CN117180246B - 异甘草素在制备防治虾白斑综合征药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物源抗病毒技术领域，涉及异甘草素在制备防治虾白斑综合征药物中的应用。本发明提供了异甘草素在制备防治虾白斑综合征药物中的应用，异甘草素能够有效地遏制白斑综合征病毒在克氏原螯虾体内的复制，并显著提升感染白斑综合征病毒的克氏原螯虾的存活率。本发明为将异甘草素开发成一种抗水产动物白斑综合征药物提供参考依据。
Description
技术领域
本发明属于植物源抗病毒技术领域，涉及异甘草素在制备防治虾白斑综合征药物中的应用。
背景技术
异甘草素（Isoliquiritigenin）作为甘草、石竹等植物的主要活性成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、舒张肌肉，抑制糖尿病并发症等药理活性，并能降低抗生素的毒副作用和用量。异甘草素的作用机制主要是抑制醛糖还原酶、酪氨酸酶，同时可以激活鸟苷环化酶，从而实现抗肿瘤、诱导细胞凋亡等功能。异甘草素目前的研究热点主要集中在抗哮喘活性，关于其抗病毒活性的研究较少。目前，异甘草素的研究尚未涉及水生动物抗病毒活性。
白斑综合征是一种由白斑综合征病毒（White spot syndrome virus，简称WSSV）引发的重要水生动物传染病，被我国划定为二类动物疫病。
近年来，一系列环境友好型制剂和药物，如免疫增强剂、中草药提取物、益生菌和水产疫苗，在水生生物病毒的预防和治疗中得到广泛应用。这些制剂和药物具有安全性高、残留物低、难以产生耐药性等优点。我国拥有丰富的中草药资源，许多中草药富含有机酸、黄酮类、萜类、皂苷类、生物碱等天然活性成分，具备抗病毒、增强机体免疫力和抗应激能力的特性。同时，这些成分能够通过多个靶点、多条途径协同作用于病原体，从而实现协同抑制和消灭病原体的效果。因此，开展抗病毒天然活性成分的筛选和创新研究意义重大，不仅能够满足水产养殖产业的紧迫需求，还能够确保水产品的安全性以及环境友好性。
发明内容
甘草素是从甘草根的水解产物中分离出的一种黄酮类成分，属于羟基查耳酮类化合物。除了甘草，异甘草素也存在于在其他植物如石竹、红芪、黄芪、串果藤等中药材中。其结构式如下所示：
。
本发明的目的在于提供异甘草素在制备防治虾白斑综合征药物中的应用，探索异甘草素在水产养殖抗病毒方面的可行性，为抗病毒绿色渔药创新研究拓展新途径。
基于上述目的，本申请通过提供异甘草素在制备防治虾白斑综合征药物中的应用来解决该领域中的这种需要。
本发明涉及异甘草素在制备预防和/或治疗虾白斑综合征药物中的应用。基于本发明动物实验研究结果，异甘草素证实可用于虾白斑综合征的预防与治疗。
还有，本发明涉及异甘草素在制备白斑综合征病毒抑制剂方面的应用。基于本发明动物实验研究结果，异甘草素具有良好的抗白斑综合征病毒WSSV的作用。异甘草素可用于制备白斑综合征的相关治疗药物。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果或者优点：
本发明首次研究验证并阐明了异甘草素在抵御白斑综合征病毒方面的生物活性。基于动物实验研究的结果，证明异甘草素能够有效地遏制白斑综合征病毒在克氏原螯虾体内的复制，并显著提升克氏原螯虾感染白斑综合征病毒的存活率。
对克氏原螯虾中的白斑综合征病毒，异甘草素表现出优异的抗病毒效果，本发明为处理由该病毒引发的水产动物疾病提供了有力手段。
异甘草素作为一种天然活性成分，具备低毒性、低残留、低成本、环保安全等优点。借助其生物活性，可以有效对抗危害克氏原螯虾养殖的白斑综合征病毒，这为开发与研制绿色水产养殖生物药剂提供了新的途径，同时也扩展了异甘草素的应用领域。
附图说明
图1为绝对定量标准曲线。
图2为不同浓度异甘草素注射克氏原螯虾24h后对鳃组织中WSSV复制拷贝数的影响。
图3为通过Kaplan-Meier方法对不同处理下克氏原螯虾的累计存活率。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
为了使本领域技术人员更好地理解、实施本发明的技术方案，现结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述各实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到，白斑综合征病毒由西北农林科技大学水产病害实验室提供；异甘草素（Isoliquiritigenin，CAS:961-29-5）购自上海麦克林生化科技股份有限公司。
本实施例提供异甘草素对克氏原螯虾的安全浓度及抗白斑综合征病毒活性测定。实验动物选用克氏原螯虾，购自陕西省咸阳市水族市场。
待测药液的配制：准确称取异甘草素标准品，用色谱级DMSO配制成浓度为100mg/mL的标准液，再用DMSO稀释成不同的浓度10、20、50、80mg/mL；用0.22μm有机系针头滤器过滤，并转入棕色的色谱瓶中作为标准品稀释液使用。
白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因引物：
上游引物（VP28-F）：AAACCTCCGCATTCCTGTGA；
下游引物（VP28-R）：TCCGCATCTTCTTCCTTCAT。
（1）安全性评价
在进行抗病毒活性测定前，开展异甘草素对克氏原螯虾的安全性评价。
从健康的克氏原螯虾中随机选取样本，每组包括10只克氏原螯虾个体，置于26℃水温下的塑料箱内，用于后续实验处理。该实验设定两组，分别为空白对照组和药物处理组。在空白对照组中注射TM缓冲液（100mM Tris-HCl，10mM MgCl2，pH=7.5）；而药物处理组则注射了不同浓度的异甘草素（60、70、80、90、100mg/kg）。每只克氏原螯虾个体注射的药物体积为100μL。药物注射后，连续72h观察并记录虾的存活状况。
实验结果：在注射后的72小时内，当处理组注射的异甘草素浓度为60~80mg/kg时，克氏原螯虾的状态保持稳定，且未出现明显变化或不适症状；当处理组注射的异甘草素浓度为90~100mg/kg，出现1-2只克氏原螯虾个体死亡的情况。因此，本试验确定异甘草素的安全使用浓度应至少低于80mg/kg。后续的实验中，我们将选用低于80mg/kg的异甘草素浓度，继续对克氏原螯虾进行实验。
（2）抗病毒活性检测
本实施例于25℃养殖水体中进行，挑选健康的克氏原螯虾分为3组（WSSV处理组、异甘草素与WSSV共处理组，空白对照组），每组30只，设置3个平行实验。异甘草素的测试浓度为25mg/kg和50mg/kg。每只克氏原螯虾注射处理液的体积为100μL。药物处理方式为WSSV病毒和单体化合物（异甘草素）预混后立即腹部注射（每只虾的病毒用量为6.9×107copies，预混：在25℃下病毒液同药液混匀后立刻注射）。在注射后的24小时后，每个处理组随机挑选出5只克氏原螯虾，采集20-40mg鳃组织，然后将样本置于-80℃保存，以备后续使用。
采集的样品分别用于WSSV基因组DNA拷贝数的绝对定量。使用绝对荧光定量PCR检测处理样品鳃组织中病毒基因组拷贝数。用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取采集的组织样品DNA。使用超微量分光光度计检测提取DNA浓度和纯度，然后将DNA浓度统一调整为50ng/μL。通过RT-qPCR和构建的绝对定量标准曲线（图1）定量组织中的病毒拷贝数。实验结果见图2。
克氏原螯虾鳃组织DNA的提取方法步骤：
1）称取15mg左右的组织材料，充分研磨，放入装有200μL GA缓冲液的离心管中，涡旋振荡15sec；
2）加入20μL Proteinase K（20mg/mL）溶液，涡旋混匀，简短离心去除管盖内壁的水珠，56℃放置，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
3）加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
4）加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
6）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
7）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
8）重复操作步骤7）；
9）将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液ddH2O，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；
11）重复步骤10）
12）离心得到的溶液包含DNA产物，将DNA产物置于-20℃保存备用。
使用CFX-96实时进行PCR定量检测。定量引物使用VP28。定量试剂盒用Vazyme的AceQ® qPCR SYBR® Green Master Mix。
qRT-PCR反应体系为10μL，包括1μL DNA模板，5μL ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Vazyme），3μL灭菌无核酸酶水以及上、下游引物各0.5μL。
反应程序为95℃预热30s，随后40个循环（95℃持续5s，60℃持续30s，72℃持续30s）。
由图2可知，不同浓度的异甘草素（25和50mg/kg）显著降低了WSSV在克氏原螯虾体内的拷贝数，具有良好的抗WSSV的生物活性，抑制率达到了71.76%和85.82%。
（3）存活率检测
确定安全浓度后，在体内测试异甘草素对克氏原螯虾的保护作用。将健康的克氏原螯虾随机分为3组，每组100只，分别注射TM缓冲液（对照组）、TM-WSSV混合物（阳性对照组）和药物-WSSV混合物（处理组，25和50mg/kg）。各组克氏原螯虾观察8d并记录死亡情况。其中，存活率计算公式为：存活率(%)=处理组存活数/每组的总数×100%。检测结果见图3。
由图3可知，异甘草素能够显著减少感染WSSV克氏原螯虾的死亡率。试验期间，TM缓冲液处理的克氏原螯虾未发现死亡或者仅少量的克氏原螯虾出现死亡。WSSV处理的克氏原螯虾，出现大量死亡，在8d时的存活率为4%。用不同浓度的异甘草素（25和50mg/kg）处理的患病克氏原螯虾存活率有所提高，达到了17%和34%。
由图3可知，异甘草素能够显著抑制WSSV克氏原螯虾体内复制，并同时提高受WSSV感染克氏原螯虾的存活率。
综上，本发明实施例结果充分说明，异甘草素可通过显著降低WSSV复制相关基因的表达，抑制WSSV在克氏原螯虾体内的复制，提高受病毒感染的宿主存活率。本发明为开发异甘草素作为一种高效实用的抗WSSV药物提供了理论依据，同时为异甘草素对其它水生动物病毒的抗病毒作用研究提供了重要参考。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (2)
1.异甘草素作为唯一活性成分在制备预防和/或治疗虾白斑综合征药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，所述异甘草素能抑制白斑综合征病毒。
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