CN116392468A - 一种苍术素在制备预防或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种苍术素在制备预防或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用。本发明的目的在于探索苍术素在水产养殖抗病毒方面的可行性，为抗病毒绿色渔药创新研究拓展新途径。本发明为苍术素作为一种高效实用的抗WSSV药物提供了重要的理论依据，因此可有望将苍术素开发成为一种预防或治疗水产动物白斑综合征的药物，并为苍术素对其它水生动物病毒的抗病毒效果评价及作用机制研究提供有意义的参考。
Description
技术领域
本发明属于植物源抗病毒药物技术领域，具体为一种苍术素在制备预防或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用。
背景技术
白斑综合征是由白斑综合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)引起的一种水生动物重大传染病
近年来，免疫增强剂、中草药提取物、益生菌和水产疫苗等一系列环境友好型制剂和药物被广泛应用于防治水生生物病毒。我国中草药资源丰富，自古以来便是中国医术发展的重要组成部分，许多中草药含有机酸、黄酮类、萜类、皂苷类、生物碱类等天然活性成分，具有抗病毒、增强机体免疫力和抗应激能力的作用，同时还能从多靶点、多途径作用于病原体进行协同抑制和杀灭作用，具有安全性高、残留低、不易产生耐药性等特点。
因此，进行抗病毒天然活性成分的创新研究，对满足产业迫切需求、保障水产品安全和环境友好具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种预防或治疗水产动物白斑综合征药物，以针对白斑综合征病毒发挥有效的抑制作用。
根据本发明的一个方面，提供一种苍术素在制备预防或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用。苍术素不仅具有具有促进胃排空、抗炎、抗肿瘤、降血糖、利尿等多种药理活性，而且其结构简单，廉价易得。因此苍术素作为先导化合物开发新药物前景广阔。本发明的目的在于探索苍术素在水产养殖抗病毒方面的可行性，为抗病毒绿色渔药创新研究拓展新途径。本发明为苍术素作为一种高效实用的抗WSSV药物提供了重要的理论依据，因此可有望将苍术素开发成为一种预防或治疗水产动物白斑综合征的药物，并为苍术素对其它水生动物病毒的抗病毒效果评价及作用机制研究提供有意义的参考。
优选地，还包括苍术素衍生物在制备预防或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用；苍术素衍生物选自苍术素在药学上可接受的盐、酯、醚、立体异构体、前药分子中的至少一种。
优选地，水产动物为甲壳类水产动物。
优选地，甲壳类水产动物为克氏原螯虾。
优选地，该预防或治疗水产动物白斑综合征的药物的给药量为每kg水产动物添加25～50mg。
根据本发明的另一个方面，提供一种预防或治疗水产动物白斑综合征的药物，包含活性成分，活性成分为苍术素、苍术素衍生物中的至少一种。
优选地，还包括药学可接受的载体。本领域技术人员易于知晓，在苍术素可用于预防和治疗水产动物白斑综合征的基础上，配伍药学上可供选择的载体或助剂，将所述药物制备成便于水产养殖使用的制剂或疫苗。对药学上可供选择的载体或助剂，本发明不做限定。
优选地，该预防或治疗水产动物白斑综合征的药物为注射剂。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果或优点：
本发明首次验证并揭示了苍术素抗白斑综合征病毒的生物活性。在动物实验研究中发现，苍术素能够显著抑制白斑综合征病毒在克氏原螯虾体内的复制，并同时提高受白斑综合征病毒感染的克氏原螯虾的存活率。苍术素在甲壳类水产养殖中具有良好的抗白斑综合征病毒作用，因此可将苍术素应用于防治由白斑综合征病毒引发的水产动物病害。同时，苍术素作为一种天然活性成分，具有低毒、低残留、低成本、绿色安全的特性，利用其生物活性对危害甲壳类水产养殖的白斑综合征病毒进行防治，为水产养殖绿色生物药剂的开发和研制提供了新路径，拓展了苍术素的新用途。
附图说明
图1为苍术素的化学结构图；
图2为WSSV病毒的绝对定量标准曲线；
图3为不同苍术素浓度对WSSV病毒的抑制率；
图4为不同苍术素浓度对克氏原螯虾的存活率。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
下述实施例中所用的实验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获取。
白斑综合征病毒由国家海洋局第三海洋研究所提供，西北农林科技大学水产病害实验室保存。
苍术素(Atractylodin，CAS:55290-63-6)购自上海麦克林生化科技股份有限公司，其结构式如图1所示。
实验动物选用克氏原螯虾，购自陕西咸阳水族市场。
白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因引物：
上游引物(VP28-F)AAACCTCCGCATTCCTGTGA
下游引物(VP28-R)TCCGCATCTTCTTCCTTCAT
实施例1
在本实施例中，探究苍术素对克氏原螯虾的安全浓度。
实验方法：
(1)配制苍术素溶液：将苍术素溶解于色谱级二甲基亚砜(Dimethylsulfoxide，DMSO)，配制成苍术素的浓度为100mg/mL的标准液，再用DMSO稀释成不同的浓度10、20、50、80mg/mL；用0.22μm有机系针头滤器过滤，并转入棕色的色谱瓶中作为标准品稀释液使用。
(2)随机挑选健康的克氏原螯虾分成4组，每组10只，放置于水温为26℃的塑料箱中用于试验处理。试验设置空白对照组和药物处理组：空白对照组仅注射TM缓冲液，即包含100mM Tris-HCl，10mM MgCl2，pH为7.5的缓冲液；药物处理组则是注射不同浓度的苍术素(80、100、120mg/kg)；药物注射体积为100μL/只。注射后，连续72h观察并记录虾的存活状况。
实验结果：在注射72h内，处理组中苍术素的注射浓度为80～120mg/kg时，克氏原螯虾无明显变化，且未表现出不适症状。因此确定苍术素的安全使用浓度高于120mg/kg，则在后续实验中采用低于120mg/kg的苍术素浓度，对克氏原螯虾进行实验。
实施例2
在本实施例中，检测苍术素抗白斑综合征病毒的活性。
实验方法：
本实施例于25℃养殖水体中进行，挑选健康的克氏原螯虾，随机分成7个处理组。设置空白对照组，编号为对照组1，即仅注射TM缓冲液的处理组；设置WSSV处理组，编号为对照组2，即注射TM缓冲液与WSSV病毒混合液的处理组，每只虾的病毒用量为6.9×107copies；设置苍术素与WSSV共处理组，其中，苍术素注射浓度为15mg/kg的处理组，编号为实验组1；苍术素注射浓度为25mg/kg的处理组，编号为实验组2；苍术素注射浓度为35mg/kg的处理组，编号为实验组3；苍术素注射浓度为50mg/kg的处理组，编号为实验组4；苍术素注射浓度为60mg/kg的处理组，编号为实验组5。实验组1～5的药物处理方式如下：在25℃下，将WSSV病毒和苍术素混合均匀后，立即对克氏原螯虾进行腹部注射，每只虾的病毒用量为6.9×107copies。
每组30只克氏原螯虾，设置3个平行实验，每只虾注射处理液的体积为100μL。注射24h后，分别在每个处理组随机挑取5只克氏原螯虾，采集虾的鳃组织，于-80℃下保存备用。
各组采集到的鳃组织分别用于WSSV基因组DNA拷贝数的绝对定量，实验方法如下：
(1)使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取采集的组织样品DNA。
提取克氏原螯虾鳃组织DNA的具体操作如下：
S1、溶解：称取15mg的克氏原螯虾鳃组织，研磨后与200μLGA缓冲液混合，并涡旋振荡均匀，再加入20μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K(Proteinase K)溶液，再次涡旋混匀，置于56℃环境下，直至组织完全溶解，得到混合液。
S2、将上述混合液与200μL缓冲液GB充分混匀，于70℃下静置，待溶液变清澈，再加入200μL无水乙醇，充分混匀，出现沉淀物。再将溶液和沉淀物都加入吸附柱CB3中，在12000rpm的转速下离心30s，倒出上清液。
S3、清洗：依次用500μL缓冲液GD、600μL漂洗液PW分别通过离心对沉淀物进行清洗。再将600μL漂洗液PW和清洗后的沉淀物置于吸附柱CB3内，在12000rpm的转速下离心2min，倒掉上清液，并将吸附柱CB3于室温放置，以彻底晾干沉淀中残余的漂洗液；
S4、洗脱：将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜悬空滴加50μL双蒸水(ddH2O)作为洗脱缓冲液，于室温下放置2～5min，并12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；重复一次滴加双蒸水、常温放置、离心的洗脱操作。离心得到的溶液包含DNA产物，将DNA产物置于20℃保存备用。
(2)使用绝对荧光定量PCR检测处理样品鳃组织中病毒基因组拷贝数。
PCR定量检测的具体操作如下：使用荧光定量PCR仪CFX-96进行实时PCR定量检测，定量试剂盒用诺唯赞Vazyme公司生产的AceQ
qPCR SYBR/>
Green Master Mix。反应程序为95℃预热30s，随后以95℃持续5s，60℃持续30s，72℃持续30s为一个循环，进行40个循环。
(3)使用超微量分光光度计检测提取DNA浓度和纯度，然后将DNA浓度统一调整为50ng/μL。
(4)通过RT-qPCR和构建的绝对定量标准曲线以定量组织中的病毒拷贝数，qRTPCR反应体系为10μL，包括1μL DNA模板，5μL ChamQ SYBR qPCR Master Mix，3μL无核酸酶水以及白斑综合征病毒囊膜蛋白VP28基因引物的上、下游引物各0.5μL。
实验结果：构建的绝对定量标准曲线如图2所示，测得的WSSV在不同组别中克氏原螯虾体内的拷贝数如表1所示。
由表1中对照组1～2与实验组1～5的实验结果可知，苍术素能抑制白斑综合征病毒WSSV在克氏原螯虾体内复制，从而降低WSSV的浓度，有效减少白斑综合征的传染与病发。对比实验组1～5的病毒抑制率，可以看出，实验组2～4中对应的克氏原螯虾体内的病毒抑制率较高，说明苍术素的注射浓度在25～50mg/kg之间时，能够显著降低WSSV在克氏原螯虾体内的拷贝数，具有良好的抗WSSV的生物活性。其中WSSV病毒抑制率最高的处理组为实验组4，即注射剂中苍术素浓度为50mg/kg时，具有最佳的抗WSSV活性。
实验组1中抑制率较小，说明苍术素浓度较小，抗WSSV活性较弱；实验组5中的病毒抑制率相较于实验组4的病毒抑制率相仿，无显著性差异，说明在苍术素浓度＞50mg/kg时，继续增加苍术素浓度对WSSV病毒抑制率的影响较小。对比对照组1(即空白对照组)、实验组2(即苍术素的注射浓度为25mg/kg)与实验组4(即苍术素的注射浓度为50mg/kg)中克氏原螯虾体内的病毒抑制率，在图2中可以发现实验组4的病毒抑制率大于实验组2的病毒抑制率，说明苍术素注射浓度为50mg/kg的药液比注射苍术素浓度为25mg/kg的药液，更能预防或治疗水产动物白斑综合征。
表1.不同组别克氏原螯虾中WSSV病毒的抑制率
其中，病毒抑制率计算公式为：病毒抑制率(％)＝(对照组2注射24h后病毒浓度-实验组注射24h后病毒浓度)/对照组2注射24h后病毒浓度×100％。
实施例3
在本实施例中，探究苍术素浓度对感染了白斑综合征病毒的克氏原螯虾的存活率影响。
实验方法：
按照实施例2的分组方式，将健康的克氏原螯虾随机分成7个处理组，每组100只克氏原螯虾，分别为对照组1、对照组2、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4、实验组5。
各组的处理方式与实施例2中处理组严格保持一致：设置仅注射TM缓冲液的处理组作为空白对照组，编号为对照组1；设置WSSV处理组作为阳性对照组，编号为对照组2，即注射TM缓冲液与WSSV病毒混合液的处理组，每只虾的病毒用量为6.9×107copies；设置苍术素与WSSV共处理组，其中，苍术素注射浓度为15mg/kg的处理组，编号为实验组1；苍术素注射浓度为25mg/kg的处理组，编号为实验组2；苍术素注射浓度为35mg/kg的处理组，编号为实验组3；苍术素注射浓度为50mg/kg的处理组，编号为实验组4；苍术素注射浓度为60mg/kg的处理组，编号为实验组5。实验组1～5的药物处理方式如下：在25℃下，将WSSV病毒和苍术素混合均匀后，立即对克氏原螯虾进行腹部注射，每只虾的病毒用量为6.9×107copies。
每天观察各组克氏原螯虾并记录死亡情况。其中，存活率计算公式为：存活率(％)＝处理组存活数/每组的总数×100％。
实验结果：测得的不同组别克氏原螯虾的第8天的存活率如表2所示。
由表2中对照组1～2与实验组1～5的实验结果可知，实验组1～5比对照组2的存活率高，说明苍术素能够显著减少感染WSSV克氏原螯虾的死亡率。实验期间，对照组1中仅使用TM缓冲液处理的克氏原螯虾未发现死亡或者仅少量的克氏原螯虾出现死亡。对照组2中使用WSSV处理的克氏原螯虾，出现大量死亡，第8天的存活率仅为8％。
对比实验组1～5的存活率，可以看出，实验组2～4中对应的克氏原螯虾体内的病毒抑制率较高，说明苍术素的注射浓度在25～50mg/kg之间时，能够显著提高受WSSV感染克氏原螯虾的存活率。在图4中，可以对比对照组1(即空白对照组)、对照组2(即阳性对照组)、实验组2(即苍术素的注射浓度为25mg/kg)与实验组4(即苍术素的注射浓度为50mg/kg)中克氏原螯虾每天的存活率，可以发现实验组4每天的存活率均大于实验组2的存活率，说明注射苍术素浓度为50mg/kg的药液比苍术素注射浓度为25mg/kg的药液，更能预防或治疗水产动物白斑综合征。其中存活率最高的处理组为实验组4，即药液中苍术素注射浓度为50mg/kg时，具有最佳的存活率，在第8天能达到47％。
表2.不同组别克氏原螯虾的8天存活率
| 组别 | 病毒注射浓度(copies) | 苍术素注射浓度(mg/kg) | 8天存活率(％) |
| 对照组1 | 0 | 0 | 97 |
| 对照组2 | 6.9×107 | 0 | 8 |
| 实验组1 | 6.9×107 | 15 | 14 |
| 实验组2 | 6.9×107 | 25 | 28 |
| 实验组3 | 6.9×107 | 35 | 36 |
| 实验组4 | 6.9×107 | 50 | 47 |
| 实验组5 | 6.9×107 | 60 | 44 |
综上，本发明实施例结果充分说明，苍术素可通过显著降低WSSV复制相关基因的表达，抑制WSSV在克氏原螯虾体内的复制，提高受病毒感染的宿主存活率。本研究为开发苍术素作为一种高效实用的抗WSSV药物提供了理论依据，同时为苍术素对其它水生动物病毒的抗病毒作用研究提供了重要参考。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种苍术素在制备预防或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用。
2.如权利要求1所述应用，其特征在于，还包括苍术素衍生物在制备预防或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用；所述苍术素衍生物选自苍术素在药学上可接受的盐、酯、醚、立体异构体、前药分子中的至少一种。
3.如权利要求1～2任一项所述应用，其特征在于，所述水产动物为甲壳类水产动物。
4.如权利要求3所述应用，其特征在于，所述甲壳类水产动物为克氏原螯虾。
5.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物的给药量为每kg水产动物添加25～50mg。
6.一种预防或治疗水产动物白斑综合征的药物，其特征在于，包含活性成分，活性成分为苍术素、苍术素衍生物中的至少一种。
7.如权利要求6所述预防或治疗水产动物白斑综合征的药物，其特征在于，还包括药学可接受的载体。
8.如权利要求7所述预防或治疗水产动物白斑综合征的药物，其特征在于，所述药物为注射剂。
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|---|---|---|---|
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