CN114712342B - 紫草酸在制备抗流感病毒药物中的应用 - Google Patents

紫草酸在制备抗流感病毒药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了紫草酸在制备抗流感病毒药物中的用途，属于制药领域。实验结果显示：紫草酸对多种流感病毒株的滴度均具有较好的抑制活性，且具有剂量依赖性。紫草酸对感染病毒的细胞中NP mRNA、NP及NS1蛋白表达均有显著的抑制作用。此外，紫草酸与奥司他韦按照1:2的摩尔比联合处理具有较单独应用紫草酸或奥司他韦更强的抑制效果。以上结果表明，紫草酸对流感病毒具有较好的抑制活性，具备制备抗甲型流感病毒药物的潜力。

Description

紫草酸在制备抗流感病毒药物中的应用
技术领域
本发明属于制药领域，涉及紫草酸在制备抗流感病毒药物中的应用。
背景技术
流感病毒是分节段的单股负链RNA病毒，属正黏病毒科。流感病毒感染引发的流行性感冒在世界范围内广泛流行，给公共卫生和畜禽业的发展带来重大的威胁。到目前为止，已被发现的流感病毒有甲(A)、乙(B)、丙(C)和丁(D)4种类型。其中，甲型流感病毒(Influenza Avirus,IAV)最易传染且极易发生变异，危害性最大。IAV的RNA有8个片段，主要编码PB1、PB2、PB1-F2、PA、HA、NA、NP、NS1、M1、M2和NEP/NS2等11种蛋白。其中核蛋白(nucleoprotein,NP)是病毒的主要结构蛋白，与RNA及RNA多聚酶(含PA、PB1、PB2三个亚基)共同构成病毒核衣壳的结构。血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)是位于病毒包膜上的两种重要蛋白。根据HA和NA抗原特异性的不同，IAV可分为多种不同的亚型，常见的有H1N1、H5N1及H9N2等。此外，病毒包膜上还有基质蛋白2(matrixprotein,M2)，具有离子通道的作用，有助于病毒进入细胞。
被批准过在临床上使用的抗IAV药物主要有三类：(1)M2离子通道抑制剂，如金刚烷胺和金刚乙胺；(2)神经氨酸酶抑制剂，如奥司他韦和扎那米韦；(3)RNA聚合酶抑制剂，法匹拉韦和巴洛沙韦酯。金刚烷胺和金刚乙胺是被最早批准用于临床的一类抗IAV药物，但由于其具有严重的不良反应，且现行的流感病毒株均对其具有耐药性，已不被推荐使用。神经氨酸酶抑制剂和RNA聚合酶抑制剂在近年来的应用过程中也出现了一定程度的耐药，其应用受到了极大的限制。因此，迫切需要开发出新型的抗IAV药物。
从丰富的中药资源中挖掘新型抗IAV药物具有广阔前景。紫草酸是存在于丹参等中药中的一种水溶性多酚类化合物。研究表明，紫草酸能够通过阻碍TLR4/NF-κB信号通路传导显著抑制脂多糖刺激单核巨噬细胞THP-1中TNF-α、IL-1β及IL-6等炎性因子的产生，具有较好的抗炎活性；紫草酸对HIV-1的核衣壳蛋白、P24抗原及复制酶均有一定的抑制活性；紫草酸能明显改善Huh7细胞和BALB/c小鼠模型上CCl4诱导的肝氧化损伤，具有较好的保肝活性；同时，紫草酸还被发现对NA抑制剂筛选试剂盒的病毒NA具有较强的抑制活性，但尚未见紫草酸抗流感药效的报道。
紫草酸：分子式C27H22O12，分子量538.461，CAS No.：28831-65-4，结构式如下：
Figure BDA0003637198740000021
发明内容
本发明的第一个目的是提供紫草酸在制备抗流感病毒药物中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种由紫草酸和奥司他韦组成的药物组合物。
本发明的第三个目的是提供由紫草酸和奥司他韦组成的药物组合物在制备抗流感病毒药物中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种抗流感病毒药物。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：首先，申请人在体外从对病毒滴度、NPmRNA、NP和非结构蛋白1(nonstructural protein1,NS1)蛋白的影响三个方面研究了紫草酸对H1N1、H9N2等多株流感病毒的抑制效果，结果显示，紫草酸对病毒滴度均有显著的抑制作用，对病毒的NP mRNA及NP、NS1蛋白也有显著的抑制作用。接着，申请人考察了紫草酸与奥司他韦联用后的抗流感效果，通过将紫草酸与奥司他韦按照不同摩尔比联用，发现当二者摩尔比为1:2时，在感染后48小时(hpi,hours post infection)时对病毒的NP mRNA及滴度的抑制作用较单独应用紫草酸或奥司他韦更强，二者具有显著的协同增效作用。
结果表明，紫草酸能够抑制流感病毒，具有制备抗流感病毒药物的潜力。在制备所述抗流感病毒药物时，可以将紫草酸单独作为活性成份，也可以将紫草酸和奥司他韦共同作为活性成分，当然，该药物还可含有药学上可被接受的载体。
更详尽的技术方案参见实施例。
附图说明
图1：CCK-8法检测紫草酸在MDCK、A549细胞上的毒性。A：不同浓度紫草酸处理的A549细胞存活率，B：不同浓度紫草酸处理的MDCK细胞存活率，C：紫草酸对A549细胞的CC50曲线，D：紫草酸对MDCK细胞的CC50曲线；**p<0.01vs Control,n＝3。
图2：紫草酸在A549和MDCK细胞上对WSN、PR8和H9N2病毒滴度的抑制作用。A、B:WSN；C、D:PR8；E、F:H9N2；*p<0.05,**p<0.01vs DMSO,n＝3。
图3：紫草酸对感染WSN的A549细胞中NP mRNA表达的影响。A：紫草酸处理24hpi；B：紫草酸处理48hpi；*p<0.05,**p<0.01vs DMSO,n＝3。
图4：紫草酸对感染WSN的A549细胞中NP、NS1蛋白表达的影响。A、B、C：紫草酸处理24hpi的蛋白表达测定；D、E、F：紫草酸处理48hpi的蛋白表达测定；*p<0.05,**p<0.01vsControl,n＝3。
图5：紫草酸与奥司他韦联合处理对感染WSN的A549细胞中病毒滴度和NPmRNA表达的影响。A：联合处理24hpi的病毒滴度；B：联合处理48hpi的病毒滴度；C：联合处理24hpi的NP mRNA表达；D：联合处理48hpi的NP mRNA表达；*p<0.05,**p<0.01vs DMSO,#p<0.05,##p<0.01vs 25μM LA,△p<0.05vs 24μM Oselt,n＝3。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述。需要说明的是，以下实施例对于本发明只有说明作用，而没有限制作用。实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
1.实验材料
人肺癌(A549)细胞、犬肾(MDCK)细胞：由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室馈赠，并由本实验室保存。
2.病毒株
A/PR/8/1934(H1N1)流感病毒(简称PR8)：由中国科学院武汉病毒研究所馈赠，由本实验室保存，并用10日龄鸡胚扩增。
A/WSN/33(H1N1)流感病毒(简称WSN)、A/duck/Hubei/W1/2004(H9N2)流感病毒：由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室馈赠，由本实验室保存，并用10日龄鸡胚扩增。
3.药品及试剂
紫草酸：以下简称LA，纯度＞98.0％，购自成都德思特生物科技有限公司；称取6.70mg紫草酸粉末，加入500μL DMSO充分溶解，配制为25.0mM的溶液作为储备液，临用前用DMEM培养基稀释成所需浓度；
磷酸奥司他韦(Oseltamivir phosphate，Oselt)：购自瑞士罗氏公司；称取4.90mg磷酸奥司他韦，加入500μL DMSO充分溶解，配制为24.0mM的溶液作为储备液，临用前用DMEM培养基稀释成所需浓度；磷酸奥司他韦是活性物质“羧酸奥司他韦”的前药形式。
TPCK-胰酶：称取2.0mg的TPCK-胰酶冻干粉末，用10mL的DMEM培养基充分溶解，0.22μM微孔滤膜过滤，配制浓度为0.2mg/mL的储存液，4℃保存。临用前，用DMEM培养基稀释TPCK-胰酶储存液至指定浓度。
阿氏液：称取4.10g葡萄糖，1.60g柠檬酸钠，0.11g柠檬酸，0.84g氯化钠加三次水定容至200mL，超声溶解，108℃，高压灭菌15min，分装，4℃保存备用。
1％鸡红细胞悬液：采集3只2～6月龄非免疫鸡的新鲜血液2mL与2mL阿氏液混合，常温1500rpm离心5min，去上清，加入等体积的PBS混合后，1500rpm再次离心5min，弃去上清血浆和白细胞层，加入等体积的PBS混合，2000rpm离心10min，弃上清，吸取1mL红细胞沉淀加入到99mL PBS中制成浓度为1％的鸡红细胞悬液，4℃保存备用。
胎牛血清(FBS)：PAN公司(德国)
DMEM细胞培养基：Gibco公司(美国)
0.25％EDTA-胰酶、0.25％胰酶：Biosharp公司
青霉素和链霉素：吉诺生物医学技术有限公司(杭州)
DMSO：美国Sigma公司
TPCK-胰酶：美国Sigma公司
CCK-8试剂盒：日本同仁公司
TRIzol：上海爱必信生物科技有限公司
逆转录试剂盒：上海东洋纺生物科技有限公司
SYBR Green PCR试剂盒：德国QIAGEN公司
PCR引物：上海生工生物工程股份有限公司
RIPA裂解液：上海碧云天生物技术有限公司
蛋白酶抑制剂(Cocktail)：上海碧云天生物技术有限公司
BCA蛋白定量试剂盒：上海碧云天生物技术有限公司
SDS-PAGE蛋白上样缓冲液：上海碧云天生物技术有限公司
蛋白marker：北京聚合美生物科技有限公司
脱脂牛奶：美国BD公司
Influenza Avirus NP抗体：美国GeneTex公司
Influenza Avirus NS1抗体：美国GeneTex公司
β-αctin、rabbit-HRP、mouse-HRP：抗体美国CST公司
实施例1：紫草酸在细胞上的毒性检测
在96孔细胞培养板中接种A549或MDCK细胞，培养24h后，细胞生长丰度约90％，吸去每孔中的培养基，PBS清洗两遍，用100μL系列不同浓度(3.125、6.25、12.5、25.0、50.0、100.0、200.0和400.0μM)的紫草酸药液处理细胞，以0.1％DMSO溶液为阴性对照组(取1μL溶于1mL DMEM)。同时设置不接种细胞的空白组，各个药物浓度组及对照组均设置5个复孔。
将药物处理过的细胞培养板在培养箱孵育48h，吸弃上清液，向每孔加入100μLCCK-8(Cell Counting Kit-8)稀释液(取1mL CCK-8试剂与9mL DMEM培养基充分混合制得)。将培养板在培养箱内继续孵育30min，用酶标仪在450nm处测定各组吸光度值。
参照如下公式计算细胞存活率：
Cell viability(％)＝(OD样品-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100％
图1实验结果表明，紫草酸处理48h，50μM及以下浓度对A549细胞无明显毒性，25μM及以下浓度对MDCK细胞无明显毒性；紫草酸在A549和MDCK细胞上的CC50分别为110.5和59.79μM。
实施例2：对细胞上清中病毒滴度的影响
1.上清样品的收集：
(1)细胞接毒：含100TCID50的WSN、PR8或H9N2流感病毒液各1mL感染A549或MDCK细胞。
(2)给药处理：在37℃孵育1.5h后吸弃未吸附的病毒稀释液，加入0.1％DMSO、6.25、12.5、25、50μM LA或24μM Oselt继续孵育。
(3)病毒滴度的检测：在24、36、48及72hpi，收集细胞上清，利用TCID50法检测病毒滴度。
2.病毒滴度的检测：
(1)细胞铺板：在96孔板中接种MDCK细胞，37℃、5％CO2培养箱培养24h。
(2)待检病毒样品稀释：用DMEM培养基对待检病毒样品做连续10倍倍比稀释。
(3)病毒吸附：待96孔板中MDCK细胞生长至90％丰度，将稀释后的流感病毒液加入到96孔板中，每孔接种100μL，每个稀释度设置8个复孔，细胞对照组不加病毒液，只加等体积的DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下培养。
(4)持续孵育：37℃、5％CO2条件下孵育1.5h，吸弃细胞上清液，加入100μL含1μg/mL TPCK胰酶的无血清DMEM培养基，37℃、5％CO2条件下继续培养72h。
(5)反复冻融：培养72h后的MDCK细胞样品放入-80℃冰箱冷冻过夜后，放置37℃烘箱解冻，按此方法反复冻融2～3次，使细胞裂解充分释放细胞内的病毒。
(6)确定血凝阳性孔：应用HA试验确定血凝阳性孔，96孔板每孔吸取解冻细胞上清50μL至v型96孔微量反应板中，再悬空加入等体积1％鸡红细胞，轻摇血凝板混匀，于室温下静置30min后观察并记录各组细胞血细胞凝集情况，根据Reed-Muench两氏法计算得到样品种的病毒TCID50。
距离比例＝(高于50％血凝阳性孔的百分数-50％)/(高于50％血凝阳性孔的百分数-低于50％血凝阳性孔的百分数)
lgTCID50＝距离比例×稀释度对数之间的差+高于50％血凝阳性孔的稀释度的对数
图2实验结果表明，对于感染WSN的细胞，相较于病毒对照组，12.5、25及50μM紫草酸在24、36、48和72hpi均能明显降低A549细胞上清中病毒滴度(**p<0.01)，12.5和25μM紫草酸在36、48和72hpi均能降低MDCK细胞上清中的病毒滴度；对于感染PR8的A549和MDCK细胞，相较于病毒对照组，6.25μM紫草酸处理组细胞上清中病毒滴度无明显差异，而12.5和25μM紫草酸处理组在36、48和72hpi病毒滴度均显著降低(*p<0.05,**p<0.01)；对于感染H9N2的A549和MDCK细胞，25μM紫草酸在四个时间点均能明显降低上清中的病毒滴度(**p<0.01)。
结果表明，紫草酸对WSN、PR8及H9N2三种流感病毒株的滴度均具有较好的抑制活性，且具有剂量依赖性。
实施例3：对流感病毒NP mRNA表达的影响
1.细胞样品的制备
(1)细胞接毒：含100TCID50的WSN流感病毒液1mL感染A549细胞。
(2)给药处理：在37℃孵育1.5h后吸弃未吸附的病毒稀释液，加入0.1％DMSO、25μM、50μM LA或24μM Oselt继续孵育。
(3)NP mRNA的检测：在24和48hpi，提取细胞总RNA，qRT-PCR检测NP mRNA的表达。
2.提细胞总RNA
(1)细胞样品处理：6孔板内的细胞处理24或48h后，吸弃6孔板培养基，用冰PBS洗涤三次，向各孔中加入1mL TRIzol，室温下静置5min后，吸取各孔内的细胞裂解液至1.5mLEP管中。
(2)分离RNA：向每个EP管加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，使细胞裂解液和氯仿充分混合，冰上静置15min后，4℃、12000rpm离心15min，小心吸取上清液500μL至新的EP管中。
(3)沉淀RNA：向上述新EP管中加入500μL的异丙醇，上下颠倒EP管充分混匀，室温静置10min，然后4℃、12000rpm离心10min，弃去管内液体。
(4)洗涤RNA：向EP管底物沉淀中加入1mL预冷的75％乙醇(DEPC水配制)，轻柔颠倒洗涤，7600rpm离心5min，弃去管内液体，在7600rpm条件下继续离心1min后，再次弃去管内液体。
(5)溶解RNA：冰上敞口干燥管内沉淀3min左右至管内无明显水珠，加20μLDEPC水，反复吹打溶解RNA沉淀。
(6)琼脂糖凝胶电泳检测鉴定总RNA完整性：称取0.5g琼脂糖，加入25mL1×TAEbuffer，微波炉加热煮沸3次，温度降至60℃以下时加入2.5μL Gelred核酸染料，混匀后倒入凝胶槽，室温凝30min左右，制成2％琼脂糖凝胶。恒压90v，55mA条件下电泳15min后，经凝胶成像仪成像，包含28S、18S和5S(从上到下)三条带，若条带28S的亮度为条带18S亮度的1.0～2.0倍，条带5S较浅时，说明RNA完整性较好。
(7)RNA浓度测定：利用超微量生物检测仪检测RNA的浓度和纯度(DEPC水调零)。OD260/280比值在1.8～2.0间可用，说明RNA纯度较高，可用于后续实验。
3.去除DNA及逆转录反应
冰上配制去除DNA的反应体系，Total RNA的用量为3μg，根据测得的各组RNA样品浓度，计算出各组所需的RNA体积V(μL)。
根据逆转录试剂盒配制去除DNA反应体系：
表1去除DNA反应体系
Figure BDA0003637198740000081
配制好去除DNA反应体系后，37℃孵育5min，得到去除DNA反应液。
根据逆转录试剂盒配制逆转录反应体系：
表2逆转录反应体系
Figure BDA0003637198740000082
37℃15min，98℃5min，4℃20min逆转录后得到cDNA。
用SYBR Green PCR试剂盒检测细胞中特定基因的mRNA水平。
引物：
NP(WSN)上游序列5’-GCCTGCCTGCCTGTGTGTATGGAT-3’
NP(WSN)下游序列5’-GGCATGCCATCCACACCAGTTGAC-3’
GAPDH上游序列5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’
GAPDH下游序列5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’
反应体系如下：
表3 PCR反应体系
Figure BDA0003637198740000083
反应条件按照95℃预变性2min，95℃变性5s，60℃退火10s，72℃45s进行40个循环。使用2-ΔΔCq方法相对定量mRNA水平。
图3实验结果表明，相较于病毒对照组，25和50μM紫草酸处理在24及48hpi均能显著抑制感染WSN的A549细胞中NP mRNA表达(*p<0.05,**p<0.01)。
实施例4：对流感病毒NP、NS1蛋白表达的影响
(1)细胞总蛋白的提取：用1mL的预冷的PBS清洗细胞3次，按照蛋白裂解液RIPA(1×)：蛋白酶抑制剂cocktail(100×)＝100:1的比例配制蛋白裂解溶液，每孔加入100μL蛋白裂解溶液。冰上剧烈震荡30min至细胞完全裂解，吸取细胞裂解液加入到1.5mL离心管中，4℃条件下1.2×104rpm离心10min，吸取上清(即蛋白原液)置于-80℃保存备用。
(2)BCA法测定蛋白浓度：蛋白原液稀释10倍，每孔加入20μL蛋白标准溶液或待测蛋白稀释液+160μL BCA工作液，37℃培养箱孵育30min，570nm处测吸光度。根据所测得的吸光度值，结合标准曲线可得相应的蛋白浓度。
加入适量loading buffer后，混匀，100℃金属浴10min使蛋白变性，-80℃保存备用。
(3)Western blot实验：
配胶：按照无菌水5.9mL、30％Acr-Bis 5.0mL、1.5M Tris-HCl(pH6.8)3.8mL、10％SDS 0.15mL、10％APS 0.15mL、TEMED 0.006mL配制10％分离胶，加入1mL异丙醇液封，室温凝胶40min。按照无菌水5.5mL、30％Acr-Bis 1.3mL、1.0MTris-HCl(pH 6.8)1.0mL、10％SDS0.080mL、10％APS 0.080mL、TEMED 0.008mL配制5％浓缩胶，室温凝胶40min。
电泳：上样后，80V恒压电泳约30min，待蛋白marker开始分离时，将电压调换成120V，并继续电泳直至loading buffer即将跑出下层胶，即可停止电泳。
转膜：PVDF膜用甲醇活化1min，按照“1层海绵-3层滤纸-胶-膜-3层滤纸-1层海绵”的顺序安装好转膜装置，加入冰和水，200mA恒流转膜，根据目的蛋白分子量大小来确定转膜的时间。
封闭：将PVDF膜用TBST清洗5次，5min/次，剪角作标记，转移到含有封闭液(5％脱脂奶粉)的平皿中，室温封闭2h。
孵一抗：将一抗用稀释液按一定的稀释比(1:1000)稀释，封闭好的膜用TBST洗3次，之后将蛋白膜置于抗体溶液中，4℃孵育过夜。
洗膜：用TBST清洗膜5次，每次5min。
孵二抗：准备二抗稀释液(1:10000)，用蛋白膜于室温封闭1h。
洗膜：用TBST清洗膜5次，每次5min。
发光、显影：在暗室中配制化学发光混合液并加至PVDF膜上，室温下反应半分钟后，使用凝胶成像仪进行显影。
图4结果所示，相较于病毒对照组，12.5、25及50μM紫草酸处理组在24和48hpi细胞中NP蛋白和NS1蛋白均有明显下调(*p<0.05,**p<0.01)，且呈剂量依赖性。
实验例5：与奥司他韦联合处理对病毒滴度和NP mRNA表达的影响
为了考察紫草酸与抗流感药物奥司他韦联合处理后的抗病毒效果，分别按照紫草酸：奥司他韦摩尔比＝1:1、2:1和1:2的比例处理A549，进一步考察抗病毒效果情况。
(1)细胞接毒：1mL含100TCID50WSN流感病毒液感染A549细胞。
(2)给药处理：在37℃孵育1.5h后吸弃未吸附的病毒稀释液，加入0.1％DMSO、25μMLA、24μM Oselt、12.5μM LA+12μM Oselt、16.7μM LA+8μM Oselt或8.3μMLA+16μM Oselt继续孵育。
(3)病毒滴度及NP mRNA的检测：在24和48hpi，分别按照实施例2和实施例3的操作检测病毒滴度和NP mRNA的表达水平。
图5结果所示，相较于病毒对照组，紫草酸、奥司他韦及三个联合处理组在24和48hpi病毒滴度及NP mRNA的表达均显著降低；相较于单独紫草酸或奥司他韦处理，8.3μM紫草酸+16μM奥司他韦处理组在48hpi病毒滴度及NP mRNA的表达均显著降低。结果表明，紫草酸与奥司他韦按照1:2的摩尔比具有较单独应用紫草酸或奥司他韦更优的抑制效果。

Claims (5)

1.由紫草酸和奥司他韦组成的药物组合物，所述紫草酸与奥司他韦的摩尔比为1:2。
2.权利要求1所述的药物组合物在制备抗流感病毒药物中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述流感病毒为甲型流感病毒。
4.一种抗流感病毒药物，其活性成份是权利要求1所述的药物组合物。
5.如权利要求4所述的抗流感病毒药物，其特征在于：还含有药学上可接受的载体。
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