CN112939824A - 一类化合物及其用于结直肠癌的医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一类化合物及其用于结直肠癌的医药用途，属于药学技术领域，该化合物为式I或式II所示的化合物，或其药学上可接受的盐或酯，涉及肿瘤相关活性等方面的应用，特别是制备预防和/或治疗与肿瘤有关疾病的药物中的应用，尤其是结直肠癌。

Description

一类化合物及其用于结直肠癌的医药用途
技术领域
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一类化合物及其用于结直肠癌的医药用途，属于药学技术领域。
背景技术
信号转导子和转录激活因子3(STAT3)与人类癌症的发生和发展密切相关。研究发现STAT3的异常激活会导致癌症转移，但是，临床上并没有相关STAT3抑制剂用于癌症治疗。
发明内容
LY1是一种新型有效的STAT3小分子抑制剂，是抗肿瘤候选新药。化学名为3-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物，在STATs家族成员中具有高度选择性，可以特异性抑制STAT3 Tyr-705位点的磷酸化，从而阻断STAT3信号传导传递过程。研究表明LY1可以有效抑制结肠癌细胞系和肺癌细胞系的增殖，集落形成，迁移和侵袭，动物实验中，通过口服给药有明显的肿瘤抑制活性，同时在多次有效剂量下，它不会引起明显的毒性。结构式如下：
Figure BDA0002945231910000011
因此LY1可以通过阻断STAT3信号通路抑制肿瘤的生长和转移，可能成为癌症的治疗药物。
本发明合成一系列结构类似，抗肿瘤活性强、对新冠肺炎有效的化合物。
本发明提供一系列化合物的制备方法，该制备方法高效实用经济、生产周期短，收率较高，易于工业化生产。
本发明验证了系列化合物抗肿瘤活性，对化合物LY-1进行了系统的验证，为抗肿瘤药物、抗新冠药物提供潜在药物分子。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种化合物，所述化合物的结构式如下
Figure BDA0002945231910000021
本发明采用的技术方案为：
第一方面，提供一类化合物，为式I或式II所示的化合物，或其药学上可接受的盐或酯：
Figure BDA0002945231910000022
其中，A环可以是五、六、七元饱和或者不饱和环，环内存在一到两个杂原子，杂原子指N、O、S；
R1为一个或多个取代基，各自独立地选自氢、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基；
R2为一个或者两个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、C1～C3烷氧基、所述卤素指氟、氯、溴或碘。
R3为取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘。
R4为一个或多个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基，芳香族、杂芳族、环或杂环，所述卤素指氟、氯、溴或碘、
Figure BDA0002945231910000023
Figure BDA0002945231910000024
在一些实施例中，A环吡咯基、咪唑基、吡唑基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、四氢呋喃基、噻唑基、苯环、、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、
Figure BDA0002945231910000031
作为优选为苯环。所述R1为一个或多个取代基，各自独立地选自氢、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基，作为优选为氢。
所述R2为一个或者两个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、C1～C3烷氧基、或C1～C3烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘，作为优选为甲基。
所述R3为取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘，作为优选为氢、甲基、羟基、卤素。
所述R4为一个或多个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基，芳香族、杂芳族、环或杂环，
Figure BDA0002945231910000032
Figure BDA0002945231910000033
所述卤素指氟、氯、溴或碘，、作为优选为
Figure BDA0002945231910000034
在上述优选的基础上，化合物为3-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物，简称化合物LY1，结构式如下
Figure BDA0002945231910000035
药理实验证明，该化合物肺癌、结直肠癌细胞系现出强力的生长抑制作用，进一步发现该化合物对新冠病毒有明显的抑制作用。
本发明的目的之一在于提供式I/式II通式所示的化合物的制备方法，合成路线如下：
Figure BDA0002945231910000036
Figure BDA0002945231910000041
本发明的另一目的在于提供化合物LY1的制备方法，合成路线如下：化合物LY1的制备方法，其特征在于，合成路线如下：
Figure BDA0002945231910000042
包括：
(1)(化合物1)1-萘磺酰氯经取代反应制得(化合物2)1-萘磺酰胺；
(2)(化合物2)1-萘磺酰胺经氧化反应制得(化合物3)5，8-二氧代-二氢萘；
(3)(化合物3)5，8-二氧代-二氢萘再与(化合物4)叔丁基4-(2-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸酯发生取代反应得到(化合物5)(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)；
(4)(化合物5)(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)氨基脱保护得到目标化合物(化合物LY1)4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1-二氧化物。
进一步的，步骤(1)具体是指：将化合物1加入到盛有溶剂的反应器中，搅拌，在冰浴中滴加0℃的氨水，滴加完毕后，薄层跟踪检测反应，反应完成后，减压蒸馏，析出固体，过滤，真空干燥，得化合物2。
优选的，所述的溶剂为非质子性溶剂中的一种或几种。
步骤(2)具体是指：将(化合物2)1-萘磺酰胺加入盛有有机溶剂的反应器中，控温65℃-70℃并搅拌；将十倍当量硫酸高铈用2mol/L的稀硫酸溶解，控温65℃-70℃并搅拌，缓慢滴加入至体系中，从滴加开始计时，25-35分钟后停止反应，放置冷却后抽滤，随后在滤液中加入二氯甲烷萃取，取二氯甲烷层，真空干燥，得5，8-二氧代-二氢萘。作为更优选，温度为65℃，反应时间为27分钟。
进一步的，步骤(2)中，所述有机溶剂为冰乙酸、三氟醋酸中的一种或几种。
步骤(3)具体是指：将化合物3、化合物4与催化剂用冰乙酸溶解，常温下搅拌反应25-30小时；减压蒸馏除去溶剂，得粗品，粗品经纯化得化合物5；
所述催化剂为一水合乙酸铜、三氯化铈、三乙胺中的一种或几种；更优选为一水合乙酸铜。
步骤(4)具体是指：化合物5脱去氨基保护得到化合物LY1；具体包括：用有机溶剂二氯甲烷溶解化合物5，通入盐酸气体，室温搅拌，薄层跟踪检测反应；反应结束后，过滤，即得化合物LY1。
步骤(4)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿，二氧六环中的一种或几种。
优选的，步骤(3)中，粗品经纯化得化合物5，包括：
在粗品中加入无水乙醇，110℃加热沸腾，液相监测反应产物全部转化后，停止加热，自然冷却搅拌6h，过滤得滤饼，柱层析后，加入10倍当量的有机溶剂完全溶解后，滴加入25倍当量的醇类有机溶剂，旋蒸后除去有机溶剂，待晶体全部析出，过滤得化合物5。
进一步的，纯化过程中，所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或几种，优选为二氯甲烷；醇类有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种，优选为异丙醇。
本发明提供的化合物LY1系列化合物的制备纯化方法，制备方法简单，成本低，收率高，以萘磺酰氯为原料，以较低的成本方便地制备了有良好抗肿瘤活性的化合物LY1。
第三方面，提供所述的化合物在制备预防和/或治疗与肿瘤有关疾病的药物中的应用，与肿瘤有关疾病尤其是结直肠癌。
该化合物通过高特异性与高结合亲和力来抑制STAT3的活化，用作STAT3抑制剂。
能够作为特异性的抑制STAT3靶基因的表达的药物。
能够作为治疗STAT3介导的疾病的药物。
能够作为治疗包括肺癌、乳腺癌和结直肠癌、新型冠状病毒肺炎在内的癌症的药物。
能够作为治疗包括结直肠癌，肺癌、新型冠状病毒肺炎在内的对STAT3抑制剂类药物或者吉非替尼产生耐药性的疾病的药物。
其中化合物LY1效果尤佳。
附图说明
图1为：MST的结果可以表明LY1与STAT3蛋白直接结合；
图2为：LY1选择性抑制STAT3的DNA结合活性，而对STAT1二聚体和STAT5二聚体几乎没有影响；
图3为：LY1可以显着降低大肠癌细胞系中p-STAT3的表达，但不抑制总STAT3的表达；
图4为：定量RT-PCR分析结果表明表明STAT3相关基因被LY1下调；
图5为：LY1可以抑制大肠癌细胞株的存活；
图6为：蛋白质印迹分析，STAT3的siRNA可以有效抑制STAT3及其下游靶标的表达；
图7为：流式细胞仪检测结果表明sub G1期的细胞数量明显增加；
图8为：与对照组相比，用LY1治疗的小鼠的癌症信号更少；
图9为：LY1的治疗显着降低了肿瘤负担；
图10为：LY1的治疗没有造成小鼠体重的明显变化；
图11为：LY1的治疗没有造成各个器官的明显变化；
图12为：异种移植肿瘤结果显示p-STAT3，Bcl-2和c-myc表达降低；
图13为：异种移植肿瘤结果，化合物经过LY-1处理，细胞p-STAT3表达降低；
图14为：以最高剂量(1000mg kg-1)的LY1进行治疗，所有小鼠均具有生命力和活力；
图15为：参与急性毒性试验的所有小鼠的器官中均未发现明显的毒性。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
一、化合物及其制备
前体准备
1)、制备1-萘磺酰胺
Figure BDA0002945231910000061
将1-萘磺酰氯(5g，21.9mmol)加入到盛有200ml丙酮的1L圆底烧瓶中，搅拌，在冰浴中滴加240ml 0℃的氨水，滴加完毕后，薄层跟踪检测反应，反应完成后，减压蒸馏出有机溶剂和氨水分解出的氨气，析出固体，过滤，真空干燥，得1-萘磺酰胺(4.35g，收率96.7％)。该化合物无需进一步纯化，直接用于下一步反应。实验数据如下：
Mp 147～149℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.65(d,J＝8.5Hz,1H),8.19(d,J＝8.2Hz,1H),8.14(d,J＝6.8Hz,1H),8.08(d,J＝7.4Hz,1H),7.76–7.59(m,5H).HR-MS(ESI)calcd for C10H9NO2S[M+Na]+230.0246,found 230.0244
2)、制备5，8-二氧代-二氢萘
Figure BDA0002945231910000071
将无水硫酸高铈(160g，677.45mmol)用750ml 2mol/L稀硫酸溶解，控温65℃。将1-萘磺酰胺(10g，48.49mmol)加入盛有200ml冰乙酸的500ml圆底烧瓶中，控温65℃，该温度下搅拌，缓慢滴加入至硫酸高铈水相体系中，从滴加开始计时，薄层色谱监测，27分钟后停止反应，待反应液冷却后，过滤，滤液用1200ml二氯甲烷萃取，干燥除水后低压旋蒸，得到淡黄色固体，真空干燥，得5，8-二氧代-二氢萘(6.72g，收率58.43％)。直接用于下一步反应无需纯化。实验数据如下：
Mp 186～188℃.HR-MS(ESI)calcd for C10H7NO4S[M+Na]+259.9988,found259.9989
实施例1
Figure BDA0002945231910000072
1.1制备(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)
Figure BDA0002945231910000081
将5，8-二氧代-二氢萘(56.5g，238.17mmol)、叔丁基4-(2-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸酯(60g，217.90mmol)与一水合乙酸铜(5.6g，28.05mmol)加入到盛有1200ml冰乙酸的2L圆底烧瓶中，25℃反应，该温度下搅拌反应26小时；减压蒸馏除去溶剂，得粗品。
在粗品中加入1500ml的无水乙醇，110℃加热沸腾，液相监测反应产物全部转化后，停止加热，自然冷却搅拌6h，过滤得滤饼，柱层析后除去一般杂质，后加入10倍当量的二氯甲烷完全溶解后，缓慢滴加25倍当量的异丙醇，33℃低压旋蒸后除去相同量的二氯甲烷，待晶体全部析出，过滤，得紫红色晶体，低压干燥得4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯，纯度为97％.(67.53g，收率83％)。
实验数据如下：
Mp 189～190℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.85(s,1H),8.39(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.29(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),8.05(t,J＝7.8Hz,1H),7.46–7.40(m,3H),7.23(d,J＝4.2Hz,2H),6.12(s,1H),3.45(t,J＝4.8Hz,4H),2.82(t,J＝5.0Hz,4H),1.40(s,9H).HR-MS(ESI)calcd for C25H28N4O6S,[M+Na]+535.1622,found 535.1619
1.2制备4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)胺)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1-二氧化物
Figure BDA0002945231910000082
将(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(2g，3.78mmol)加入到盛有2ml二氯甲烷的50ml圆底烧瓶中，随后通入盐酸气，薄层跟踪检测反应；反应结束后，过滤得滤饼，减压干燥分离出4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)胺)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1-二氧化物(1.95g，收率97％)。实验数据如下：
Mp 200～201℃.1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：9.11(s，1H)，8.74(s，2H)，8.42(d，J＝7.4Hz，1H)，8.08(m，2H)，7.44(d，J＝7.8Hz，1H)，7.32(t，J＝7.7Hz，1H)，7.28–7.19(m，2H)，5.86(s，1H)，3.18–3.10(m，8H).HR-MS(ESI)calcd for C20H18N4O3S,[M+H]+395.1172,found 395.1171实施例2
Figure BDA0002945231910000091
2.1制备(1,4-二氧代5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)-烟酸
Figure BDA0002945231910000092
将5，8-二氧代-二氢萘1(237mg,1mmol)、5-氨基烟酸(172mg,1.2mmol).与一水合乙酸铜(20mg,0.1mmol)加入到盛有5ml冰乙酸的25ml圆底烧瓶中，加热回流，该温度下搅拌反应3小时；减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离出3-(萘-2-基氨基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物(221mg，收率71％)。
实验数据如下
1H NMR(500MHz,DMSO):δ8.31(s,1H),8.04(d,J＝7.6Hz,1H),7.98(d,J＝2.5Hz,1H),7.94(d,J＝7.5Hz,1H),7.78(t,J＝7.5Hz,1H),7.44(s,1H),7.40(s,2H),5.62(s,1H),5.34(s,2H).HRMS(ESI)for C16H11N3O6SNa[M+Na]+:calcd,396.0266；found,396.0270.
实施例3
Figure BDA0002945231910000093
3.1制备(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)
Figure BDA0002945231910000101
将5，8-二氧代-二氢萘(0.5g，2.11mmol)、叔丁基4-(2-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸酯(0.787g，2.53mmol)与一水合乙酸铜(42mg，0.21mmol)加入到盛有12ml冰乙酸的25ml圆底烧瓶中，118℃加热回流，该温度下搅拌反应3小时；减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离出化合物(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(0.568g，收率51％)。实验数据如下：
Mp 189～190℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.85(s,1H),8.39(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.29(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),8.05(t,J＝7.8Hz,1H),7.46–7.40(m,3H),7.23(d,J＝4.2Hz,2H),6.12(s,1H),3.45(t,J＝4.8Hz,4H),2.82(t,J＝5.0Hz,4H),1.40(s,9H).HR-MS(ESI)calcd for C25H28N4O6S,[M+Na]+535.1622,found 535.1619
3.2制备4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)胺)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1-二氧化物
Figure BDA0002945231910000102
将(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(200mg，0.378mmol)加入到盛有2ml二氯甲烷的10ml圆底烧瓶中，随后加入2ml三氟醋酸，室温搅拌，薄层跟踪检测反应；反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离出化合物制备4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)胺)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1-二氧化物(149mg，收率95％)。实验数据如下：
Mp 200～201℃.1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：9.11(s，1H)，8.74(s，2H)，8.42(d，J＝7.4Hz，1H)，8.08(m，2H)，7.44(d，J＝7.8Hz，1H)，7.32(t，J＝7.7Hz，1H)，7.28–7.19(m，2H)，5.86(s，1H)，3.18–3.10(m，8H).HR-MS(ESI)calcd for C20H18N4O3S,[M+H]+395.1172,found395.1171。
实施例4
Figure BDA0002945231910000111
制备7-((4-羟苯基)氨基)-5,8-二氧-5,8-二氢萘-1-磺酰胺
Figure BDA0002945231910000112
将5，8-二氧代-二氢萘(100mg，0.421mmol)、4-氨基苯酚(55.2mg，0.506mmol)与一水合乙酸铜(16.83mg，0.084mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入5ml冰乙酸，使之溶解，在室温下反应3小时，反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离得到7-((4-羟苯基)氨基)-5,8-二氧-5,8-二氢萘-1-磺酰胺。
实验数据如下.
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.67(s,1H),)δ9.63(s,1H)8.39(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.07(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),8.05(t,J＝7.8Hz,1H)7.23(d,J＝4.2Hz,2H))6.93(s,1H)7.23(d,J＝4.2Hz,2H),5.88(S,H)HR-MS(ESI)calcd forC16H12N2O5S,[M+H]345.0467,found345.0460
实施例5
Figure BDA0002945231910000113
5.1制备3-((4-(二乙氨基)苯基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物
Figure BDA0002945231910000114
将5,8-二氧代-二氢萘3(300mg，1.26mmol)、N,N-二乙基对苯二胺4(249.26mg，1.52mmol)与一水合乙酸铜(20mg，0.1mmol)加入到盛有15ml冰乙酸的100ml圆底烧瓶中，室温下搅拌24小时；减压蒸馏除去溶剂，加入无水乙醇加热，冷凝回流，将大部分溶剂蒸去后过滤，柱层析分离滤饼出3-((4-(二乙氨基)苯基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物(37mg，收率7.67％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.66(s,1H),8.39(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.07(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),8.05(t,J＝7.8Hz,1H)7.20(d,J＝8.9Hz 2H),6.78–6.70(d,J＝8.9Hz,2H),5.99(s,1H),3.37(d,J＝7.0Hz,4H),,1.11(t,J＝7.0Hz,6H).HR-MS(ESI)calcdforC20H19N3O3S,[M+H]382.1147,found382.1147
实施例6
Figure BDA0002945231910000121
6.1制备3-((2-氨基苯基)氨基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物
Figure BDA0002945231910000122
将5,8-二氧代-二氢萘1(237mg,1mmol)、1,2-二氨基苯胺(130mg,1.2mmol)。与一水合乙酸铜(20mg,0.1mmol)加入到盛有10ml冰乙酸的50ml茄形瓶中，室温搅拌反应16小时；减压蒸馏除去溶剂，液相色谱测得3-((2-氨基苯基)氨基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物(234mg，收率72％)
实验数据如下；黄色粉末状固体mp(262℃-267℃).1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.70(dd,J＝1.0Hz,2H),8.24-7.90(m,7H),7.23(s,1H),6.43-6.58(m,1H)
HRMS(ESI)of C16H12N3O3S[M+H]+326.0
实施例7
Figure BDA0002945231910000123
7.1制备3-(4-氟-2-(三氟甲基)苄基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物
Figure BDA0002945231910000131
将5，8-二氧代-二氢萘1(100mg)、4-氟-2-(三氟甲基)苯胺(90.6mg).与一水合乙酸铜(28.4mg)加入到盛有5ml冰乙酸的25ml圆底烧瓶中，加热回流，该温度下搅拌反应34小时；反应结束后，得到产物粗产品47.6mg(收率47.6％)。随后加入DCM溶解后加入5g100目硅胶制砂，制砂结束后进行柱层析分离纯化。分离结束后得到初步纯化产物，进LC-MS中分析得到里面有397分子量产物，可以进一步纯化。进一步柱层析纯化得到纯化后产物3-(4-氟-2-(三氟甲基)苄基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物26.2mg(收率26.2％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.20(s,1H),8.37(d,J＝7.6Hz,1H),8.26(d,J＝7.6Hz,1H),8.02(t,J＝7.6Hz,1H),7.64(dd,J＝8.8,5.1Hz,3H),5.76(s,1H),HRMS(ESI)ofC17H8F4N2O3S[M+H]397.3152
实施例8
Figure BDA0002945231910000132
8.1制备3-((6-氟吡啶-3-基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物
Figure BDA0002945231910000133
将5，8-二氧代-二氢萘(100mg，0.421mmol)、2-氟-5氨基吡啶(56.71mg，0.506mmol)与一水合乙酸铜(16.83mg，0.084mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入5ml冰乙酸，使之溶解，在室温下反应3小时，反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离得到3-((6-氟吡啶-3-基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物。
实验数据如下
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.87(s,1H),8.64(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H)8.37(d,J＝7.6Hz,1H),8.26(d,J＝7.6Hz,1H),8.02(t,J＝7.6Hz,1H)7.67(dd,J＝7.4,2.7Hz,1H)7.40(d,J＝7.4Hz,1H)6.06(s,1H)HR-MS(ESI)calcd for C15H8FN3O3S,[M+H]330.02,found330.02
实施例9
Figure BDA0002945231910000141
9.1制备N-甲基萘-1-磺酰胺
Figure BDA0002945231910000142
将1-萘磺酰氯(5g，21.9mmol)加入到盛有200ml丙酮的1L圆底烧瓶中，搅拌，在冰浴中滴加240ml 0℃的甲胺，滴加完毕后，薄层跟踪检测反应，反应完成后，减压蒸馏出有机溶剂和氨水分解出的氨气，析出固体，过滤，真空干燥，得N-甲基萘-1-磺酰胺(4.82g，收率95.66％)。该化合物无需进一步纯化，直接用于下一步反应。
9.2制备N-甲基-5,8-二氢萘-1-磺酰胺
Figure BDA0002945231910000143
将无水硫酸高铈(160g，677.45mmol)用750ml 2mol/L稀硫酸溶解，控温65℃。将N-甲基萘-1-磺酰胺(10g，48.49mmol)加入盛有200ml冰乙酸的500ml圆底烧瓶中，控温65℃，该温度下搅拌，缓慢滴加入至硫酸高铈水相体系中，从滴加开始计时，薄层色谱监测，27分钟后停止反应，待反应液冷却后，过滤，滤液用1200ml二氯甲烷萃取，干燥除水后低压旋蒸，得到淡黄色固体，真空干燥，得N-甲基-5,8-二氢萘-1-磺酰胺(6g，收率54.22％)。直接用于下一步反应无需纯化
9.3 4-(2-(((8-(N-甲基氨磺酰基)-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯
Figure BDA0002945231910000151
将N-甲基-5,8-二氢萘-1-磺酰胺(56.5g，238.17mmol)、叔丁基4-(2-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸酯(60g，217.90mmol)与一水合乙酸铜(5.6g，28.05mmol)加入到盛有1200ml冰乙酸的2L圆底烧瓶中，25℃反应，该温度下搅拌反应26小时；减压蒸馏除去溶剂，得粗品。
在粗品中加入1500ml的无水乙醇，110℃加热沸腾，液相监测反应产物全部转化后，停止加热，自然冷却搅拌6h，过滤得滤饼，柱层析后除去一般杂质，后加入10倍当量的二氯甲烷完全溶解后，缓慢滴加25倍当量的异丙醇，33℃低压旋蒸后除去相同量的二氯甲烷，待晶体全部析出，过滤，得紫红色晶体，低压干燥得4-(2-(((8-(N-甲基氨磺酰基)-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯.(54.33g，收率78.32％)。
9.4制备N-甲基-5,8-二氧杂-7-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5,8-二氢萘-1-磺酰胺
Figure BDA0002945231910000152
将(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(2g，3.78mmol)加入到盛有20ml二氯甲烷的50ml圆底烧瓶中，随后通入盐酸气，薄层跟踪检测反应；反应结束后，过滤得滤饼，减压干燥分离出N-甲基-5,8-二氧杂-7-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5,8-二氢萘-1-磺酰胺(1.82g，收率98％)。实验数据如下：
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.58(s,1H),8.47(dq,J＝7.9,1.4Hz,2H),7.93(t,J＝7.8Hz,1H),7.46(tq,J＝4.6,2.7Hz,1H),7.21(t,J＝3.4Hz,3H),6.65(s,1H),6.37(s,1H),3.17(t,J＝4.6Hz,4H),2.93(dd,J＝5.9,3.4Hz,4H),2.80(d,J＝3.0Hz,3H),2.04(s,1H)HR-MS(ESI)calcd forC21H22N4O4S,[M+H]+427.1362,found 427.1361
二、药理部分(结直肠癌)
1.细胞活力测定。将细胞以每孔5000个细胞的量接种在96孔板中。温育24小时后，用1至32后，的LY1处理细胞。将细胞孵育24小时，并使用MTT测定法鉴定生存力。在490nm处读取吸光度。
2.菌落形成。将细胞以每孔10000个细胞的量接种在6孔板中。培养24小时后，用不同浓度的LY1处理细胞，并孵育一周。洗涤细胞并用冷甲醇固定15分钟。用结晶紫染色10分钟后，漂洗细胞并干燥。
5.DNA结合活性测定。STAT3的DNA结合活性通过EMSA/Gel-Shift试剂盒(中国，上海，Beyotime)根据制造商的说明进行了测试。简而言之，在室温下在结合缓冲液中过冷的hSIE探针(5'-AGCTTCATTTCCCGTAAATCCCTA-3')与STAT1和STAT3结合，而MGFe(5'-AGATTTCTAGGAATTCAA)与STAT5和STAT1结合，在室温下放置30分钟。将放射性标记的探针与蛋白质样品混合，并在室温下孵育30分钟。使样品经受SDS-PAGE凝胶并转移至PVDF膜。使用ChemiDOC记的探针与蛋系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)检测结合的免疫复合物。
6.免疫荧光。将SW480和HCT116细胞以每孔5胞以每孔接种在24孔板中。温育24小时后，将细胞在无血清培养基中培养24小时。细胞用LY1(4Y1)预处理2小时，然后用IL-6(50ng/mL)再培养30分钟。处理后，将细胞用冷甲醇固定15分钟。用5％正常山羊血清封闭细胞，并用0.3％Triton X-100处理30分钟。用PBS洗涤3次后，在4℃下用P-STAT3和STAT3的一抗(1：100稀释)探测细胞过夜。将细胞与抗兔IgG(H+L)，F(ab')2片段Alexa Fluor 555二抗(Cell Signaling，1：200)孵育1小时。使用DAPI(Beyotime Biotechnology)固定10分钟后，用荧光显微镜捕获细胞。
7.微量热泳分析。制备了多达16种LY1稀释液的滴定系列。荧光标记的STAT3蛋白的浓度保持恒定在10-20nM，并且滴定剂的浓度是变化的。因此，利用Monolith NT蛋白标记试剂盒，用荧光染料标记2-20试剂STAT3蛋白。标记过程和随后的游离染料去除均在45分钟内完成。在稀释系列中，最高浓度被选择为比预期的Ki高20倍。将未标记分子的系列稀释液的1 0未标等分试样与10试样稀释的荧光标记分子混合。将混合样品装入玻璃毛细管中，并使用Monolith NT.115MST仪器进行MST分析。
8.生物膜层干涉术。使用ForteBio的Super Streptavidin(SSA)生物传感器将100ug器将t-1生物素化的重组人STAT3蛋白捕获到SSA生物传感器的表面上。到达基线后，对传感器进行60s包含1.66、3.32、6.64、13.28和26.56的表的LY1的association step，然后分离60s。所有试剂均在含有1％DMSO，0.02％Tween 20和0.1mg20有-1BSA的PBS缓冲液中稀释。
9.蛋白质印迹分析。将细胞以每孔50×104个细胞的密度接种在6孔板中。温育24小时后，将细胞用LY1(1μM，2μM和4μM)或二甲基亚砜处理24小时。处理后收集细胞并裂解，然后将裂解物进行10％SDS-PAGE凝胶处理并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用1：2000稀释的一抗和1：4000辣根过氧化物酶偶联二抗探查细胞膜。一抗包括Cyclin D1，β-catenin，Survivin，C-myc，Bcl-2，phospho-STAT3(Tyr705)和STAT3，均购自Abcam。E-钙粘着蛋白，N-钙粘着蛋白，波形蛋白，磷酸化STAT5(Tyr694)和STAT5购自Cell Signaling Technology(美国马萨诸塞州贝弗利)。切割的caspase-3和caspase-9获自Bioworld Company。io肌动蛋白和二抗购自Beyotime Biotechnology。
10.小鼠器官的H&E染色
解剖取各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾五大脏器，在10％中性缓冲甲醛中新鲜固定48h，石蜡包埋，5石蜡厚切片。切片进行H&E染色，光镜下观察。
11.肿瘤组织的IHC
如先前所述进行免疫组织化学染色。固定的肿瘤切片与针对p-STAT3的抗体一起孵育。DAB染色试剂盒(南京基恩生物技术有限公司，中国南京)按照生产商的建议显示阳性细胞。
12.急性毒性试验
ICR小鼠(7周，SLACCAS)雌雄各半，随机分成3组，每组10只。分别以200、400、600、800和1000mg/kg单剂量腹腔内(i.p.)注射9。每组10只，观察治疗后2周内动物的异常行为和死亡率。
实施例1.LY1与STAT3结合并破坏信号转导过程。
为了评估纯化的STAT3和LL1之间的亲和力，我们进行了微型热泳分析(MST)实验。制备了多达16种LY1稀释液的滴定系列。荧光标记的STAT3蛋白的浓度保持恒定在10-20nM，并且滴定剂的浓度是变化的。因此，利用Monolith NT蛋白标记试剂盒，用荧光染料标记2-20试剂STAT3蛋白。标记过程和随后的游离染料去除均在45分钟内完成。在稀释系列中，最高浓度被选择为比预期的Ki高20倍。将未标记分子的系列稀释液的1 0未标等分试样与10试样稀释的荧光标记分子混合。将混合样品装入玻璃毛细管中，并使用MonolithNT.115MST仪器进行MST分析。平衡解离常数(Kd)用于显示两个分子之间的亲和力，实验结果得出LY1和STAT3的Kd值为3.33示，所以MST的结果可以表明LL1与STAT3蛋白直接结合，(图1)。这些结果全部表明LL1特异性结合STAT3，并且这种结合是稳定的以及高亲和力的。作为转录因子，STAT3二聚体将易位进入细胞核并与靶DNA结合以启动转录。我们使用电泳迁移率变动分析(EMSA)评估DNA结合活性，STAT3的DNA结合活性通过EMSA/Gel-Shift试剂盒(中国，上海，Beyotime)测试。在室温下在结合缓冲液中过冷的hSIE探针与STAT1和STAT3结合，而MGFe与STAT5和STAT1结合，在室温下放置30分钟。将放射性标记的探针与蛋白质样品混合，并在室温下孵育30分钟。使样品经受SDS-PAGE凝胶并转移至PVDF膜。使用ChemiDOC记的探针与蛋系统(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)检测结合的免疫复合物。结果显示LY1对于LY1会减弱hSIE探针在HCT116和SW480细胞中的信号，并且随着LY1浓度的上升，结果更加明显，而对于MGFe探针在HCT116和SW480细胞中的信号几乎没有影响。结果证明LY1选择性抑制STAT3的DNA结合活性，而对STAT1二聚体和STAT5二聚体几乎没有影响(图2)。实施例2.LY1抑制了STAT3的磷酸化和核易位
我们研究了STAT3，p-STAT3和下游靶标的表达。LY1(1、2和4下游)处理24小时后，对HCT116和SW480细胞中p-STAT3(Tyr-705)，STAT3和下游靶基因的蛋白质印迹分析。将细胞以每孔50×104个细胞的密度接种在6孔板中。温育24小时后，将细胞用LY1(1μM，2μM和4μM)或二甲基亚砜处理24小时。处理后收集细胞并裂解，然后将裂解物进行10％SDS-PAGE凝胶处理并转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用1：2000稀释的一抗和1：4000辣根过氧化物酶偶联二抗探查细胞膜。一抗包括Cyclin D1，β-catenin，Survivin，C-myc，Bcl-2，phospho-STAT3(Tyr705)和STAT3，E-钙粘着蛋白，N-钙粘着蛋白，波形蛋白，磷酸化STAT5(Tyr694)和STAT5。使用抗β用肌动蛋白抗体检查蛋白质的正确负载。使用ImageJ软件的灰度值分析对蛋白质水平进行定量。结果显示，在HCT116和SW480细胞中，LY1可以显着降低大肠癌细胞系中p-STAT3的表达，但不抑制总STAT3。所以结果证明LY1可以显著抑制STAT3的磷酸化。(图3)。此外，LY1能下调STAT3的靶基因，如Cyclin D1，Survivin和Bcl-2。下游靶基因的下调证明了LY1可以抑制STAT3的核易位从而减少STAT3靶基因的表达。为了进一步证实LY1对STAT3下游基因表达的影响，使用RT-qPCR测量STAT3下游靶基因表达。使用TRIzol(Invitrogen，Life Technologies)从细胞中分离总mRNA，并使用用于qPCR的HiScript QRT SuperMix(Vazyme Biotech)合成cDNA。使用SYBR green在装有iQ5多色实时荧光定量PCR检测系统(Bio-Rad)的iCycler上进行定量RT-PCR分析。使用以下等式计算治疗之间的相对基因表达水平：相对基因表达＝2-(ΔΔ2-等式计算治疗ΔCtcontrol)。结果与蛋白质印迹数据一致，表明STAT3相关基因被LY1下调(图4)。
实施例3.LL1在体外抑制结肠直肠癌细胞的活力。
为了测试LY1的抗癌作用，我们验证了LY1在五种人类结直肠癌细胞系SW480，HCT116，RKO，HT29和Caco-2中的细胞毒性。将SW480，HCT-116，RKO，HT29和Caco-2细胞接种在96孔板中，孵育过夜，并分别用0、1、2、4、8、16和16中，的LY1处理24小时。再加入四甲基偶氮唑盐(MTT)检测细胞活力。在490nm处测得吸光度。使用SigmaPlot 9.0软件(SySTATSoftware，Inc.，San Jose，CA)测定IC50值。我们的数据表明LY1可以显著降低大肠癌细胞株的IC50值，且有剂量依赖性。证明LY1可以抑制大肠癌细胞株的存活(图5)。为了进一步证实LY1对p-STAT3的抑制能力及其抗癌作用，我们使用siRNA方法特异性沉默STAT3并评估其对结直肠癌细胞的作用。在转染有STAT3 siRNA的HCT-116和SW480细胞系中STAT3，p-STAT3，ββSTAT3iR，cyclin D1和c-myc的蛋白质印迹分析。使用抗β蛋肌动蛋白抗体检查蛋白质的正确负载。使用ImageJ软件的灰度值分析对蛋白质水平进行定量。数据显示，p-STAT3，STAT3和下游基因的表达量都有显著下降。这证明STAT3的siRNA可以有效抑制STAT3及其下游靶标的表达(图6)。这些结果表明STAT3在结直肠癌细胞的生长中起关键作用。另外，STAT3沉默导致SW480和HCT116细胞系中细胞活力的降低。但是，LY1处理并未进一步诱导细胞死亡，这表明LY1对STAT3具有选择性(图7)。
实施例4.LY1诱导大肠癌细胞凋亡并抑制其转移。
越来越多的研究证实STAT3负责调节与肿瘤生长密切相关的多种细胞生物学过程，我们构建了裸鼠尾静脉转移的模型。用pGKV5荧光素酶载体转染的HCT116细胞被引入免疫缺陷小鼠的尾静脉。通过体内生物发光成像监测接受pGKV5荧光素酶载体感染的细胞的小鼠。我们在注射后的头几天观察到来自胸腔的信号，并且在一周之内逐渐变得无法检测到信号，这表明肿瘤细胞最初被困在肺毛细血管床中，然后通过肺毛细血管分散到全身血液中循环。42天后，对照组小鼠的肺部出现转移。相反，与对照组相比，用LY1治疗的小鼠的癌症信号更少(图8)。以上这些数据表明，LY1可能通过调节EMT相关蛋白的表达来阻止细胞转移。
实施例5.LY1在体内抑制肿瘤生长。
我们已经证明了新型STAT3小分子抑制剂LY1可以特异性抑制STAT3的激活并在体外诱导大肠癌细胞的凋亡。此外，我们还研究了LY1在体内的抗肿瘤活性和毒性。我们使用两种体内小鼠模型检查了LY1在结直肠肿瘤发生中的抗肿瘤活性。在异种移植模型中，将经典的STAT3抑制剂statstat用作阳性对照。我们通过口服管饲法每天一次对小鼠以5mg kg-1的剂量施用Statstat或LY1。与阴性和阳性对照相比，LY1的治疗显着降低了肿瘤负担(图9)。通过测重，没有观察到体重或器官的总体解剖结构的显着变化，也没有观察到明显的毒性迹象，如食欲不振，活动减少或嗜睡(图10和11)。LY1的这些体内特性从概念上证明了该化合物在癌症治疗中的治疗潜力。我们之前证明了LY1抑制p-STAT3水平并诱导bcl-2介导的细胞凋亡。为了确定LY1诱导的这些生物学效应是否在体内也起作用，我们分析了从LY1或媒介物治疗的小鼠中获得的异种移植肿瘤。结果显示p-STAT3，Bcl-2和c-myc表达降低(图12和13)。体外和体内结果均证明LY1是一种安全的，选择性的STAT3抑制剂。为了评估LY1在体内的安全性，我们进行了急性毒性试验。即使以最高剂量(1000mg kg-1)进行治疗，所有小鼠均具有生命力和活力，因此无法获得中值致死剂量(LD50)(图14)。此外，在参与急性毒性试验的所有小鼠的器官中均未发现明显的毒性(图15)。总之，我们的结果证明LY1显着降低了肿瘤的生长，并且可能代表了大肠癌的一种有前途的策略。

Claims (10)

1.一类化合物，为式I或式II所示的化合物，或其药学上可接受的盐或酯：
Figure FDA0002945231900000011
其中，A环为五、六、七元饱和、不饱和碳环或杂环，杂环环内存在一到两个杂原子，杂原子各自独立地选自N、O、S；
R1为一个或多个取代基，各自独立地选自氢、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基；
R2为取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、C1～C3烷氧基、或C1～C3烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘；
R3为取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘；
R4为一个或多个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基，芳香族、杂芳族的碳环或杂环，杂环环内存在一到两个杂原子，杂原子各自独立地选自N、O、S；所述卤素指氟、氯、溴或碘；
或R4选自
Figure FDA0002945231900000012
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述A环选自苯环、吡咯基、咪唑基、吡唑基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、
Figure FDA0002945231900000013
优选为苯环。
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述R1为氢。
4.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述R2为甲基。
5.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述R3为氢、甲基、羟基、卤素。
6.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述R4为一个取代基，优选为
Figure FDA0002945231900000014
7.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，式I所示的化合物选自：
Figure FDA0002945231900000021
8.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，式II所示的化合物选自：
Figure FDA0002945231900000031
9.如权利要求1-8任一项所述的化合物在制备预防和/或治疗与肿瘤有关疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的与肿瘤有关疾病为结直肠癌。
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