CN117902998A - 特发性肺纤维化抑制剂及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特发性肺纤维化抑制剂及其制备方法、应用，该抑制剂能够高选择性地靶向BET蛋白的溴结构域BD1，对BRD4‑BD1的抑制活性显著高于对BRD4‑BD2的抑制活性，为IPF的治疗提供了一种有效的手段。

Description

特发性肺纤维化抑制剂及其制备方法、应用

技术领域

本发明涉及医药化学领域，具体涉及特发性肺纤维化抑制剂及其制备方法、应用。

背景技术

特发性肺纤维化(IPF)是一种以慢性进行性纤维化间质性肺炎为特征的致命性肺部疾病，其中位生存时间为3-5年。IPF的纤维化机制仍不清楚，涉及由遗传或环境因素引起的肺泡上皮细胞重复性微损伤。随着这种微损伤引发异常上皮间质转化(EMT)，导致成纤维细胞和细胞外基质(ECM)沉积，最终导致肺部功能障碍和呼吸衰竭而死亡。

表观遗传修饰在IPF的发病机制中发挥着重要作用，包括DNA甲基化和组蛋白乙酰化水平升高，可以通过这种机制调节基因表达并引发细胞表型变化。溴结构域和末端外(BET)蛋白家族是重要的表观遗传的调节因子，包括BRD2、BRD3、BRD4和BRDT，其通过溴结构域BD1和BD2识别乙酰化组蛋白和转录因子。越来越多的研究表明，BRD4可能是治疗IPF的一个潜在靶点，例如，转化生长因子B(TGF-β)刺激成纤维细胞后，COL1A2和Acta2基因启动子区域的组蛋白乙酰化水平会提高，从而导致BRD4富集并结合COL1A2和Acta2促进转录和表达。

现有的泛BET抑制剂如JQ1或CG223已表现出一定的抗纤维化潜力，然而这些抑制剂往往受到剂量限制性毒性和严重副作用的限制，如血小板减少、胃肠道毒性、高胆红素血症、表皮增生和免疫缺陷等。因此，有必要提高BET抑制剂的选择性，进而开发高效、低毒的IPF治疗药物。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种特发性肺纤维化抑制剂，其能够高选择性地靶向BET蛋白的溴结构域BD1，对BRD4-BD1的抑制活性显著高于对BRD4-BD2的抑制活性，为IPF的治疗提供了一种有效的手段。

本发明通过下述技术方案实现：

一种化合物或其药学上可接受的盐，所述化合物为式I所示的化合物或式II所示化合物：

式I中，R₁为烷氧基取代的苯基，R₂独立地选自卤素、烷氧基、C₁-C₄烷基，n＝1、2；

式II中，X为S或者O，R₃为取代的苯基，所述取代的苯基的取代基选自卤素、烷氧基、C₁-C₄烷基、氰基。

BET蛋白具有两个串联的溴结构域BD1和BD2，其中，BD1是染色质结合所必需的，可以促进与肺纤维化相关的转录复合物的募集。这种募集特别发生在靶基因的启动子或增强子区域，从而控制与肺纤维化相关的基因的转录。

本技术方案中，式I或式II的化合物及其药学上可接受的盐能够作为BET抑制剂，靶向BET蛋白的溴结构域BD1，对BRD4-BD1的抑制活性显著高于对BRD4-BD2的抑制活性。在部分优选的实施例中，这类化合物对BRD4-BD1的抑制活性是其对BRD4-BD2的抑制活性近100倍。

本技术方案中，式I所示的化合物中，R₁为烷氧基取代的苯基。在一个或多个实施例中，R₁为甲氧基或乙氧基取代的苯基。在部分优选的实施例中，R₁为甲氧基取代的苯基。在一个或多个实施例中，R₁优选为一取代或者二取代的苯基。

本技术方案中，式I所示的化合物中，R₂为独立地选自卤素、烷氧基、C₁-C₄烷基，n＝1、2。在部分实施例中，R₂独立地选自卤素、甲氧基、C₁-C₂烷基，n＝1、2。在一个或多个实施例中，R₂为F、Cl或Br。在一个或多个实施例中，R₂为甲氧基或者乙氧基。在一个或多个实施例中，R₂可以是直链烷基，例如甲基、乙基、丙基，R₂也可以是支链烷基，例如异丙基、叔丁基。

本技术方案中，式II所示的化合物中，X可以是S或者O。R₃为一取代或者多取代的苯基，优选地，R₃为一取代或者二取代的苯基。在部分实施例中，R₃的苯基上的取代基选自卤素、烷氧基、C₁-C₄烷基、氰基。在部分优选的实施例中，取代基选自F、Cl、甲氧基、C₁-C₃烷基、氰基。在一个或多个实施例中，C₁-C₃烷基可以是直链烷基如甲基、乙基、丙基，也可以是支链烷基例如异丙基。

通过体外BRD4-BD1和BRD4-BD2的抑制效力和细胞抗增殖效力发现，相较于式I所示的化合物，式II所示的化合物具有更高的选择性，这可能是因为式I中的酰胺N原子与BRD4-BD1的Gln85形成关键氢键，而在BRD4-BD2中没有类似的相互作用。将式I中酰胺基团替换为脲基得到式II后，脲基中的羰基氧与BRD4-BD1的Asp88形成一个关键氢键，且脲基的两个氮原子与Gln85形成一个氢键相互作用。另外，式II与BRD4-BD2的分子对接结果表明，由于式II中脲基的引入，分子中环戊酮结构不能进入BRD4-BD2的关键催化口袋底部，导致式II相较于式I与BRD4-BD2的亲和性降低。对接结果进一步表明，式II对BRD4-BD1具有选择性是由于脲基的羰基氧与BRD4-BD1的Asp88形成氢键相互作用，而在BRD4-BD2中缺乏相应的残基与式II形成相互作用。

进一步地，BET抑制剂具有以下任一种结构式：

进一步地，所述药学上可接受的盐为式I所示的化合物或式II所示化合物的酸加成盐，其中，用于成盐的酸包括氯化氢、硫酸、溴化氢、柠檬酸、磷酸、马来酸。

本发明的另一个目的在于提供前述任一种化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其中，所述式I所示的化合物的制备方法包括以下步骤：

4-氨基-苯甲酸甲酯衍生物P1与2-甲基环己烷-1,3-二酮或2-甲基-1,3-环戊二酮反应得到中间体M1，中间体M1通过酯水解反应得到中间体M2，中间体M2与芳基胺衍生物进行酰胺缩合反应得到式I所示的化合物，其合成路线如下：

本技术方案中，反应a的溶剂优选为甲苯，在一个或多个实施例中，反应温度为100～120℃，在一个或多个实施例中，反应a中，4-氨基-苯甲酸甲酯衍生物P1、2-甲基环己烷-1,3-二酮或2-甲基-1,3-环戊二酮与脱水剂MgSO₄溶解于溶剂中后回流反应，之后加入酸催化剂，例如甲苯磺酸，反应得到中间体M1。在部分实施例中，反应b的溶剂为THF:H₂O＝2:1，反应温度为70～110℃。在部分实施例中，反应c中，在碱性条件下，中间体M2在加入芳基胺衍生物ArNH₂后，加入DMF、Et₃N、HOBt、EDCI后，在室温下进行缩合反应得到式I所示的化合物。

进一步地，所述式II所示的化合物的制备方法包括以下步骤：

2-氯-4-硝基苯胺与2-甲基环戊烷-1,3-二酮反应生成中间体M3，中间体M3还原得到中间体M4，中间体M4在碱性条件下与Et₃N和CH₃CN反应得到式II所示的化合物，其合成路线如下：

本技术方案中，反应d的溶剂优选为甲苯，在部分优选的实施例中，2-氯-4-硝基苯胺与2-甲基环戊烷-1,3-二酮、甲苯磺酸，MgSO₄反应得到中间体M3，在一个或多个实施例中，反应d的反应温度为100～120℃。在部分实施例中，反应e中，中间体3在THF和H₂O的混合溶剂体系中，用铁粉和NH₄Cl还原得到中间体M4，优选地，溶剂为THF:H₂O＝2:1。在部分实施例中，中间体M4在碱性条件下使用Et₃N和CH₃CN作为试剂反应得到式II所示的化合物。

本发明还提供一种前述任一种化合物或其药学上可接受的盐在制备BET抑制剂中的用途。

本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物包括前述任一种化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、辅料。

本发明还提供前述任一种化合物或其药学上可接受的盐，或者任一种药物组合物在制备治疗特发性肺纤维化药物中的应用。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

本发明提供的一种BET抑制剂能够高选择性地靶向BET蛋白的溴结构域BD1，对BRD4-BD1的抑制活性显著高于对BRD4-BD2的抑制活性，为IPF的治疗提供了一种有效的手段。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1示出了本发明具体实施例中利用免疫荧光法考察化合物11(26b)、阳性对照JQ1/Nintedanib(NI)对TGF-β(T)诱导的NIH-3T3细胞中肺纤维化关键蛋白Collagen I和α-SMA表达的影响，其中，(5)和(10)分别指化合物11、JQ1、Nintedanib的用量为5或10微摩尔；

图2示出了本发明具体实施例中通过划痕实验考察在化合物11(26b)、阳性对照JQ1/Nintedanib(NI)对TGF-β(T)诱导的A549细胞的迁移能力的影响；

图3示出了本发明具体实施例中通过免疫印记法考察化合物化合物11(26b)、阳性对照JQ1/Nintedanib(NI)对TGF-β(T)诱导的A549细胞中上皮-间质转化标志物(E-cadherin和Vimentin)和Fibronectin表达的影响；

图4示出了本发明具体实施例中通过免疫组化探究化合物11(26b)和阳性对照JQ1/Nintedanib处理后的肺纤维化小鼠肺部组织中肺纤维化标志物Collagen I和α-SMA及BRD4表达的影响，其中Sham为对照样。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法即可制备。本发明所有原料，对其纯度没有特别限制，本发明优选采用分析纯或医药化学领域常规的纯度要求。本发明所有原料，其牌号和简称均属于本领域常规牌号和简称，每个牌号和简称在其相关用途的领域内均是清楚明确的，本领域技术人员根据牌号、简称以及相应的用途，能够从市售中购买得到或者通过常规方法制备得到。

本发明对所述取代基的表达方式没有特别限制，均采用本领域技术人员熟知的表达方式，本领域技术人员基于常识，可根据其表达方式正确理解其含义。本发明中使用的术语“连接”在不进行特别说明的情况下，可以是直接相连，也可以使经由其他基团间接相连。

一、BET抑制剂的制备

式I所示的化合物的合成路线为：

【实施例1～实施例9】

将4-氨基-3-氯苯甲酸甲酯P1(1.0equiv)、2-甲基环戊烷-1，3-二酮及其衍生物(2.0equiv)和无水MgSO₄(3.0equiv)在甲苯(20mL)中加热115℃，0.5h后，加入对甲苯磺酸(p-TSA)(1.2equiv)作为酸催化剂，然后回流反应10h。反应结束后，等待反应液冷却，有机层过滤，减压下浓缩得到棕色固体。粗产物经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝70:1)，得到中间体M1。

将LiOH(5.0equiv)和M1(1.0equiv)溶于THF:H2O(2:1)(15mL)中，在80℃下搅拌3h。反应完成后减压浓缩，然后用1M盐酸(aq)酸化，析出黄色固体，然后真空抽滤，收集沉淀，并用水冲洗滤饼，烘干后得到中间体苯甲酸衍生物M2，直接进行后续反应。

将M2(1.2equiv)溶解于6mL DMF中，然后加入HOBt(1.3equiv)，在0℃下搅拌10min。随后加入EDCI(1.3equiv)，芳胺和三乙胺(3.5equiv)，在0℃下反应0.5h后转移至常温反应24h。TLC监测反应。反应完成后，加入300mL的水淬灭反应，如果有固体析出则进行减压抽滤，并用水洗滤饼，将固体烘干后进行纯化。如果没有固体析出则用二氯甲烷(4×200ml)萃取，有机层用饱和氯化钠水溶液冲洗，然后再用无水硫酸钠干燥。以上处理后得到粗产物经柱层析(二氯甲烷:甲醇＝80:1-10:1)纯化，得到最终产物式I所示的化合物。

式II所示的化合物的合成路线为：

【实施例10～实施例20】

将P2(1.0equiv)、2-甲基环戊烷-1，3-二酮(2.0equiv)和无水MgSO₄(3.0equiv)在甲苯(20mL)中加热115℃，0.5h后，加入对甲苯磺酸(p-TSA)(1.2equiv)作为酸催化剂，然后回流反应10h。反应结束后，等待反应液冷却，有机层过滤，减压下浓缩得到棕色固体。粗产物经柱层析纯化(二氯甲烷:甲醇＝70:1)，得到中间体M3。

中间体M3(1.0equiv)、Fe(铁粉)(4.0equiv)以及氯化铵(4.0equiv)加入到四氢呋喃和水的混合溶液1：1(15mL)中，并将混合物在50℃下反应6h。待反应完成后，将反应体系进行减压浓缩，然后粗产物用甲醇溶解并超声10min，再真空抽滤去除无机试剂，将滤液减压浓缩得到黄色固体。粗产物经柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝60：1)，得到中间体M4。

将M4(1.0equiv)、异氰酸酯衍生物(2.0equiv)和三乙胺(3.0equiv)在MeCN中于80℃搅拌过夜。反应完成后有固体析出，然后将反应混合物真空浓缩，粗产物通过柱层析纯化(二氯甲烷：甲醇＝60：1)，得到产物式II所示的化合物。

实施例1～实施例20的产物的结构式、表征、收率如表1所示。

表1

二、BET抑制剂的性能测试

【实施例21】

实施例1～20制备得到的化合物1～20的体外BRD4-BD1和BRD4-BD2的抑制效力和细胞抗增殖效力。

BRD4-BD1和BRD4-BD2酶抑制活性由上海睿智公司提供技术服务支持，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒进行测定。

将实施例1～20合成的化合物1～20、对比例(JQ-1)与阳性对照配置成浓度为1mM/L的DMSO溶液。将刺激因子TGF-β刺激后的NIH-3T3细胞用胰酶消化成细胞悬液后，用细胞计数板技术，以每孔6000个的细胞密度接种在96孔板中。37℃孵育24h后，用各种浓度的测试化合物处理细胞48h，而后每个孔中加入20μLMTT溶液(浓度为5mg/L)，放置细胞培养箱孵育。待4h后，取出96孔板吸出每孔中的培养基，而后每孔加入200μL DMSO溶解底部蓝紫色甲臜结晶，置于摇床低速振荡15min促进结晶溶解，置于酶标仪中测定570nm处的吸光度(OD值)。利用公式：抑制率＝(阴性对照组OD值-实验组OD值)×100％/(阴性对照组OD值-空白组OD值)，计算测试化合物对肿瘤细胞的抑制率，而后用GraphPad Prism8.0软件计算各测试化合物的IC₅₀值。

化合物1～20对BRD4-BD1、BRD4-BD2和NIH-3T3细胞的抑制活性如表2所示：

表2：

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由表2可知，现有的BET抑制剂JQ-1对BRD4-BD1没有选择性，而化合物1～20对BRD4-BD1具有更好的抑制活性，并且部分化合物对BRD4-BD2和NIH-3T3细胞表现出微弱至中等的抑制活性。同时，具有式II结构的化合物10～20相较于具有式I结构的化合物1～9对BRD4-BD1具有更强的抑制活性，这可能是因为与化合物1～9中的酰胺N原子能够与BRD4-BD1的Gln85形成关键氢键不同，化合物10～20的脲基中的羰基氧与BRD4-BD1的Asp88形成一个关键氢键，且脲基的两个氮原子与Gln85形成一个氢键相互作用。

另外，化合物11与BRD4-BD2的分子对接结果表明，由于脲基的引入，分子中环戊酮结构不能进入BRD4-BD2的关键催化口袋底部，导致脲类衍生物相较于酰胺衍生物与BRD4-BD2的亲和性降低。对接结果进一步表明，化合物11对BRD4-BD1具有选择性是由于脲基的羰基氧与BRD4-BD1的Asp88形成氢键相互作用，而在BRD4-BD2中缺乏相应的残基与化合物11形成相互作用。

如表2所示，化合物11对BRD4-BD1具有最强的抑制活性，IC₅₀＝42nM，相较于其对BRD4-BD2的抑制活性(IC₅₀＝4179nM)大约高了100倍。

【实施例22】

利用免疫印迹和免疫荧光技术评估化合物11处理后的TGF-β1诱导的NIH-3T3细胞的纤维化相关蛋白(Collagen I和α-SMA)的表达。

免疫印记：细胞接种于六孔板中(每孔3×10⁵个细胞)，置于37℃培养箱过夜。不同浓度的11，阳性对照JQ1和Ninterdanib及其联用处理细胞48h后，用PBS洗涤细胞2次后用细胞裂解液制成细胞悬液，13000rpm离心20min后，使用BCA蛋白检测试剂盒定量蛋白浓度。经15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，将等效浓度的总蛋白转移到硝化纤维素(PVDF)膜上。在室温下用5％脱脂牛奶-TBST溶液封闭1h后，将膜与相应的一抗孵育在4℃过夜，用TBST溶液洗涤两次后，用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗孵育膜，并以ECL作为HRP底物观察。

免疫荧光：细胞接种于24孔板后，在37℃培养箱中孵育24h。用不同浓度优选化合物处理细胞48h后，用4％多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤三次，用0.2％TritonX-100和血清孵育30min。固定的细胞与指定的一抗在4℃下孵育过夜，然后用冷PBS洗涤，与二抗在25℃下孵育1h。最后，用4',6-二氨基-2-苯乙烯醇(DAPI)对细胞核进行染色，用激光扫描共聚焦显微镜拍摄图像。

实验结果如图1所示，化合物11通过下调Ⅰ型胶原和α-SMA在TGF-β1诱导的NIH-3T3细胞中诱导细胞凋亡，进而有效减弱TGF-β1诱导的肺成纤维细胞的增殖和分化。

【实施例23】

在TGF-β1诱导的A549细胞中通过伤口愈合测定和Transwell测定评估39b的抗迁移和抗侵袭特性。

划痕试验：肿瘤细胞接种于六孔板中(每孔5×10⁵个细胞)，37℃孵育24h后，用消毒的200μL移液枪头垂直于细胞平面沿着孔中线进行划痕，而后用PBS洗去不贴壁的细胞，并用不同浓度的化合物培养基混合液或正常培养基处理，37℃孵育24h后用倒置显微镜拍摄图像。

为了研究化合物11治疗肺纤维化的潜力，我们采用TGF-β1诱导A549细胞的肺成纤维细胞转化进行体外分析。采用划痕实验评估化合物11的抗迁移和抗侵袭特性。实验结果如图2和图3所示，结果表明，与阳性药物相比，化合物11对TGF-β1诱导的A549细胞的迁移和侵袭具有更强的抑制作用。为了进一步研究BET-BD1选择性抑制剂11在体外抗肺纤维化的作用机制，利用western blot考察了11对刺激因子TGF-β1诱导的A549中上皮-间质转化标志物(E-cadherin和Vimentin)和Fibronectin表达的影响。结果表明，TGF-β刺激A549细胞后，Fn和Vimentin的蛋白表达显著增加。与阳性对照JQ1和Nintednib相比，化合物11能够显著降低Fn和Vimentin蛋白表达，同时明显上调E-cadherin蛋白的表达。以上结果表明，化合物11通过抑制调控EMT和Fn蛋白的表达而具有体外抗肺部纤维化的作用。

【实施例24】

在博莱霉素(Bleomycin)诱导的肺纤维化小鼠模型中利用免疫组化试验评估了化合物11的体内抗肺纤维化功效。

免疫组化：将组织切片浸入EDTA抗原提取缓冲液(pH＝8.0)或柠檬酸缓冲液(pH＝6.0)中，利用微波进行抗原提取。然后，将anti-α-SMA抗体(1：500)、anti-Collagen I(1：400)、anti-BRD4(1：400)与切片在37℃下孵育0.5h，用HRP聚合物偶联的二抗处理载玻片，然后用二氨基联苯胺溶液显影。

实验结果如图4所示，化合物11有效抵消了纤维化相关蛋白α-SMA和胶原蛋白-I的上调，同时还逆转了博莱霉素诱导的E-钙粘蛋白的下调。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述化合物为式I所示的化合物或式II所示化合物：

式I中，R₁为烷氧基取代的苯基，R₂独立地选自卤素、烷氧基、C₁-C₄烷基，n＝1、2；

式II中，X为S或者O，R₃为取代的苯基，所述取代的苯基的取代基选自卤素、烷氧基、C₁-C₄烷基、氰基。

2.根据权利要求1所述的一种化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式I中，R₁为甲氧基或乙氧基取代的苯基，R₂独立地选自卤素、甲氧基、C₁-C₂烷基，n＝1、2。

3.根据权利要求1所述的一种化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，式II中，R₃为一取代或者二取代的苯基，其中，取代基选自F、Cl、甲氧基、C₁-C₃烷基、氰基。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的一种化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，具有以下任一种结构式：

5.根据权利要求4所述的一种化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述药学上可接受的盐为式I所示的化合物或式II所示化合物的酸加成盐，其中，用于成盐的酸包括氯化氢、硫酸、溴化氢、柠檬酸、磷酸、马来酸。

6.一种如权利要求1～5中任一项所述的一种化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述式I所示的化合物的制备方法包括以下步骤：

4-氨基-苯甲酸甲酯衍生物P1与2-甲基环己烷-1,3-二酮或2-甲基-1,3-环戊二酮反应得到中间体M1，中间体M1通过酯水解反应得到中间体M2，中间体M2与芳基胺衍生物进行酰胺缩合反应得到式I所示的化合物，其合成路线如下：

7.一种如权利要求1～5中任一项所述的一种化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，所述式II所示的化合物的制备方法包括以下步骤：

2-氯-4-硝基苯胺与2-甲基环戊烷-1,3-二酮反应生成中间体M3，中间体M3还原得到中间体M4，中间体M4在碱性条件下与Et₃N和CH₃CN反应得到式II所示的化合物，其合成录下如下：

8.如权利要求1～5中任一项所述的一种化合物或其药学上可接受的盐在制备BET抑制剂中的用途。

9.一种药物组合物，其特征在于，包括权利要求1～5中任一项所述的一种化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、辅料。

10.如权利要求1～5中任一项所述的一种化合物或其药学上可接受的盐，或者如权利要求9所述的一种药物组合物在制备治疗特发性肺纤维化药物中的应用。