CN106902346A - 药物组合物及其制药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了药物组合物及其制药用途，具体地，所述药物组合物包括第一组分、第二组分，其中，第一组分为选自具有式I所式的亲环孢素抑制剂、其药学上可接受的盐和其溶剂合物中的至少一种；第二组分为选自抗病毒药物、其药学上可接受的盐和其溶剂合物中的至少一种。本发明的药物组合物可用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染引起的疾病。

Description

药物组合物及其制药用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种药物组合物及其制药用途。
背景技术
乙型肝炎病毒(HBV)隶属于嗜肝DNA病毒科，病毒颗粒由核衣壳和包膜组成，包膜主要由三种抗原组成，它们在HBV感染的检测中发挥核心作用。核衣壳包含乙型肝炎核心抗原(HBcAg)、DNA聚合酶-逆转录酶和病毒基因组。HBV基因组为3.2kb的部分双链环状DNA，与我们所知的所有哺乳类动物的DNA病毒不同，嗜肝DNA病毒依靠一种RNA中间体逆转录方式进行复制。基于HBV这种独特的复制周期，使用核苷酸/核苷类似物的抗病毒治疗策略主要针对HBV RNA逆转录过程。
直到现在，乙肝病毒进入细胞的精确机制尚未被阐明。内吞作用和病毒包膜与质膜直接融合都被认为是潜在途径。有包膜的病毒粒子结合到宿主细胞的preS1受体，包含松弛环状DNA(rcDNA)的核衣壳被释放进入细胞质并被转运至细胞核。在细胞核里，rcDNA被修复形成cccDNA。该cccDNA作为模板被转录成次基因组RNA(sgRNA)和前基因组RNA(pgRNA)。在核衣壳里，pgRNA被反转录成反义链DNA。RcDNA则来自以反义链DNA为模板合成的正义链DNA。核衣壳被再次转运到细胞核扩增cccDNA，或者被包膜包裹然后通过内质网释放出细胞。作为HBV生命周期的复制中间体，cccDNA对HBV持续性感染有重要作用。因此抗乙肝病毒药物的药物靶标和免疫调节策略都是针对HBV不同生命周期的。
病人血清里面出现HBV DNA是病毒复制活跃的最好提示。HBsAg抗体的产生是由于包膜抗原暴露和获得保护性免疫。HBcAg抗体在所有曾经感染过HBV的病人中都可以检测得到。然而，与HBsAg抗体不同，这种抗体不是保护性的，它有助于我们区分急性感染和慢性感染，如果病人血清里出现anti-HBc IgM抗体，则显示此病人为急性感染。HBeAg抗体是在抗原被清除和病毒不再复制或者减弱复制的情况下出现
乙肝病毒感染宿主肝细胞，宿主则成为乙肝病毒携带者；乙肝病毒长期处于复制的活动状态，宿主则可能慢慢演变成慢性乙型肝炎(CHB)患者。慢性乙型肝炎的肝损伤是宿主对HBV免疫反应的结果；HLA-class I限制的，细胞毒素T淋巴细胞介导的HBV抗原反应会导致肝细胞凋亡和坏死。因此，慢性乙型肝炎是一个HBV、病人肝细胞和免疫系统三者相互作用的动态情形。基于这种相互作用，慢性乙型肝炎的自然过程可以被划分为不同变化阶段，然而不是所有病人都会经历其所有阶段。第一个阶段为“免疫耐受期”，表现为：HBeAg阳性、高病毒载量、正常丙氨酸转氨酶(ALT)量和接近正常的肝组织结构。成人慢性HBV感染通常只经历一个较短的免疫耐受期。相反，围产期或者幼年早期慢性HBV感染则要经历较长的免疫耐受期。第二个阶段免疫清除期通常在青春期或者成人期发生，这个阶段特征表现为：HBeAg阳性、HBV高水平和ALT高表达，有时还会出现肝代偿性失调。这些症状可能会加快一些HBeAg阳性阶段的病人肝纤维化或者肝硬化的进程，但是也可能导致大多数病人血清HBV DNA水平的降低，甚至最终HBV DNA被清除和HBeAg血清转化为anti-HBe抗体。随着HBeAg血清转化，大多数病人进入第三个阶段—“潜伏期”，该阶段的特点为：持续正常的ALT表达、低HBV DNA载量、没有或者很少炎症坏死组织。
目前用于治疗慢性乙型肝炎的药物有以下6种，包括：干扰素(IFN，两种形式：IFN和PEG-IFN)和5种核苷酸/核苷类似物(拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦)。乙型肝炎治疗的目标是持续抑制HBV复制，防止肝硬化和肝癌发生。治疗有效的标准则是根据血清HBV DNA水平降低、HBeAg消失、HBsAg消失、ALT水平正常和组织切片检查肝脏的炎症反应降低等指标来判断。针对HBV感染的病人的抗病毒治疗的理想目标则是将HBV完全清除，包括HBsAg减少、anti-HBs血清转化和被感染肝细胞中cccDNA被完全清除。然而，将cccDNA从被感染肝细胞核中完全清除是目前抗病毒药物所不能达到的，于是临床治疗HBV感染并不能将病毒从肝细胞中完全清除，主要通过宿主免疫系统控制病毒的复制。
亲环孢素(Cyclophilins，Cyps)因其为环孢素A(CyclosporinA，CsA)的细胞内高亲和性配体而命名。亲环素是人类细胞中表达的肽基脯氨酸顺反异构酶的三大家族成员之一，在动植物中广泛表达及分布，结构上具有高度保守性。环孢菌素A是一种免疫抑制剂，临床上用于治疗器官移植产生的排斥反应及自身免疫系统疾病，所以亲环素被认为参与了免疫制剂过程。亲环素还具有其他许多重要的生物学功能，如辅助蛋白折叠、介导细胞间信号转导和细胞凋亡、参与HIV-1病毒蛋白组装等。其中两种功能研究得最为透彻，一是亲环素具有肽酰脯氨酸顺/反异构酶(PPIase)活性，能够催化蛋白质特别是富含脯氨酸的蛋白质折叠，同时起着分子伴侣的作用；而是与CsA结合形成CyP-CsA复合体，在人体中通过钙调磷酸酶(CaN)抑制免疫反应。CyP-CsA复合物与钙调磷酸酶结合可抑制其活性，使T细胞核因子(NF-ATc)不能被去磷酸化，阻断了T细胞核因子从胞浆到细胞核的转移，导致细胞信号传导中断，T细胞活化所必需的一些细胞因子表达受阻，从而抑制T细胞增殖。
多项研究已证实，CypA疏水区的PPI酶活性在参与HCV RNA复制和蛋白表达过程中起到了至关重要的作用，该区域的碱基突变可破坏HCV复制。最近研究证实HCV NS5A是CypA的主要配体，CypA对NS5A中脯氨酸肽键的异构化在HCV复制过程中起到重要作用，而亲环素抑制剂可通过破坏CypA-NS5A的相互作用达到抑制病毒复制的作用。
目前，人工合成的无免疫抑制作用的CsA衍生物如Debio-025(Alisporivir)，NIM-811和SCY-635在结构上保留了CsA的基本结构，仅在3和4位点与CsA不同，却能在低浓度时抑制PPI酶的水解活性，表现出明显强于CsA的抗HCV效应，同时对碱性磷酸酶几乎无亲和活性，避免了类似CsA的免疫抑制效应。而且亲环素抑制剂的耐药发生率非常低，尤其是联合用药时，针对病毒酶抑制剂的耐药发生率也明显减少。
SCY-635是一个无免疫抑制作用的CsA类似物，在体外试验中已被证实能抑制CypA的PPI酶活性，与PEG-IFN和利巴韦林联合应用时能协同并增强其抗病毒效应。在人体试验中发现SCY-635能上调体内IFN应答。服用SCY-635的患者随着SCY-635血药浓度逐渐增高，血浆IFN-a、IFN-λ1、IFNλ3和2’5’-寡腺苷酸合成酶-1的浓度也随之增高。类似结果也出现在复制子细胞模型试验中，SCY-635被证实能刺激I型和III型IFN及IFN效应基因(ISG)的分泌。因此，亲环素抑制剂除直接干扰HCV复制过程外，还可能通过一系列激活宿主天然抗HCV免疫的方法发挥其抗病毒的作用。
由于亲环素抑制剂表现出良好的抗病毒效应，其在临床应用上被广泛研究。Debio-025首先在一组HIV/HCV共感染者身上进行了I期临床试验。由于初步结果比较理想，积极展开了评估Debio-025联合PEG-IFNa-2a治疗的疗效及安全性的II期临床试验。NIM811的I期和II期研究同时在HCV基因型1型的PEG-IFN/RBV经治复发者中进行。同时，SCY-635单药治疗的I期试验也在20例HCV感染者中展开。目前SCY-635的II期研究正在进行中，主要目的在于评估SCY-635联合PEG-IFN/RBV的三联治疗对基因型1型初治患者的疗效和安全性。除了上述药物外，目前正在研发中的亲环素抑制剂还包括Sangamide和EP-CyP546。亲环素抑制剂因抗病毒作用强，耐药屏障高，病毒性突破率低，不良反应少，可口服吸收等优势而具备良好的临床应用前景。
体外试验证明环孢菌素A对乙型肝炎病毒蛋白合成和DNA复制均具有抑制作用，CsA可通过降低PyK2Y402的磷酸化水平抑制HBV复制。而环孢菌素A衍生物—亲环素抑制剂Alisporivir能够抑制HBV复制和降低乙肝病毒表面抗原HBsAg分泌，其对乙型肝炎病毒的抑制效果还要优于环孢菌素A。目前关于亲环素抑制剂的临床抗病毒研究主要集中在丙型肝炎病毒和艾滋病毒方面，亲环素抑制剂对乙型肝炎病毒是否同样具有良好的抑制效果还缺乏足够的实验证据。关于亲环素抑制剂SCY-635或其组合药物对乙型肝炎病毒的作用目前尚没有任何相关研究报道，本发明首次探究SCY-635组合药物对乙型肝炎病毒复制的影响，为开发成为治疗乙型肝炎创新药物提供了新的物质基础，具有较好的创新性。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种有用的商业选择。为此，本发明的一个目的在于提出一种有效治疗或预防乙型肝炎的药物组合物。
根据本发明的特别发现，提供了以下的实施方案：
本发明涉及用于预防和治疗乙型肝炎的一种药物组合物及方法。因此，本发明所述药物组合物也可用于制备预防/治疗乙型肝炎病毒引起的疾病的药物和药剂。在具体方面，此类药物和药剂包括治疗有效剂量的亲环孢素抑制剂和抗病毒药物，以及药学上可接受的载体。
根据本发明的实施例，本发明的药物组合物包括第一组分和第二组分，其中，第一组分为选自式I所示结构的亲环孢素抑制剂或其药学上可接受的盐或溶剂合物，第二组分为选自抗病毒药物、其可药用盐和其溶剂合物中的至少一种。
其中，
A为式IIa或式IIb所示的残基：
B为乙基、1-羟基乙基、异丙基或正丙基；
R1为：
含有一至六个碳原子的直链或支链烷基，其任选地被一个或多个相同或不同的基团R3取代；
含有二至六个碳原子的直链或支链烯基，其任选地被选自卤素、羟基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个相同或不同的基团取代；
含有二至六个碳原子的直链或支链炔基，其任选地被选自卤素、羟基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个相同或不同的基团取代；
含有三至六个碳原子的环烷基，其任选地被选自卤素、羟基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个相同或不同的基团取代；或
含有一至六个碳原子的直链或支链烷氧基羰基；
R2为异丁基或2-羟基异丁基；
X为-S(O)n-、硫或氧；
R3分别独立地选自选自卤素、羟基、羧基、烷氧基羰基、-NR4R5和-NR6(CH2)mNR4R5；
R4和R5分别独立地为：
氢；
含有一至六个碳原子的直链或支链烷基，其任选地被一个或多个相同或不同的基团R7取代；
包括二至四个碳原子的直链或支链烯基或炔基；
含有三至六个碳原子的环烷基，其任选地被含有一至六个碳原子的直链或支链烷基取代；
取代的苯基，其任选地被选自卤素、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基的一个至五个不同的集团取代；
饱和或不饱和杂环，其含有五个或六个环原子和选自氮、硫和氧的一至三个相同或不同的杂原子；
或者R4和R5与它们所连接的氮原子一起形成含有四至六个环原子的饱和或不饱和杂环，所述杂环可以任选地含有另一个选自氮、氧和硫的杂原子，所述杂环可以任选地
被选自烷基、苯基和苄基的一至四个相同或不同的基团取代；
R6为氢或含有一至六个碳原子的直链或支链烷基；
R7分别独立地选自卤素、羟基、羧基、烷氧基羰基和-NR8R9；
R8和R9分别独立地为氢或含有一至六个碳原子的直链或支链烷基；
n为1或2；
m为2、3或4；
卤素为氟、氯、溴或碘。
根据本发明的实施例，所述所述亲环孢素抑制剂中A为具有式IIa所示的残基，B为乙基。
根据本发明的实施例，所述所述亲环孢素抑制剂中R1为2-氨基乙基、2-氨基丙基、2-单烷基氨基乙基、2-单烷基氨基丙基、2-二烷基氨基乙基、2-二烷基氨基丙基、2-单环烷基氨基乙基、2-单环烷基氨基丙基、2-二环烷基氨基乙基或2-二烷基氨基丙基，其中烷基为包含一至四个碳原子的直链或支链，环烷基包含三至六个碳原子。
根据本发明的实施例，所述亲环孢素抑制剂中X为氧或硫。根据本发明的具体实施例，所述所述亲环孢素抑制剂中X为硫时，R1选自二甲基氨基乙基、二乙氨基乙基、甲基-叔丁基氨基乙基和乙基-叔丁基氨基乙基。
根据本发明的实施例，所述所述亲环孢素抑制剂的药学上可接受的盐为磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、盐酸盐、甲磺酸盐或丙酸盐。
根据本发明的实施例，所述亲环孢素抑制剂为下列之一结构或为下列之一结构的药学上可接受的盐或溶剂合物：
3-甲氧基环孢菌素；
3-(2-氨基乙氧基)环孢菌素；
3(2-N，N-二甲基氨基乙氧基)环孢菌素；
3-(异丙氧基)环孢菌素；
3-(2-乙基丁氧基)环孢菌素；
3-(2，2-二甲基丙氧基)环孢菌素；
3-(2-羟基乙氧基)环孢菌素；
3-(3-羟基丙氧基)环孢菌素；
3-[2-(N-甲基氨基)乙氧基]环孢菌素；
3-[2-(N-甲基-N-异丙基氨基)乙氧基]环孢菌素；
3-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]环孢菌素；
3-[2-(N-吗啉)乙氧基)环孢菌素；
3-乙氧基环孢菌素；
3-(2-甲氧基乙基硫基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙基硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-乙硫基环孢菌素；
3-丙烯基硫代环孢菌素；
3-[(2-甲氧基)乙基硫基]环孢菌素；
3-(甲基硫基)4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-(甲氧基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-(丙-2-烯-1-氧)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-(异丙氧基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-(乙氧基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-[2-(甲氧基)乙氧基]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-[3-(甲氧基)丙氧基]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素。
根据本发明的实施例，所述第二组分为恩替卡韦或替诺福韦，或这两者药学上可接受的盐或溶剂合物。
在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防和/或治疗乙型肝炎病毒感染引起的疾病。
根据本发明的实施例，所述乙型肝炎病毒感染引起的疾病为选自急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝硬性、肝癌中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述药物组合物其给药方式采用皮下或肌肉注射的方式，或以混合物形式给药，或分别口服加注射的形式给药，或给予不同时间的先后次序形式给药。
根据本发明的实施例，所述药物组合物的用药剂量为1-1000mg/天，优选为50-500mg/天，最优选为100mg/天。根据本发明的具体实施例，乙肝感染模型小鼠给药剂量为10mg/kgBid，如果小鼠和人的生物利用度差别不大换算成人的给药剂量为10mgx60x2/12＝100mg/天。
发明人经过实验，意外发现，亲环孢素抑制剂与抗病毒药物具有协同效应，特别是环孢菌素衍生物SCY-635与恩替卡韦或替诺福韦组合用药有着意想不到的抗HBV效果，从而可以预期该组合药物可以作为降低乙肝HBsAg或抑制HBV DNA复制、治疗乙型病毒性肝炎的组合药物继续开发。目前尚无有关SCY-635的组合药物治疗乙肝病毒感染性疾病和制备抗乙肝病毒药物的报道，因此环孢菌素衍生物SCY-635与恩替卡韦或替诺福韦组合用药对于HBsAg和HBV DNA强效抑制均具有明确的创新性。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1显示了根据本发明的实施例4，SCY-635对SCY-635、恩替卡韦、替诺福韦分别单独用药与组合用药对HBsAg表达水平和HBV DNA拷贝数的影响的图谱。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1制备3-甲氧基环孢菌素
将3-(巯基苯并噻唑-2-基硫)环孢菌素(0.4g，0.28mmol)和樟脑磺酸(0.7g，3mmol)的干燥四氢呋喃和干燥甲醇溶液在50℃加热2h。将混合物冷却至室温，添加饱和碳酸氢钠、醚和水。分离层，用二乙醚萃取水相。用无水硫酸镁干燥合并的有机萃取物，过滤。在硅胶上重复进行层析，用二氯甲烷和乙酸乙酯的混合物洗脱，获得120mg的3-甲氧基环孢菌素。
实施例2制备3-(2-甲氧基乙硫基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素
在氮气下浓缩液体氨(30mL)。添加酰胺钠(1.0g)，然后添加4-(γ-羟基甲基亮氨酸)-环孢菌素(1.22g，1.0mmol)的叔丁基甲醚(20mL)溶液。将混合物在-35℃搅拌90分钟。添加2-甲氧基乙基二硫化物(5.9g)，在-35℃继续再搅拌2小时。添加固体氯化铵(1.5g)，将混合物在-33℃搅拌10分钟。在恢复至室温后，用叔丁基甲醚稀释混合物，用水、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。在除去溶剂后，使用硅胶柱层析法纯化残余物，首先用乙酸乙酯/庚烷、然后用甲醇/乙酸乙酯洗脱，获得500mg 3-(2-甲氧基乙硫基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素。
实施例3制备3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素
在惰性气氛中，在低温下，向二异丙基氨基锂(LDA)的干燥四氢呋喃溶液中滴加4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素(1.22g,1.0mmol)的干燥四氢呋喃溶液。将混合物在-35℃持续搅拌90分钟。添加2-(N,N-二甲基氨基)乙基二硫化物(4.6g)，在-35℃继续再搅拌2小时。添加固体氯化铵(1.5g)，将混合物在-33℃搅拌10分钟。在恢复至室温后，用叔丁基甲醚稀释混合物，用水、盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。在除去溶剂后，使用硅胶柱层析法纯化残余物，首先用乙酸乙酯/庚烷、然后用甲醇/乙酸乙酯洗脱，获得260mg 3-[(R)-2-(N,N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素。
实施例4制备3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素的盐
将3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素溶于10ml乙醚中，添加相应的酸，在25℃搅拌2小时，过滤收集沉淀物，用冷醚洗涤，真空干燥。由此分别制得3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素的磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、盐酸盐、甲磺酸盐、丙酸盐。
实施例5SCY-635与恩替卡韦或替诺福韦联合用药与分别单独用药对HBsAg水平和HBV DNA拷贝数的影响
1.实验材料
HepG和Huh7肝癌细胞：由武汉大学保藏中心提供(HepG2保藏中心编号为GDC024，Huh7保藏中心编号为GDC134)；
胎牛血清：购买于美国Gibco公司；
DMEM培养基：购买于美国Gibco公司；
Lipo2000转染试剂：购买于美国Life公司；
HBsAg检测试剂盒：购买于上海科华生物工程股份有限公司；
乙型肝炎病毒(HBV)核酸扩增(PCR)荧光定量检测试剂盒：购买于上海科华生物工程股份有限公司；
恩替卡韦：购买于大连美仑生物技术有限公司；
富马酸替诺福韦酯：购买于大连美仑生物技术有限公司。
2.细胞培养条件
HepG2、Huh7细胞用含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，在体积分数5％CO2，37℃，饱和湿度下培养。
3.实验分组
空白对照组：不加细胞和药物，只加等体积含10％FBS的DMEM培养液；
阴性对照组：加细胞不加药物，加等量二甲亚砜(DMSO)，加等体积含10％FBS的DMEM培养基；
单独给药组：加细胞和不同浓度的SCY-635、恩替卡韦或替诺福韦，用二甲亚砜(DMSO)配制，SCY-635的终浓度分别为0.5μmol/L和2μmol/L，恩替卡韦终浓度为0.5μmol/L和2μmol/L，替诺福韦终浓度为50μmol/L和200μmol/L，分别加等体积含10％FBS的DMEM培养基。
联合给药组：加细胞和不同浓度的SCY-635与恩替卡韦或替诺福韦的组合药，组合如下：
0.5μmol/L SCY-635+0.01μmol/L恩替卡韦；2μmol/L SCY-635+0.01μmol/L恩替卡韦；0.5μmol/L SCY-635+0.1μmol/L恩替卡韦；2μmol/L SCY-635+0.1μmol/L恩替卡韦；0.5μmol/L SCY-635+50μmol/L替诺福韦；2μmol/L SCY-635+50μmol/L替诺福韦；2μmol/LSCY-635+200μmol/L替诺福韦；2μmol/L SCY-635+200μmol/L替诺福韦，每组分别加等体积含10％FBS的DMEM培养基。
4.实验方法
取对数生长期的Huh7细胞以4×105个/孔的密度接种于24孔板，每孔0.5ml，置于5％CO2，37℃，饱和湿度下培养6小时，细胞贴壁且生长良好，吸去培养板中的培养基，加入新鲜培养基。每孔细胞转入0.8μg HBV全基因组质粒(pBlue-HBV1.3)，转染过程如下：将0.8μg质粒与2μl Lipo2000转染试剂加入100μl Opti－MEM无血清培养基，混匀，静置20min，将混合液加入培养的细胞中。培养12小时后，弃去培养基，然后按上述实验分组将培养液或药物溶液分别加入相应孔中，每组设3个复孔，在5％CO2，37℃，饱和湿度下继续培养48小时。收集细胞培养液，离心5分钟，取上清液检测HBsAg水平。同时收集细胞提取HBV DNA(复制中间体闭合环状DNA，cccDNA)进行荧光定量PCR检测。
5.实验结果
实验结果见附图1：
图1显示了SCY-635、恩替卡韦、替诺福韦分别单独用药与组合用药对HBsAg表达水平和HBV DNA拷贝数的影响：
结果表明：我们测试了亲环孢素抑制剂SCY-635联合恩替卡韦(enticavir)或替诺福韦(tenofovir)对转染HBV全基因组的Huh7细胞和HepG2细胞分泌的乙肝表面抗原(HBsAg)及对HBV DNA复制的抑制活性。试验结果发现：2μmol/L浓度的环孢菌素抑制剂SCY-635联合0.1μmol/L浓度的恩替卡韦或2μmol/L浓度的环孢菌素抑制剂SCY-635联合200μmol/L的替诺福韦比分别单独用药时更能显著降低HBV全基因组转基因人肝癌细胞系HepG2和Huh7细胞的血清HBV DNA拷贝数以及乙肝表面抗原(HBsAg)水平。实验数据显示：2μmol/L浓度的SCY-635、0.1μmol/L浓度的恩替卡韦和200μmol/L的替诺福韦对HBsAg的抑制率分别为30％、25％和61％，而2μmol/L SCY-635与0.1μmol/L恩替卡韦或2μmol/LSCY-635与200μmol/L替诺福韦联合给药对HBsAg的抑制率则分别为43％和77％。可见联合给药比单独给药对HBsAg的抑制效率还要高10％以上。2μmol/L浓度的SCY-635、0.1μmol/L浓度的恩替卡韦和200μmol/L的替诺福韦对HBV DNA拷贝数的抑制率分别为42％、39％和80％，而2μmol/L SCY-635与0.1μmol/L恩替卡韦或2μmol/L SCY-635与200μmol/L替诺福韦联合给药对HBV DNA的抑制率则分别为55％和90％。同样可见联合给药比单独给药对HBV DNA的抑制效率也要高出至少10％。
由此可见，环孢菌素衍生物SCY-635与恩替卡韦或替诺福韦组合用药有着意想不到的抗HBV效果，从而可以预期该组合药物可以作为降低乙肝HBsAg或抑制HBV DNA复制、治疗乙型病毒性肝炎的组合药物继续开发。目前尚无有关SCY-635的组合药物治疗乙肝病毒感染性疾病和制备抗乙肝病毒药物的报道，因此环孢菌素衍生物SCY-635与恩替卡韦或替诺福韦组合用药对于HBsAg和HBV DNA强效抑制均具有明确的创新性。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种药物组合物，其特征在于，包括第一组分、第二组分，
其中，
第一组分为选自式I所示的亲环孢素抑制剂、其药学上可接受的盐和其溶剂合物中的至少一种；
第二组分为选自抗病毒药物、其药学上可接受的盐和其溶剂合物中的至少一种；
其中，
A为式IIa或式IIb所示的残基：
B为乙基、1-羟基乙基、异丙基或正丙基；
R1为：
含有一至六个碳原子的直链或支链烷基，其任选地被一个或多个相同或不同的基团R3取代；
含有二至六个碳原子的直链或支链烯基，其任选地被选自卤素、羟基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个相同或不同的基团取代；
含有二至六个碳原子的直链或支链炔基，其任选地被选自卤素、羟基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个相同或不同的基团取代；
含有三至六个碳原子的环烷基，其任选地被选自卤素、羟基、氨基、单烷基氨基和二烷基氨基的一个或多个相同或不同的基团取代；或
含有一至六个碳原子的直链或支链烷氧基羰基；
R2为异丁基或2-羟基异丁基；
X为-S(O)n-、硫-或氧；
R3分别独立地选自卤素、羟基、羧基、烷氧基羰基、-NR4R5和-NR6(CH2)mNR4R5；
R4和R5分别独立地为：
氢；
含有一至六个碳原子的直链或支链烷基，其任选地被一个或多个相同或不同的基团R7取代；
包括二至四个碳原子的直链或支链烯基或炔基；
含有三至六个碳原子的环烷基，其任选地被含有一至六个碳原子的直链或支链烷基取代；
取代的苯基，其任选地被选自卤素、烷氧基、烷氧基羰基、氨基、烷基氨基和二烷基氨基的一个至五个不同的集团取代；
饱和或不饱和杂环，其含有五个或六个环原子和选自氮、硫和氧的一至三个相同或不同的杂原子；
或者R4和R5与它们所连接的氮原子一起形成含有四至六个环原子的饱和或不饱和杂环，所述杂环可以任选地含有另一个选自氮、氧和硫的杂原子，所述杂环可以任选地被选自烷基、苯基和苄基的一至四个相同或不同的基团取代；
R6为氢或含有一至六个碳原子的直链或支链烷基；
R7分别独立地选自卤素、羟基、羧基、烷氧基羰基和-NR8R9；
R8和R9分别独立地为氢或含有一至六个碳原子的直链或支链烷基；
n为1或2；
m为2、3或4；
卤素为氟、氯、溴或碘。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述亲环孢素抑制剂中A为具有式IIa所示的残基，B为乙基。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述亲环孢素抑制剂中R1为2-氨基乙基、2-氨基丙基、2-单烷基氨基乙基、2-单烷基氨基丙基、2-二烷基氨基乙基、2-二烷基氨基丙基、2-单环烷基氨基乙基、2-单环烷基氨基丙基、2-二环烷基氨基乙基或2-二烷基氨基丙基，其中烷基为包含一至四个碳原子的直链或支链，环烷基包含三至六个碳原子。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述亲环孢素抑制剂中X为氧或硫；任选的，X为硫时，R1选自二甲基氨基乙基、二乙氨基乙基、甲基-叔丁基氨基乙基和乙基-叔丁基氨基乙基。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述亲环孢素抑制剂的药学上可接受的盐为磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、盐酸盐、甲磺酸盐或丙酸盐。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述亲环孢素抑制剂为下列之一或下列之一的药学上可接受的盐或溶剂合物：
3-甲氧基环孢菌素；
3-(2-氨基乙氧基)环孢菌素；
3(2-N，N-二甲基氨基乙氧基)环孢菌素；
3-(异丙氧基)环孢菌素；
3-(2-乙基丁氧基)环孢菌素；
3-(2，2-二甲基丙氧基)环孢菌素；
3-(2-羟基乙氧基)环孢菌素；
3-(3-羟基丙氧基)环孢菌素；
3-[2-(N-甲基氨基)乙氧基]环孢菌素；
3-[2-(N-甲基-N-异丙基氨基)乙氧基]环孢菌素；
3-[2-(哌啶-1-基)乙氧基]环孢菌素；
3-[2-(N-吗啉)乙氧基)环孢菌素；
3-乙氧基环孢菌素；
3-(2-甲氧基乙基硫基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-[(R)-2-(N，N-二甲基氨基)乙基硫基-Sar]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-乙硫基环孢菌素；
3-丙烯基硫代环孢菌素；
3-[(2-甲氧基)乙基硫基]环孢菌素；
3-(甲基硫基)4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-(甲氧基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-(丙-2-烯-1-氧)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-(异丙氧基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-(乙氧基)-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-[2-(甲氧基)乙氧基]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素；
3-[3-(甲氧基)丙氧基]-4-(γ-羟基甲基亮氨酸)环孢菌素。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述第二组分为恩替卡韦或替诺福韦，或这两者药学上可接受的盐或溶剂合物。
8.权利要求1所述的药物组合物在制备预防和/或治疗乙型肝炎药物中的用途，所述药物用于预防/治疗乙型肝炎病毒感染引起的疾病，任选地，所述乙型肝炎病毒感染引起的疾病为选自急性乙型肝炎、慢性乙型肝炎、肝纤维化、肝硬性、肝癌中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物组合物其给药方式采用皮下或肌肉注射的方式，或以混合物形式给药，或分别口服加注射的形式给药，或给予不同时间的先后次序形式给药。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物组合物的用药剂量为1-1000mg/天，优选为50-500mg/天，最优选为100mg/天。
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