CN115028679B

CN115028679B - 一种具有Cyclophilin A降解活性的PROTAC化合物及其制备方法与应用

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Publication number: CN115028679B
Application number: CN202210957971.XA
Authority: CN
Inventors: 刘文军; 孙蕾; 李和桥; 杨文贤; 白晓园; 张鹤
Original assignee: Shenzhen Bay Laboratory
Current assignee: Shenzhen Bay Laboratory
Priority date: 2022-08-11
Filing date: 2022-08-11
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2042-08-11
Also published as: CN115028679A; WO2024031965A1

Abstract

本发明公开了一种具有Cyclophilin A降解活性的PROTAC化合物及其制备方法与应用。所述PROTAC化合物的结构式如式Ⅰ所示。本发明提供的式Ⅰ所示化合物能够用于预防和/或治疗CypA介导的疾病，如CypA介导的炎症、自身免疫性疾病和/或肿瘤。本发明还提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的式Ⅰ所示化合物和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。本发明提供的PROTAC化合物可靶向降解CypA蛋白，因而可以用于制备治疗炎症、自身免疫性疾病及肿瘤等相关疾病的药物；本发明式Ⅰ所示化合物对病毒诱导的肺炎、类风湿性关节炎及肺癌细胞迁移和浸润有明显的抑制功能。

Description

一种具有Cyclophilin A降解活性的PROTAC化合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种具有Cyclophilin A降解活性的PROTAC化合物及其制备方法与应用，属于生物医药领域。

背景技术

Cyclophilin A（亲环素A，CypA）是一种多功能的免疫调节蛋白，在真核细胞中广泛表达。在病毒感染导致的炎症过程中，CypA可通过正调控NF-κB信号通路促进炎细胞因子的产生。在自身免疫疾病如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮、银屑病的发生过程中，CypA可以促进白细胞迁移并诱导趋化因子和细胞因子的表达。在多种肿瘤相关的疾病过程中，CypA的表达显著增加，这与肿瘤的发生、转移及预后密切相关。因此CypA是治疗炎症、自身免疫性疾病及肿瘤的重要靶点蛋白。

PROTAC（靶向诱导蛋白降解联合体）由识别靶标蛋白的小分子配体、连接链和E3泛素蛋白连接酶配体三部分组成，可直接将靶蛋白降解，从而达到相关疾病治疗的效果。目前尚未有关靶向CypA的PROTAC药物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种可实现CypA降解的PROTAC化合物，该PROTAC化合物能够靶向降解CypA，可以应用于治疗CypA介导的炎症、自身免疫性疾病及肿瘤等相关疾病。

本发明所提供的PROTAC化合物的结构式如式Ⅰ所示；

式Ⅰ

式Ⅰ中，TBSO表示叔丁基二甲基硅氧基。

本发明还进一步提供了式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

S1、在碱性化合物Ⅰ和苄醇存在的条件下，式1所示化合物进行水解反应得到式2所示化合物；

式1 式2

式中，Bn表示苄基；

S2、式2所示化合物与异氰酸基环己烷经亲核加成反应，得到式3所示化合物；

式3

S3、式3所示化合物经钯碳还原得到式4所示化合物；

式4

S4、在氢氧化钾存在的条件下，((4-溴丁氧基)甲基)苯与丁烷-1,4-二醇经亲核取代反应得到4-(4-(苄氧基)丁氧基)丁-1-醇；

S5、在四丁基溴化铵和碱性化合物Ⅱ存在的条件下，所述4-(4-(苄氧基)丁氧基)丁-1-醇与2-溴乙酸叔丁酯经亲核取代反应得到式5所示化合物；

式5

式5中，Bn表示苄基，tBU表示叔丁基；

S6、式5所示化合物经钯碳还原得到式6所示化合物；

式6

S7、在三苯基磷和偶氮二甲酸二异丙酯存在的条件下，式6所示化合物与式4所示化合物经Mitsunobu反应得到式7所示化合物；

式7

S8、在三氟乙酸存在的条件下，式7所示化合物经脱保护反应得到式8所示化合物；

式8

S9、在N,N-二异丙基乙胺存在的条件下，式9所示化合物与叔丁基二甲基氯硅烷经亲核取代反应得到式10所示化合物；

式9 式10

式10中，TBSO表示叔丁基二甲基硅氧基;

S10、在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基乙胺存在的条件下，式8所示化合物与式10所示化合物经缩合反应得到式Ⅰ所示化合物。

上述的制备方法中，步骤S1中，所述碱性化合物Ⅰ为KOH（氢氧化钾）；

式1所示化合物与所述苄醇的摩尔比为1：5~15，优选1：10；

所述水解反应的温度为120~150^oC，时间为8~16h；

所述水解反应在水中进行；

步骤S2中，所述亲核加成反应的时间为12~24h，在回流状态下进行；

步骤S3中，所述钯碳中钯的质量百分含量为10%；

所述还原反应在乙醇中进行。

上述的制备方法中，步骤S4中，所述碱性化合物Ⅱ为KOH；

所述((4-溴丁氧基)甲基)苯与所述丁烷-1,4-二醇的摩尔比为1：2~5，优选1：3；

所述亲核取代反应的温度为20~40^oC，时间为1~5h；

步骤S5中，所述碱性化合物Ⅲ为NaOH；

所述4-(4-(苄氧基)丁氧基)丁-1-醇与所述2-溴乙酸叔丁酯的摩尔比为1：1~5，优选1：2；

所述亲核取代反应的温度为20~40^oC，时间为12~24h。

上述的制备方法中，步骤S7中，式6所示化合物与式4所示化合物的摩尔比为1：1~1.5，优选1：1；

式6所示化合物、所述三苯基磷、所述偶氮二甲酸二异丙酯的摩尔比为1：1~2：1~2，优选1：1.5：1.5；

所述缩合反应的温度为0~25^oC，时间为1~5h；

步骤S8中，所述脱保护反应的温度为20~40^oC，时间为1~5h；

步骤S9中，式9所示化合物与叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为1：1~5，优选1：2；

式9所示化合物与所述N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：5~15，优选1：10；

所述取代反应的温度为0~25^oC，时间为12~18h；

步骤S10中，式8所示化合物与式10所示化合物的摩尔比为1：1~1.5，优选1：1.1；

式8所示化合物、所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐、所述1-羟基苯并三唑、所述N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：1~2：1~2：1~2，优选1：1.5：1.5：1.5；

所述缩合反应的温度为0~25^oC，时间为12~18h。

本发明提供的式Ⅰ所示化合物能够用于预防和/或治疗CypA介导的疾病，如CypA介导的炎症、自身免疫性疾病和/或肿瘤；

优选地，所述炎症包括肺炎；

所述自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和银屑病；

所述肿瘤包括肺肿瘤。

式Ⅰ所示化合物在制备具有下述任一种功能的产品种的应用也属于本发明的保护范围：

1）降解CypA蛋白；

2）减轻流感病毒诱导的肺炎；

3）治疗类风湿性关节炎；

4）抑制癌细胞的迁移和浸润。

本发明还提供了一种药物组合物，其包含作为活性成分的式Ⅰ所示化合物和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。

本发明提供的PROTAC化合物可靶向降解CypA蛋白，因而可以用于制备治疗炎症、自身免疫性疾病及肿瘤等相关疾病的药物；本发明式Ⅰ所示化合物对病毒诱导的肺炎、类风湿性关节炎及肺癌细胞迁移和浸润有明显的抑制功能。

附图说明

图1为本发明式I所示化合物的合成路线图。

图2为式I所示化合物对细胞活性的影响结果。

图3为式I所示化合物对CypA的降解活性结果，其中，A为不同浓度式I所示化合物对CypA的降解结果，B为图3中的A的CypA相对表达量。

图4为式I所示化合物减轻B型流感病毒诱导的肺炎的结果，其中，A为检测各组小鼠CypA的表达，B为各组小鼠的肺指数，C为各组小鼠病理，D为各组小鼠病理评分，E为各组小鼠Il1b mRNA相对表达量，F为各组小鼠Il6 mRNA相对表达量，G为各组小鼠Tnfa mRNA相对表达量，H为各组小鼠Ifng mRNA相对表达量。

图5为式I所示化合物抑制类风湿性关节炎的结果，其中，A为各组大鼠踝HE图片，B为各组大鼠关节肿胀率，C为各组大鼠关节指数，D为各组大鼠踝病理评分。

图6为式I所示化合物抑制肺癌细胞迁移和浸润的结果，其中，A为Traswell法观察各组细胞的迁移和浸润的结果，B为对图6中的A进行的计数。

具体实施方式

实施例1、靶向降解CypA的式I化合物的设计与合成

合成路线图如图1所示。

（1）2,6-双(苄氧基)苯甲酰胺（化合物2）的合成

将化合物1(2.0 g,6.34 mmol)和氢氧化钾(2.85 g,50.73 mmol)溶在20 mL苯甲醇和2 mL水中的混合物在微波下加热至130 °C反应12 h，然后真空浓缩除去溶剂。将残余物加入水(200mL)，过滤出的固体通过硅胶快速柱色谱法纯化，用(石油醚/乙酸乙酯=20:1至1:1)洗脱，得到化合物2(1.2g）。

¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 7.63 (s, 1H), 7.45 (d, J = 7.1 Hz, 4H), 7.38(t, J = 7.3 Hz, 4H), 7.34–7.27 (m, 3H), 7.21 (t, J = 8.3 Hz, 1H), 6.72 (d, J= 8.4 Hz, 2H), 5.11 (s, 4H).

（2）2,6-双(苄氧基)-N-(环己基氨基甲酰基)苯甲酰胺（化合物3）的合成

将化合物2(1.2 g, 3.6 mmol)、异氰酸基环己烷(0.54 g, 4.32 mmol)溶在甲苯(30 ml)中回流18小时，并真空浓缩得到粗产物。将其通过硅胶快速柱色谱纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1:3，v/v)的混合物洗脱，得到白色固体状的化合物3(1.1g)。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.39 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.38– 7.20 (m, 11H), 6.58 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.13 (s, 4H), 3.75 (dd, J = 7.9,3.8 Hz, 1H), 1.97 (d, J = 10.2 Hz, 2H), 1.74 (dd, J = 9.0, 3.9 Hz, 2H), 1.65– 1.55 (m, 1H), 1.43 – 1.22 (m, 5H).

（3）N-(环己基氨基甲酰基)-2,6-二羟基苯甲酰胺（化合物4）的合成

将化合物3(1.1 g, 2.4 mmol)、10% Pd-C (0.22 g)加入到EtOH (30 ml)中，在氢气环境下于25°C搅拌16 h。过滤混合物。真空蒸发滤液。残余物通过硅胶快速柱色谱纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1:1，v/v)的混合物洗脱，得到白色固体4(520mg)。

¹H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11.68 (s, 2H), 10.53 (s, 1H), 8.23 (s, 1H),7.24 (s, 1H), 6.43 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 3.61 (s, 1H), 1.86 (s, 2H), 1.66 (s,2H), 1.54 (s, 1H), 1.34 – 1.23 (m, 5H).

（4）4-(4-(苄氧基)丁氧基)丁烷-1-醇的合成

将((4-溴丁氧基)甲基)苯(2.0 g, 8.23 mol)和丁烷-1,4-二醇(2.22 g, 24.68mol)溶在DMSO (15 mL)中，加入氢氧化钾(2.31 g, 41.13 mmol)，并将反应混合物在25℃搅拌2小时。一旦LCMS显示反应完成，将水(200ml)倒入反应液中，用二氯甲烷(200ml×3)萃取，真空除去溶剂并通过硅胶柱色谱法纯化，用(石油醚/乙酸乙酯=0~10%)得到无色油状物(1.1 g)。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.35 – 7.25 (m, 5H), 4.50 (s, 2H), 3.63 (t,J = 5.6 Hz, 2H), 3.54–3.40 (m, 6H), 2.35 (s, 1H), 1.66 (dd, J = 10.0, 4.3 Hz,8H).

（5）2-(4-(4-(苄氧基)丁氧基)丁氧基)乙酸叔丁酯（化合物5）的合成

将4-(4-(苄氧基)丁氧基)丁-1-醇(1.1 g, 4.36 mmol)、2-溴乙酸叔丁酯(1.7 g,8.72 mmol)和四丁基溴化铵(2.81 g, 8.72 mmol)溶在DCM(10ml)中，加入(5M)NaOH(10ml)，将反应混合物在室温搅拌18小时。一旦LCMS显示反应完成，将反应倒入水(200ml)中，用DCM(200×3)萃取，真空除去溶剂并通过硅胶柱色谱法纯化，用(石油醚/乙酸乙酯=0-20%)得到无色油状物化合物5(502mg)。

（6）2-(4-(4-羟基丁氧基)丁氧基)乙酸叔丁酯（化合物6）的合成

将化合物5(3.8 g, 10.3 mmol)、10% Pd/C (400 mg)加入到乙醇(60 ml)中，在氢气环境下于25°C搅拌16 h。过滤混合物，真空蒸发滤液, 将残余物通过硅胶快速柱色谱纯化，用乙酸乙酯/石油醚(1:1，v/v)的混合物洗脱，得到无色油状的化合物6(1.6 g)。

1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 3.94 (s, 2H), 3.63 (t, J = 5.8 Hz, 2H),3.53 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.49 – 3.44 (m, 4H), 1.70 – 1.64 (m, 8H), 1.47 (d,J = 10.4 Hz, 9H).

（7）2-(4-(4-(2-((环己基氨基甲酰基)氨基甲酰基)-3-羟基苯氧基)丁氧基)丁氧基)乙酸叔丁酯（化合物7）的合成

将化合物6(500 mg, 1.81 mmol)、化合物4(500 mg, 1.81 mmol)和三苯基磷(710mg, 2.72 mmol)溶在N,N-二甲基甲酰胺 (10 mL)中，冷却至0℃，在氮气的保护下加入偶氮二甲酸二异丙酯(545 mg,2.72 mmol)。将反应混合物在氮气保护下于25℃搅拌2小时。向反应液中加入水并用二氯甲烷(100 mL×3)萃取。将有机相真空浓缩。粗产物通过硅胶柱色谱纯化，用(石油醚/乙酸乙酯=20:1至1:1)洗脱，得到无色油状化合物7(250mg)。

（8）2-(4-(4-(2-((环己基氨基甲酰基)氨基甲酰基)-3-羟基苯氧基)丁氧基)丁氧基)乙酸的合成

将化合物7(250 mg, 0.47 mmol)溶在TFA(2 mL)和DCM(8 mL)的混合溶剂中。将反应混合物在氮气保护下于25℃搅拌2小时。将混合物真空浓缩。粗产物通过硅胶柱色谱法纯化，用(二氯甲烷/甲醇=100:0至10:1)洗脱，得到无色油状化合物8(180mg)。

（9）(2S,4R)-1-((S)-2-氨基-3,3-二甲基丁酰基)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基 )吡咯烷-2-甲酰胺的合成

将化合物9（500 mg，1.16mmol）和N,N-二异丙基乙胺（1498 mg，11.6mmol）溶在N,N-二甲基甲酰胺（5mL）中，冷却至0℃，在氮气保护下加入叔丁基二甲基氯硅烷（348mg，2.32mmol）。将反应液在氮气保护下于25℃搅拌16小时。向反应液中加入水并用二氯甲烷(100 mL×3)萃取。将有机相真空浓缩。粗产物通过硅胶柱色谱法纯化，用(石油醚/乙酸乙酯= 20:1至0:100和DCM/MeOH 100:0至10:1)洗脱，得到橙色油状化合物10(200mg)。

（10）(2S,4R)-4-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-1-((S)-2-(2-(4-(4-(2-((环己基氨基甲酰基)氨基甲酰基)-3-羟基苯氧基)丁氧基) )丁氧基)乙酰氨基)-3,3-二甲基丁酰基)-N-(4-(4-甲基噻唑-5-基)苄基)吡咯烷-2-甲酰胺的合成

将化合物8(180 mg, 0.375 mmol)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(108 mg, 0.5625 mmol)、1-羟基苯并三唑(76 mg,0.5625 mmol)和N,N-二异丙基乙胺(73 mg,0.5625 mmol)在N,N-二甲基甲酰胺(5 mL)中，冷却至0^oC，在氮气保护下加入化合物11(225 mg, 0.4125 mmol)。将反应混合物在氮气保护下于25℃搅拌16小时。将混合物真空浓缩。粗产物通过硅胶柱色谱纯化，用(二氯甲烷/甲醇＝50:1至10:1)洗脱，得到白色固体化合物Ⅰ(50mg，纯度：84%)。

化合物Ⅰ的结构表征数据如下：

¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 8.75 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.30 (m, 5H), 6.47(dd, J = 8.4, 3.6 Hz, 2H), 4.61 (s, 1H), 4.49 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 4.39 (d, J= 11.6 Hz, 1H), 4.24 (d, J = 15.5 Hz, 1H), 4.10 (dd, J = 12.6, 6.4 Hz, 2H),3.88 – 3.84 (m, 1H), 3.78 (d, J = 15.4 Hz, 1H), 3.74 – 3.64 (m, 2H), 3.60 (d,J = 4.4 Hz, 1H), 3.45 – 3.35 (m, 6H), 2.37 (d, J = 4.8 Hz, 3H), 2.14 – 2.05(m, 1H), 2.03 – 1.93 (m, 1H), 1.85 (d, J = 8.4 Hz, 4H), 1.67 (dd, J = 16.4,10.3 Hz, 4H), 1.55 (d, J = 12.5 Hz, 4H), 1.33 – 1.17 (m, 6H), 0.91 (d, J =4.8 Hz, 9H), 0.75 (s, 9H), -0.00 (d, J = 3.3 Hz, 6H).

实施例2、式I所示化合物对A549细胞活性的CCK-8法测试

一、式I所示化合物处理A549细胞

（1）收集对数期A549细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100uL，铺板使待测细胞调密度10³-10⁴ cells/孔，5%CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底。

（2）加入不同浓度的式（I）化合物：0、10、10²、10³、10⁴、10⁵nM/孔，设3个复孔，5%CO₂，37℃孵育12小时。

二、CCK-8法检测A549细胞活性

（1）上述细胞每孔加入10 μLCCK8试剂，作用2 h。

（2）终止培养，小心吸去孔内培养液。

（3）用酶标仪检测每孔的吸光度，参数为450 nm波长。

（4）计算实验组与对照组吸光度比值，细胞存活率=（实验组吸光度-空白对照）÷（对照组吸光度-空白对照）×100%。

本发明实施例的化合物对A549细胞活性如下：

式（I）化合物的浓度从0至10⁵nM对A549细胞的毒性很小，细胞存活率都保持在80%以上，如图2所示。

实施例3、式I所示化合物在蛋白免疫印迹实验水平的生物活性测试

一、式I所示化合物处理A549细胞

（2）加入不同浓度的式I化合物：0、10、10²、10³、10⁴、10⁵nM/孔，设3个复孔，5%CO₂，37℃孵育12小时。

二、收集蛋白质样品

（1）将处理后的细胞于培养基中刮下，充分混悬后300g离心5分钟收集，PBS洗一遍后，弃去PBS。

（2）每一样品加入100μL的2×Loading Buffer，充分震荡混匀，100℃变性5分钟，混匀后于-20℃保存或直接用于Western Blot检测。5×Loading Buffer的配方为：250 mMTris-HCl(pH6.8)，10％(W/V)SDS，0.5％(W/V)溴酚蓝，50％(V/V)甘油，5％(W/V) β-巯基乙醇(2-ME)。2×Loading Buffer的制备是将1.5倍体积的双蒸水加入到5×LoadingBuffer中即得。

（3）蛋白免疫印迹实验（Western Blot，WB）检测的具体步骤如下：

1）配制合适浓度的SDS-PAGE胶：分离胶的浓度为10％，浓缩胶的浓度为5％。

2）制备样品：根据实验要求制备蛋白样品，离心、混匀并上样于SDS-PAGE胶上样孔中。根据蛋白定量结果适量调整上样体积。

3）电泳：接通电源，蛋白样品在浓缩胶中电压为80伏特，待蛋白样品进入分离胶时，把电压调整为120伏特继续电泳。待溴酚蓝几乎完全跑出PAGE胶时终止电泳。

4）转膜：电泳结束后取下凝胶，按下列顺序安装转膜装置：(负极)、滤纸、凝胶、活化的PVDF膜、滤纸、(正极)。然后夹紧转移装置置于转膜缓冲液中，最后放入冰盒，置于4℃冷库100V恒压通电40分钟。

5）封闭：转膜结束后，取出PVDF膜，将膜浸没在含5％的脱脂奶粉的TBST缓冲液里，室温下摇床振荡1小时。

6）一抗孵育：封闭结束后，用TBST缓冲液荡洗3次，然后加入适度稀释比例的一抗，4℃过夜。将PVDF膜用TBST缓冲液荡洗3次，每次振荡5分钟。

7）二抗孵育：弃去TBST缓冲液，加入稀释的二抗，室温下摇床振荡1小时。弃去二抗，将PVDF膜用TBST缓冲液荡洗3次，每次振荡5分钟。

8）曝光：将ECL显色底物均匀覆盖在PVDF膜上，曝光成像。

本发明实施例的化合物对CypA的降解活性如下：在A549细胞系中，在WB结果中可以明显观察到式I所示化合物对CypA蛋白的降解作用，如图3所示化合物对CypA的半数降解浓度是100 nM以下。

实施例4、式I所示化合物在IBV诱导的肺炎中的保护作用

一、小鼠分组和小鼠肺炎模型的构建

取6-8周龄雌性C57BL/6小鼠随机分为空白组（PBS）、未治疗组（IBV）、治疗组1（IBV+OSE（抗流感病毒药物奥司他韦）、治疗组2（IBV+化合物）、治疗组3（IBV+化合物+OSE）共5组，每组5只，体重19±3 g。C57 BL/6小鼠按200 μL/10 g体重腹腔注射阿弗汀麻醉，小鼠麻醉后，空白组小鼠向鼻腔滴入50 μL PBS，治疗组、治疗组1、治疗组2和治疗组3小鼠向鼻腔滴入50 μL PBS重悬的IBV-/Guangxi-Jiangzhou/1352/2018（8000 PFU）。治疗组1的小鼠于IBV感染后24 h尾静脉注射化合物（10 mg/kg体重/天，溶于100 μL PBS）。治疗组2的小鼠于IBV感染后24 h按照10 mg/kg的剂量腹腔注射0.2 mg（200 μL 生理盐水溶解）OSE，并每隔24 h注射0.2 mg OSE一次。治疗组3的小鼠于IBV感染后24 h腹腔注射化合物（10 mg /kg体重/天，溶于100 μL PBS）和按照10 mg/kg的剂量腹腔注射0.2 mg（200 μL 生理盐水溶解）OSE，并每隔24 h注射0.2 mg OSE一次。空白组及未治疗组按照治疗组2的注射时间给予同剂量生理盐水。在IBV感染后7天处死各组小鼠并进行后续检测实验。

二、肺组织CypA表达水平的检测

（1）取约100 mg各组小鼠肺组织，放入lysis buffer中，在组织破碎仪中裂解，转速4000 rpm，运行40 s，间隔10 s，运行2次。

（2）运行结束后，12000 rpm，4℃离心15 min，取上清，加入5×loading buffer，金属浴10 min，用于WB实验检测CypA表达。

（3）WB实验方法同实施例3。

三、肺指数检测

乙醚麻醉小鼠，称重。将小鼠的血液采集干净，小鼠呈仰卧位固定。打开胸腔，剔除掉食道和心脏，分离出肺组织并称重。小鼠肺称重计算肺指数=小鼠肺重÷小鼠体重。肺指数是判断肺部炎症严重程度非常重要的指标，炎症会导致肺指数增高。

四、小鼠肺组织病理观察：

（1）取小鼠肺组织放入4%的多聚甲醛固定16小时以上，常规脱水、浸蜡，包埋、切片，常规HE染色。

（2）根据肺组织间质水肿、肺泡水肿、炎性细胞浸润、肺泡出血、透明膜形成四个指标分别评分：无：0分；轻度：1分；中度：2分；广泛：3分，累计总和即为组织评分。

五、肺组织细胞因子表达水平的检测

（1）取约100 mg各组小鼠肺组织，放入1mL Trizol中，在组织破碎仪中裂解，转速4000 rpm，运行40 s，间隔10 s，运行2次。

（2）运行结束后，按照TRIZOL法提取总mRNA并反转录，得到cDNA后做qPCR检测。

（3）qPCR反应程序：

①95℃ 30 s；②95℃ 30 s；③60℃ 60 s； ②③循环40次。用2^-ΔΔCT法计算变化倍数。

六、实验结果

实验结果如图4所示，其中，图4中A为检测各组小鼠CypA的表达，图4中B为各组小鼠的肺指数，图4中C为各组小鼠病理，图4中D为各组小鼠病理评分，图4中E为各组小鼠Il1bmRNA相对表达量，图4中F为各组小鼠Il6 mRNA相对表达量，图4中G为各组小鼠Tnfa mRNA相对表达量，图4中H为各组小鼠Ifng mRNA相对表达量。

（1）由图4中A可以看出，式I所示化合物能够明显减少小鼠肺组织CypA的表达。

（2）由图4中B、图4中C、图4中D和可以看出，IBV+化合物组和IBV+OSE+化合物组能够明显减轻小鼠的肺损伤，IBV+OSE+化合物组效果更好。

（3）由图4中E、图4中F、图4中G、图4中H可以看出，IBV+化合物组和IBV+OSE+化合物组能够明显减轻小鼠的肺组织IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ的表达，从而减轻小鼠的肺部炎症，且IBV+OSE+化合物组效果更好。

实施例5、式（I）化合物在类风湿性关节炎中的保护作用

一、大鼠分组和大鼠关节炎模型的构建

将卡介苗于80℃水浴灭活1 h，与不完全弗氏佐剂充分研磨，混匀，制成15 mg/mL的弗氏完全佐剂（Freund complete adjuvant，FCA）。将Lewise大鼠分为4组：为空白组（PBS）、未治疗组（UT）、治疗组1（化合物）、治疗组2（MTX（甲氨蝶呤）），每组5只，体重19±3g。除PBS组外的大鼠右后足爪皮内注射0.1 mL FCA，于注射后第14天治疗组1（化合物）尾静脉注射化合物（10 mg/kg体重，溶于100 μL PBS），3 次/周；治疗组2（MTX（甲氨蝶呤））腹腔注射甲氨蝶呤（1.2 mg体重/kg），3次/周。

二、关节肿胀率

测量足跖关节周径造模前、给药前和给药后3周分别测量所有大鼠左后足(继发病变侧)踝关节周径1次，计算关节肿胀百分率。

三、关节指数

关节肿胀评分测定关节指数给药前(第0天)和给药3周。根据大鼠前后肢踝关节、趾关节红肿程度及受影响关节指数进行评分。0分：正常；1分：1个关节红肿；2分：2个及2个以上关节红肿；3分：踝关节以下足掌严重红肿；4分：包括踝关节在内的全部足爪红肿且不能负重。四肢分别进行评分，累计总和即为关节指数。

四、关节滑膜病理学检查

（1）给药第21天，采血结束后安乐死，取左足跖关节放入4%的多聚甲醛固定16小时以上，10%EDTA脱钙，常规脱水、浸蜡，包埋、切片，常规HE染色。

（2）光镜下观察关节滑膜增生及滑膜下层炎症程度，并进行滑膜细胞增生评分。正常滑膜组织滑膜细胞单层，排列整齐，呈扁平形，少量炎细胞浸润，无血管增生，无纤维化，无乳头状增生（评分为0）。滑膜细胞增生，细胞层数稍有增加，滑膜组织中纤维组织增生，毛细血管增多扩张充血，可见炎细胞及纤维母细胞浸润（根据严重程度分级评分1-3）。

五、实验结果

如图5所示，其中，图5中A为各组大鼠踝HE图片，图5中B为各组大鼠关节肿胀率，图5中C为各组大鼠关节指数，图5中D为各组大鼠踝病理评分。

由图5中各图可以看出，本发明式I所示化合物能明显缓解大鼠关节肿胀，降低踝关节的关节指数并减轻踝关节的炎症。

实施例6、式I所示化合物对肺癌细胞迁移和浸润的抑制作用

一、细胞处理

（1）收集对数期A549细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100uL，铺板使待测细胞调密度10³~10⁴ cells/孔，5% CO₂，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底。

（2）加入不同浓度的式I所示化合物：0、10、10²、10³、10⁴、10⁵nM/孔，设3个复孔，5%CO₂，37℃孵育12小时。

将24孔细胞培养插入物(8 μmol/L孔径)的上部腔室进行包被（无迁移）或（有侵袭）基质（1 mg/mL），37℃干燥30 min。

（3）A549/WT和A549/CypA-细胞经20 ng/mL TGF-β处理48 h后，胰化，洗涤，在无血清的DMEM中悬浮。

二、采用Transwell Chambers（美国康宁公司）进行测定

（1）在上腔室中每插入约5×10⁴个细胞，在下腔室中加入含有10%胎牛血清的DMEM。

（2）孵育6 h（迁移）或24 h（侵袭）后，用棉签将停留在插入膜上部的非迁移或侵袭性细胞去除。

（3）将移入膜下侧的细胞固定，用2%结晶紫乙醇染色。

（4）染色细胞在日本Olympus CKX41显微镜下观察计数。

三、实验结果

如图6所示，其中，图6中A为Traswell法观察各组细胞的迁移和浸润，图6中B为对图6中A的计数。

由图6可以看出，本发明式I所示化合物能够明显减少肺癌细胞的迁移和浸润。

本发明还包括以下的优选实施方案：

1、如本文所述的式Ⅰ所示化合物在预防和/或治疗CypA介导的疾病中的用途。

2、如本文所述的式Ⅰ所示化合物在预防和/或治疗CypA介导的炎症、自身免疫性疾病和/或肿瘤中的用途。

3、如本文所述的式Ⅰ所示化合物在预防和/或治疗CypA介导的肺炎中的用途。

4、如本文所述的式Ⅰ所示化合物在预防和/或治疗CypA介导的类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和银屑病中的用途。

5、如本文所述的式Ⅰ所示化合物在预防和/或治疗CypA介导的肺肿瘤中的用途。

6、如本文所述的式Ⅰ所示化合物在降解CypA蛋白、减轻流感病毒诱导的肺炎、治疗类风湿性关节炎、抑制癌细胞的迁移和浸润中的用途。

7、用于治疗CypA介导的疾病的如本文所述的式I化合物。

8、根据实施方案7所述的式I化合物，其中所述CypA介导的疾病是CypA介导的炎症，优选CypA介导的肺炎、CypA介导的类风湿关节炎。

9、用于治疗肿瘤的如本文所述的式I化合物。

10、根据实施方案9所述的式I化合物，其中所述肿瘤是肺肿瘤。

11、用于治疗自身免疫性疾病的如本文所述的式I化合物。

12、根据实施方案11所述的式I化合物，其中自身免疫性疾病包括系统性红斑狼疮、银屑病。

13、一种治疗受试者中的CypA介导的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的式I化合物。

14、一种治疗受试者中的肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的式I化合物。

15、一种治疗受试者中的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如本文所述的式I化合物。

Claims

1.式Ⅰ所示化合物；

式Ⅰ

式Ⅰ中，TBSO表示叔丁基二甲基硅氧基。

2.权利要求1所述的式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

式1 式2

式中，Bn表示苄基；

式3

S3、式3所示化合物经钯碳还原得到式4所示化合物；

式4

式5

式5中，Bn表示苄基，tBU表示叔丁基；

S6、式5所示化合物经钯碳还原得到式6所示化合物；

式6

S7、在三苯基膦和偶氮二甲酸二异丙酯存在的条件下，式6所示化合物与式4所示化合物经Mitsunobu反应得到式7所示化合物；

式7

式8

式9 式10

式10中，TBSO表示叔丁基二甲基硅氧基；

S10、在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑和N,N-二异丙基乙胺存在的条件下，式8所示化合物与式10所示化合物经缩合反应得到权利要求1所述的式Ⅰ所示化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述碱性化合物Ⅰ为KOH；

式1所示化合物与所述苄醇的摩尔比为1：5~15；

所述水解反应的温度为120~150^oC，时间为8~16h；

所述水解反应在水中进行；

步骤S2中，所述亲核加成反应的时间为12~24h，在回流状态下进行。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：步骤S4中，所述((4-溴丁氧基)甲基)苯与所述丁烷-1,4-二醇的摩尔比为1：2~5；

所述亲核取代反应的温度为20~40^oC，时间为1~5h；

步骤S5中，所述碱性化合物Ⅱ为NaOH；

所述4-(4-(苄氧基)丁氧基)丁-1-醇与所述2-溴乙酸叔丁酯的摩尔比为1：1~5；

所述亲核取代反应的温度为20~40^oC，时间为12~24h。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤S7中，式6所示化合物与式4所示化合物的摩尔比为1：1~1.5；

式6所示化合物、所述三苯基膦、所述偶氮二甲酸二异丙酯的摩尔比为1：1~2：1~2；

所述缩合反应的温度为0~25^oC，时间为1~5h；

步骤S8中，所述脱保护反应的温度为20~40^oC，时间为1~5h；

步骤S9中，式9所示化合物与叔丁基二甲基氯硅烷的摩尔比为1：1~5；

式9所示化合物与所述N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：5~15；

所述取代反应的温度为0~25^oC，时间为12~18h；

步骤S10中，式8所示化合物与式10所示化合物的摩尔比为1：1~1.5；

式8所示化合物、所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐、所述1-羟基苯并三唑、所述N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1：1~2：1~2：1~2；

所述缩合反应的温度为0~25^oC，时间为12~18h。

6.权利要求1所述的式Ⅰ所示化合物在制备预防和/或治疗CypA介导的疾病的药物中的应用；

所述CypA介导的疾病包括CypA介导的炎症、CypA介导的自身免疫性疾病和/或CypA介导的肿瘤。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述CypA介导的炎症包括肺炎；

所述CypA介导的自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和银屑病；

所述CypA介导的肿瘤包括肺肿瘤。

8.权利要求1所述的式Ⅰ所示化合物在制备具有下述任一种功能的产品中的应用；

1）降解CypA蛋白；

2）减轻流感病毒诱导的肺炎；

3）治疗类风湿性关节炎；

4）抑制CypA表达量显著增加的癌细胞的迁移和浸润。

9.一种药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1所述的式Ⅰ所示化合物和至少一种药学上可接受的载体、赋形剂和/或稀释剂。