CN110882255A - 齐墩果烷三萜类化合物在抗乙型肝炎病毒中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种式一所示的齐墩果烷三萜类化合物、其光学异构体、溶剂合物或药学可接受的盐在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用，
Figure DDA0001795926480000011
其中，R为羟基、C1‑10烷氨基、C1‑10烷氧基、C1‑10烷基、苯氧基、苄氧基或咪唑基，本发明提供的齐墩果烷三萜类化合物具有显著地抗HBV复制的作用，该类化合物与临床上使用药物相比，结构和作用机制均不同，存在广阔的开发前景。

Description

齐墩果烷三萜类化合物在抗乙型肝炎病毒中的应用
技术领域
本发明属于医药用途领域，特别涉及一种齐墩果烷三萜类化合物在抗乙型肝炎病毒中的应用。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染已成为全球性的公共健康问题，据2017年7月世界卫生组织统计，全球目前约有2.57亿HBV感染者。HBV感染可引起急性和慢性肝炎，继而引发肝脏病变。每年约数百万的患者死于HBV感染导致的肝功能衰竭、肝纤维化、肝硬化和肝癌。我国是乙型肝炎的高发区，慢性乙型肝炎是我国最常见的慢性传染性疾病之一，2006年表面抗原阳率达7.18％，现在虽有所降低，但仍在6％-7％左右。
HBV疫苗的普及和婴幼儿计划免疫项目的推广对乙肝的预防起到了积极的作用，但仍有5-10％左右的人对疫苗无抗体应答或产生不良反应，因此HBV的治疗仍是一个至关重要的问题。目前抗病毒治疗主要是干扰素(interferon，IFN)和核苷类似物(Nucleosideanalogues，NUCs)，上市的IFN包括IFNα和聚乙二醇IFNα；NUCs包括拉米夫定(lamivudine，3TC)、阿德福韦酯(adefovirdipivoxil，ADV)、恩替卡韦(entecavir，ETV)、替比夫定(telbivudine，LdT)和替诺福韦(tenofovir，TFV)。干扰素类药物治疗费用昂贵，且存在不良反应，限制了其在临床的广泛应用。核苷类似物通过抑制逆转录过程以抑制病毒复制，抑制病毒作用较强，但停药后复发率高，长期用药也存在耐药问题。他们均不能完全抑制HBV的复制，从而无法彻底清除病毒感染，无法治愈乙肝。因此迫切需要新机制、新靶点的抗乙肝药物。
HBV属于嗜肝DNA病毒，基因组结构特殊，为不完全双链环状DNA(rcDNA)，长链为负链，长度固定，约3.2kb；短链为正链。HBV在细胞内的生命周期大致包括：病毒与受体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白(Na+/taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)结合，进入肝细胞并释放核衣壳，rcDNA进入细胞核，延长修补正链形成共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)，然后转录形成RNA，RNA可翻译形成HBV各结构蛋白和功能蛋白，衣壳蛋白装配形成衣壳，前基因组RNA(pregenomic RNA，pgRNA)与逆转录酶一起被包裹入衣壳，进一步逆转录形成rcDNA，再经过内质网和高尔基体包被，形成成熟的病毒颗粒，最后分泌至胞外。pgRNA被包裹进入衣壳后也可直接经过包被，分泌至细胞外。药物影响HBV复制周期的任何一个环节都可能抑制病毒的复制。
齐墩果烷型三萜类物质如垂盆草、灵芝、茯苓、山楂、薰衣草、青叶胆、女贞子、地榆等作为我国传统中医药，仍在临床使用，具有保肝、抗肿瘤、抗炎、降糖及抗病毒的作用。文献报道，2-氰基-3,12-二氧齐墩果烷-1,9(11)-二烯-28-酸(CDDO)及其衍生物是一类具有独特分子结构的多功能药物。如，在CCl4诱导的小鼠肝硬化和HCC模型中，乙酰胺CDDO(CDDOethyl amide，CDDO-EA)能减慢肝纤维化，降低血清胆红素和腹水，减小HCC实验模型的肝肿瘤体积；CDDO-EA可以对抗高糖引起的髓核细胞凋亡和ROS积累，保护细胞免于氧化损伤；组蛋白去乙酰化酶抑制剂与CDDO-EA联用，显著降低RAW264.7细胞中新生成的NO，且能明显延缓的小鼠肺癌的发生；临床试验证明CDDO类化合物能明显改善晚期慢性肾病和2型糖尿病患者的肾小球滤过率。但是目前文献中尚无CDDO相关化合物在抗HBV方面的应用。
发明内容
本发明提供一种齐墩果烷三萜类化合物的新用途，即齐墩果烷三萜类化合物在抗乙型肝炎病毒中的应用。
本发明具体技术方案如下：
本发明提供一种式一所示的齐墩果烷三萜类化合物、其光学异构体、溶剂合物或药学可接受的盐在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用，
Figure BDA0001795926460000031
其中，R为羟基、C1-10烷氨基、C1-10烷氧基、C1-10烷基、苯氧基、苄氧基或咪唑基。
优选地，R为羟基、C1-4烷氨基或C1-4烷氧基。
优选地，R为羟基，简称CDDO，结构如下所示：
Figure BDA0001795926460000032
优选地，R为乙氨基，简称CDDO-EA，结构如下所示：
Figure BDA0001795926460000041
优选地，R为甲氧基，简称CDDO-Me，结构如下所示：
Figure BDA0001795926460000042
式一所示的齐墩果烷三萜类化合物、其光学异构体、溶剂合物或药学可接受的盐在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
本发明中所用术语C1-10烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基等，所述烷基可以是取代的或未取代的，当被取代时，包括三氟甲基、三氟乙基、羟甲基、羟基乙基、氨基甲基、氨基乙基等。
本发明中所用术语C1-10烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基和叔丁氧基等。
本发明中所用术语C1-10烷氨基包括甲氨基、乙氨基、丙氨基、异丙氨基、丁氨基、异丁氨基、仲丁氨基、叔丁氨基等。
本发明中所用术语C1-10烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基等。
本发明所用术语“异构体”包括本发明式一所示的齐墩果烷三萜类化合物的所有可能的异构体(例如对映异构体、非对映异构体、几何异构体、构象异构体、差向异构体和旋转异构体等)形式。例如，不对称中心各自的R和S构型、(Z)和(E)双键异构体和(Z)和(E)构象异构体均在本发明的保护范围内。
本发明式一所示的齐墩果烷三萜类化合物可以形成溶剂合物，例如水合物、醇合物等。一般来说，与药学可接受的溶剂如水、乙醇等形成的溶剂合物形式与非溶剂合物形式相当。
本发明式一所示的齐墩果烷三萜类化合物还可以是前药或可在体内代谢变化后释放出所述活性成分的形式。选择和制备适当的前药衍生物是本领域技术人员公知技术，本发明对此不做限制。
本发明式一化合物或其药学可接受的盐还可以以晶体存在，本发明包含式一所示的齐墩果烷三萜类化合物或其药学可接受的盐的任意晶型。
本发明式一所示的齐墩果烷三萜类化合物、其光学异构体、溶剂合物或药学可接受的盐可以通过以下途径给药：胃肠外、局部、静脉内、口服、皮下、动脉内、真皮内、经皮、直肠、颅内、腹膜内、鼻内、肌内途径或作为吸入剂。
本发明式一所示的齐墩果烷三萜类化合物、其光学异构体、溶剂合物或药学可接受的盐可以药物制剂的形式给药，该药物组合物包括式一所示的齐墩果烷三萜类化合物、其光学异构体、溶剂合物或药学可接受的盐及药学可接受的载体或辅料。
本发明的式一所示的齐墩果烷三萜类化合物、其光学异构体、溶剂合物或药学可接受的盐可根据给药途径配成各种适宜的剂型。
当口服用药时，本发明化合物可制成任意口服可接受的制剂形式，包括但不限于片剂、胶囊、水溶液或水悬浮液。其中，片剂使用的载体一般包括乳糖和玉米淀粉，另外也可加入润滑剂如硬脂酸镁。胶囊制剂使用的稀释剂一般包括乳糖和干燥玉米淀粉。水悬浮液制剂则通常是将活性成分与适宜的乳化剂和悬浮剂混合使用。任选地，以上口服制剂形式中还可加入一些甜味剂、芳香剂或着色剂。
当皮肤局部施用时，本发明化合物可制成适当的软膏、洗剂或霜剂制剂形式，其中将活性成分悬浮或溶解于一种或多种载体中。软膏制剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、乳化蜡和水；洗剂或霜剂可使用的载体包括但不限于：矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、吐温60、十六烷酯蜡、十六碳烯芳醇、2-辛基十二烷醇、苄醇和水。
本发明式一所示的齐墩果烷三萜类化合物、其光学异构体、溶剂合物或药学可接受的盐还可以无菌注射制剂形式用药，包括无菌注射水或油悬浮液或无菌注射溶液，也可以是冻干形式。其中，可使用的载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，灭菌的非挥发油也可用作溶剂或悬浮介质，如单甘油酯或二甘油酯。
本发明的药物制剂包括药学上可实施的任何制剂，例如口服制剂、肠胃外给药制剂等。
1.应用PrestoBlue细胞活性检测试剂检测了齐墩果烷三萜类化合物在对HepAD38(HepAD38是基于肝癌细胞HepG2构建的稳定表达HBV基因组的细胞系，HBV表达受四环素调控)的毒性；同时观察个药物浓度对细胞病变效应(Cytopathic effect，CPE)情况，以确定各齐墩果烷三萜类化合物在细胞中抗HBV药效评价所用的工作浓度。结果显示1μM CDDO组、0.6μM CDDO-EA以及0.6μM CDDO-Me组细胞活力与对照组无明显差异，但是显微镜下细胞形态略有变化。因此，后续实验中我们选择0-0.8μM CDDO以及0-0.4μM CDDO-EA和CDDO-Me进行体外药效评价。
2.从荧光定量PCR结果看出本发明提供的齐墩果烷三萜类化合物不仅能剂量依赖性降低细胞内HBV core DNA的水平，而且能剂量依赖性降低上清中HBV DNA的含量。从Southern blot结果看出本发明提供的齐墩果烷三萜类化合物成比例降低细胞内HBVrcDNA(relaxed circular DNA)、DSL DNA(double-stranded linear DNA)以及ssDNA(single-strand,negative polarity DNA)的含量，且作用机制与阳性对照药3TC抗HBV的作用机制不同。
3.本发明提供的齐墩果烷三萜类化合物对细胞内总HBV pgRNA表达无明显影响作用，但呈剂量依赖性降低衣壳化pgRNA的含量。说明齐墩果烷三萜类化合物不影响pgRNA的表达，可通过影响pgRNA被包裹入衣壳的环节抑制HBV复制。
4.本发明提供的齐墩果烷三萜类化合物对细胞内总HBc表达无明显影响作用，对衣壳的迁移率无影响，但能剂量依赖性增加衣壳的含量，降低衣壳内HBV DNA的含量，表明本发明提供的齐墩果烷三萜类化合物不影响HBc的表达，可影响衣壳蛋白装配发挥抗HBV作用。
5.ELISA检测检测结果显示，本发明提供的齐墩果烷三萜类化合物不影响上清中HBeAg的含量，但能降低HBsAg含量。
由此得出本发明提供的齐墩果烷三萜类化合物具有显著抗HBV复制的作用。
附图说明
图1为齐墩果烷三萜类化合物在HepAD38细胞中细胞活力的影响结果图；图中A表示CDDO在HepAD38细胞中细胞活力的影响结果图，B表示CDDO-EA在HepAD38细胞中细胞活力的影响结果图；C表示CDDO-Me在HepAD38细胞中细胞活力的影响结果图；
图2为齐墩果烷三萜类化合物对HepAD38细胞内HBV core DNA表达水平的影响结果图；图中A、B、C和D分别表示qPCR方法检测CDDO-EA、CDDO、CDDO-Me和阳性对照药3TC对HepAD38细胞内HBV core DNA表达水平的影响结果图；图中E表示Southern blot方法检测CDDO-EA、CDDO和阳性对照药3TC对HepAD38细胞内HBV core DNA表达水平的影响结果图。
图3为齐墩果烷三萜类化合物对HepAD38细胞上清HBV DNA表达水平的影响结果图；图中A表示CDDO-EA对HepAD38细胞上清HBV DNA表达水平的影响结果图，B表示CDDO对HepAD38细胞上清HBV DNA表达水平的影响结果图。
图4为齐墩果烷三萜类化合物对HepAD38细胞内总HBV pgRNA表达水平的影响结果图；图中A表示CDDO-EA对细胞内总HBV pgRNA表达水平的影响结果图，B表示CDDO对细胞内总HBV pgRNA表达水平的影响结果图。
图5为齐墩果烷三萜类化合物对HepAD38细胞HBV衣壳化pgRNA表达水平的影响结果图，图中A表示CDDO-EA对HepAD38细胞HBV衣壳化pgRNA表达水平的影响结果图，B表示CDDO对HepAD38细胞HBV衣壳化pgRNA表达水平的影响结果图。
图6为齐墩果烷三萜类化合物对HepAD38细胞内HBc总蛋白表达水平的影响结果图；图中泳道1为细胞对照，2、8和14为病毒对照，3-7依次为0.05、0.1、0.2、0.3和0.4μM的CDDO-EA，9-13依次为0.2、0.3、0.4、0.6和0.8μM的CDDO，15为3TC对照，16为Bay 41-4109对照，17为BA-38017对照。
图7为齐墩果烷三萜类化合物对HepAD38细胞HBV衣壳含量和迁移率的影响结果图，图中A表示1.5％琼脂糖凝胶下检测CDDO和CDDO-EA对HepAD38细胞HBV衣壳含量和迁移率的影响结果图；B表示1.8％琼脂糖凝胶下检测CDDO和CDDO-EA对HepAD38细胞HBV衣壳含量和迁移率的影响结果图；泳道1为细胞对照，2、8和14为病毒对照，3-7依次为0.05、0.1、0.2、0.3和0.4μM的CDDO-EA，9-13依次为0.2、0.3、0.4、0.6和0.8μM的CDDO，15为3TC对照，16为Bay 41-4109对照，17为BA-38017对照。
图8为齐墩果烷三萜类化合物对HepAD38细胞上清液中HBsAg含量和HBeAg含量的影响结果图，图中A表示CDDO-EA对HepAD38细胞上清液中HBsAg含量的影响结果图，B表示CDDO对HepAD38细胞上清液中HBsAg含量的影响结果图，C表示CDDO-EA对HepAD38细胞上清液中HBeAg含量的影响结果图，D表示CDDO对HepAD38细胞上清液中HBeAg含量的影响结果图。
具体实施方式
为了更好理解本发明的内容，下面结合具体实施方法对本发明内容作进一步说明，但本发明的保护内容不局限于以下实施例。
实施例1齐墩果烷三萜类化合物对HBV DNA的抑制作用
1.细胞培养
HepAD38细胞传代用培养液(tet+)：含10％胎牛血清(Gbico)、380μg/ml G418(Gibco)、青霉素和链霉素双抗100U/ml(Gibco)和2μg/mL四环素(Tetracycline，tet，Sigma)的MEM(Gibco)培养液。
HepGAD38细胞种板/稀释药物所用培养液(tet-)：含10％胎牛血清(Gbico)、380μg/ml G418(Gibco)、青霉素和链霉素双抗100U/ml(Gibco)的培养液。
HepAD38细胞汇合度达90％时，培养瓶内加入0.25％胰酶-EDTA(Gibco)，37℃消化5分钟，弃掉胰酶，残液37℃继续消化5分钟，加含有四环素的完全培养液吹散，1:3传代，3-4天传代一次。
2.细胞毒性检测
HepAD38细胞接种于96孔板中，2×104个/孔，37℃、5％CO2中培养；24h后，用不含四环素的完全培养基将药物CDDO(购于MedChemExpress公司)、CDDO-EA(购于MedChemExpress公司)和CDDO-Me(购于MedChemExpress公司)稀释成不同浓度，加入细胞中，同时设置空白对照组(只有培养液没有细胞)和细胞对照组(未加药细胞)，每组3个平行孔。加药后第3d更换一次相同培养液。①给药6d后，在倒置显微镜下观察各孔细胞的生长状态，不同给药浓度的细胞与正常细胞作对比，分别观察各给药孔细胞CPE，以细胞状态改变或死亡比例分别标记为4+(细胞死亡比例75％-100％)、3+(细胞死亡比例50％-75％)、2+(细胞死亡比例25％-50％)、1+(细胞死亡比例0-25％)和0+(细胞状态与对照组无差异)。②分别在给药6d，每孔加入PrestoBlue溶液，将培养板在培养箱内孵育30min-2小时，在PerkinElmer EnSpire多功能酶标仪上检测激发波长为560nm、发射波长为590nm的荧光值。结果以公式[(细胞对照荧光值-空白孔荧光值)-(给药组细胞荧光值-空白孔荧光值)]/(细胞对照荧光值-空白孔荧光值)，计算各药物浓度细胞存活率，结果见图1。
图中显示0-0.8μM CDDO组、0-0.4μM CDDO-EA以及0-0.04μM CDDO-Me各组细胞状态改变均为0+。虽然PrestoBlue法中1μM CDDO组、0.6μM CDDO-EA以及0.6μM CDDO-Me组细胞活力与对照组无明显差异，但是CPE法观察到细胞形态略有变化。综合上述两种方法，确定化合物进行体外药效的工作浓度：CDDO为0-0.8μM，CDDO-EA和CDDO-Me为0-0.4μM。
3.化合物对HBV DNA的抑制作用
HepAD38细胞接种于24孔板中，1×105个/孔，37℃、5％CO2中培养；24h后，将孔板中培养基弃去，加入用不含四环素的完全培养基稀释的不同浓度药物。设置细胞对照组(培养液含四环素不含药，tet+)、病毒对照组(培养液不含四环素不含药，tet-)、阳性对照组(拉米夫定，3TC，购于MedChemExpress公司)和实验药物组(CDDO、CDDO-EA和CDDO-Me)。加药第3d更换一次相同培养液，在加药6d后收取细胞和上清，上清进行2000rpm离心10min后取上清液，保存于-80℃待测。
3.1细胞内HBV core DNA
细胞裂解液配制：10mM Tris-HCl/pH＝8.0，1mM EDTA，1％NP40；
细胞HBV core DNA提取：每孔加入300uL细胞裂解液，室温裂解5-10min，12000rpm离心5min；取上清，加入蛋白酶K(终浓度为20mg/mL，Sigma)，37℃消化1h；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，上下颠倒混匀，12000rpm离心30min；取上清，加入1/10体积的3M醋酸钠(PH＝5.5)混匀，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀，-20℃过夜；12000rpm 4℃离心20min，弃掉上清，再加入75％乙醇，12000rpm 4℃离心10min；弃掉上清液，12000rpm 4℃离心3min，吸去多余液体，室温静置1min；用20μL的ddH2O溶解沉淀即得到HBV core DNA，-20℃保存备用。
qPCR法对细胞内HBV core DNA测定和计算：使用试剂盒TransStart Tip GreenqPCR SuperMix(北京全式金有限公司)在ABI7500Fast型高通量实时荧光定量PCR(qPCR)仪检测HBV core DNA含量，每个DNA样品重复测定2次。
HBV core DNA qPCR引物：5’-GGCTTTCGGAAAATTCCTATG-3’(上游)；5’-AGCCCTACGAACCACTGAAC-3’(下游)。
反应体系如下所示：
实时荧光定量反应体系
Figure BDA0001795926460000111
Figure BDA0001795926460000121
反应条件：20uL体系，94℃，30s，1个循环；94℃5s，60℃30s，40个循环。每个DNA样品平行进行两个反应。
反应结束后，每个样品HBV core DNA相对于对照组的含量用ΔΔCt法进行计算，计算公式如下：
相对含量(％)＝2^(HBV Ct对照组-HBV Ct药物组)×100％(HBV Ct对照组)，HBV Ct对照组代表病毒对照组HBV core DNA的Ct值；HBV Ct药物组代表不同浓度药物组HBV core DNA的Ct值，结果见图2(A、B、C和D)。
从图中可以看出，CDDO和CDDO-EA显著降低细胞内HBV core DNA的水平，且成剂量依赖性；0.4μM CDDO-EA对HBV core DNA抑制率约为86％，0.8μM CDDO对HBV core DNA抑制率约为66％，而0.4μM CDDO-Me对HBV core DNA抑制率为29％；阳性药3TC剂量依赖性抑制HBV core DNA的水平，0.8μM 3TC对HBV core DNA抑制率约为88％。
Southern blot法对细胞内HBV core DNA测定：
(1)相关液体配制：
变性液：0.5N NaOH、1.5M NaCl；
中和液：1.5M NaCl、1M Tris-HCl，pH7.4；
20×SSC：3M NaCl、0.3M柠檬酸钠。
(2)DIG标记的HBV DNA探针的制备：将表达HBV的质粒通过酶切成线性，然后利用DIG RNA labeling mix(Roche)通过体外转录试剂盒(Promega)合成DIG特异标记的HBV负链RNA，DNase I消化质粒模板，-20℃分装保存。
(3)取HBV core DNA样品10uL，加至1.2％的琼脂糖胶中，进行电泳，70V 6h；将胶放入0.2N HCl中，室温摇晃15min；变性液中浸泡1h；中和液中浸泡1h；20×SSC进行转膜，通过虹吸作用将DNA转印到膜上；将膜放入杂交液(Roche)中，50℃预杂交1h；加入DIG标记的HBV DNA探针，50℃杂交过夜；2×SSC，0.1％SDS在室温下洗膜2次，5min/次；0.5×SSC，0.1％SDS在68℃洗膜2次，15min/次；加入1×Blocking buffer(Roche)，室温孵育30min；加入抗DIG抗体(Cell Signaling Technology)，室温孵育30min；1×Washing buffer(Roche)洗膜，2次，20min/次；将膜放入Detection buffer(Roche)中，室温摇晃5min；加入ECL显色液，成像，结果见图2(E)。
从图中可以看出，Southern blot得到的结果与qPCR结果相一致。此外，Southernblot结果还能看出，3TC对HBV rcDNA和DSL降低的比例要多于ssDNA，与其作用机制相吻合，而CDDO和CDDO-EA成比例降低rcDNA、DSL DNA以及ssDNA的含量，也提示CDDO和CDDO-EA与3TC抗HBV的作用机制不同。
3.2上清HBV DNA
根据乙型肝炎病毒核酸定量测定试剂盒(PCR-荧光探针法，湖南圣湘生物科技有限公司)提供的方法，每个PCR反应管中加入5μL核酸释放剂；再加入5μL待测上清样本/标准品，吸打3～5次混匀，室温裂解10min；每管加入40μL PCR-mix(反应液38μL+酶混合液2μL+内标0.2μL)，放入ABI7500Fast型高通量实时荧光定量PCR仪，上机检测。
反应条件如下：50uL体系，50℃2min；94℃，5min；94℃15s，57℃30s，45个循环。
反应结束后，机器根据试剂盒提供标准品形成一条标准曲线，根据标准曲线机器自动计算出每个样品HBV DNA的含量，结果见图3。
Figure BDA0001795926460000141
从图中可以看出，CDDO和CDDO-EA剂量依赖性降低上清中HBV DNA的含量。
实施例2齐墩果烷三萜类化合物对HBV pgRNA的抑制作用
HepAD38细胞接种于24孔板中，1×105个/孔，37℃、5％CO2中培养；24h后，将孔板中培养基弃去，加入用不含四环素的完全培养基稀释的不同浓度药物。设置细胞对照组(培养液含四环素不含药，tet+)、病毒对照组(培养液不含四环素不含药，tet-)和实验药物组(CDDO和CDDO-EA)。加药第3d更换一次相同培养液，在加药6d后弃掉上清液体，将含有细胞的24孔板保存于-80℃待测。
1.1细胞内总HBV pgRNA
细胞内总RNA提取：24孔板中加入TRIzol(Invitrogen)，1mL/孔，冰上裂解10min；加入200μL氯仿抽提，轻轻颠倒混匀，12000rpm 4℃离心15min；将上层水相加入等体积异丙醇，室温放置5～10min，12000rpm4℃离心15min；加入500μL 75％的乙醇清洗沉淀RNA，轻抚混匀，使RNA分散，12000rpm 4℃离心10min；弃掉上清，8000rpm 4℃离心2min；20μL DEPC水溶解沉淀即得到RNA，通过NanoDrop 2000超微量分光光度计测定各样品RNA浓度后-80℃保存待测。
逆转录(reverse transcriptase，RT)反应：按照RNA逆转录试剂盒(Promega)说明书配制反应液，取1μg RNA样品+10.5μL逆转录混合液[5×buffer(4μL)+MgCl2(4μL)+dNTP(1μL)+RT(1μL)+RNase inhibitor(0.5μL)]，再加入RNase-free水补至20μL体系，混匀后放于PCR仪上；逆转录反应程序：25℃，5min；42℃，60min；70℃，15min。
qPCR测定：将逆转录反应得到的cDNA以β-actin作为内参进行qPCR检测，反应体系和条件与实施例1中相同。
HBV pgRNA RT-qPCR引物：5’-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3’(上游)；5’-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3’(下游)。
β-actin PCR引物：5’-CCAACCGCGAGAAGATGA-3’(上游)；5’-CCAGAGGCGTACAGGGATAG-3’(下游)。
结果见图4。
从图中可以看出，CDDO和CDDO-EA对细胞内HBV pgRNA总量表达没有明显影响。
1.2 HBV衣壳化pgRNA
HBV衣壳化pgRNA的提取：
裂解液配制：50mM Tris-HCl(pH＝7.5)，1mM EDTA，150mM NaCl，1％NP-40。
TNE buffer：10mM Tris-HCl(pH＝8)，100mM NaCl，1mM EDTA。
24孔板细胞中加入300μL裂解液，室温裂解细胞，20min；10000rpm，离心5min，转移上清至另一1.5mL EP管中，再加入1μL微球菌核酸酶(NEB)和15μL 100mM CaCl2，37℃放置30min，消化游离核酸；加入15μL 0.5M EDTA，颠倒混匀；加入125μL 35％PEG-8000，颠倒混匀后，短暂离心，冰上放置2h；6000rpm离心10min，弃去上清，再加入50μL，4℃，过夜放置，重悬沉淀；每管中加入1mL TRIzol，进行RNA提取，步骤同1.1，即得到HBV衣壳化pgRNA。
逆转录反应：按照RNA逆转录试剂盒(Promega)说明书配制反应液，取9.5μL RNA样品+10.5μL逆转录混合液[5×buffer(4μL)+MgCl2(4μL)+dNTP(1μL)+RT酶(1μL)+RNaseinhibitor(0.5μL)]，共20μL体系，混匀后放于PCR仪上；逆转录反应程序：25℃，5min；42℃，60min；70℃，15min。
qPCR测定：将逆转录反应得到的cDNA进行实时荧光定量PCR检测，反应体系和条件与实施例1中相同。
HBV pgRNA RT-qPCR引物：5’-GAGTGTGGATTCGCACTCC-3’(上游)；5’-GAGGCGAGGGAGTTCTTCT-3’(下游)。
结果见图5。
从图中可以看出，CDDO和CDDO-EA均剂量依赖性降低HBV衣壳化pgRNA的表达水平。
实施例3齐墩果烷三萜类化合物对HBc蛋白含量的影响作用
CDDO和CDDO-EA作用于HepAD38细胞，以4μM 3TC(不影响HBc和衣壳装配)、2μMBay41-4109(购于MedChemExpress公司，降低HBc含量并使得衣壳蛋白降解)和5μM BA-38017(美国Baruch.S Blumberg研究所郭巨涛教授惠赠，不影响HBc含量但能加速衣壳迁移率)作为对照药物，样品收取过程与实施例2中相同。
细胞总蛋白裂解液配制(5×)：0.05％溴酚蓝(质量/体积比)，0.3M Tris-HCl(pH＝6.8)，50％甘油(体积比)，10％SDS(质量/体积比)，25％β-巯基乙醇(体积比)。
24孔板细胞中加入100μL 1×蛋白裂解液，冰上裂解10分钟，转入EP管中；100℃10min；12000rpm 4℃离心10min，取上清转移至新EP管中备用。
电泳：配制积层胶(浓度为5％)和分离胶(浓度为10％)，样品进行SDS-PAGE电泳，在积层胶采用电压60V，当溴酚蓝进入分离胶后，把电压提高到110V继续电泳，根据蛋白Marker位置判断跑胶完成后，转膜。
转膜：在电泳期间即制备转膜缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，20％(体积比)甲醇)，置于4℃预冷。PVDF膜预先用甲醇活化1min，然后浸于转膜缓冲液中。电泳结束后，小心取下凝胶，转移到转膜缓冲液中平衡5min，之后进行湿转。在转膜仪的阳极自下而上依次铺3张滤纸、PVDF膜、凝胶、3张滤纸，叠放整齐，注意气泡的撵除。制作三明治完毕，将转膜仪的阴极盖好，恒流250mA转约30min。
抗体孵育：转膜结束后，将膜取下，摇床上TBST洗10min。将膜放入封闭液(5％脱脂奶粉于TBST)中，室温振摇封闭1h。抗HBc(南京金斯瑞生物科技有限公司制备)和β-actin(Cell Signaling Technology)一抗用封闭液体1：1000稀释，4℃孵育过夜。次日，移除一抗溶液，TBST洗3次，每次10min。用封闭液将辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(北京全式金生物技术有限公司)溶液1：5000稀释，室温孵育1h，TBST洗3次，每次10min。
显色：最后用ECL免疫印迹化学发光试剂(Millipore)孵育，通过ChemiDoc XRS+化学发光成像分析系统(BIO-RAD)捕获图像，结果见图6。
从图中可以看出，CDDO和CDDO-EA均对HBc蛋白的表达无明显影响作用；对照药3TC和BA-38017对HBc蛋白的表达无明显影响作用，Bay41-4109降低了HBc蛋白的表达。
实施例4齐墩果烷三萜类化合物对衣壳含量的影响作用
CDDO和CDDO-EA作用于HepAD38细胞，以3TC(4μM)、Bay41-4109(2μM)和BA-38017(5μM)作为对照药物，样品收取过程与实施例2中相同。
24孔板细胞中加入150μL细胞裂解液(配方同实施例1)，冰上裂解10分钟，转入EP管中；100℃10min；12000rpm 4℃离心10min，取上清转移至新EP管中备用。
各取上清25μL，与5μL 6X DNA loading buffer混匀，分别加至1.5％和1.8％的琼脂糖胶中，进行电泳，70V 6h；制备转膜三明治，滤纸-凝胶-NC膜-滤纸，置于TNE缓冲液中，滤纸上放纸巾，用保鲜膜封好体系，压上1kg左右的重物，室温放置过夜，通过虹吸作用将DNA转移到NC膜上；转膜结束后PBS洗膜约5min；把膜放入2.5％多聚甲醛，室温摇床固定10min；蒸馏水洗膜一次，50％甲醇室温固定20min；PBS室温洗膜5min后，TBST配置5％的脱脂牛奶，室温封闭1h；抗HBc一抗(南京金斯瑞生物科技有限公司)用封闭液体1：1000稀释，4℃孵育过夜。次日，移除一抗溶液，TBST洗3次，每次10min。用封闭液将辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗(北京全式金生物技术有限公司)溶液1：5000稀释，室温孵育1h，TBST洗3次，每次10min；最后用ECL免疫印迹化学发光试剂(Millipore)孵育，通过ChemiDoc XRS+化学发光成像分析系统(BIO-RAD)捕获图像，得到衣壳含量以及迁移率变化结果。
将膜在变性液(配方见实施例1)中浸泡5min；再在中和液(配方见实施例1)中浸泡10min；后续进行DIG标记的HBV DNA探针杂交步骤与实施例1中Southern blot步骤相同，最后得到衣壳中HBV DNA含量的结果，结果见图7。
从图中可以看出，无论是1.5％凝胶还是1.8％凝胶的结果均显示，CDDO和CDDO-EA均能剂量性增加衣壳的含量，且剂量性降低衣壳HBV DNA的含量，但两个化合物均对衣壳的迁移速率无明显影响。对照药3TC、Bay41-4109和BA-38017均显著降低衣壳内HBV DNA的含量，3TC对衣壳的含量和迁移率均无影响；Bay41-4109作用后没有检测到衣壳；BA-38017可以加快衣壳迁移率。
实施例5齐墩果烷三萜类化合物对HBsAg和HBeAg的影响作用
CDDO和CDDO-EA作用于HepAD38细胞，样品处理过程与实施例2中相同，药物作用第6d时收取细胞上清液，进行2000rpm离心10min后取上清，保存于-80℃待测。
从2-8℃冰箱中取出HBsAg和HBeAg检测试剂盒(北京科美生物技术有限公司)，在室温下平衡30分钟，同时将浓缩洗涤液作1：20稀释；将微孔板从密封袋中取出，设空白对照两孔，校准品孔，并根据设计的样本数量在板架上放好微孔板条；除空白对照孔外，其余孔分别加入50μL校准品或待测上清；除空白对照孔外，其余每孔加入酶标记物50μL；用微量振荡器振荡混匀5s，用封板膜封闭反应板，置37℃温育1h；每孔应加入不少于350μl的洗涤液，洗板5次，每次浸泡10s，最后在干净的吸水纸上拍干；每孔加入化学发光底物工作液(两种发光底物等体积混匀)100μL，用微量振荡器振荡混匀5s；室温避光静置反应5min，立刻在EnVision多功能酶标仪上(PerkinElmer)依序测量各孔的发光值；根据标准品数值绘制标准曲线，计算每孔HBsAg或HBeAg含量，结果见图8。
从图中可以看出，CDDO和CDDO-EA均能降低上清中HBsAg的含量，对HBeAg含量无明显影响。

Claims (6)

1.一种式一所示的齐墩果烷三萜类化合物、其光学异构体、溶剂合物或药学可接受的盐在制备抗乙型肝炎病毒药物中的应用，
Figure FDA0001795926450000011
其中，R为羟基、C1-10烷氨基、C1-10烷氧基、C1-10烷基、苯氧基、苄氧基或咪唑基。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，R为羟基、C1-4烷氨基或C1-4烷氧基。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，R为羟基。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，R为乙氨基。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，R为甲氧基。
6.如权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，式一所示的齐墩果烷三萜类化合物、其光学异构体、溶剂合物或药学可接受的盐在制备治疗乙型肝炎药物中的应用。
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