗涤。将滤液浓缩以提供284g，然后这被过滤并且用庚烷洗涤。合并的固体在真空烘箱中干燥以提供中间体1。
中间体2
1-[(叔丁氧基羰基)甲基氨基]环丙烷羧酸甲酯的制备
将双(三甲基甲硅烷基)氨基钠(1M，3250mL)溶液添加至1-[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙烷羧酸甲酯(中间体1)(536.4g，2.49摩尔)在无水四氢呋喃(1500mL)中的溶液，使温度保持在5℃以下。将反应保持1小时并且然后将反应混合物冷却至-10℃以下。将碘甲烷(530g，3.73摩尔)以将温度维持在-10℃以下的这样的速率添加。反应被允许加温至室温并且被保持过夜。添加氯化铵溶液(15％，1400mL)并且将混合物搅动2小时。停止搅动并且允许分离相。然后将有机相浓缩。将二氯甲烷(2500mL)添加至残留物并且将有机层用20％氯化铵溶液(1000mL)洗涤30分钟。将相分离，并且将有机相用20％氯化铵(1500mL)萃取1小时。将相分离，并且将二氯甲烷用20％氯化铵(1500mL)萃取18小时。然后将相分离，并且将有机相浓缩。将甲苯(150mL)添加至残留物并且将溶液浓缩以提供中间体2。
中间体3
1-[(羟甲基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯的制备
将双(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠(65％，931g，2.99摩尔)以将温度维持在40℃以下的这样的速率添加至1-[(叔丁氧基羰基)甲基氨基]环丙烷羧酸甲酯(中间体2)(602g，2.99摩尔)在甲苯(1500mL)中的搅拌的溶液，并且保持过夜。将反应冷却至4℃并且在小于15℃下添加2N NaOH(1250mL)。停止搅拌并且将相分离。将有机相经过无水硫酸钠干燥，过滤并且浓缩以提供中间体3。
中间体4
1-{[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙基}甲磺酸甲酯的制备
将甲磺酰氯(125.9g,1.10摩尔)以将温度维持在10℃以下的这样的速率添加至1-[(羟基甲基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(中间体3)(200.9g，0.999摩尔)在二氯甲烷(1000mL)和三乙胺(111.1g,1.10摩尔)中的搅拌的溶液。在完成添加后将反应保持30分钟并且添加水(700mL)并且搅拌30分钟。将相分离并且将有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并且浓缩以提供中间体4。
中间体5
1-[(溴甲基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯的制备
将溴化锂(694g，7.99摩尔)递增地添加至1-{[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙基}甲磺酸甲酯(中间体4)(300.5g，0.999摩尔)在丙酮(3000mL)中的搅拌的溶液，使温度保持小于30℃。将反应在室温下保持18小时。将反应混合物浓缩。添加二氯甲烷(2500mL)，随后添加水以使得水相为上层。将相分离并且将有机层用水(700mL)洗涤。将有机层用无水硫酸钠洗涤，过滤并且浓缩以提供中间体5。
中间体6
S-({1-[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙基}甲基)4-甲基苯硫代磺酸酯的制备
将乙腈(2500mL)中的对甲苯硫代磺酸钾盐(333.5g,1.47摩尔)、[1-(溴甲基)环丙基]氨基甲酸叔丁酯(中间体5)(259.3g，0.982摩尔)和18-冠-6(25.9g，0.0981摩尔)在氮气下加热至77℃持续15小时。在冷却后，将反应混合物过滤并且浓缩。将浓缩物溶解在二氯甲烷(1500mL)中并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液(500mL)萃取。将有机层经过无水硫酸钠干燥，过滤并且浓缩以提供中间体6。
中间体7
S-{[1-(甲基氨基)环丙基]甲基}4-甲基苯硫代磺酸酯盐酸盐的制备
将二氧六环(4N，730mL)中的盐酸添加至二氧六环(400mL)中的S-({1-[(叔丁氧基羰基)氨基]环丙基}甲基)4-甲基苯硫代磺酸酯(中间体6)(392.2g，0.982摩尔)，使温度保持在31℃以下。在3.5小时后，在1小时内缓慢添加甲基叔丁基醚(MTBE)(1000mL)并且将固体过滤并且用MTBE洗涤。将固体在真空烘箱中在50℃下干燥以提供中间体7。
中间体8
S-{[1-(二甲基氨基)环丙基]甲基}4-甲基苯硫代磺酸酯的制备
将三乙胺(131g，1.30摩尔)添加至二氯甲烷(2500mL)中的S-{[1-(甲基氨基)环丙基]甲基}4-甲基苯硫代磺酸酯盐酸盐(中间体7)(252.3g，0.866摩尔)，使温度保持在5℃以下。然后在5分钟内添加含水甲醛(37％，105.5g，1.30摩尔)。在保持30分钟后，递增地添加三乙酰氧基硼氢化钠(315.6g,1.50摩尔)，使温度保持<6℃。在1.5小时之后，添加饱和碳酸氢钠(1250mL)并且搅动10分钟。将相分离。将有机层经过无水硫酸钠干燥，过滤并且浓缩以提供中间体8，1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.55(m,2H)，0.72(m,2H)，2.26(s,6H)，2.46(s,3H)，3.18(s,2H)，7.34(d,2H J＝8.2Hz)，7.79(d,2H J＝8.2Hz)。
中间体9
1-氨基环丙烷羧酸甲酯盐酸盐的制备
将氯化亚砜(887g,7.46摩尔)以将温度保持在32℃以下的这样的速率添加至1-氨基环丙烷羧酸在甲醇(5000mL)中的搅拌的浆体。冰浴被用于冷却反应。在添加完成后，将反应混合物加热至回流持续5小时。在冷却后，将溶剂移除并且将产生的固体在MTBE(1000mL)中制浆。将浆体过滤，用MTBE洗涤并且干燥以给出以提供作为白色固体的中间体9。
中间体10
1-异丙基氨基环丙烷羧酸甲酯的制备
将三乙胺(241g，2.38摩尔)在氮气下添加至1-氨基环丙烷羧酸甲酯盐酸盐(中间体10)(240.7g，1.59摩尔)和丙酮(120g,2.07摩尔)在二氯甲烷(3500mL)中的搅拌的浆体，使温度保持在7℃以下。将反应保持30分钟并且添加三乙酰氧基硼氢化钠(438g,2.07摩尔)，使温度保持在10-15℃的范围内。在完成添加之后将反应在15℃下保持持续3小时。在30分钟内添加饱和的含水碳酸氢钠(750mL)并且搅动1小时。然后将相分离并且将有机层用饱和碳酸氢钠溶液(500mL)萃取。在相分离后，将有机层用无水硫酸钠干燥，过滤并且浓缩以提供中间体10。
中间体11
1-(N-异丙基-N-甲基氨基)环丙烷羧酸甲酯的制备
将二氯甲烷(3000mL)中的1-异丙基氨基环丙烷羧酸甲酯(中间体10)(249g,1.58摩尔)与含水甲醛(37％,167g,2.06摩尔)和乙酸(6mL)在室温下在氮气下搅拌1.5小时。在冷却至9℃以下后，在1.5小时内递增地添加三乙酰氧基硼氢化钠(437g,2.06摩尔)，使温度保持在12℃以下。在完成添加之后将反应保持2小时。在保持时期之后，将反应用饱和碳酸氢钠(1000mL)猝灭并且将相分离。然后将有机层用饱和碳酸氢钠(750mL)萃取。将相分离并且将有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并且浓缩以提供作为白色固体的中间体11(85.9％)。
中间体12
1-(N-异丙基-N-甲基氨基)环丙烷甲醇盐酸盐的制备
将双(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠(506g,1.64摩尔)逐滴添加到1-(异丙基-甲基氨基)环丙烷羧酸甲酯(中间体11)(232g，1.36摩尔)在甲苯(2500mL)中的溶液，使温度保持在27℃以下。将反应在环境温度下保持18小时。冷却至5℃以下并且添加2M NaOH(750mL)，使温度保持在10℃以下。将相分离并且将有机相用无水硫酸钠干燥并且过滤。将异丙醇(300mL)中的5-6N HCl添加至滤液并且将溶剂浓缩至一半体积。将固体过滤并且用MTBE(500mL)洗涤。将产物在真空烘箱中干燥以提供中间体12。
中间体13
1-氯甲基-1-(N-异丙基-N-甲基氨基)环丙烷盐酸盐的制备
将氯化亚砜(183g,1.54摩尔)在50℃下在1.5小时内逐滴添加至1-(N-异丙基-N-甲基氨基)环丙烷甲醇(中间体12)(229.5g,1.28摩尔)在甲苯(2400mL)中的搅拌的浆体中。在完成添加之后将反应保持1小时。然后允许反应冷却至室温。然后将该批次浓缩至约900g。然后将固体过滤并且用MTBE(500mL)洗涤。将产物在真空烘箱中在50℃下干燥以提供中间体13。
中间体14
S-({1-[甲基(丙-2-基)氨基]环丙基}甲基)4-甲基苯硫代磺酸酯的制备
将碳酸钾(79.89g,0.578摩尔)添加至1-氯甲基-1-(异丙基甲基氨基)环丙烷盐酸盐(中间体13)(110.94g,0.560摩尔)在乙腈(1100mL)中的搅拌的浆体中，随后添加对甲苯硫代磺酸钾盐(139.22g,0.623摩尔)。将反应混合物在环境温度下搅拌过夜。将产生的浆体通过Celite过滤并且浓缩。将浓缩物溶解在二氯甲烷(1000mL)中并且用饱和碳酸氢钠溶液(200mL)萃取两次。将有机层经过无水硫酸钠干燥并且浓缩以提供中间体14，1HNMR(400MHz,CDCl3)δ0.56(m,2H),0.75(m,2H)，0.97(d,6H J＝6.4Hz)，2.25(s,3H)，2.46(s,3H)，2.82(m,1H)，3.19(s,2H)，7.34(d,2H J＝8.2Hz)，7.79(d,2H J＝8.2Hz)。
中间体15
S-{[1-(乙基氨基)环丙基]甲基}4-甲基苯硫代磺酸酯盐酸盐的制备
按照与制备中间体7相同的合成顺序制备中间体15。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ1.04-1.07(m,2H),1.17-1.21(m,2H),1.31(t,J＝7.3Hz,3H),2.48(s,3H),3.19(q,J＝7.3Hz,2H),3.50(s,2H),7.48-7.50(m,2H),7.86-7.88(m,2H)。
中间体16
S-{[1-(二甲基氨基)环丁基]甲基}4-甲基苯硫代磺酸酯按照与用于中间体8的描述的相同的合成顺序制备。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ1.60-1.70(m,4H),2.11-2.21(m,2H),2.14(s,6H),2.46(s,3H),3.35(s,2H),7.34-7.36(m,2H),7.83-7.85(m,2H)。
中间体17
S-{[1-(二乙基氨基)环丙基]甲基}4-甲基苯硫代磺酸酯按照与用于中间体8的描述的相同的合成顺序制备。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ0.49-0.52(m,2H),0.68-0.71(m,2H),0.99(t,J＝7.2Hz,6H),2.46(s,3H),2.54(q,J＝7.2Hz,4H),3.22(s,2H),7.34-7.36(m,2H),7.82-7.84(m,2H)。
[4'-羟基-N-甲基亮氨酸]4环孢菌素A根据在欧洲专利第484,281号中描述的方法制备；并且[4'-羟基-N-甲基亮氨酸]4-(N-苄基)-Val5-环孢菌素A根据在WO2009/148615中公开的方法制备，其公开内容特别地通过引用以其整体并入。后一种化合物在Papageorgiou等人，Bioorganic&MedicinalChemistry(1997),第5卷(1),第187-192页中描述。
化合物A的制备
将12L加套的圆柱形反应器用无水四氢呋喃(THF)(2.2L)和二异丙基胺(DIPA；142mL,1013mmol,13当量)装载并且搅拌30分钟。将水含量经由Karl-Fischer库仑滴定法测量(174ppm)并且冷却至-40℃。将n-BuLi(405mL,1013mmol,13当量)在10分钟内添加至此溶液(在添加期间最大温度是-30℃)。将此溶液在-40℃下搅拌30分钟，此时在15分钟内添加[4'-羟基-N-甲基亮氨酸]4环孢菌素A(93.6g,76.8mmol)的溶液(在添加期间最大温度是-30℃)。将此混合物在-40℃下保持2小时，此时在10分钟内添加THF中的S-{[1-(二甲基氨基)环丙基]甲基}4-甲基苯硫代磺酸酯(中间体8，145g,506mmol,6.6当量)(在添加期间最大温度是-32℃)并且在1小时内将温度升高至-25℃。将混合物在-25℃下保持1小时并且在1小时内将温度升高至0℃并且用冰乙酸(125mL,28当量)猝灭并且在室温下搅拌过夜。然后将水(1.0L)添加至混合物并且将混合物搅拌30分钟并且将相分开。将有机(上)层浓缩至最小体积以给出在MTBE(1.0L)和水(1.0L)中重构的粘性油。将混合物搅拌30分钟并且将相分开。将水(0.5L)添加至有机(上)层，随后添加氨水(0.5L的30％水溶液)，使得最终pH在11-12之间。将此混合物搅拌14小时，此时没有检测(HPLC)到亲电试剂。再次将相分开并且将有机层汽提至最小体积并且将此残留物进行色谱分析并且用流动相A＝庚烷，B＝5％MeOH/EtOAc：(0-100％B,～50L总的MPA+MPB被使用)洗脱以在移除溶剂后给出106g材料。将材料溶解在1L MTBE和1L水中并且搅拌30分钟，将水层丢弃并且将1.0L水添加至有机层并且用1N HCl将pH调节至2.5±0.2。将混合物搅拌15分钟，允许相在15分钟期间分开，并且将有机层丢弃并且将水层用MTBE洗涤四次以上。在此时间期间，可能有必要用多达2％v/v饱和盐水溶液破坏乳液。然后将MTBE(1.0L)添加至水层并且用氨水将pH调节至9-10。在搅拌15分钟后，将有机层浓缩以提供粗制材料(81g)。通过硅胶色谱法(甲醇/二氯甲烷；1.5kg二氧化硅盒)实现最终纯化以提供作为固体的化合物A，1H NMR(400MHz,CDCl3)0.5-0.6(m,2H),0.6-1.1(m,39H),1.1-1.8(m,23H),1.35(d,J＝7.3Hz,3H),1.9-2.2(m,4H),2.3-2.5(m,3H),2.35(s,6H),2.70(s,6H),2.74(d,J＝12.9Hz,1H),2.83(d,J＝12.9Hz,1H),3.12(s,3H),3.17(s,3H),3.25(s,3H),3.44(s,3H),3.50(s,3H),3.63(d,J＝6Hz,1H),3.75(q,J＝6.4Hz,1H),4.54(五重峰,J＝7.4Hz,1H),4.6-4.7(m,1H),4.84(五重峰,J＝7.0Hz,1H),4.9-5.0(m,1H),5.0-5.1(m,1H),5.13(d,J＝10.9Hz,1H),5.2-5.6(m,5H),5.70(dd,J＝10.7,4.2Hz,1H),5.81(s,1H),7.15(d,J＝8.0Hz,1H),7.48(d,J＝8.3Hz,1H),7.64(d,J＝7.7Hz,1H),7.93(d,J＝9.7Hz,1H)。
化合物B的制备
将12L加套的圆柱形反应器用无水THF(2.2L)和二异丙基丙胺(DIPA；140mL,1000mmol,13当量)装载并且搅拌30分钟。将水含量经由Karl-Fischer库仑滴定法测量(174ppm)并且冷却至-40℃。将n-BuLi(401mL,1000mmol,13当量)在10分钟内添加至此溶液(在添加期间最大温度是-30℃)。将此溶液在-40℃下搅拌30分钟，此时在15分钟内添加[4'-羟基-N-甲基亮氨酸]4环孢菌素A(93.6g,76.8mmol)的溶液(在添加期间最大温度是-30℃)。将此混合物在-40℃下保持2小时，此时在10分钟内添加158mLTHF中的S-({1-[甲基(丙-2-基)氨基]环丙基}甲基)4-甲基苯硫代磺酸酯(中间体14，158g,504mmol,6.6当量)并且在1小时内将温度升高至-25℃。将混合物在-25℃下保持1小时并且在1小时内将温度升高至0℃并且用冰乙酸(125mL,28当量)猝灭并且在室温下搅拌过夜。然后将水(1.0L)添加至混合物并且将混合物搅拌30分钟并且将相分开。将有机(上)层汽提至最小体积以给出在MTBE(1.0L)和水(1.0L)中重构的粘性油，并且将混合物搅拌30分钟并且将相分开并且将水(0.5L)添加至有机层(上)，随后添加氨水(0.5L的30％水溶液)，使得最终pH在11-12之间。将此溶液搅拌14小时，并且将水层丢弃。然后添加水(0.5L)和氨水(0.5L)，使得pH是>12。将此混合物搅拌持续另外的6小时，此时没有检测(HPLC)到亲电试剂。再次将相分开并且将有机层浓缩至最小体积。粗制材料通过连续的硅胶色谱法(对于第一柱用乙酸乙酯/庚烷洗脱并且然后对于第二柱用甲醇/二氯甲烷洗脱)进一步纯化以提供作为固体的化合物B；1H NMR(500MHz,CDCl3)0.5-1.1(m,47H),1.2-1.8(m,23H),1.34(d,J＝7.3Hz,3H),2.0-2.2(m,5H),2.3-2.5(m,3H),2.34(m,3H),2.69(s,6H),2.76(d,J＝12.8Hz,1H),2.82(d,J＝15.9Hz,1H),3.11(s,3H),3.16(s,3H),3.24(s,3H),3.42(s,3H),3.49(s,3H),3.6(m,1H),3.74(q,J＝6.2Hz,1H),4.53(五重峰,J＝7.4Hz,1H),4.6-4.7(m,1H),4.83(五重峰,J＝7.3Hz,1H),4.9-5.0(m,1H),5.0-5.1(m,2H),5.12(d,J＝10.8Hz,1H),5.25-5.45(m,3H),5.47(d,J＝6.2Hz,1H),5.6-5.7(m,1H),5.75(s,1H),7.14(d,J＝8.0Hz,1H),7.47(d,J＝8.4Hz,1H),7.63(d,J＝7.6Hz,1H),7.91(d,J＝9.5Hz,1H)。
通过进行用于合成化合物A或化合物B的根据上文描述的方法，还制备以下的化合物：
[(R)-[(1-(N,N-二甲基氨基)环丁基)甲硫基-肌氨酸]3[4'-羟基-N-甲基亮氨酸]4-环孢菌素A(化合物C)，1H NMR(400MHz,CHCl3-d)δppm 0.70(d,2H)0.93(m,30H)1.09(d,J＝6.49Hz,2H)1.30(m,13H)1.48(m,2H)1.76(m,12H)2.09(m,4H)2.39(m,15H)2.70(d,J＝1.46Hz,4H)2.94(s,2H)3.03(m,2H)3.13(s,2H)3.18(s,2H)3.25(s,2H)3.49(d,J＝10.35Hz,4H)3.76(m,J＝10.18,2.31,1.20,1.20Hz,1H)4.54(m,1H)4.64(dd,J＝9.40,8.61Hz,1H)4.84(m,1H)4.98(m,1H),5.07(m,1H)5.13(d,J＝10.93Hz,1H)5.35(m,1H)5.43(m,1H)5.51(d,J＝5.91Hz,1H)5.70(m,1H)5.97(s,1H)7.15(d,J＝8.05Hz,1H)7.53(d,J＝8.35Hz,1H)7.62(d,J＝7.76Hz,1H)7.95(d,J＝9.52Hz,1H)8.28(m,1H)。
[(R)-[(1-(N,N-二乙基氨基)环丙基)甲硫基-肌氨酸]3[4'-羟基-N-甲基亮氨酸]4-环孢菌素A(化合物D)，1H NMR(400MHz,CHCl3-d)δppm 0.60(d,2H)0.70(d,J＝6.00Hz,3H)0.90(m,40H)1.27(m,15H)1.59(m,14H)2.08(m,4H)2.45(m,3H)2.70(d,J＝1.76Hz,6H)2.79(d,J＝7.56Hz,1H)3.02(m,1H)3.12(s,3H)3.17(s,3H)3.25(s,3H)3.44(s,3H)3.49(m,3H)3.60(m,1H)3.75(m,J＝17.25,0.88,0.63,0.63Hz,1H)4.55(五重峰,J＝7.38Hz,1H)4.64(dd,J＝9.22,8.88Hz,1H)4.84(qd,J＝7.27,7.03Hz,0H)4.98(dd,J＝9.00,6.95Hz,1H)5.07(t,J＝7.42Hz,1H)5.13(d,J＝10.93Hz,1H)5.35(m,3H)5.50(d,J＝6.05Hz,1H)5.70(dd,J＝10.81,4.17Hz,1H)5.74(s,1H)7.15(d,J＝7.96Hz,1H)7.49(d,J＝8.15Hz,1H)7.62(d,J＝7.47Hz,1H)7.94(d,J＝9.71Hz,1H)。
[(R)-[(1-(N-乙基-N-甲基氨基)环丙基)甲硫基-肌氨酸]3[4'-羟基-N-甲基亮氨酸]4-环孢菌素A(化合物E)，1H NMR(400MHz,CHCl3-d)δppm 0.60(m,1H)0.70(dddd,J＝19.52,1.02,0.84,0.72Hz,1H)0.77(m,2H)0.92(m,29H)1.10(m,3H)1.25(d,J＝17.86Hz,6H)1.36(m,3H)1.62(m,22H)2.08(m,4H)2.34(d,J＝11.76Hz,0H)2.45(m,3H)2.62(m,2H)2.70(s,3H)2.81(m,2H)3.01(m,1H)3.11(m,3H)3.18(m,2H)3.27(m,2H)3.44(m,2H)3.53(d,J＝1.22Hz,0H)3.62(m,1H)3.76(m,1H)4.51(m,1H)4.64(m,1H)4.84(m,1H)5.06(m,3H)5.35(m,3H)5.50(m,1H)5.70(m,1H)5.78(m,J＝13.58,1.79,1.79,1.05Hz,0H)7.15(m,1H)7.49(m,1H)7.65(m,1H)7.94(m,1H)。
[(R)-[(1-(N,N-二甲基氨基)环丁基]甲硫基-肌氨酸]3-(N-苄基)-Val5-环孢菌素A(化合物F)，1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 0.40(s,2H)0.83(m,35H)1.07(m,2H)1.15(m,3H)1.31(m,4H)1.50(m,1H)1.62(m,8H)2.09(s,5H)2.80(m,5H)2.88(s,2H)2.95(s,2H)3.07(s,2H)3.19(s,2H)3.33(m,16H)4.12(m,1H)4.29(m,1H)4.59(m,1H)4.66(d,J＝4.34Hz,1H)4.72(m,1H)4.91(d,J＝10.54Hz,1H)5.02(m,1H)5.14(dddd,J＝9.08,1.68,0.76,0.54Hz,2H)5.26(dd,J＝3.95,0.78Hz,1H)5.39(m,3H)6.34(d,J＝0.20Hz,1H)6.55(dt,J＝7.77,0.56Hz,1H)7.02(m,1H)7.27(m,3H)8.17(dd,J＝7.69,1.24Hz,1H)8.39(ddd,J＝1.04,0.68,0.57Hz,1H)8.47(m,1H)。
[(R)-[(1-(N-甲基氨基)环丙基]甲硫基-肌氨酸]3[4'-羟基-N-甲基亮氨酸]4-环孢菌素A(化合物G)，1H NMR(400MHz,CHCl3-d)δppm 0.45-0.55(m,2H),0.6-1.1(m,39H),1.1-1.8(m,23H),1.35(d,J＝7.3Hz,3H),1.9-2.2(m,4H),2.3-2.5(m,3H),2.38(s,3H),2.70(s,6H),3.13(s,3H),3.19(s,3H),3.25(s,3H),3.46(s,3H),3.50(s,3H),3.56(d,J＝6Hz,1H),3.75(m,1H),4.54(五重峰,J＝7.4Hz,1H),4.63-4.68(m,1H),4.84(五重峰,J＝7.0Hz,1H),4.9-5.0(m,1H),5.0-5.1(m,1H),5.13(d,J＝10.9Hz,1H),5.2-5.6(m,5H),5.70(dd,J＝10.7,4.2Hz,1H),6.00(s,1H),7.15(d,J＝8.0Hz,1H),7.45(d,J＝8.3Hz,1H),7.64(d,J＝7.7Hz,1H),7.97(d,J＝9.7Hz,1H)。
[(R)-[(1-(N-乙基氨基)环丙基]甲硫基-肌氨酸]3-[4'-羟基-N-甲基亮氨酸]4-环孢菌素A(化合物H)，1H NMR(400MHz,CHCl3-d)δppm 0.5-0.6(m,2H),0.6-1.1(m,42H),1.1-1.8(m,23H),1.35(d,J＝7.3Hz,3H),1.9-2.2(m,4H),2.37-2.48(m,3H),2.61-2.65(m,2H),2.70(s,6H),3.13(s,3H),3.20(s,3H),3.25(s,3H),3.46(s,3H),3.50(s,3H),3.57-3.59(m,1H),3.75(q,J＝6.4Hz,1H),4.54(五重峰,J＝7.4Hz,1H),4.62-4.65(m,1H),4.84(五重峰,J＝7.0Hz,1H),4.96-5.00(m,1H),5.04-5.09(m,1H),5.13(d,J＝10.9Hz,1H),5.28-5.61(m,5H),5.70(dd,J＝10.7,4.2Hz,1H),6.09(s,1H),7.15(d,J＝8.0Hz,1H),7.45(d,J＝8.3Hz,1H),7.63(d,J＝7.7Hz,1H),7.96(d,J＝9.7Hz,1H)。
HCV活性
使用从由Kriger等人,2001,Journal of Virology 75：4614–4624,Pietschmann等人,2002,Journal of Virology 76：4008-4021描述的那些修改的方法并且使用如在美国专利第6,630,343号中描述的HCV RNA构建对式(I)的化合物测试抗HCV活性。在人类肝癌细胞、含有稳定的荧光素酶(LUC)报告基因的HCV RNA复制子中检查化合物。HCV RNA复制子ET含有驱动产生新霉素磷酸转移酶(NeoR)融合蛋白的HCV的5’端(具有HCV内部核糖体进入位点(IRES)和HCV核心蛋白的最初几个氨基酸)。报告的荧光素酶被包含到1b复制子中。EMCV IRES元件控制HCV结构蛋白NS3-NS5的翻译。NS3蛋白裂解HCV多聚蛋白以释放HCV复制需要的成熟的NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白。HCV的真正的(authentic)3’NTR处于复制子的3’端。LUC报告基因的活性与HCV复制水平成正比，并且阳性对照的抗病毒化合物使用LUC端点产生可再现的抗病毒应答。
将化合物以六种半对数浓度溶解在DMSO中。将HCV复制子细胞移出至用于分析细胞数目(细胞毒性)或抗病毒活性专用的96孔板中，并且在第二天将化合物添加至适当的孔中。之后，当细胞仍然是亚融合时，将细胞处理72小时。抗病毒活性被表示为EC50和EC90，即分别将病毒复制减少了50％和90％的化合物的有效浓度。化合物的EC50和EC90值源自被评估为HCV RNA复制子来源的LUC活性的HCV RNA水平。细胞毒性被表示为IC50和IC90，即分别将细胞生存能力抑制了50％和90％的化合物的浓度。使用作为细胞数目和细胞毒性的指示的比色测定来计算化合物的IC50和IC90值。在人类细胞系中LUC报告基因的活性与HCV RNA的水平成正比。使用干扰素-α-2b作为对照在平行实验中验证HCV复制子测定。化合物在1a复制子(qRT_PCR/TaqMan)、1b复制子(LUC)和2a复制子(qRT-PCR/TaqMan)中测试。获得以下的平均EC50值(以nM)：
化合物 基因型1b
A 60
B 60
C 160
D 70
E 20
F 520
G 60
H 40
此外，将化合物A在其他基因型中测试抗HCV活性，具有抗基因型1a的70nM的EC50值和抗基因型2a的60nM的EC50值。
HBV活性
还在大量的用表达HBV的质粒瞬时转染的建立的肝细胞系中或诸如AD38细胞的稳定转染的细胞系中对式(I)的化合物测试抗人类乙型肝炎病毒(HBV)的抗病毒活性。在瞬时测定中，将HepG或HuH7细胞用1.1X单位长度HBV基因组转染(Durantel等人,2004,Hepatology 40：855-864)，然而对于AD38细胞，HBV表达经由四环素可诱导的启动子被诱导。然后将细胞在多种浓度的测试化合物的存在下温育持续4或7天。在温育结束时，将胞内HBV DNA分离并且通过实时PCR或通过DNA印记分析(SouthernBlot analysis)定量。抗病毒活性也可以通过分析从细胞分泌到细胞培养介质中的HBV颗粒(通过分析颗粒HBV DNA或通过评估在细胞上清液中存在的HBeAg)被评估。抗病毒活性被表示为EC50和EC90，即分别将病毒复制减少了50％和90％的化合物的有效浓度。抗HBV活性也可以在被HBV感染之后的HepaRG细胞系中测试。在以多种浓度的测试化合物温育感染的细胞(包括在HBV感染之前处理HepaRG细胞)后，抗病毒活性通过由实时PCR定量细胞内或细胞外的HBV DNA来确定。
在此测定中，化合物A具有>20μM的EC50并且化合物B具有>20μM的EC50。
HIV活性
还使用感染HIV毒株HIV-1IIIB的人类T-类淋巴母细胞系CEM-SS，对式(I)的化合物测试对人类免疫缺陷病毒-1(HIV)的抗逆转录病毒活性(Weislow等人,1989,J.Natl.Cancer Inst.81：577-586)。在此MTS细胞保护测定中，每个实验包括细胞对照孔(仅细胞)、病毒对照孔(细胞加上病毒)、药物毒性孔(仅细胞加上药物)、药物比色对照孔(仅药物)以及实验孔(药物加上细胞加上病毒)。首先将化合物溶解于DMSO中并且使用以20μM或2μM的高浓度开始的六种半对数稀释来测试。将HIV-1RF以50μL的体积(病毒的量被确定以在感染后6天给出大约90％的细胞杀伤)添加至每个孔。在测定终止时，将测定板用基于可溶的四唑鎓的染料MTS(CellTiter 96试剂,Promega)染色以确定细胞生存能力并且定量化合物的毒性。MTS通过代谢活性细胞的线粒体酶代谢以产生可溶的甲臜(formazan)产物，这提供细胞生存能力和化合物细胞毒性的定量分析。在使用齐多夫定(3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷或AZT)作为阳性对照的平行实验中验证测定。
抗人类呼吸道合胞病毒(RSV)的细胞保护测定：
细胞制备-在抗病毒测定中使用之前将HEp2细胞(人类上皮细胞，ATCC目录#CCL-23)在用10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠、和0.1mM NEAA增补的DMEM中在T-75烧瓶中传代。在测定之前的当天，将细胞分开1:2以确保它们在感染时处于指数生长期。总细胞和生存能力定量使用血细胞计数器和台盼蓝拒染法来进行。对于在测定中待被利用的细胞，细胞生存能力大于95％。细胞以1x104个细胞每孔再悬浮在组织培养介质中并且以100μL的体积添加至平底微量滴定板。将板在37℃/5％CO2下温育过夜以允许细胞粘附。然后将介质移除并且将药物以100μL体积添加至微量滴定板。
病毒制备-RSV毒株Long和RSV毒株9320从ATCC获得(分别地，目录#VR-26和目录#VR-955)并且在HEp2细胞中生长用于产生储备液病毒池。滴定前的小份的病毒从冰箱(-80℃)中被移除并且被允许在生物学安全橱中慢慢解冻至室温。将病毒再悬浮并且稀释到测定介质(用2％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠和0.1mM NEAA增补的DMEM)中使得以100μL体积添加至每个孔的病毒的量是被确定在感染后第6天产生85％至95％的细胞杀伤的量。
在此测定中，化合物A在10μM下证实抵抗RSV毒株9320的病毒复制的68％的减少。
抗流行性感冒病毒的细胞保护测定
细胞制备-在抗病毒测定中使用之前，将MDCK细胞(犬肾细胞，ATCC目录#CCL-34)在用10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠、和0.1mM NEAA增补的DMEM中在T-75烧瓶中传代。在测定之前的当天，将细胞分开1:2以确保它们在感染时处于指数生长期。总细胞和生存能力定量使用血细胞计数器和台盼蓝拒染法来进行。对于在测定中待被利用的细胞，细胞生存能力大于95％。将细胞以1x104个细胞每孔再悬浮在组织培养介质中并且以100μL体积添加至平底微量滴定板。将板在37℃/5％CO2下温育过夜以允许细胞粘附。然后将介质移除并且将单层用DPBS洗涤。然后将化合物以100μL体积添加至微量滴定板。
病毒制备-流行性感冒A/CA/05/09(CDC)、A/HK/8/68(ATCC目录#VR-544)和B/Allen/45(ATCC目录#VR-102)毒株从ATCC或从疾病控制中心获得并且在MDCK细胞中生长用于产生储备液病毒池。滴定前的小份病毒从冰箱(-80℃)中被移出并且被允许在生物学安全橱中慢慢解冻至室温。将病毒再悬浮并且稀释到测定介质(用2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠和0.1mM NEAA和1μg/mlTPCK处理的胰蛋白酶增补的DMEM)中，使得以100μL体积添加至每个孔的病毒的量是被确定在感染后第4天产生85％至95％的细胞杀伤的量。
效力和毒性XTT-在37℃下在5％CO2培养箱中温育之后，将测试板用四唑鎓染料XTT(2,3-双(2-甲氧基-4-硝基-5-磺苯基)-5-[(苯基氨基)羰基]-2H-四唑鎓氢氧化物)染色。XTT-四唑鎓被代谢活性细胞的线粒体酶代谢为可溶性的甲臜产物，这允许快速定量分析由抗病毒测试物质对病毒诱导的细胞杀伤的抑制。XTT溶液作为RPMI1640中的1mg/mL的储备液被每天制备。吩嗪硫酸甲酯(PMS)溶液以0.15mg/mL在PBS中制备并且在-20℃下储存在暗处。XTT/PMS储备液在使用之前通过添加40μL PMS每ml XTT溶液直接制备。将五十微升XTT/PMS添加至板的每个孔并且将板在37℃下再温育4小时。将板用粘合性板密封器密封并且轻轻摇动或倒转若干次以混合可溶性甲臜产物并且将板用Molecular Devices Vmax板读数器在450/650nm下分光光度法地读数。
数据分析-原始数据采集自Softmax Pro 4.6软件并且被输入到用于四参数曲线拟合分析的Microsoft Excel XLfit 4电子表格中。
化合物F在10μM下具有以下的抑制水平：
流行性感冒A H1N1(A/CA/05/09)：98％。
流行性感冒A H3N2(A/HK/8/68)：68％。
流行性感冒B(B/Allen/45)：15％。
进行抗流行性感冒A H1N1的IC50测定(一式三份)并且化合物F具有5.4μM的IC50。
亲环蛋白结合活性
使用从Quesniaux等人(Quesniaux等人,1987,Eur.J Immunol.27:1359-1365)描述的方法修改的竞争性ELISA确定式(I)的化合物的亲环蛋白抑制结合。被结合到D-Lys8-环孢菌素A(D-Lys8-Cs)的琥珀酰基间隔区的活化酯通过8位中的D-赖氨酰基残基结合到牛血清白蛋白(BSA)。将BSA溶解于0.1M硼酸盐缓冲液，pH9.0中(4mg于1.4ml中)。将溶解于二甲基甲酰胺(0.6ml)的百倍摩尔过量的D-Lys8-Cs在剧烈搅拌下逐滴添加至BSA。将偶联反应在室温下在温和搅拌下进行2至3小时，并且将缀合物相对于磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)广泛地透析。在小份的缀合蛋白的丙酮沉淀后，非共价结合的D-Lys8-Cs余留在丙酮溶液中，并且计算环孢菌素共价结合的程度。
将微量滴定板用D-Lys8-Cs-BSA缀合物(2μg/ml在PBS中在4℃下持续24小时)涂覆。将板用洗涤并且单独用PBS洗涤三次。为了阻断非特异性结合，将2％BSA/PBS(pH7.4)添加至孔并且允许在37℃下温育2小时。在单独的微量滴定板中在乙醇中制成待被测试的化合物的五倍稀释组。用于与人类重组亲环蛋白一起测定的起始浓度是0.1mg/mL。将198μL的0.1μg/mL的亲环蛋白溶液添加至微量滴定板，随后立即添加2μL的稀释的环孢菌素A(用作参考化合物)或本文公开的化合物。涂覆的BSA-Cs缀合物、游离的环孢菌素A或本文公开的化合物和亲环蛋白之间的反应被允许在4℃下平衡过夜。用在含有PBS的1％BSA中稀释的抗亲环蛋白兔抗血清检测亲环蛋白并且在4℃下温育过夜。将板如上文描述地洗涤。然后结合的兔抗体通过缀合至在1％BSA-PBS中稀释的碱性磷酸酶的山羊抗兔IgG检测并且被允许在37℃下温育2小时。将板如上文描述地洗涤。在用4-硝基苯基磷酸盐(在二乙醇胺缓冲液中的1g/l，pH 9.8)在37℃下温育1-2小时之后，使用分光光度计在405nm下分光光度法地测量酶反应。
获得以下的IC50值(nM)：
化合物 亲环蛋白A 亲环蛋白B 亲环蛋白D
A 20 13 598
B 18 23 N/A
C 12 11 610
D 71 64 N/A
E N/A N/A N/A
F 57 43 395
G 29 50 N/A
H 14 16 N/A
IL-2活性
使用具有抗CD3和抗CD28共刺激的Jurkat细胞对式(I)的化合物测试其通过刺激的T细胞抑制IL-2产生。所有的化合物具有开始于10μM(n＝2)至0.0015μM的0.5-Log 9-点滴定。环孢菌素A(对照)也以开始于500ng/mL的0.5-Log 9-点滴定进行。待被测试的所有化合物被溶解于二甲基亚砜中。用平行的Alamar Blue板评估细胞毒性。在96孔板中在200μL生长介质中以1x105个细胞每孔接种Jurkat细胞。将细胞在用10％胎牛血清增补的完全RPMI介质中培养，伴随着用5％二氧化碳(CO2)在37℃下的一小时温育。
将PMA和PHA在完全介质中分别稀释成1ng/mL和5μg/mL的最终浓度。将稀释的化合物1:1混合并且每孔添加25μL的混合物。将板在5％CO2中在37℃下温育过夜。
第二天，将一百微升细胞培养上清液从每个孔转移至非灭菌V型底板并且在分析之前将板在-80℃下储存。按照制造商的指导使用Pierce HumanIL-2Colorimetric ELISA试剂盒(Pierce,#EH2IL25)进行上清液中IL-2浓度的测定。在测试之前，将细胞培养上清液用等体积的完全RPMI(每孔25μL样品+25μL RPMI)稀释以便保持在测定的线性范围中。
在PMA/PHA和测试药物不存在下(背景)含有细胞的双份孔和在测试药物(100％产生IL-2)不存在下含有用PMA/PHA刺激的细胞的双份孔作为对照被包括。将用DMSO处理的活化细胞用于使IL-2值归一化。使用来自Molecular Devices的SoftMax Pro软件中4参数曲线拟合产生IL-2标准曲线。
进行两种独立的测定以评估环孢菌素A和代表性化合物对PMA/PHA刺激的Jurkat细胞中的IL-2产生的作用(计算平均值)。在4.35ng/mL环孢菌素A的存在下IL-2产生被抑制50％(IC50)。获得以下的IC50值(以ng/mL)：
化合物 IL-2抑制IC50
A 4842
B 7690
C 9310
D 13400
E >13620
F 452
测定人类外周血单核细胞(PBMC)中的细胞因子产生
用本文提供的化合物测试冷冻保存的商业的PBMC或先前被冷冻保存在RPMI1640)/胎牛/DMSO溶液(50/40/10v/v)中的从HCV供体分离的PBMC。
用于IL28B基因分型的全血管也被绘制并且基因分型使用具有等位基因特异性Taqman探针的实时PCR以检测染色体18q13上的单核苷酸多态性rs12979860C/T来进行。
将PBMC在平底48孔板中在RPMI细胞培养介质中在37℃下培养24小时。每个孔接纳180μL细胞悬浮液(2x106个细胞/mL)。处理液(20μL)被添加至每个孔(每种状况2个孔)，并且包括RPMI(对照)、具有DMSO的RPMI(0.005％)和以在RPMI中的20μM的浓度的本文提供的化合物(用于2μM环孢菌素A或本文提供的化合物的最终处理)。在温育结束时，将板在200次g下离心5分钟。细胞上清液被收集并且通过用于细胞因子IFN-α(检测试剂从15种已知的人类IFN-α亚型中识别出14种)和IFN-λ1(IL-29)的ELISA被测定。将细胞小球用冷的PBS洗涤两次并且ATP含量通过添加100μL每孔的Cell Titer(Promega,Madison,WI)测定。然后将板放置在-80℃下直到蛋白分析。对于蛋白分析，将板解冻，刮出并且使用BCA蛋白测定试剂盒(23227,ThermoScientific,Rockford IL)测定细胞悬浮液的蛋白含量。
供体人口统计学在表1中概括。在不同的测定组中利用来自这些供体的PBMC在表2中概括。
表1.健康和HCV阳性的供体的人口统计学和IL28B基因分型。
NA，不可用
*关于Humalin处理的供体
表2.进行的测定组。每个组代表在同一天进行的测定。
*在细胞上清液中检测到的测定标记物。将这些背景值从在这些细胞批次的化合物处理之后检测到的水平中减去。
**在冷冻保存和解冻之后测试的来自与CT2的第二测试相同的收集物的细胞。
测试来自三个健康供体的PBMC以确定它们在用本文提供的化合物处理后是否释放干扰素。来自这些供体的之一(#2)的DMSO处理的PBMC产生IL-29，并且在处理后这些水平轻微地增加(表3)。来自其他两个供体的PBMC在任何处理后不产生IFN-α或IL-29(表3和表4)。
在用本文提供的化合物处理后，在一组用于干扰素应答的独立测定中测试来自多个HCV阳性供体的PBMC(表2)。在用本文提供的化合物处理后，来自所有HCV阳性供体的细胞产生IFNα和IL-29(表3和表4)。在下文的表中，LOQ意指“定量极限”。
表3.在化合物处理(2μM持续24小时)后PBMC上清液中的IL-29浓度
表4.在化合物处理(2μM持续24小时)后PBMC上清液中的IFN-α浓度
实施例B1：化合物对由Toll样受体激动剂诱导的干扰素和细胞因子的HBV介导的抑制的影响
用本文提供的化合物测试来自健康供体的PBMC。在某些实验中，使用浆样或髓样DC耗尽的PBMC级分。用Toll样受体配体在HepAD38来源的HBV和在XVIVO 15介质中的化合物存在或不存在下，在96或48孔的组织培养板中刺激PBMC或PBMC级分。在刺激后18小时收集上清液。细胞因子和干扰素的产生通过ELISA测定。测试的细胞因子和干扰素的清单包括但不限于IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23和TNF-α。
将浆样(pDC)和髓样树突细胞(mDC)使用磁珠分离试剂盒从健康供体的人类PBMC分离并且用本文提供的化合物测试。将PDC和mDC用Toll样受体配体在HepAD38来源的HBV和在XVIVO 15介质中的化合物存在或不存在下，在96或48组织培养板中刺激。在某些pDC实验中，XVIVO介质含有IL-3。在刺激后18小时收集上清液。细胞因子和干扰素的产生通过ELISA测定。测试的细胞因子和干扰素的清单包括但不限于IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23和TNF-α。
使用IL-4和GMCSF从单核细胞产生单核细胞来源的DC(MoDC)。从健康供体的PBMC纯化单核细胞。用本文的化合物测试MoDC。用Toll样受体配体在HepAD38来源的HBV和在XVIVO 15介质中的化合物存在或不存在下，在96孔组织培养板中刺激MoDC。在刺激后18小时收集上清液。细胞因子和干扰素的产生通过ELISA测定。测试的细胞因子和干扰素的清单包括但不限于IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23和TNF-α。
实施例B2：化合物对由PBMC和树突细胞表达的共刺激分子的HBV介导的调节的影响
用本文提供的化合物测试来自健康供体的PBMC。使用8色FACSverse仪器通过流式细胞仪测定诸如CD40、CD80和CD86的共刺激分子的表达。用Toll样受体配体在HepAD38来源的HBV和在XVIVO 15介质中的化合物存在或不存在下，在6孔组织培养板中刺激PBMC。在24小时后细胞将会成块，并且用一组荧光标记抗体(包括但不限于抗人类CD1c、CD3、CD11c、CD14、CD19、CD20、CD40、CD80、CD86、CD123、CD141、CD303、CD304和HLA-DR的抗体)染色。CD40、CD80和CD86的平均荧光强度将通过用于HLADR+细胞和mDC1(CD1c+)、pDC(CD123+、CD303+或CD123+、CD304+)和mDC2(CD141+)亚群的流式细胞仪评估。
实施例B3：化合物对通过来自HBV感染的黑猩猩的PBMC的细胞因子和干扰素产生的影响。
用本文提供的化合物测试来自健康和HBV感染的黑猩猩的PBMC。在某些实验中，使用浆样或髓样DC耗尽的PBMC级分。用Toll样受体配体在XVIVO 15介质中的化合物存在或不存在下，在96组织培养板中刺激PBMC或PBMC级分。在刺激后18h收集上清液。细胞因子和干扰素的产生通过ELISA测定。测试的细胞因子和干扰素的清单包括但不限于IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-λ、IL-6、IL-10、IL-12、IL-23和TNF-α。
实施例B4：化合物对通过来自HBV感染的黑猩猩的PBMC和树突细胞表达共刺激分子的影响
用本文提供的化合物测试来自健康和HBV感染的黑猩猩的PBMC。使用8色FACSverse仪器通过流式细胞仪测定诸如CD40、CD80和CD86的共刺激分子的表达。用Toll样受体配体在XVIVO 15介质中的化合物存在或不存在下，在6孔组织培养板中刺激PBMC。在24h后细胞将会成块，并且用一组荧光标记抗体(包括但不限于抗人类CD1c、CD3、CD11c、CD14、CD19、CD20、CD40、CD80、CD86、CD123、CD141、CD303、CD304和HLA-DR的抗体)染色。CD40、CD80和CD86的平均荧光强度将通过用于HLADR+细胞和mDC1(CD1c+),pDC(CD123+、CD303+或CD123+、CD304+)和mDC2(CD141+)亚群的流式细胞仪评估。
实施例B5：化合物对HBV表达细胞的干扰素应答性的影响
用本文提供的化合物测试表达HBV的人类肝母细胞瘤细胞系HepAD38。HepAD38细胞表达HBV蛋白并且释放HBV病毒体。HBV的表达通过从培养基移除四环素被诱导。用四环素或不用四环素培养的HepAD38细胞以及母体HepG2细胞在化合物存在下或不存在下用IFN-α或IFN-β刺激。干扰素可诱导基因的诱导将分别通过PCR、流式细胞仪或ELISA测定。
实施例B6：化合物对HBV进入的影响
以下的实施例例证由本发明的代表性化合物抑制HBV进入到培养的肝细胞中。如先前所描述[Gripon P等人，(2002)；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第9卷，第15655-15660页]，将HepaRG细胞用HBV在4％PEG8000存在下在37℃下以2000-20000(通常6000)GEq/细胞感染16小时。为测试用于抑制HBV进入的化合物，将HepaRG细胞用化合物预处理2小时，然后添加HBV接种物并且用化合物在约37℃下继续温育16小时。在洗涤出游离的HBV和化合物之后，将细胞在化合物不存在下培养持续另外的12天。通过ELISA用从在感染后12天的感染的细胞分泌的病毒包膜蛋白(HB)水平监测HBV感染。将化合物在4μM和1μM下一式两份筛选。在此实施例中，化合物A、B和F分别具有1.6μM、<1μM和<1μM的IC50值。机械地，本发明的化合物可以经由抑制特异性的转运体(代替抑制亲环蛋白或除了抑制亲环蛋白之外)影响病毒进入。
实施例B7：化合物对登革热病毒的影响
在病毒感染和复制的基于细胞的测定中对化合物A、B和F测试抗登革热病毒的活性。用DENV1毒株感染HuH7细胞(感染复数＝0.1)。在1小时温育以允许病毒附着和感染之后，添加化合物(在1、3和9μM的浓度下，一式三份)。温育被继续5天，并且然后将细胞和介质收获用于分析。通过用于在介质中存在的病毒的实时RT-PCR测定评估病毒复制，并且对细胞测定代谢生存力(MTT测定)。所有三个化合物抑制登革热病毒产生，分别具有>9μM、1μM和1.4μM的IC50值。
线粒体通透性转换
线粒体通透性转换(MPT)通过测量由Ca2+诱导的线粒体的溶胀来测定。该程序从由Blattner等人,2001,Analytical Biochem.,295：220描述的方法修改。使用利用在基于蔗糖的缓冲液中的温和的均匀化以及然后差速离心以首先移除细胞碎片并且然后使线粒体形成小球的标准方法从大鼠肝脏制备线粒体，所述大鼠肝脏已经用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)灌注以移除血液。通过150微摩尔的Ca2+诱导溶胀(从氯化钙的浓溶液添加)并且通过测量在535-540nm下的散射来监测。在诱导溶胀之前5分钟添加代表性化合物。通过对比使用和不使用式(I)的化合物的溶胀来测定EC50。
在上文的测试中，化合物A给出10μM或更低的EC50值，这指示式(I)的化合物穿透线粒体并且抑制MPT的能力。
慢性丙型肝炎的短期治疗
下文详细描述涉及慢性肝炎的治疗和控制的多种方法。术语“方法”包括本文描述的所有方法、特别地包括施用以与干扰素和任选地利巴韦林的组合的式(I)的化合物的方法。
在一方面中，本文提供调节和/或敏化具有慢性丙型肝炎的受试者的免疫系统使得受试者对干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗应答的方法。调节治疗的受试者的免疫系统可以通过诱导固有免疫系统的标记物被指示，其中如与未曾用式(I)的化合物治疗的经历干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗的受试者的免疫系统相比，固有免疫系统的标记物的水平的增加或减小指示免疫系统被调节。方法可以包括检测和/或测量固有免疫系统的标记物的水平以确定用式(I)的化合物治疗并且经历干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗的受试者的免疫系统是否已经被调节。
在另一方面中，本文公开在具有慢性丙型肝炎的受试者中诱导对干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗的敏感性的方法。如与未曾用式(I)的化合物治疗的受试者相比，用式(I)的化合物治疗的受试者可以具有对干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗的增强或改进的敏感性。治疗的受试者可以经历缓解或改善由慢性HCV引起的症状。治疗的受试者可以具有不可检测的HCV RNA水平或维持的不可检测的HCV RNA，如下文所描述。在另外的方面中，本文公开用于在具有慢性丙型肝炎的受试者中诱导对干扰素治疗的敏感性的与干扰素一起的式(I)的化合物。在还另外的方面中，提供了治疗被HBV、HCV或HIV感染的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的式(I)的化合物。
本文还公开在具有慢性丙型肝炎的受试者中诱导对干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗的应答性。如与未曾用式(I)的化合物治疗的受试者相比，用式(I)的化合物治疗的受试者可以具有对干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗的增强或改进的应答性。治疗的受试者可以经历缓解或改善由慢性HCV引起的症状。治疗的受试者可以具有不可检测的HCV RNA水平或维持的不可检测的HCV RNA，如下文所描述。在另外的方面中，提供了在具有慢性丙型肝炎的受试者中诱导对干扰素治疗的敏感性的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的式(I)的化合物与干扰素(例如聚乙二醇化干扰素)的组合持续约两周至约六周的时期。在另外的方面中，提供了在停止治疗之后在具有慢性丙型肝炎的受试者中诱导维持的抗病毒活性的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的式(I)的化合物与干扰素的组合持续约两周至约六周的时期，例如约四周。在此方面的实施方案中，方法还可以包括向受试者施用利巴韦林。在此方面的另外的方面中，受试者被基因型1HCV例如基因型Ia感染。在此方面的又另外的实施方案中，受试者携带用于染色体19单核苷酸多态性rs12979860的IL28B非CC基因型。在此方面的还另外的实施方案中，受试者携带用于染色体19单核苷酸多态性rs12979860的IL28B TT基因型。在此方面的还另外的实施方案中，受试者携带用于染色体19单核苷酸多态性rs12979860的IL28B CT基因型。
在又另一方面中，本文公开在停止干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗之后在具有慢性肝炎的受试者中诱导维持的抗病毒活性的方法。抗病毒活性可以在停止治疗之后被维持持续大于约五周、约10周、约15周、约20周或约24周。抗病毒活性可以在停止干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗之后被维持持续大于约五周至约24周、持续约10周至24周、或持续约15周至24周。维持的抗病毒活性可以基于受试者中存在的HCV RNA的水品被测定，使得受试者中HCV RNA的大体上不可检测的水平指示维持的抗病毒活性。理解的是，“HCV RNA的大体上不可检测的水平”意指小于约15IU/mL的水平。
在一个实施方案中，本文提供的方法可以使得受试者对干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗更敏感，并且受试者可以经历缓解或改善与慢性丙型肝炎有关的症状。
在一个实施方案中，本文提供的方法被应用于未曾用基于干扰素的治疗治疗的受试者。
在一个实施方案中，本文提供的方法被应用于先前已经用干扰素治疗治疗但治疗是不成功的受试者。在此实施方案的一个方面中，受试者是无效应答者，即在之前的治疗过程的第12周实现HCV RNA的小于2log10的减少的人。在此实施方案的另一方面中，受试者是被定义为在之前的治疗过程完成时HCV RNA是不可检测的但在随访期丙型肝炎病毒变得可检测的人的之前的复发者。在此实施方案的另外的方面中，受试者是被定义为在第12周时实现HCV RNA的至少2log10的减少但直到之前的治疗过程的第24周丙型肝炎病毒从未变得不可检测的人的部分应答者。
在一个实施方案中，本文提供的方法缓解或改善与慢性丙型肝炎有关的症状。术语“缓解”或“改善”可以指的是慢性丙型肝炎的治疗中的任何成功的标记，包括任何客观或主观的参数，例如症状的减轻、减退或变小或受试者的身体健康的改进。症状的改善或缓解可以是基于客观或主观的参数；包括体检的结果。症状中的某些包括但不限于黄疸、厌食症(食欲不振)和萎靡。
在另一个实施方案，本文描述的方法可以包括检测和/测量HCV RNA水平以确定在停止干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗之前、期间和之后中的至少一种的情况下受试者对干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗是否是应答的或敏感的，并且确定在停止干扰素治疗或干扰素/利巴韦林治疗之后受试者是否具有维持的抗病毒活性。方法还可以包括确定受试者是否经历相对于开始治疗之前较少的与慢性丙型肝炎有关的症状或减少的严重度的症状。
在一个实施方案中，本文提供的方法包括向具有慢性丙型肝炎的受试者施用有效量的式(I)的化合物、干扰素和任选地利巴韦林持续短的持续时间，例如约两周至六周。在另一个实施方案中，方法还包括继续施用干扰素和任选地利巴韦林持续另外的约20周至约52周。方法包括在两个阶段即初始阶段和第二阶段施用试剂。例如，初始阶段可以是小于约六周的时期并且第二阶段可以是大于或等于约20周的时期。初始阶段可以是约两周至六周，并且第二阶段可以是在约20周至约52另外的周之间。初始阶段可以是约两周、约三周、约四周、约五周或约六周，并且第二阶段可以是约20、约24、约28、约32、约36、约40、约44、约48或约52另外的周。初始阶段可以是约四周，并且第二阶段可以是约44另外的周。第二阶段可以直接跟随在初始阶段之后。第二阶段可以在约一天、约两天、约三天、约四天、约五天、约六天、约一周或约两周的无治疗的短暂间隔之后跟随初始阶段。在初始阶段中，式(I)的化合物可以与干扰素一起和任选地与利巴韦林一起被施用。在第二阶段中，干扰素可以单独地施用或任选地与利巴韦林一起被施用。
在一个实施方案中，在治疗的初始阶段中，式(I)的化合物、干扰素和任选地利巴韦林被施用持续约两周至约六周，例如持续约四周，随后直接在第二阶段中施用干扰素和任选地利巴韦林持续约20周至约44另外的周，例如持续约44另外的周。
本文提供的方法可以包括选择具有慢性丙型肝炎的受试者的步骤。“受试者”可以是任何哺乳动物受试者，例如人类受试者。通过本文公开的方法中的任何一种被治疗的受试者是需要治疗的个体，例如人类受试者。在某些实施方案中，受试者已经被诊断具有或呈现慢性丙型肝炎的一种或更多种症状。在其他实施方案中，受试者已经被感染HCV基因型1。
在某些实施方案中，HCV是基因型1HCV并且可以具有任何亚型。例如，在某些实施方案中，HCV是亚型1a或1b。拒信，基因型1的HCV感染较差地对目前的干扰素治疗应答。本文提供的方法可以对具有基因型1的HCV感染的治疗是有利的。本文提供的方法可以包括选择被基因型1HCV、特别地基因型1a HCV感染的受试者的步骤。
在某些实施方案中，本文提供的方法包括：涉及选择具有慢性丙型肝炎的受试者的步骤；涉及选择被HCV基因型1、特别地基因型1a感染的受试者的步骤；或涉及选择被HCV基因型1、特别地基因型1a感染并且携带用于染色体19单核苷酸多态性rs12979860的非CC基因型的受试者的步骤。在某些实施方案中，本文提供的方法包括涉及选择被HCV基因型1、特别地基因型1a感染并且携带用于染色体19单核苷酸多态性rs12979860的IL28TT基因型或IL28CT基因型的受试者的步骤。
在一个实施方案中，本文提供的方法包括向具有慢性丙型肝炎的受试者施用作为约24小时时期的过程中的分剂量并且以与干扰素和任选地利巴韦林的组合的有效量的式(I)的化合物。
如本文所使用，将理解的是，提到的具有碱性取代基的式(I)的化合物的量指的是抑制剂的游离碱的量。
在另一个实施方案中，方法包括向受试者施用包含以与有效量的干扰素和任选地利巴韦林的组合的有效量的式(I)的化合物的组合物。在另外的实施方案中，施用式(I)的化合物和任选地利巴韦林可以每天两次或三次连续地进行持续数天或数周，并且施用干扰素可以每周或每两周进行。
在另外的实施方案中，方法包括施用以与其他活性剂例如干扰素和任选地利巴韦林的组合的有效量的式(I)的化合物，其中三种试剂在约24小时时期中被至少两次施用到需要其的感染的受试者，其中每次施用优选地被分开约8小时至约16小时。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体并入本文，犹如每个单独的出版物、专利或专利申请被特别地和单独地指示成通过引用并入。虽然前述内容已经在多个实施方案方面上被描述，技术人员将理解可以进行多种修改、替代、删减和改变而不脱离本发明的精神。

Claims (14)

1.一种环孢菌素A衍生物，其中3-肌氨酸位置被基团-S-CH2C[CH2(CH2)n]NR2R3取代，其中R2是氢或具有从一个至四个碳原子的烷基链，并且当所述烷基链具有3个或4个碳原子时，所述链是直链或支链的；R3是具有从一个至四个碳原子的烷基链，并且当所述烷基链具有3个或4个碳原子时，所述链是直链或支链的；并且n是1或2。
2.一种式(I)的化合物：
其中：
A是(E)-CH＝CHCH3或-CH2CH2CH3；
B是乙基、1-羟基乙基、异丙基或正丙基；
n是1或2；
X是羟基或氢；
R1是氢或任选地被可以是相同或不同的一个或更多个基团R4取代的含有从一个至四个碳原子的直链或支链的烷基；
R2是氢或具有从一个至四个碳原子的烷基链，并且当所述烷基链具有3个或4个碳原子时，所述链是直链或支链的；并且
R3是具有从一个至四个碳原子的烷基链，并且当所述烷基链具有3个或4个碳原子时，所述链是直链或支链的；
R4是任选地被选自由以下组成的组的可以是相同或不同的一个至五个基团取代的苯基：烷基、卤代烷基、卤素、羟基、烷氧基、氨基、N-烷基氨基、N,N-二烷基氨基、羧基和烷氧基羰基；
或其药学上可接受的盐。
3.如权利要求2所述的化合物，其中X是羟基。
4.如权利要求2或权利要求3所述的化合物，其中A是(E)-CH＝CHCH3，B是乙基，并且n是1。
5.如权利要求2至4中任一项所述的化合物，其中A是(E)-CH＝CHCH3，B是乙基，n是1并且R2和R3各自是甲基。
6.如权利要求2或权利要求3所述的化合物，
其中A是(E)-CH＝CHCH3；
B是乙基；
n是1或2；
R1是氢或苄基；并且
R2是氢或C1-C4烷基；
R3是C1-C4烷基。
7.如权利要求2或权利要求3所述的化合物，
其中A是(E)-CH＝CHCH3；
B是乙基；
n是1或2；
R1是氢或苄基；并且
可以是相同或不同的R2和R3各自是C1-C4烷基。
8.如权利要求1或2所述的化合物，所述化合物选自：
[(R)-[(1-(N,N-二甲基氨基)环丙基]甲硫基-肌氨酸]3[4’-羟基-N-甲基亮氨酸]4-环孢菌素A；
[(R)-[(1-(N-甲基-N-异丙基氨基)环丙基]甲硫基-肌氨酸]3[4’-羟基-N-甲基亮氨酸]4-环孢菌素A；
[(R)-[(1-(N,N-二甲基氨基)环丁基]甲硫基-肌氨酸]3[4’-羟基-N-甲基亮氨酸]4-环孢菌素A；
[(R)-[(1-(N,N-二乙基氨基)环丙基]甲硫基-肌氨酸]3[4’-羟基-N-甲基亮氨酸]4-环孢菌素A；
[(R)-[(1-(N-乙基-N-甲基氨基)环丙基]甲硫基-肌氨酸]3[4’-羟基-N-甲基亮氨酸]4-环孢菌素A；
[(R)-[(1-(N,N-二甲基氨基)环丁基]甲硫基-肌氨酸]3-(N-苄基)-缬氨酸5-环孢菌素A；
[(R)-[(1-(N-甲基氨基)环丙基]甲硫基-肌氨酸]3[4’-羟基-N-甲基亮氨酸]4-环孢菌素A；和
[(R)-[(1-(N-乙基氨基)环丙基]甲硫基-肌氨酸]3[4’-羟基-N-甲基亮氨酸]4-环孢菌素A。
9.一种组合物，包含权利要求1至8中任一项的化合物和药学上可接受的载体。
10.一种用于抑制亲环蛋白的权利要求1至8中任一项的化合物。
11.一种用于治疗被病毒感染的受试者的权利要求1至8中任一项的化合物。
12.如权利要求11所述的化合物，其中所述病毒选自HCV、HBV和HIV。
13.如权利要求11所述的化合物，其中所述病毒选自流行性感冒病毒、登革热病毒和呼吸道合胞病毒(RSV)。
14.一种式(III)的化合物：
其中：
R2是氢或具有从一个至四个碳原子的烷基链，并且当所述烷基链具有3个或4个碳原子时，所述链是直链或支链的；
R3是具有从一个至四个碳原子的烷基链，并且当所述烷基链具有3个或4个碳原子时，所述链是直链或支链的；
n是一或二；
并且R10是离去基团，
或其盐。
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