CN115998723A

CN115998723A - 莽草酸在制备预防和/或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用

Info

Publication number: CN115998723A
Application number: CN202211674364.9A
Authority: CN
Inventors: 吉华松; 李鹏飞; 高任; 陈瑞爱; 余庆; 韩书煜; 欧阳征亮; 陈博; 王高学; 凌飞; 陈诚
Original assignee: Nanchang Yimen Biotechnology Co ltd; Guangxi Academy of Sciences; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Nanchang Yimen Biotechnology Co ltd; Guangxi Academy of Sciences; Zhaoqing Dahuanong Biological Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2022-12-26
Filing date: 2022-12-26
Publication date: 2023-04-25

Abstract

本发明涉及莽草酸在制备预防和/或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用。本发明为白斑综合征的预防和治疗提供了一种新的药物，能够显著抑制白斑综合征病毒在水产动物体内的复制，并同时提高受白斑综合征病毒感染的水产动物的存活率。莽草酸对水产动物养殖中的白斑综合征病毒具有良好的抗病毒作用，可应用于预防和治疗由白斑综合征病毒引发的水产动物病害。

Description

莽草酸在制备预防和/或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用

技术领域

本发明属于植物源抗病毒药物技术领域，具体地涉及莽草酸在制备抗水产动物白斑综合征病毒药物中的应用。

背景技术

莽草酸(Shikimic acid,SA)是一种存在于银杏、八角等大多数植物和微生物中的单体化合物，是芳香族氨基酸生物合成途径中的关键中间体，也是合成多种生物碱、手性药物的重要前体分子，其结构简单，易于提取。莽草酸本身可以通过影响花生四烯酸代谢，抑制血小板聚集，抑制动、静脉血栓及脑血栓形成，具有有抗炎、镇痛作用；同时还具有一定的预防禽流感病毒和甲型H1N1流感病毒的效果。白斑综合征病毒(White spot syndromevirus，WSSV)导致的白斑综合征是迄今为止对水产动物养殖产业危害最大的疫病。在过去的二十多年中，各国学者不断地寻找预防和治疗WSSV感染的方法和途径，主要包括免疫增强剂、重组蛋白疫苗、灭活疫苗、遗传育种、RNAi和中草药提取物等领域，其中药物防控是生产中最直接、最有效的手段。近年来，起源于医药的金刚烷胺、鸟嘌呤类似物和病毒唑等国内外水产抗病毒药物被禁用，如今临床应用水产抗病毒药物寥寥无几。因此，进行抗病毒渔药创新研究，对满足产业迫切需求、保障水产品安全和环境友好具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供莽草酸在制备预防和/或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用，探索莽草酸在水产养殖抗病毒方面的可行性，为抗病毒绿色渔药创新研究拓展新途径。本发明涉及莽草酸能够显著抑制白斑综合征病毒在水产动物体内的复制，并同时提高受白斑综合征病毒感染的水产动物的存活率。

莽草酸是自然界中存在的一种重要的有机酸，是抗禽流感药物磷酸奥司他韦(达菲)合成的关键原料。莽草酸不仅具有抗肿瘤、保护心脑血管、抗炎止痛等多种生物活性，而且其具有廉价易得、结构简单、低毒、低残留、安全的特性。因此莽草酸作为先导化合物开发新药物前景广阔，以解决水产动物受WSSV感染的问题。

根据本发明的一个方面，提供莽草酸在制备预防和/或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用。基于本发明的实验动物验证，莽草酸对白斑综合征病毒WSSV具有抑制活性，能够显著抑制白斑综合征病毒在水产动物体内的复制，并同时提高受白斑综合征病毒感染的水产动物的存活率，可用于预防和/或治疗水产动物白斑综合征药物的制备。

优选地，上述水产动物为克氏原螯虾。

优选地，莽草酸的添加量为每一千克水产动物中添加25～50mg的莽草酸，上述莽草酸的添加量一方面保证了莽草酸应用于制备预防和/或治疗水产动物白班综合征药物中的活性和疗效，同时有利于控制成本和安全性。

根据本发明的另一个方面，提供一种预防和/或治疗水产动物白斑综合征的药物，其活性成分包括莽草酸。

优选地，上述药物为注射剂。基于本发明中的动物实验研究结果，领域技术人员易于知晓，在莽草酸可用于预防和治疗水产动物白斑综合征的基础上，配伍药学上可供选择的载体或助剂，将上述药物制备成便于水产养殖使用的制剂或疫苗。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果在于：本发明首次验证并揭示了莽草酸抗白斑综合征病毒的生物活性。动物实验研究发现，莽草酸能够显著抑制白斑综合征病毒在水产动物体内的复制，并同时提高受白斑综合征病毒感染的水产动物的存活率。莽草酸对水产动物养殖中的白斑综合征病毒具有良好的抗病毒作用，可应用于预防和治疗由白斑综合征病毒引发的水产动物病害。

附图说明

图1是本发明实施例1中绝对定量标准曲线示意图；

图2是本发明实施例1中不同浓度莽草酸注射克氏原螯虾24h后对鳃组织中WSSV复制拷贝数和抑制率的检测结果图；

图3是本发明实施例2中不同浓度莽草酸对克氏原螯虾的累计存活率的检测结果图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例和实施例中的附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。本发明实施例旨在说明莽草酸的抗白斑综合征病毒活性。

实施例1

本实施例阐述的是莽草酸抑制WSSV在水产动物体内复制的试验。

1.试验材料

病毒材料：白斑综合征病毒由国家海洋局第三海洋研究所提供，西北农林科技大学水产病害实验室保存。

待测药液的配制：准确称取莽草酸标准品，用色谱级DMSO配制成浓度为100mg/mL的标准液，再用DMSO稀释成不同的浓度10、15、20、30、40、60、80mg/mL；用0.22μm有机系针头滤器过滤，并转入棕色的色谱瓶中作为标准品稀释液使用。

实验动物：实验采用克氏原螯虾，购自陕西咸阳水族市场。

2.安全性测试

随机挑选健康的克氏原螯虾分为2组(空白对照组和药物处理组)，每组10只，放置于水温为27℃的塑料箱中用于试验处理。空白对照组仅注射TM(100mM Tris-HCl,10mMMgCl₂,pH 7.5)缓冲液；药物处理组则是分别注射不同浓度的莽草酸，其中莽草酸的测试浓度分别为：20、50、80、100、120mg/kg。含莽草酸的药物处理液注射体积为100μL/只。药物处理液注射后，连续72h观察并记录虾的存活状况。

安全性评价结果表明，在所测试的时间(72h)和浓度(20～120mg/kg)范围内，莽草酸对克氏原螯虾是安全的，同时，克氏原螯虾并未表现出不适症状。

3.抗病毒活性检测

随机挑选健康的克氏原螯虾，每种分为3组(空白组、对照组、药物处理组)，每组25只，设置3个平行实验。试验于25℃养殖水体中进行。其中，空白组是仅注射TM(100mM Tris-HCl,10mM MgCl₂,pH 7.5)缓冲液；对照组是将TM缓冲液在25℃下与含量6.9×10⁷copies的病毒混匀后立即向克氏原螯虾的腹部进行注射；药物处理组则是向克氏原螯虾分别注射10mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、50mg/kg、70mg/kg的莽草酸。药物处理方式为WSSV病毒和莽草酸预混后立即腹部注射(每只虾的病毒用量为6.9×10⁷copies，预混：在25℃下病毒液同药液混匀后立刻注射)。含莽草酸的药物处理液体积为100μL。分别在24h后每个处理组随机挑取5只克氏原螯虾，采集虾的鳃组织，-80℃保存待用。

通过RT-qPCR和构建的绝对定量标准曲线定量组织中的病毒拷贝数。采集的样品分别用于WSSV基因组DNA拷贝数的绝对定量。使用绝对荧光定量PCR检测处理样品鳃组织中病毒基因组拷贝数。用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取采集的组织样品DNA。使用超微量分光光度计检测提取DNA浓度和纯度，然后将DNA浓度统一调整为50ng/μL。

克氏原螯虾鳃组织DNA的提取包括如下操作：

1)称取15mg左右的组织材料，充分研磨，放入装有200μL GA缓冲液的离心管中，涡旋振荡15sec；

2)加入20μL Proteinase K(20mg/mL)溶液，涡旋混匀，简短离心去除管盖内壁的水珠，56℃放置，直至组织完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

3)加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

4)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；

5)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；

6)向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

7)向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；

8)重复操作步骤7)；

9)将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

10)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液ddH₂O，室温放置2 5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中；

11)重复步骤10)

12)离心得到的溶液包含DNA产物，将DNA产物置于20℃保存备用。

使用CFX 96实时进行PCR定量检测。定量引物使用VP28-141，引物序列见表1。定量试剂盒用Vazyme的

qPCR

Green Master Mix。定量反应体系见表2，反应程序见表3。

表1引物VP28-141的序列

表2 RT-qPCR反应体系

试剂	体积(μL)
		2×SYBR Green Master Mix	7.5
Forward Primer(10μM)	0.3
		Reverse Primer(10μM)	0.3
模板	1
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	Up to 15

表3 RT-qPCR反应程序

4.测试结果

表4.实施例1中克氏原螯虾WSSV的拷贝数和抑制率

绝对定量标准曲线如图1所示，克氏原螯虾24h后鳃组织中WSSV复制拷贝数和WSSV抑制率如表4和图2所示。其中，WSSV抑制率计算公式为：抑制率(％)＝(对照组WSSV拷贝数-药物处理组WSSV拷贝数)/对照组WSSV拷贝数×100％。

将对照组和处理组对应的WSSV复制拷贝数和WSSV抑制率进行比对，相对于对照组，本发明通过用不同浓度的莽草酸处理克氏原螯虾，使克氏原螯虾体内WSSV复制拷贝数降低。由表4和图2可知，当莽草酸的添加量≥25mg/kg时，患病克氏原螯虾体内对WSSV的抑制率＞70％；当莽草酸的添加量≥50mg/kg时，患病克氏原螯虾体内对WSSV的抑制率＞80％。由此说明，不同浓度的莽草酸显著降低了WSSV在克氏原螯虾体内的拷贝数，具有良好的抗WSSV的生物活性。

实施例2

本实施例阐述的是莽草酸提高感染WSSV水产动物存活率的试验。

1.安全性测试：本实施例按照实施例1进行安全性评价测试。

2.存活率检测

将健康的克氏原螯虾随机分为3组(空白组、对照组、药物处理组)，每组100只。其中，空白组是仅向每只克氏原螯虾腹部注射TM(100mM Tris-HCl,10mM MgCl₂,pH 7.5)缓冲液；对照组是将TM缓冲液在25℃下与含量6.9×10⁷copies的病毒混匀后立即向克氏原螯虾的腹部进行注射；药物处理组则是向克氏原螯虾分别注射25mg/kg和50mg/kg的莽草酸。各组克氏原螯虾观察8d并记录死亡情况。

3.测试结果

克氏原螯虾的累计存活率如图3所示。其中，存活率计算公式为：存活率(％)＝处理组存活数/每组的总数×100％。

将对照组和处理组对应的克氏原螯虾存活率进行比对，相对于对照组，本发明通过用不同浓度的莽草酸处理克氏原螯虾，使患病克氏原螯虾存活率升高。由图3可知，空白组未发现死亡或者仅少量的克氏原螯虾出现死亡；对照组出现大量死亡的克氏原螯虾，在8d时的存活率为7％；药物处理组中用25mg/kg莽草酸处理的患病克氏原螯虾存活率为27％；药物处理组中用50mg/kg莽草酸处理的患病克氏原螯虾存活率为42％。测试结果说明，莽草酸能够显著减少感染WSSV克氏原螯虾的死亡率。

因此，莽草酸能够显著抑制WSSV克氏原螯虾体内复制，并同时提高受WSSV感染克氏原螯虾的存活率。综上所述，莽草酸可通过显著降低WSSV复制相关基因的表达，抑制WSSV在克氏原螯虾体内的复制，提高受病毒感染的宿主存活率。本研究为开发莽草酸作为一种高效实用的抗WSSV药物提供了理论依据，同时为莽草酸对其它水生动物病毒的抗病毒作用研究提供了重要参考。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。

Claims

1.莽草酸在制备预防和/或治疗水产动物白斑综合征药物中的应用。

2.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述水产动物为克氏原螯虾。

3.如权利要求1所述应用，其特征在于，所述莽草酸的添加量为每一千克水产动物中添加25～50mg的莽草酸。

4.一种预防和/或治疗水产动物白斑综合征的药物，其特征在于，所述药物的活性成分包括莽草酸。

5.如权利要求4所述药物，其特征在于，所述药物为注射剂。