CN117180262B - 高良姜素在制备虾白斑综合征治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物源抗病毒药物技术领域，涉及高良姜素在制备虾白斑综合征治疗药物中的应用。本发明提供了高良姜素在制备预防或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用。基于本发明的实验动物验证，高良姜素对白斑综合征病毒WSSV具有抑制活性，将其作为抗甲壳类水产动物白斑综合征病毒的药物成分，同时提高受白斑综合征病毒感染的克氏原螯虾的存活率，可利用其生物活性对危害甲壳类水产养殖的白斑综合征病毒进行防治，为水产养殖绿色生物药剂的开发和研制提供了新路径，拓展了高良姜素的新用途。
Description
技术领域
本发明属于植物源抗病毒药物技术领域，涉及高良姜素在制备虾白斑综合征治疗药物中的应用。
背景技术
高良姜素（Galangin）是一种存在于中国传统中药材高良姜干燥根中的天然活性成分，是一种可合成的黄烷类物质。研究证明，高良姜素类化合物具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化等多种独特的生物效应，广泛应用于科学研究、临床医学以及农业生产。高良姜素具有多种生物活性，可抑制DMBA代谢、影响CYP1A1活性等。另外，高良姜素还可作为抗癌药物中间体。目前，高良姜素的研究尚未涉及水生动物抗病毒活性。
白斑综合征病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）引发的对虾白斑综合征病是迄今为止对甲壳类养殖业危害最为严重的疫病。在过去的二十多年里，全球学者们一直在探索各种预防和控制WSSV感染的方法和途径，其中主要涵盖了免疫增强剂、重组蛋白疫苗、灭活疫苗、遗传育种、RNAi以及中草药提取物等领域。然而，由于目前甲壳类养殖业中疫苗防控方面存在着不容忽视的研究缺陷，药物防控仍然是生产过程中最为直接且有效的手段。近年来，许多起源于医药领域的水产抗病毒药物，如金刚烷胺、鸟嘌呤类似物和病毒唑等，在国内外均受到限制使用，导致临床应用的水产抗病毒药物甚少。因此，开展抗病毒渔药创新研究，对于满足产业的紧急需求、确保水产品的安全性以及保护环境友好具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供高良姜素在防治虾白斑综合征中的应用，探索高良姜素在水产养殖抗病毒方面的可行性，为抗病毒绿色渔药创新研究拓展新途径。
基于上述目的，本申请通过提供高良姜素在防治虾白斑综合征中的应用来解决该领域中的这种需要。
本发明提供了高良姜素在在制备虾白斑综合征治疗药物中的应用。高良姜素不仅具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗氧化等多种生物活性，而且其结构简单，可以人工合成，高良姜素对白斑综合征病毒WSSV具有抑制活性，可用于预防和治疗虾白斑综合征。高良姜素的化学结构如下：
。
本发明进一步提供高良姜素在制备预防或治疗白斑综合征病毒的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果或者优点：
本发明首次验证并揭示了高良姜素抗白斑综合征病毒的生物活性。动物实验研究发现，高良姜素能够显著抑制白斑综合征病毒在克氏原螯虾体内的复制，并同时提高受白斑综合征病毒感染的克氏原螯虾的存活率。高良姜素对克氏原螯虾的白斑综合征病毒具有良好的抗病毒作用，可应用于防治由白斑综合征病毒引发的克氏原螯虾病害。
高良姜素具有低毒、低残留、低成本、绿色安全等优点，可利用其生物活性对危害克氏原螯虾养殖的白斑综合征病毒进行防治。本发明为水产养殖绿色生物药剂的开发和研制提供了新路径，拓展了高良姜素的新用途。
附图说明
图1为绝对定量标准曲线。
图2为不同浓度高良姜素注射克氏原螯虾24h后对鳃组织中WSSV复制拷贝数的影响。
图3为通过Kaplan-Meier方法对不同处理下克氏原螯虾的累计存活率。
具体实施方式
下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
为了使本领域技术人员更好地理解、实施本发明的技术方案，现结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但所举实施例不作为对本发明的限定。
下述实施例中所述实验方法和检测方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可在市场上购买得到。
本实施例提供了高良姜素抗白斑综合征病毒活性测定。实验动物采用克氏原螯虾，购自陕西省咸阳市水族市场。
（1）试验材料
病毒材料：白斑综合征病毒由西北农林科技大学水产病害实验室提供。
待测药液的配制：准确称取高良姜素标准品，用色谱级DMSO配制成浓度为100mg/mL的标准液，再用DMSO稀释成不同的浓度10、15、20、30、40、60、80mg/mL；用0.22μm有机系针头滤器过滤，并转入棕色的色谱瓶中作为标准品稀释液使用。
（2）安全性评价
在进行抗病毒活性测定前，开展高良姜素对克氏原螯虾的安全性评价。
随机挑选健康的克氏原螯虾分组，每组12只，放置于水温为24-27℃的塑料箱中用于试验处理。试验设置空白对照组和药物处理组。空白对照组仅注射TM（100 mM Tris-HCl，10mM MgCl2，pH=7.5）缓冲液，药物处理组则是注射不同浓度的高良姜素。高良姜素的测试浓度为：30、40、50、60、70、80mg/kg。药物注射体积为100μL/只。药物注射后，连续72h观察并记录虾的存活状况。
安全性评价结果表明，在所测试的时间（72h）和浓度（30~50mg/kg）范围内，高良姜素对克氏原螯虾是安全的，同时，克氏原螯虾并未表现出不适征状；在所测试的时间（72h）和浓度（60~80mg/kg）范围内，克氏原螯虾每组出现1-6只的死亡。因此，确定高良姜素的安全使用浓度高于50mg/kg同时不宜高于60mg/kg，则在后续实验中采用低于50mg/kg的高良姜素浓度，对克氏原螯虾进行实验。
（3）抗病毒活性检测
随机挑选健康的克氏原螯虾，每种分为3组（WSSV处理组、高良姜素与WSSV共处理组，空白对照组），每组25只，设置3个平行实验。试验于25℃养殖水体中进行。高良姜素的测试浓度为25、50mg/kg。每只克氏原螯虾注射处理液的体积为100μL。药物处理方式为WSSV病毒和单体化合物（高良姜素）预混后立即腹部注射（每只虾的病毒用量为6.9×107copies，预混：在25℃下病毒液同药液混匀后立刻注射），分别在24h后每个处理组随机挑取5只克氏原螯虾，采集虾的鳃组织，-80℃保存待用。
采集的样品分别用于WSSV基因组DNA拷贝数的绝对定量。使用绝对荧光定量PCR检测处理样品鳃组织中病毒基因组拷贝数。用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取采集的组织样品DNA。使用超微量分光光度计检测提取DNA浓度和纯度，然后将DNA浓度统一调整为50ng/μL。通过RT-qPCR和构建的绝对定量标准曲线（图1）定量组织中的病毒拷贝数。
克氏原螯虾鳃组织DNA的提取：
1）称取15mg左右的组织材料，充分研磨，放入装有200μL GA缓冲液的离心管中，涡旋振荡15sec；
2）加入20μL Proteinase K（20mg/mL）溶液，涡旋混匀，简短离心去除管盖内壁的水珠，56℃放置，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
3）加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
4）加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；
5）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；
6）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
7）向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；
8）重复操作步骤7）；
9）将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；
10）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100μL洗脱缓冲液ddH2O，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；
11）重复步骤10）
12）离心得到的溶液包含DNA产物，将DNA产物置于-20℃保存备用。
使用CFX-96实时进行PCR定量检测。定量引物使用VP28-141，引物序列见表1。定量试剂盒用Vazyme的AceQ® qPCR SYBR® Green Master Mix。定量反应体系见表2，反应程序见表3。
表1，引物VP28-141的序列
表2，RT-qPCR反应体系
表3，RT-qPCR反应程序
（4）存活率检测
确定安全浓度后，在体内测试高良姜素对克氏原螯虾的保护作用。将健康的克氏原螯虾随机分为3组，每组100只，分别注射TM缓冲液（对照组）、TM-WSSV混合物（阳性对照组）和药物-WSSV混合物（处理组，15和30mg/kg）。各组克氏原螯虾观察8d并记录死亡情况。其中，存活率计算公式为：存活率（%）=处理组存活数/每组的总数×100%。
由图2可知，不同浓度的高良姜素（15和30mg/kg）显著降低了WSSV在克氏原螯虾体内的拷贝数，具有良好的抗WSSV的生物活性，抑制率达到了66.50%和81.23%。
由图3可知，高良姜素能够显著减少感染WSSV克氏原螯虾的死亡率。试验期间，TM缓冲液处理的克氏原螯虾未发现死亡或者仅少量的克氏原螯虾出现死亡。WSSV处理的克氏原螯虾，出现大量死亡，在8d时的存活率为5%。用不同浓度的高良姜素（15和30mg/kg）处理的患病克氏原螯虾存活率有所提高，达到了24%和39%。
由图3可知，高良姜素能够显著抑制WSSV克氏原螯虾体内复制，并同时提高受WSSV感染克氏原螯虾的存活率。
综上，本发明实施例结果充分说明，高良姜素可通过显著降低WSSV复制相关基因的表达，抑制WSSV在克氏原螯虾体内的复制，提高受病毒感染的宿主存活率。本研究为开发高良姜素作为一种高效实用的抗WSSV药物提供了理论依据，同时为高良姜素对其它水生动物病毒的抗病毒作用研究提供了重要参考。
如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。
Claims (1)
1.高良姜素作为唯一活性组分在制备虾白斑综合征治疗药物中的应用。
Priority Applications (1)
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Citations (4)
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|---|---|---|---|---|
| CN102048993A (zh) * | 2009-10-29 | 2011-05-11 | 中国中医科学院中药研究所 | 高良姜提取物在制备抑制钙离子通道药物中的应用 |
| CN103611040A (zh) * | 2013-12-10 | 2014-03-05 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 高良姜植物的花和/或果实在制备抑菌剂或防治水产动物细菌性疾病药物中的应用 |
| CN104208234A (zh) * | 2013-05-29 | 2014-12-17 | 镇江威特药业有限责任公司 | 一种高效预防虾白斑综合征的中草药散剂 |
| CN115212276A (zh) * | 2022-07-14 | 2022-10-21 | 集美大学 | 一种防治虾蟹纤毛虫病的外用中草药组合物 |
-
2023
- 2023-11-02 CN CN202311444476.XA patent/CN117180262B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102048993A (zh) * | 2009-10-29 | 2011-05-11 | 中国中医科学院中药研究所 | 高良姜提取物在制备抑制钙离子通道药物中的应用 |
| CN104208234A (zh) * | 2013-05-29 | 2014-12-17 | 镇江威特药业有限责任公司 | 一种高效预防虾白斑综合征的中草药散剂 |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Effect of Galangal (Alpinia galanga Linn.) Extract on the Growth Rate and Resistance to Vibrio harveyi and White Spot Diseases in Pacific White Shrimp (Litopenaeus vannamei);Tidaporn Chaweepack 等;Journal of Agricultural Science;第7卷(第9期);摘要 * |
| Phytochemical and Pharmacological activities of Alpinia galangal: A review;Ramesh Kumar Verma等;Asian Journal of Pharmacy and Pharmacology;第8卷(第3期);第79页左栏第3段，81页左栏第1段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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