CN112807375B - 王氏保赤丸在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用 - Google Patents

王氏保赤丸在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及王氏保赤丸在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用，属于医药技术领域。本发明提供了王氏保赤丸在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用，研究发现，王氏保赤丸可显著缩短醉酒小鼠醒酒时间，降低急性酒精性肝损伤造模小鼠血清中谷草转氨酶和谷丙转氨酶的水平，可显著改善急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织的病理变化，可显著降低急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中活性氧的表达，可显著提高急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶的活性及谷胱甘肽的水平，并且，可增加急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中醌氧化还原酶的表达，具有良好的缓解酒精性肝损伤作用。

Description

王氏保赤丸在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的 应用
技术领域
本发明涉及王氏保赤丸在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用，属于医药技术领域。
背景技术
近年来，随着人们生活水平的不断提高，我国酒精的人均消耗量有大幅度增长，酒精相关器官损伤疾病的发病率也逐年增加。
肝脏是酒精损伤的重要靶器官之一，已有大量研究阐明了酒精-内毒素-枯否细胞-TNFα等细胞因子-肝脏炎症这一损伤途径和机制。还有研究发现，肝巨噬细胞(库普弗细胞)是内毒素解毒的主要细胞，也是内毒素攻击的靶细胞，内毒素除了干扰细胞能量代谢和细胞内信号传导而对肝细胞产生直接毒性作用外，还能激活库普弗细胞释放促炎介质，介导肝损伤。
轻微的酒精性肝损伤会造成脂肪肝，严重的酒精性肝损伤则会造成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化，严重酗酒时可诱发广泛肝细胞坏死，甚至肝功能衰竭，严重损害人体健康。但是，目前，对于酒精性肝损伤还没有确切有效的治疗方法。因此，如何开发治疗酒精性肝损伤的药物广受关注。
王氏保赤丸是一种中成药，可用于小儿乳滞疳积、痰厥惊风、喘咳痰鸣、乳食减少、吐泻发热、大便秘结、四时感冒以及脾胃虚弱、发育不良等症；成人肠胃不清、痰食阻滞者亦有疗效。目前，关于王氏保赤丸在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用尚无报道。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了王氏保赤丸在制备药物中的应用，其特征在于，所述药物具有如下至少一种用途：
(a)解酒；和/或，
(b)预防和/或治疗酒精性肝损伤。
在本发明的一种实施方式中，所述解酒是指缩短醒酒时间，和/或，提高肝脏组织中乙醇脱氢酶的活性。
在本发明的一种实施方式中，所述预防和/或治疗酒精性肝损伤是指降低血清中谷草转氨酶的水平，降低血清中谷丙转氨酶的水平，改善肝脏组织的病理变化，降低肝脏组织中活性氧的表达，提高肝脏组织中超氧化物歧化酶的活性，提高肝脏组织中谷胱甘肽的含量，和/或，提高肝脏组织中醌氧化还原酶的水平。
在本发明的一种实施方式中，所述王氏保赤丸的成分包含大黄、黄连、制南星以及川贝母。
在本发明的一种实施方式中，所述药物含有王氏保赤丸、药物载体和/或药用辅料。
在本发明的一种实施方式中，所述药物载体包含微囊、微球、纳米粒和/或脂质体。
在本发明的一种实施方式中，所述药用辅料包含溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂和/或释放阻滞剂。
在本发明的一种实施方式中，所述药物的剂型为散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂或注射剂。
本发明技术方案，具有如下优点：
1、本发明提供了王氏保赤丸在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用，研究发现，王氏保赤丸可显著降低急性酒精性肝损伤造模小鼠血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的水平，可显著改善急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织的病理变化，可显著降低急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中活性氧(ROS)的表达，可显著提高急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性，可提高急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中谷胱甘肽(GSH)的含量，并且，可提高急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中醌氧化还原酶1(NQO-1)的水平，具有良好的缓解酒精性肝损伤作用。
2、本发明提供了王氏保赤丸在制备解酒药物中的应用，研究发现，王氏保赤丸可显著缩短醉酒小鼠的醒酒时间，并且，可显著提高急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中乙醇脱氢酶(ADH)的活性，具有良好的解酒作用。
附图说明
图1：不同组小鼠的醉酒及醒酒时间。
图2：不同组小鼠肝脏组织中乙醇脱氢酶(ADH)的活性。
图3：不同组小鼠肝脏组织中乙醇脱氢酶基因(ADH1)的mRNA表达量。
图4：不同组小鼠血清中谷草转氨酶(ALT)的活性。
图5：不同组小鼠血清中谷丙转氨酶(AST)的活性。
图6：不同组小鼠肝脏组织的病理损伤情况。
图7：不同组小鼠肝脏组织中活性氧(ROS)的含量。
图8：不同组小鼠肝脏组织中活性氧(ROS)的含量。
图9：不同组小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性。
图10：不同组小鼠肝脏组织中谷胱甘肽(GSH)的含量。
图11：不同组小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶1(SOD1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)以及醌氧化还原酶-1(NQO-1)的蛋白表达量。
图12：不同组小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶1(SOD1)基因的mRNA表达量。
图13：不同组小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶2(SOD2)基因的mRNA表达量。
图14：不同组小鼠肝脏组织中醌氧化还原酶-1(NQO-1)基因的mRNA表达量。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实验例1：不同药物对急性酒精损伤模型小鼠肝脏的影响
1.1实验材料
1.1.1实验动物
雄性C57BL/6小鼠，体重控制在18～22g，SPF级，购自常州卡文斯实验动物有限公司。
1.1.2主要药物与试剂
1)王氏保赤丸粉末，将购自精华制药集团股份有限公司王氏保赤丸粉碎而得；
2)水飞蓟宾，购自天津天士力制药股份有限公司；
3)检测试剂盒：ADH试剂盒、AST试剂盒、ALT试剂盒、GSH试剂盒、SOD试剂盒，购自上海酶联生物科技有限公司。
1.2实验方法
1.2.1小鼠醉酒时间统计
18只C57BL/6雄性小鼠适应性饲养1周后随机分为三组，三组分别为：模型组(Model)、王氏保赤丸组(WSBC)、水飞蓟宾组(Silybin)，每组6只。分组完成后，王氏保赤丸组小鼠以400mg/kg的剂量灌胃0.2mL王氏保赤丸溶液(王氏保赤丸粉末溶于饮用水所得)，水飞蓟宾组小鼠以35mg/kg的剂量灌胃0.2mL水飞蓟宾溶液(水飞蓟宾溶于饮用水所得)，模型组灌胃0.2mL饮用水。灌胃2h后，各组小鼠分别灌胃0.3mL的50％(v/v)乙醇进行造模。造模结束后，观察并记录小鼠的醉酒与醒酒时间，记录结果见图1。
1.2.2小鼠急性酒精性肝损伤实验
24只C57BL/6雄性小鼠适应性饲养1周后随机分为四组，分别为空白组(Blank)、模型组(Model)、王氏保赤丸组小鼠以400mg/kg的剂量灌胃0.2mL王氏保赤丸溶液(王氏保赤丸粉末溶于饮用水所得)，水飞蓟宾组小鼠以35mg/kg的剂量灌胃0.2mL水飞蓟宾溶液(水飞蓟宾溶于饮用水所得)，空白组和模型组分别灌胃0.2mL饮用水。灌胃2h后，空白组小鼠灌胃0.3mL饮用水，其余各组小鼠分别以6g/kg的剂量灌胃0.3mL的50％(v/v)乙醇溶液进行造模，12h、24h后各重复灌胃给药及乙醇溶液1次，共3次，末次乙醇灌胃后2h，将各组小鼠摘眼球取血，处死小鼠，解剖取胃、肝脏。用4％多聚甲醛固定部分肝脏、胃部组织，留待病理检测，其余部分冻入-80℃冰箱，备用。小鼠血液室温(25℃)放置2h后，在4℃、3500rpm的条件下离心30min，取上层血清备用。
取各组小鼠部分肝脏，通过ADH试剂盒检测各组小鼠肝脏组织中乙醇脱氢酶(ADH)的活性，检测结果见图2。
取各组小鼠部分肝脏，以小鼠肝脏mRNA为模板，采用实时荧光定量PCR法检测各组小鼠肝脏组织中乙醇脱氢酶基因(ADH1)的mRNA表达量(ADH1的扩增引物为核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的ADH1-F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的ADH1-R)，检测结果见图3。
取各组小鼠血清，通过AST试剂盒和ALT试剂盒检测各组小鼠血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的活性，检测结果见图4-5。
取各组小鼠部分肝脏组织HE染色，在显微镜下观察拍照，观察结果见图6。
免疫组化染色检测各组小鼠肝脏组织中活性氧(ROS)表达水平，检测结果见图7-8。
取各组小鼠部分肝脏，通过GSH试剂盒和SOD试剂盒检测各组小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和谷胱甘肽(GSH)的含量，检测结果见图9-10。
取各组小鼠部分肝脏，采用Western Blot法检测各组小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶1(SOD1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)以及醌氧化还原酶-1(NQO-1)的蛋白表达量，检测结果见图11。
取各组小鼠部分肝脏，以裂解肝脏总蛋白为模板，采用Western blotting法检测各组小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶1(SOD1)、超氧化物歧化酶2(SOD2)以及醌氧化还原酶-1(NQO-1)的蛋白表达量，检测结果见图12-14。
1.3统计方法
数据处理使用GraphPad Prism 8.0软件。数据结果以平均值±标准差(means±SD)方式表现。采用单因素方差分析进行统计学分析和检验，以当P<0.05被认为具有统计学上的差异，P<0.01则被认为具有统计学上的显著差异。
1.4实验结果
1.4.1小鼠醉酒时间统计结果
如图1所示，各组小鼠醉酒时间无明显区别，但王氏保赤丸可显著缩短小鼠醒酒时间(P<0.01)，模型组和水飞蓟宾组小鼠相比，醒酒时间无明显差异。
1.4.2小鼠急性酒精性肝损伤实验结果
如图2所示，模型组小鼠肝脏组织中ADH活性较空白组上升且有统计学差异(P<0.05)，王氏保赤丸组小鼠肝脏组织中ADH活性较模型组上升，且有显著性差异(P<0.01)，推测王氏保赤丸可以提高急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中ADH活性。
如图3所示，王氏保赤丸可以提高急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中乙醇脱氢酶基因(ADH1)的表达量。
谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是评价肝功能最常用的生化指标，可通过分析小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性来评价药物对小鼠急性酒精性肝损伤造模小鼠的影响。如图4-5所示，模型组小鼠与空白组小鼠相比，血清中AST、ALT水平均有增高；与模型组相比，王氏保赤丸组小鼠与水飞蓟宾组小鼠血清中AST水平均有所降低，且有显著性差异(P<0.01)；与模型组相比，王氏保赤丸组小鼠与水飞蓟宾组小鼠血清中ALT水平有所降低。
如图6所示，空白组小鼠肝组织结构完整，肝小叶轮廓清晰，肝索排列整齐，肝细胞无明显变性、坏死，无炎症细胞浸润及纤维组织增生；而模型组小鼠肝脏组织结构发生了显著的变化，肝脏细胞肿胀，出现了大小不一的脂肪空泡；王氏保赤丸组小鼠肝细胞圆润、饱满，肝板排列规则、整齐，肝窦无明显扩张或挤压，未见明显炎症细胞浸润。病理切片进一步证实了王氏保赤丸对急性肝损伤有一定的保护作用。
如图7-8所示，与空白组相比，模型组小鼠肝脏组织中ROS的表达显著性增多(P<0.01)；王氏保赤丸可以降低急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中ROS的表达，与模型组相比有显著性差异(P<0.01)；水飞蓟宾也降低了急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中ROS的表达，与模型组相比有显著性差异(P<0.01)；王氏保赤丸降低酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中ROS水平的能力优于水飞蓟宾。
超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)是体内重要的抗氧化物质，它们含量的减少会导致机体线粒体功能受损。如图9-10所示，与空白组比较，模型组小鼠肝脏组织中SOD活性和GSH活性降低(P<0.01)；与模型组相比，王氏保赤丸组小鼠肝脏组织中SOD活性及GSH活性均升高，其中SOD活性有统计学差异(P<0.05)。
如图11-14所示，与空白组相比，模型组小鼠肝脏组织中SOD1表达减少，且有显著性差异(P<0.05)，王氏保赤丸组小鼠与水飞蓟宾组小鼠肝脏组织中SOD1表达增加；与空白组相比，模型组小鼠肝脏组织中SOD2表达减少，王氏保赤丸组小鼠及水飞蓟宾组小鼠与模型组相比无差异；与空白组相比，模型组小鼠肝脏组织中NQO-1表达减少，王氏保赤丸组小鼠与模型组小鼠相比，肝脏组织中NQO-1表达有所增加，水飞蓟宾组小鼠与模型组小鼠相比未见明显差异。
综合图1-3的结果，王氏保赤丸可显著缩短急性酒精性肝损伤造模小鼠的醒酒时间，并且，可显著提高急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中乙醇脱氢酶(ADH)的活性，具有良好的解酒作用。
综合图4-14的结果，王氏保赤丸可显著降低急性酒精性肝损伤造模小鼠血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的水平，可显著改善急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织的病理变化，可显著降低急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中活性氧(ROS)的表达，可显著提高急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性，可提高急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中谷胱甘肽(GSH)的含量，并且，可提高急性酒精性肝损伤造模小鼠肝脏组织中醌氧化还原酶1(NQO-1)的水平，具有良好的缓解酒精性肝损伤作用。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 精华制药集团股份有限公司
<120> 王氏保赤丸在制备预防和/或治疗酒精性肝损伤的药物中的应用
<130> NTHA202100015
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccatcgagga catagaagtc gc 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tggtttcaca caagtcaccc c 21

Claims (2)

1.王氏保赤丸作为降低血清中谷草转氨酶的水平，降低血清中谷丙转氨酶的水平，改善肝脏组织的病理变化，降低肝脏组织中活性氧的表达，提高肝脏组织中超氧化物歧化酶的活性，提高肝脏组织中谷胱甘肽的含量，和/或，提高肝脏组织中醌氧化还原酶的水平的活性成分在制备治疗酒精性肝损伤的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述王氏保赤丸的成分包含大黄、黄连、制南星以及川贝母。
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