CN116585326B - 科罗索酸在制备抑制流行性乙型脑炎病毒药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了科罗索酸在制备抑制流行性乙型脑炎病毒感染药物中的用途,科罗索酸是通过CCK‑8法从脂类化合物库中筛选到的可以增强流行性乙型脑炎病毒感染后的细胞活性的药物,科罗索酸在B H K‑21细胞上和小鼠上都表现出了显著抑制流行性乙型脑炎病毒感染的效果,并且在细胞上的抑制效果显著高于其它病毒(寨卡病毒和猪瘟病毒)。所述科罗索酸的纯度≥99%,其应用剂量在BHK‑21细胞上为5‑20μM,在小鼠上为15mg/kg‑30mg/kg,科罗索酸用于抑制流行性乙型脑炎病毒增殖效果显著,在小鼠上通过有效降低脑组织病毒载量和病理损伤,从而提高感染小鼠存活率。科罗索酸作为抑制流行性乙型脑炎药物安全、毒副作用少,药物残留低且无污染。
Description
技术领域
本发明属于抗病毒技术领域,具体涉及科罗索酸在制备抑制流行性乙型脑炎病毒药物中的用途。
背景技术
流行性乙型脑炎是由乙型脑炎病毒(Epidemic encephalitis B virus)引起的以损伤中枢系统为特征的蚊媒传播疾病,属于乙类传染病,二类动物疫病,主要流行于亚洲地区。虽然发病率不高,但是一旦感染,后果严重。流行性乙型脑炎主要通过蚊子叮咬传播,其传播季节多在夏秋季节,主要传播媒介为库蚊、白纹伊蚊等蚊子。人感染后,病毒可突破血脑屏障,进入中枢神经系统,引发脑炎,导致长期神经系统并发症。猪是流行性乙型脑炎病毒的扩增宿主,所有年龄、品种的猪都易感,一般只有仔猪感染病毒后会因出现脑炎而死亡,其它年龄的猪群感染后主要是引起繁殖障碍:例如感染流行性乙型脑炎病毒的母猪会流产、产死胎或木乃伊胎;而公猪感染则易发睾丸炎,严重影响猪群的数量和质量,给养猪业造成持续性的经济损失。另外,由于南猪北养以及气候变化导致北方地区人和动物乙型脑炎病例不断增多,并且世界范围内成人乙型脑炎发病率上升,说明防控形势严峻。目前,流行性乙型脑炎的最有效预防措施是接种乙型脑炎疫苗,但是由于最近的优势基因型已经从GIII转变为GI,常规疫苗能否提供有效的保护,尚未可知。并且对于已经感染的病例,尚无有效药物进行治疗,主要是实施支持疗法。因此寻找有效的治疗流行性乙型脑炎的药物迫在眉睫。
通过化合物库筛选具有特定作用的目的化合物已被广泛应用,但是市售的化合物库种类有很多,包括生物活性化合物库,FDA上市库,临床化合物库,抗肿瘤化合物库,抗感染化合物库,抗衰老化合物库等,选择从哪一个库筛选就尤为重要。近年来研究发现,脂质中的脂肪酸、胆固醇、鞘磷脂等广泛参与了病毒感染宿主过程的各个阶段,说明脂质相关分子在病毒的感染过程中发挥着重要作用。因此本研究从脂类化合物库筛选影响流行性乙型脑炎病毒增殖的化合物,另外通过小鼠攻毒试验评价脂类化合物的保护效果,为抗流行性乙型脑炎药物的开发奠定理论基础。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。
作为本发明其中一个方面,本发明提供科罗索酸在制备抑制流行性乙型脑炎病毒药物中的用途。
作为本发明所述的应用的优选方案,其中,所述科罗索酸还包括科罗索酸的盐。
作为本发明所述的应用的优选方案,其中,在C57BL/6小鼠试验上,所述科罗索酸的用量为15mg/kg-30mg/kg。
作为本发明所述的应用的优选方案,其中,所述抑制流行性乙型脑炎病毒药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、针剂或缓释剂。
具体地,所述科罗索酸的分子式为C30H48O4,结构式为:
具体地,所述科罗索酸能够降低流行性乙型脑炎mRNA的水平。
具体地,所述科罗索酸能够抑制流行性乙型脑炎E蛋白和NS5蛋白的表达水平。
具体地,所述科罗索酸还能够抑制寨卡病毒的增殖。
与现有技术相比,本发明的有益效果在于:
一、本研究从脂类化合物库中(134种化合物)筛选抑制流行性乙型脑炎病毒增殖的化合物,从已有化合物库筛选流行性乙型脑炎的抑制剂,可以加快药物研究进程。
二、科罗索酸用于抑制流行性乙型脑炎病毒效果非常显著;实验证明科罗索酸在细胞实验中展现出明显的抗病毒活性,在10μM的浓度下即可展现出极强的抑制流行性乙型脑炎病毒增殖的作用;在小鼠体内试验中,30mg/kg的灌胃剂量可以提升感染小鼠(腹腔注射10LD50)的存活率,从10%到70%。
三、科罗索酸不仅可以抑制流行性乙型脑炎病毒的增殖,还可以抑制同为黄病毒属的寨卡病毒的增殖,但是对乙型脑炎病毒的抑制效果显著高于对寨卡病毒的抑制效果。
四、科罗索酸用于抑制流行性乙型脑炎病毒安全、毒副作用少;科罗索酸为中草药提取成分,不同于激素、抗生素、化学合成药物等,对机体无明显毒副作用。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案,下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。其中:
图1为134种脂类化合物对流行性乙型脑炎病毒的抑制率
图2为RT-qPCR法验证抑制率大于80%的脂类化合物
图3为CCK-8法检测科罗索酸对BHK-21细胞的毒性。
图4为Western Blot,RT-qPCR,和间接免疫荧光测定科罗索酸在BHK-21细胞上抑制流行性乙型脑炎病毒感染的活性。
图5为科罗索酸对不同病毒(流行性乙型脑炎病毒,寨卡病毒,猪瘟病毒)的抑制率
图6为各组小鼠在感染前后的体重变化
图7为各组小鼠的存活率曲线
图8为荧光定量PCR检测各组小鼠的脑组织乙型脑炎病毒含量
图9为各组小鼠的脑组织病理变化
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
实施例1:
试验材料:
流行性乙型脑炎病毒NJ-2008毒株,猪瘟病毒石门株,BHK-21细胞,PK-15细胞,流行性乙型脑炎病毒E蛋白抗体,NS5蛋白抗体保存在本实验室;
CCK-8检测试剂盒购自美国APEXBIO公司;
反转录试剂盒,实时荧光定量PCR(Realtime PCR)AceQ Green Master Mix试剂盒购自诺唯赞公司;
引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成;
脂类化合物库(HY-L034),科罗索酸(C30H48O4)购于MCE公司;
β-Actin抗体,荧光二抗(488),DAPI购自Proteintech生物科技有限公司。
通过CCK-8法从脂类化合物库筛选抑制流行性乙型脑炎病毒增殖药物:
待96孔板中BHK细胞密度为70%-80%时,使用脂类化合物预处理细胞1h,后接种含有脂类化合物的流行性乙型脑炎病毒(MOI=0.5),于37℃,含5%CO2培养箱培养1h后,弃上清,然后添加脂类化合物(10μM),每孔100μL,同时设置细胞对照孔,感染对照孔,每个样品设置三个重复孔,待感染对照孔出现严重病变后,每孔添加10μL cck-8试剂,37℃避光孵育,每隔半小时使用酶标仪读值(设置吸光度为450nm),直到培养基对照孔符合说明书读值。按照公式计算病毒抑制率:病毒抑制率=OD(样品孔-感染对照孔)/(细胞对照孔-感染对照孔)*100%。以病毒抑制率≥80%为筛选标准,结果如附图1所示总计筛选到6种脂类化合物,分别是香胶甾酮(Guggulsterone),羽扇豆醇(Lupel),孕烯醇酮(Pregnenolone),20S-原人参三醇((20S)-Protopanaxatriol),呋喃硫胺(Fursultiamine)和科罗索酸(Corosolic acid,CA)。
定量验证病毒抑制率大于80%的化合物:
待24孔板中BHK细胞密度为70%-80%时,使用筛选到的脂类化合物预处理细胞1h,后接种含有脂类化合物的流行性乙型脑炎病毒(MOI=0.5),于37℃,含5%CO2培养箱培养1h后,弃上清,然后添加脂类化合物(10μM),每孔500μL,同时设置感染对照孔,每个样品设置三个重复孔,24h后收获全细胞样,使用TriZOL法提取核酸,反转录成cDNA,相对荧光定量检测各样品mRNA。结果如附图2所示,6种药物中只有科罗索酸极显著降低了流行性乙型脑炎mRNA水平。
科罗索酸在BHK-21细胞上毒性的测定:
制备BHK-21细胞悬液,接种于96孔板,每孔100μL,约含有细胞数为1X104为宜,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,待细胞融合度达到80-90%后,移除96孔板上清,将科罗索酸稀释成1.6μM,3.2μM,6.4μM,12.8μM和25.6μM,每个浓度设置5组重复,将DMSO对照以及稀释的科罗索酸以100μL/孔处理BHK-21细胞48h后,移除上清,避光条件下按照CCK-8:DMEM=1:9的比例配制CCK8稀释液并添加至样品孔,避光孵育,每半小时使用酶标仪测定450nm波长下的吸光度,直至DMSO组读值介于1.0-1.8之间,停止读值,结果如附图3所示。经不同浓度科罗索酸处理细胞的线粒体脱氢酶的量与未经科罗索酸处理的细胞相比没有明显差异,说明该浓度下的科罗索酸对BHK-21细胞没有明显毒性。
Western Blot,荧光定量PCR,和间接免疫荧光测定科罗索酸在BHK-21细胞上抑制流行性乙型脑炎病毒感染活性:
制备BHK-21细胞悬液,接种于12孔板,每孔1mL,约含有1X105个细胞为宜,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,待细胞融合度达到80%后,使用DMEM稀释科罗索酸至不同浓度(2.5μM,5μM,7.5μM,10μM和20μM),移除细胞上清,添加不同浓度的科罗索酸预处理细胞1h,感染流行性乙型脑炎病毒(MOI=0.5),注意病毒悬浮液中也含有不同浓度的药物,置于37℃、5%CO2培养箱中1h,弃上清,用PBS洗三遍,加入含不同浓度科罗索酸稀释液的DMEM维持液1ml,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后,收样。弃掉每孔细胞上清,用预冷的PBS洗涤三次,每孔加入RIPA裂解液160μL,4℃裂解25分钟,吸取上清至1.5mLEP管中,8000rpm,4℃离心15分钟,转移上清至新1.5mLEP管,加入5XSDS loading buffer 40μL,沸水浴煮样15分钟,进行Western Blot检测,结果如图4所示,科罗索酸能显著抑制流行性乙型脑炎病毒的感染,并具有浓度依赖性。同时使用TriZOL提取样品总RNA,并反转成cDNA,使用Actin基因作为内参,实时荧光定量PCR检测病毒-NS3 mRNA水平。引物信息如下:Actin-F 5′CTGAAGTACCCCATCGAGCACGGCA3′;Actin-R5′GGATAGCACAGCCTGGATAGCAACG3′;Virus-F5′AGAGCGGGGAAAAAGGTCAT3′;Virus-R 5′TTTCACGCTCTTTCTACAGT 3′。20μlPCR反应体系包含10μl AceQ SYBRGreen Master Mix,0.4μl上、下游引(10μM),2μl模板DNA,以及7.2μl灭菌蒸馏水。扩增参数为:95℃10s、60℃30s共40个循环,反应结束后溶解曲线测定,反应条件为:95℃15s、60℃60s、95℃15s。本实验通过2-ΔΔCt法进行Virus-NS3基因的相对定量,结果显示科罗索酸在BHK-21细胞上明显抑制流行性乙型脑炎病毒感染。同时使用倒置荧光显微镜观察细胞内的E蛋白含量,结果显示科罗索酸可明显抑制流行性乙型脑炎病毒E蛋白的增殖,并具有明显的浓度依赖性。
科罗索酸对不同病毒(流行性乙型脑炎病毒,寨卡病毒,猪瘟病毒)的抑制效果比较:
流行性乙型脑炎病毒和寨卡病毒使用BHK-21细胞培养,猪瘟病毒使用PK-15细胞培养。制备BHK-21/PK-15细胞悬液,接种于24孔板,每孔500μL,约含有5X104个细胞为宜,置于37℃、5%CO2培养箱中培养,待细胞融合度达到80%后,使用DMEM稀释科罗索酸至不同浓度(5μM,7.5μM,10μM和20μM),移除细胞上清,添加不同浓度的科罗索酸预处理细胞1h,感染病毒(MOI=0.5),注意病毒悬浮液中含有不同浓度的药物,置于37℃、5%CO2培养箱中1h,用PBS洗三遍,加入含2%胎牛血清(FBS)的DMEM维持液1ml(注意维持液中含有不同浓度的科罗索酸),置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后,收样。使用TriZOL提取样品总RNA,并反转成cDNA,使用Actin基因作为内参,实时荧光定量PCR检测病毒mRNA水平,流行性乙型脑炎病毒和内参引物序列如上所述,寨卡病毒和猪瘟病毒引物序列如下:寨卡F:5′TTGGGTTGTGTACGGAACCTG3′;寨卡R:5′GTGCTTTGTGTATTATTCTCTTGA3′;猪瘟F:CCTGAGGACCAAACACATGTTG;猪瘟R:TGGTGGAAGTTGGTTGTGTCTG。结果如图5所示,科罗索酸虽然对猪瘟病毒基本没有抑制作用,但是对流行性乙型脑炎病毒和寨卡病毒都具有抑制作用,并且对流行性乙型脑炎病毒的抑制作用显著高于寨卡病毒。
科罗索酸的体内治疗效果:
将C57BL/6乳鼠40只,随机分为4组,每组10只。除了Blank组外,其余三组均腹腔注射10LD50病毒,24h后开始给与科罗索酸灌胃治疗,分为低剂量治疗组(15mg/kg)和高剂量治疗组(30mg/kg),每天一次,直至单独病毒感染组小鼠不死亡,或者全部死亡试验结束。每天记录小鼠体重变化,结果如图6所示,病毒感染组组小鼠在攻毒后第3天开始出现体重下降,并持续下降,直至试验结束,使用科罗索酸治疗的小鼠在攻毒后的3-5天,体重持续下降,随后体重出现缓慢增加。说明科罗索酸可以有效减轻流行性乙型脑炎病毒攻击引发的小鼠体重减轻。
各组小鼠存活情况被记录,结果如图7所示,病毒感染组在攻毒后第4天开始出现死亡,第六天达到死亡高峰,试验结束时存活率仅为10%,科罗索酸治疗组显著升高了了存活率,低剂量组存活率为50%,高剂量组小鼠存活率为70%,说明科罗索酸治疗可以有效降低流行性乙型脑炎引发的小鼠死亡。
死亡高峰日采集小鼠脑组织提取总RNA,反转录,荧光定量PCR检测脑部病毒mRNA含量,结果如图8所示,药物治疗能显著降低脑组织的病毒含量,高剂量组尤其显著。说明科罗索酸治疗可以有效降低小鼠脑组织的乙型脑炎病毒载量。
采集脑组织制作HE切片,使用显微镜观察病理变化,结果如图9所示,病毒感染组血管内部充满炎性细胞,形成典型血管套现象,另外神经细胞周围缝隙变大,细胞质松散,出现空泡,核致密,甚至坏死;相比之下,低剂量药物治疗组仍然表现出空泡,但严重程度低于病毒感染组。另外高剂量药物治疗组基本与Blank组相似。说明科罗索酸治疗可以有效减轻流行性乙型脑炎病毒引发的脑部损伤。
通过以上实验结果证明:本发明发现科罗索酸可明显抑制流行性乙型脑炎病毒的增殖,并且抑制率显著高于寨卡病毒和猪瘟病毒,进一步发现科罗索酸可以在小鼠上通过有效降低脑组织病毒载量和病理损伤,从而提高感染小鼠存活率。本发明为乙型脑炎病毒的预防和治疗提供了新的药物,具有较好的市场价值和临床应用前景。
图1为从脂类化合物库筛选抑制流行性乙型脑炎病毒增殖的药物
图2为定量RT-qPCR验证筛选到的6种化合物。*,P≤0.05;**,P≤0.01;***,P≤0.001,对照组为病毒感染组。
图3为CCK-8法检测科罗索酸对BHK-21细胞的毒性。1.6-25.6μM科罗索酸处理BHK-21细胞48h后使用CCK-8孵育1h,并在450nm测定细胞吸光度值,检测细胞线粒体脱氢酶含量,计算细胞活性。
图4为Western Blot,荧光定量PCR,和间接免疫荧光测定科罗索酸在BHK-21细胞上抑制流行性乙型脑炎病毒感染的活性。2.5-20μM科罗索酸预处理BHK-21细胞1h后感染流行性乙型脑炎病毒(MOI=0.5),从感染病毒开始科罗索酸一直存在,24h后收取细胞进行Western Blot测定细胞中流行性乙型脑炎病毒蛋白NS5含量;同时提取总RNA,反转录,进行荧光定量PCR测定;另外收集细胞用于间接免疫荧光测定。*,P≤0.05;**,P≤0.01;***,P<0.001,对照组为病毒感染组。
图5为荧光定量PCR检测科罗索酸对不同病毒(流行性乙型脑炎病毒,寨卡病毒和猪瘟病毒)的抑制率。5-20μM科罗索酸预处理细胞1h后感染病毒(MOI=0.5),从感染病毒开始科罗索酸一直存在,24h后收获全细胞样品提取总RNA,反转录,进行荧光定量PCR测定。*,P≤0.05;**,P≤0.01;***,P≤0.001;****,P≤0.0001,对照组为病毒感染组。
图6,图7,图8,图9为科罗索酸在小鼠上的抗病毒效果,试验分为四组,正常对照组(Blank),病毒感染组,低剂量治疗组(15mg/kg),高剂量治疗组(30mg/kg)。除了Blank组外,其它组小鼠腹腔感染10LD50病毒,24h后开始对低剂量治疗组(15mg/kg),高剂量治疗组(30mg/kg)给与科罗索酸灌胃治疗,各组饮食饮水自由。**,P≤0.01;***,P≤0.001,对照组为病毒感染组。
应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (7)
1.科罗索酸或其盐在制备抑制流行性乙型脑炎病毒药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于:所述科罗索酸的用量为15mg/kg-30mg/kg。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述抑制流行性乙型脑炎病毒药物的剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、针剂或缓释剂。
4.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述科罗索酸的分子式为C30H48O4,结构式为:
。
5.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述科罗索酸能够降低流行性乙型脑炎病毒mRNA的水平。
6.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于:所述科罗索酸能够抑制流行性乙型脑炎病毒E蛋白和NS5蛋白的表达水平。
7.科罗索酸或其盐在制备抑制寨卡病毒的药物中的用途。
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