CN104910069B - 氨茴酸类衍生物、其制备方法及其在医药上的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及氨茴酸类衍生物、其制备方法及其在医药上的用途。具体而言，本发明涉及一种通式(I)所示的氨茴酸类衍生物、其制备方法及含有该衍生物的药物组合物以及其作为治疗剂在治疗癌症特别是多药耐药癌症中的用途，其中通式(I)中的各取代基的定义与说明书中的定义相同。

Description

氨茴酸类衍生物、其制备方法及其在医药上的用途
技术领域
本发明涉及氨茴酸类衍生物、其制备方法及含有该衍生物的药物组合物以及其作为治疗剂在治疗癌症特别是多药耐药癌症中的用途。
背景技术
在恶性肿瘤的治疗手段中，化疗一直占据着不可替代的地位。联合化疗虽然对一些恶性肿瘤有明显的治疗效果，但对大多数恶性肿瘤效果并不理想，其主要原因在于肿瘤细胞对化疗药物产生了多药耐药性(multi-drugresistance，MDR)。据报道，目前几乎所有在用药物都能治疗一些癌症，然而由于肿瘤的多药耐药性非常强，往往导致化疗失败。据美国癌症协会统计，在肿瘤年死亡率中，90％以上的肿瘤患者死因在不同程度上是受耐药影响的。因而，现在肿瘤治疗的问题并不是缺乏有效的药物，而是如何抑制肿瘤的多药耐药性，从而使抗肿瘤药物充分发挥作用。因此，寻找逆转MDR的药物成为肿瘤治疗中急需解决的问题。
肿瘤多药耐药性是指肿瘤细胞长期接触某一化疗药物，产生的不仅对此种化疗药物耐药性，而且可对其他化学结构、作用靶点和作用机理完全不同的多种抗癌药同时产生耐药的现象。这是肿瘤细胞免受化疗药物攻击的最重要的防御机制，也是导致化疗失败的主要原因之一。肿瘤细胞的多药耐药可以分为天然耐药(在化疗开始时就存在的耐药性)和获得性耐药(在化疗过程中由一种化疗药物诱导产生)。目前认为多药耐药的发生与多种因素有关，如多药耐药基因(MDR1)及其编码的糖蛋白(P-糖蛋白)介导的耐药，多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药蛋白(LRP)表达增加，谷胱甘肽转移酶(GST)活性增强，DNA修复和复制酶、DNA拓朴酶活性改变和钙离子浓度的改变等。
肿瘤多药耐药发生机制非常复杂，其中肿瘤细胞膜中P-糖蛋白(P-gp)的过度表达被认为是产生多药耐药性的最主要原因。P-gp是深嵌于内皮细胞细胞膜中的一种蛋白，在已产生多药耐药性的肿瘤细胞膜中高度表达，能够对抗肿瘤药主动跨膜转运，其表达水平和细胞膜的通透性、细胞内药物浓度以及耐药程度有关。
乳腺癌耐药蛋白(BCRP)，属于ATP结合盒式(ATP-binding cassette,ABC)转运蛋白家族的G亚家族成员，又名ABCG2，ABCG2与急性髓性白血病、非小细胞肺癌、乳腺癌等多种肿瘤的临床化疗敏感性有关，与P-gp相似，这种转运蛋白显示出广泛的底物识别特性，包括中性的、带正电荷的和带负电荷的化合物。ABCG2过表达的肿瘤细胞株对米托蒽醌、阿霉素、柔红霉素、鬼臼乙叉甙、拓扑替康等产生交叉耐药，而对长春新碱、紫杉醇无交叉耐药。
目前作为MDR逆转剂，最为看好的是由英国Xenova公司研制的Tariquidar(XR9576，Tar，CN1241181，WO 98/017648，WO 03/095447 A1)。然而2003年5月由于在III期临床上对两例非小细胞肺癌病人的治疗中发现的毒副作用，使得Tariquidar在非小细胞肺癌临床研究临时停止。这是由于个体差异引起的，还是对药物作用机制或MDR认识不深刻所未能预见毒性导致的，具体机制还不清楚。
Tariquidar结构模块
虽然Tariquidar溶解性较差，临床显示还存在一定的毒副作用，但它与P-gp可以高亲和性、非竞争性结合，有很好的药理活性，所以开展其类似物的研究就显得尤为必要。到目前为止，国外对Tariquidar的药理学方面的研究报道很多但化学工作研究甚少。本发明完成了Tariquidar类似物结构的设计及合成工作，经分子模拟计算和药效学试验，本发明得到的化合物在逆转耐药性活性提高的同时，毒性显著降低，且溶解性得以提高。这些Tariquidar类似物为临床应用提供了可靠的途径。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，
其中：
R1和R2相同或不同，彼此独立地选自氢、-S(O)2R7、或-C(O)R8，条件是R1与R2不同时为氢；
R3和R4相同或不同，彼此独立地选自氢、卤素、C1～6烷基或C1～6烷氧基；
R5和R6相同或不同，彼此独立地选自氢、卤素、C1～6烷基或C1～6烷氧基；
R7选自烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，所述烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自卤素、烷基、卤代烷基、羟基、羟烷基、-NHC(O)R9、-NR10R11的基团取代，其中R9、R10或R11选自氢、烷基、烷氧基、环烷基、或杂环基；
R8选自烷基、烷氧基、烯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基，所述烷基、烷氧基、烯基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基任选进一步被一个或多个选自烷基、环烷基、杂环基、芳基或杂芳基的基团取代。
在本发明的一个优选的实施方案中，所述通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3和R4彼此相同，可以为氢或C1～6烷氧基。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5和R6彼此相同，可以为氢或C1～6烷氧基。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为-S(O)2R7且R2为氢，其中R7的定义如通式(I)中所定义。
在本发明的另一个优选的实施方案中，所述通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1和R2彼此相同为-S(O)2R7，其中R7的定义如通式(I)中所定义。
在本发明的进一步优选的实施方案中，所述通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7选自C1～6烷基、苯基或萘基，所述C1～6烷基、苯基或萘基任选进一步被一个或多个选自卤素、C1～4烷基、C1～4卤代烷基、-NHC(O)R9、-NR10R11的基团取代，其中R9、R10或R11选自氢、C1～4烷基、C1～4烷氧基、C3～6环烷基、或C3～6杂环基。
在本发明的进一步优选的实施方案中，所述通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为-C(O)R8且R2为氢，其中R8的定义如通式(I)中所定义。
在本发明的进一步优选的实施方案中，所述通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R8选自C1～12烷基、C1～4烷氧基、或C2～6烯基，所述C1～12烷基、C1～4烷氧基、或C2～6烯基任选进一步被一个或多个选自芳基或杂芳基的基团取代，其中所述芳基优选为苯基、或
在本发明的一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其为通式(II)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
R12选自烷基、卤代烷基、-NHC(O)R9、-NR10R11，
n为1至3的整数，
R3～R6、R9～R11如通式(I)中所定义。
在本发明的另一个优选的实施方案中，一种通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其为通式(III)所示的化合物或其药学上可接受的盐：
其中，
R选自氢、卤素、烷基、卤代烷基、-NHC(O)R9、-NR10R11，
n为1至3的整数，
R3～R6、R9～R11如通式(I)中所定义。
本发明典型的化合物包括，但不限于：
或其药学上可接受的盐。
本发明进一步涉及一种制备通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐的方法，其包括以下步骤：
第一步：将式Ia的化合物制成酰氯，然后与式Id的芳胺反应，得到式Ib的化合物；
第二步：将式Ib的化合物用Pa/C甲酸铵还原得到式Ic的化合物；
第三步：将式Ic的化合物在吡啶的催化下与磺酰氯或酰氯反应得到通式(I)化合物；
或者，第一步直接使用式Ie的靛红酸酐在酸性条件下，优选乙酸，与式Id的芳 胺反应，然后经磺酰氯或酰氯酰化得到通式(I)的化合物，
其中：R1～R6如通式(I)中所述。
本发明另一方面涉及一种药物组合物，其含有治疗有效量的本发明通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂。
本领域技术人员能够理解，本发明的药物组合物可以根据具体的施用方式被配制成各种本领域熟知的制剂形式，例如口服剂型(粉剂、片剂、胶囊、软胶囊、液体药物、糖浆、酏丸、散剂、囊剂、粒剂)，或表皮制剂(乳膏、软膏、洗剂、凝胶、香脂、膏药、糊剂、喷雾剂、气雾剂等等)，或注射制剂(溶液、悬浮剂、乳剂)。
根据本发明的药物组合物可以包含药学上可接受的载体、佐剂或稀释剂，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂例如：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂例如：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂例如：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂例如：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂例如，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。本发明的组合物可以通过利用本领域任何已知方法制成，以使病人用药后能提供快速、持久或缓慢释放的活性成分。
本发明另一方面涉及通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，或包含其的药物组合物在制备治疗癌症特别是多药耐药癌症的药物中的用途，所述多药耐药癌症特别是与P-gp或ABCG2的过度表达相关，并且所述癌症优选自肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、白血病、恶性淋巴瘤。
本发明另一方面涉及一种治疗癌症特别是多药耐药癌症的方法，其包括向需要治疗的患者施用治疗有效量的通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中，所述多药耐药癌症特别是与P-gp或ABCG2的过度表达相关，并且所述癌症优选自肝癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、白血病、恶性淋巴瘤。
本发明的化合物可以单独施用，也可以与其它药学上活性成分例如其他抗癌剂联合施用，不同活性成分可以分开或相继施用。所述其他抗癌剂例如紫杉醇，Daunrubicin，丝裂霉素C，喜树碱的半合成衍生物如拓扑替康、长春碱、长春新碱，雌激素类药如雌二醇，鬼臼毒素类药物如鬼臼噻吩甙，抗生素类抗癌药如阿霉素、米托蒽醌、柔红霉素、放线菌素D等。
本发明活性成分的给药剂量可以根据个体的情况和重量、病情的严重程度、 药物形式、给药途径以及给药周期的不同而不同，其也可以由本领域技术人员进行选择。剂量可以是每天单次给药或每天分多次给药。
本发明的药物组合物通过各种途径给药至个体动物如哺乳动物(大鼠、小鼠、驯化动物或人类)，所有的给药方式均是预期的，例如，给药可以是口服、直肠给药或经静脉、肌肉内、经皮、鞘膜内、硬膜外或脑室内注射。
除非有相反陈述，本发明说明书和权利要求中的术语具有下述含义。
“烷基”指饱和的脂族烃基团，包括1至20个碳原子的直链和支链基团。优选含有1至10个碳原子的烷基，更优选含有1至6个碳原子的烷基，进一步优选含有1至4个碳原子的烷基。非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的低级烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或未取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，优选为一个或多个以下基团，独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代。
术语“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基。
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包括3至20个碳原子，优选包括3至12个碳原子，更优选环烷基环包含3至10个碳原子，最优选环烷基环包含3至6个碳原子。单环环烷基的非限制性实施例包含环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等，优选环丙基、环己烯基。多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。
所述环烷基环可以稠合于芳基、杂芳基、环烷基或杂环基环上，形成稠合环烷基，其中与母体结构连接在一起的环为环烷基，非限制性实施例包括茚满基、四氢萘基、苯并环庚烷基等。，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基，非限制性实施例包含：
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包括3至20个环原子，其中一个或多个环原子选自氮、氧或S(O)m(其中m是0至2的整数)的杂原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的环部分，其余环原子为碳。优选包括3至12个环原子，其中1～4个是杂原子，更优选杂环基环包含3至10个环原子，更优选杂环基环包含5至6个环原子。单环杂环基的非限制性实施例包含吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基、吡喃基、四氢呋喃基等。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。
所述杂环基环可以稠合于芳基、杂芳基、杂环基或环烷基环上，形成稠合杂环基，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基，非限制性实施例包含：
“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，更优选苯基和萘基，最优选苯基。所述芳基环可以稠合于芳基、杂芳基、杂环基或环烷基环上，形成稠合芳基，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环，非限制性实施例包含：
芳基可以是取代的或未取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氨基、卤代烷基、羟烷基、羧基、羧酸酯基。
“杂芳基”指具有1至4个杂原子作为环原子，其余的环原子为碳的5至14元芳基，其中杂原子包括氧、硫和氮。优选为5至10元。杂芳基优选为5元或6元，优选例包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基、哒嗪基等。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂芳基、杂环基或环烷基环上，形成稠合杂芳基，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环，非限制性实施例包含：
杂芳基可以是任选取代的或未取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氨基、卤代烷基、羟烷基、羧基、羧酸酯基。
“卤素”指氟、氯、溴或碘。
“卤代烷基”指烷基被一个或多个卤素取代，其中烷基的定义如上所述。
“羟基”指-OH基团。
“羟烷基”指被羟基取代的烷基，其中烷基的定义如上所述。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
本发明化合物具体按照以下方案合成：
a试剂和反应条件：(i)SOCl2，83℃，回流，2h；(ii)Ar-NH2，NaHCO3，CH2Cl2，0℃至室温，5h；(iii)Pd/C，H2/HCOONH4，CH3OH，回流，4-6h；(iv)CH3CN，CH3COOH；(v)R3SO2Cl，吡啶，CH2Cl2，室温。
方案1
(1)合成化合物中的四氢异喹啉苯胺(Id)结构；
(2)用邻硝基苯甲酸Ia制成酰氯，与四氢异喹啉苯胺Id反应，再经Pd/C甲酸铵还原得到化合物Ic；或者
用靛红酸酐Ie在酸性条件下与四氢异喹啉苯胺Id反应，得到化合物Ic；
上述两种方法的产率均达到80％；在实验初始，本发明人按照文献方法，以乙腈为溶剂，靛红酸酐Ie与四氢异喹啉苯胺Id反应，反应速率较慢，转化率较低(约50％)。为了加快反应速率，提高反应转化率，在反应时加入乙酸催化反应，反应最终产率达到83％，反应速率也得到提高。
(3)以吡啶为催化剂，将磺酰氯类或酰氯类化合物与化合物Ic反应得到目标产物；
其中：R1～R6的定义如通式(I)中所定义。
下面结合具体实施例和附图详细说明本发明，本领域技术人员将理解其仅是例证性的作用，而并非以任何方式限制本发明的范围。
附图说明
图1显示本发明化合物(1μM)对P-gp高表达的R-HepG2细胞中阿霉素聚集促进作用的柱状图。
图2显示本发明化合物(1μM)对P-gp高表达的SW620-Ad300细胞中阿霉素聚集相对于无抑制剂存在的促进作用的柱状图。
图3显示本发明化合物(0.5μM)对K562/P-gp细胞中Rh123外排的抑制作用的柱状图。
图4显示本发明化合物(0.5μM)对K562/ABCG2细胞中PhA外排的抑制作用的柱状图。
图5显示本发明化合物(0.5μM)显著提高K562/P-gp中UIC2移位的柱状图。
图6显示本发明化合物(0.5μM)显著提高K562/ABCG2中5D3移位的柱状图。
图7显示本发明化合物浓度依赖性显著抑制P-gp ATP酶活性的浓度效应曲线图。
图8显示本发明化合物浓度依赖性显著抑制ABCG2ATP酶活性的浓度效应曲线。
具体实施方式
本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例
化合物的结构是通过核磁共振(NMR)或/和质谱(MS)以及红外光谱(IR)来确定的。
NMR化学位移(δ)以10-6(ppm)的单位给出。NMR的测定是用Bruker AVANCE-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(DMSO-d6)，氘代氯仿(CDCl3)，氘代甲醇(CD3OD)，内标为四甲基硅烷(TMS)。
MS的测定用FINNIGAN LCQAd(ESI)质谱仪(生产商：Thermo，型号：Finnigan LCQadvantage MAX)。
LC-MS的测定使用天瑞仪器LC-MS 1000单四极杆型液质联用仪。
IR采用SHIMADZU公司FTIR-8400S红外光谱仪测定。
HPLC的测定使用安捷伦1200DAD高压液相色谱仪(Sunfire C18150×4.6mm色谱柱)和Waters 2695-2996高压液相色谱仪(Gimini C18150×4.6mm色谱柱)。
薄层层析硅胶板使用青岛GF254硅胶板，薄层色谱法(TLC)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
柱层析一般使用青岛海洋化工有限公司硅胶200～300目硅胶为载体。
本发明的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自ABCR GmbH&Co.KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，国药集团化学试剂有限公司，北京偶合科技有限公司等公司。
实施例中无特殊说明，反应均能够在氩气氛或氮气氛下进行。
氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个氮气瓶经双排管持续通惰性气体。约1L容积的氩气或氮气气球。
实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(TLC)，反应所使用的展开剂的体系有：石油醚：乙酸乙酯、石油醚：丙酮、二氯甲烷：甲醇等。
纯化化合物采用的薄层色谱法的展开剂体系包括：石油醚：乙酸乙酯、石油醚：丙酮、二氯甲烷：甲醇等。
实施例1以2-硝基苯甲酸为起始反应物合成化合物1-5
1)2-硝基苯甲酰氯的制备
于100mL圆底烧瓶中加入0.4178g(2.5mmol)2-硝基苯甲酸，然后加入10mL二氯亚砜(可滴加几滴DMF助溶)。于83℃搅拌回流4小时，待溶液澄清后，继续搅拌回流至少2h。反应结束后，停止加热，减压蒸馏，蒸出多余二甲亚砜(蒸至近干)，得到目标产物2-硝基苯甲酰氯，反应定量进行，干燥密封，以备后用。
2)N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)-苯基)-2-硝基苯甲胺(1-b)的制备
于100mL圆底烧瓶中加入0.7810g(2.5mmol)2(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯胺1-a(根据Robert H Mach,Yunsheng Huang,Rebekah AFreeman,et al.,Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,2004,14(1),195-202制得)、0.4205g(5mmol)NaHCO3，然后加入10mL无水CHCl3，搅拌20分钟后，在冷水浴控温(30℃)条件下，分批加入步骤1)中制得的2-硝基苯甲酰氯的无水CHCl3溶液，继续搅拌2-3h。反应结束后，真空蒸除溶剂，向残余物中加入20mL水洗涤固体，过滤得到目标产物N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)-苯基)-2-硝基苯甲胺，对水相用乙酸乙酯萃取水中残留的目标产物，合并有机相。
3)(2-氨基-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺(1-c)的制备
取以上制得的N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)-苯基)-2-硝基苯甲胺(1.15g，2.5mmol，1eq)溶于20mL甲醇中，并加入0.28gPd-C(按照原料的25％质量百分比)，在搅拌下，向得到的混合物中加入甲酸铵1.26g(20mmol， 8eq)，并于67℃回流3-4h。反应结束后，过滤除去Pd-C，真空蒸除溶剂，向残余物中加入水以溶解过量的甲酸铵，然后用CH2Cl2萃取水相，分离有机相，无水硫酸钠干燥过夜，过滤，真空蒸除溶剂，得到粗产物。然后，通过薄层色谱法(TLC)(DCM：MeOH＝15:1)分离纯化粗产物，得到目标产物(2-氨基-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺0.92g，产率86％。上述三步的总产率为85％。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.74-2.93(m,8H,-CH2-),3.65(s,2H,-CH2-N-),3.837(s,3H,-OCH3),3.843(s,3H,-OCH3),5.493(s,2H,-NH2),6.54(s,1H,Ar-H),6.60(s,1H,Ar-H),6.70(t,2H,J＝7.2Hz,Ar-H),7.229-7.258(m,3H,Ar-H),7.449-7.496(m,3H,Ar-H),7.733(s,1H,-CO-NH-).
4)N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-(N-(苯磺酰基)苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物1)的制备
取0.8631g(2mmol，1eq)上述还原产物(2-氨基-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺(1-c)于圆底烧瓶中，并向其中加入10mLCH2Cl2，然后加入吡啶0.4mL(5mmol，2.5eq)，再加入苯磺酰氯0.4385g(2.3mmol，1.15eq)。将得到的混合物于室温搅拌3小时。反应结束后，向反应液中加入CH2Cl220mL稀释，然后用饱和NaHCO3溶液(20mL)洗涤以除去未反应的磺酰氯，再水洗除去NaHCO3，最后用饱和CuSO4溶液洗涤以去除吡啶。然后，合并有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤，真空蒸除溶剂，得到固体粗产品，通过TLC(石油醚：乙酸乙酯＝8:1)分离纯化粗产品得到目标产物N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-(N-(苯磺酰基)苯磺酰氨基)苯甲酰胺0.70g，产率49％(化合物1)。
ESI-MS(m/z):711.097[M]+.
IRνmax(KBr):3444.63,2921.96,2850.59,2389.64,2302.85,1676.03,1650.95,1604.66,1515.94,1452.3,1375.15,1257.5,1166.85,1124.42,1083.92,1016.42,910.34,862.12,756.04cm-1.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.74-2.87(m,8H,-CH2-),3.65(s,2H,-N-CH2-Ar),3.83(s,6H,Ar-OCH3),6.54(s,1H,Ar-H),6.59(s,1H,Ar-H),7.08(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.31(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.350-7.380(m,1H,Ar-H),7.40(d,4H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.51(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.55(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.78(q,1H,3J＝8.0Hz,4J＝1.4Hz,Ar-H),7.96(d,4H,J＝7.6Hz,Ar-H),9.14(s,1H,Ar-CONH-Ar).
5)N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-(2,4,6-三甲基苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物2)的制备
按照上述步骤4)相同的制备方法，除了用2,4,6-三甲基-苯磺酰氯磺酰化化合物1-c，制得目标产物N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-(2,4,6-三甲基苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物2)。
ESI-MS(m/z):612.947[M-1]+.
IRνmax(KBr):3444.63,2931.60,2839.02,1643.24,1600.81,1515.94,1456.16,1377.08,1328.86,1257.50,1228.57,1155.28,1118.64,1053.06,827.41,754.12cm-1.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.21(s,3H,Ar-CH3),2.62(s,6H,Ar-CH3),2.82-3.08(m,8H,-CH2-),3.81(s,2H,-CONH-Ar),3.86(s,3H,Ar-OCH3),3.87(s,3H,Ar-OCH3),5.32(s,1H,-SO2NH-),6.55(s,1H,Ar-H),6.62(s,1H,Ar-H),6.85(s,2H,Ar-H),7.05(m,1H,Ar-H),7.242(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.36(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.49(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.58(d,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.97(s,1H,-CONH-).
6)N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-(4-三氟甲基)苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物3)的制备
按照上述步骤4)相同的制备方法，除了用对三氟甲基苯磺酰氯磺酰化化合物1-c，而制得目标产物N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-(4-三氟甲基)苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物3)。
ESI-MS(m/z):639.20[M]+.
IRνmax(KBr):3448.49,3010.67,2931.6,1643.24,1602.74,1542.95,1517.87,1465.8,1400.22,1325.01,1261.36,1236.29,1168.78,1126.35,1089.71,983.63,837.05,756.04cm-1.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.78-2.95(m,8H,-CH2-),3.69(s,2H, -N-CH2-Ar),3.833(s,3H,Ar-OCH3),3.842(s,3H,Ar-OCH3),6.53(s,1H,Ar-H),6.60(s,1H,Ar-H),7.14(t,1H,J＝7.4Hz,Ar-H),7.247(t,2H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.38(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.44(t,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.54(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.57(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.64(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.88(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H).7)2-(4-乙酰氨基苯磺酰氨基)-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺(化合物4)的制备
按照上述步骤4)相同的制备方法，除了用对乙酰氨基苯磺酰氯磺酰化化合物1-c，而制得目标产物2-(4-乙酰氨基苯磺酰氨基)-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺(化合物4)。
ESI-MS(m/z):627.088[M-1]+.
IRνmax(KBr):3743.57,3450.41,3101.32,3035.75,2929.67,2356.85,1693.38,1643.24,1595.02,1519.8,1461.94,1404.08,1371.29,1325.01,1259.43,1157.21,1122.49,1087.78,838.98cm-1.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.09(s,3H,-COCH3),2.81-2.92(m,8H,-CH2-),3.73(s,2H,-N-CH2-Ar),3.777(s,3H,Ar-OCH3),3.779(s,3H,Ar-OCH3),6.664(s,1H,Ar-H),6.70(s,1H,Ar-H),7.02(t,1H,J＝6.6Hz,Ar-H),7.20(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.33(t,1H,J＝7.8Hz,Ar-H),7.47(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.52(q,4H,3J＝8.8Hz,4J＝2.4Hz),7.62(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.8(d,1H,J＝7.6Hz,Ar-H).
8)2-(双(4-溴苯磺酰基)甲基)-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺(化合物5)的制备
按照上述步骤4)相同的制备方法，除了用对溴苯磺酰氯磺酰化化合物1-c，而制得目标产物2-(双(4-溴苯磺酰基)甲基)-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉 -2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺(化合物5)。
ESI-MS(m/z):869.941[M-1]+.
IRνmax(KBr):3741.65,3672.21,2927.74,2312.49,1677.95,1515.94,1384.79,1166.85,1008.7,910.34,862.12,821.62cm-1.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.75-2.93(m,8H,-CH2-),3.70(s,2H,-N-CH2-Ar),3.831(s,3H,Ar-OCH3),3.834(s,3H,Ar-OCH3),6.54(s,1H,Ar-H),6.59(s,1H,Ar-H),6.69(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.13(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.29(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.40(t,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.51(d,4H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.58(t,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.81(d,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.80(d,4H,J＝8.4Hz,Ar-H),9.00(s,1H,Ar-CONH-Ar).
实施例2以靛红酸酐为起始反应物合成化合物6-10
Philippe Labrie和他的同事报道了靛红酸酐在tariquidar类似物合成中的应用，之后没有人再有相关报道，本发明尝试摸索并优化了实验条件。
1)(2-氨基-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺(1-c)的制备
取6.21mg(0.5mmol，1eq)2(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯胺1-a于100mL圆底烧瓶，加入10-15mL乙腈搅拌溶解，然后加入87.9mg(0.55mmol，1.1eq)靛红酸酐，将所得到的混合物搅拌回流2h后加入0.5mL冰醋酸，继续回流反应直至TLC检测确定反应终点。反应结束后，真空蒸出溶剂乙腈，并向残余物中加入CH2Cl2使其溶解，然后用15mL饱和NaHCO3洗除多余靛红酸酐，加入无水Na2SO4干燥，过滤，真空蒸除溶剂，得到粗产品。通过TLC(DCM：MeOH＝15:1)分离纯化粗产品，得到目标产物(2-氨基-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺(1-c)179.2mg，产率达83％。
2)N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)-苯基)-2-(5-(二甲氨基)萘-1-磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物6)的制备
取化合物(2-氨基-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺(1-c)0.8631g(2mmol，1eq)于圆底烧瓶，加入10mL CH2Cl2溶解，然后加入吡啶0.4mL(5mmol，2.5eq)，再加入丹磺酰氯0.797g(2.4mmol，1.2eq)。将得到的化合物室温搅拌直至TLC检测确定反应终点。反应结束后，向反应液中加入CH2Cl2稀释，然后用饱和NaHCO3溶液(20mL)洗涤以除去未反应的磺酰氯，再水洗除去NaHCO3，然后用饱和CuSO4溶液洗涤以去除吡啶。合并有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤，真空蒸除溶剂，得到固体粗产品。通过TLC(DCM：MeOH＝15:1)分离纯化粗产品，得到目标产物N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)-苯基)-2-(5-(二甲氨基)萘-1-磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物6)。
ESI-MS(m/z):663.28[M-1]+.
IRνmax(KBr):3450.41,2933.53,2831.31,2783.09,1637.45,1604.66,1432.18,1352.23,1336.07,1137.26,1056.31,857.58cm-1.
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):2.74-2.78(m,8H,-CH2-),3.06(s，6H,-N-CH3),3.70(s,6H,Ar-OCH3),3.75(s,2H,-N-CH2-Ar),6.59-6.77(m,4H,Ar-H),7.03(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.21(d,3H,J＝4.0Hz,Ar-H),7.26(d,1H,J＝7.2Hz,Ar-H),7.55(s,4H,Ar-H),7.88(d,1H,J＝6.8Hz,Ar-H),8.17(d,1H,J＝4.0Hz,Ar-H),8.26(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),8.66(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),14.1(s,1H,-NH-).
3)N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)-苯基)-2-(丙磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物7)的制备
按照上述步骤2)相同的制备方法，除了用丙磺酰氯磺酰化化合物1-c，而制得目标产物N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)-苯基)-2-(丙磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物7)。
ESI-MS(m/z):536.419[M-1]+.
IRνmax(KBr):3735.86,3624,2933.53,2827.45,2352.99,1639.38,1604.66,1413.08,1346.29,1315.62,1253.74,1165.28,1065.44,838.98cm-1.
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):0.9(s,3H,-CH2-CH3-),1.63-1.65(m,2H,-CH2-CH3),2.72-2.80(m,8H,-CH2-),3.00(s，2H,-CH2-SO2-),3.60(s,2H,-N-CH2-Ar),3.69(s,6H,Ar-OCH3),6.64(s,1H,Ar-H),6.65(s,1H,Ar-H),6.93(s,1H,Ar-H),7.21(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.35(s,1H,Ar-H),7.48(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.60(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.92(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),10.3(s,1H,-CO-NH-).
4)N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-(2-(三氟甲基)苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物8)的制备
按照上述步骤2)相同的制备方法，除了用2-三氟甲基苯磺酰氯磺酰化化合物1-c，而制得目标产物N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-(2-(三氟甲基)苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物8)。
ESI-MS(m/z):638.123[M-1]+.
IRνmax(KBr):3739.72,3510.2,3448.49,3004.89,2839.02,2592.15,2358.78,1836.11,1743.53,1641.31,1521.73,1460.01,1313.43,1257.5,1128.28,977.84,908.41,838.98,767.62cm-1.
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):2.94-3.24(m,8H,-CH2-),3.71(s,3H,Ar-OCH3),3.72(s,3H,Ar-OCH3),4.20(s,2H,-N-CH2-Ar-),6.66(s,1H,Ar-H),6.75(s,1H,Ar-H),6.77(s,1H,Ar-H),7.07(s,1H,Ar-H),7.24(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.65(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.62(t,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.71(t,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.79(d,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.97(d,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),8.20(d,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),9.90(s,1H,-NH-).5)N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-(2-氟苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物9)的制备
按照上述步骤2)相同的制备方法，除了用2-氟苯磺酰氯磺酰化化合物1-c，而制得目标产物N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-(2-氟苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物9)。
LC-MS m/z:589.20[M+1]+.
IRνmax(KBr):3737.79,3554.56,3446.56,3002.96,2925.81,2839.02,2732.94,2609.51,2325.99,1836.11,1743.53,1641.31,1548.73,1461.94,1326.93,1259.43,1124.42,975.91,825.48,769.54cm-1.
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ(ppm):2.95-3.0(m,3H,-CH2-),6.76(s,1H,Ar-H),6.79(s,1H,Ar-H),7.17(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.21(d,1H,J＝3.6Hz,Ar-H),7.26(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.31(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.48-7.49(m,1H,Ar-H),7.67(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.82-7.86(m,1H,Ar-H),7.91(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H).6)N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-(4-氯苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物10)的制备
按照上述步骤2)相同的制备方法，除了用4-氯苯磺酰氯磺酰化化合物1-c，而制得目标产物N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-(4-氯苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物10)。
LC-MS m/z:605.18(100％),607.17(36.5％).
IRνmax(KBr):3375.2,3002.96,2835.16,2761.87,2615.29,2358.78,2333.71,1911.33,1643.24,1598.88,1519.80,1469.66,1392.51,1332.72,1259.43,1230.50,1163.00,1122.49,1087.78,1031.85,1006.77,827.41,765.04cm-1.
1HNMR(400MHz,CD3OD)δ(ppm):2.95-3.0(m,3H,-CH2-),6.74(s,1H,Ar-H),6.79(s,1H,Ar-H),7.224(t,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.296-7.317(m,3H,J＝6.4Hz,2Hz,Ar-H),7.38-7.40(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.461-7.499(t,1H,J＝8Hz,Ar-H),7.545-7.638(m,5H,Ar-H),7.67(d,1H,J＝8Hz,Ar-H),7.755(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H).
实施例3以6-硝基藜芦酸为起始反应物合成化合物11-13
以6-硝基藜芦酸(购自北京偶合科技有限公司)代替实施例1中的邻硝基苯 甲酸，并按照实施例1相同的实验操作步骤进行化合物11～13的制备。
1)2-(4-叔丁基苯磺酰氨基)-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-4,5-二甲氧基苯甲酰胺(化合物11)的制备
按照实施例1相同的实验步骤，除了用6-硝基藜芦酸代替邻硝基苯甲酸，并用对叔丁基苯磺酰氯磺酰化化合物3-c，制得目标产物2-(4-叔丁基苯磺酰氨基)-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-4,5-二甲氧基苯甲酰胺(化合物11)。
ESI-MS：m/z＝687.495,[M+].
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):1.18(s,9H,-C(CH3)3),2.75-2.92(m,8H,-CH2-),3.68(s,2H,-N-CH2-Ar),3.82(s,6H,Ar-OCH3),3.845(s,3H,Ar-OCH3),3.851(s,3H,Ar-OCH3),6.52(s,1H,Ar-H),6.57(s,1H,Ar-H),6.90(s,1H,Ar-H),7.14(s,1H,Ar-H),7.18(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.30(d,2H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.36(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.63(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H).
2)N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-4,5-二甲氧基-2-(4-(三氟甲基)苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物12)的制备
按照实施例1相同的实验步骤，除了用6-硝基藜芦酸代替邻硝基苯甲酸，并用对三氟甲基苯磺酰氯磺酰化化合物3-c，制得目标产物N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-4,5-二甲氧基-2-(4-(三氟甲基)苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物12)。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.77-2.93(m,8H,-CH2-),3.69(s,2H,-N-CH2-Ar),3.82(s,6H,Ar-OCH3),3.85(s,3H,Ar-OCH3),3.89(s,3H,Ar-OCH3),5.28(s,1H,-SO2NH-Ar),6.52(s,1H,Ar-H),6.57(s,1H,Ar-H),6.87(s,1H,Ar-H),7.18(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.21(s,1H,Ar-H),7.29(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.79(d,2H, J＝8.4Hz,Ar-H).
3)(N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-4,5-二甲氧基-2-(4-甲基苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物13)的制备
按照实施例1相同的实验步骤，除了用6-硝基藜芦酸代替邻硝基苯甲酸，并用对甲基苯磺酰氯磺酰化化合物3-c，制得目标产物N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-4,5-二甲氧基-2-(4-(三氟甲基)苯磺酰氨基)苯甲酰胺(化合物13)。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.25(s,3H,Ar-CH3),2.28-2.94(m,8H,-CH2-),3.70(s,2H,-N-CH2-Ar),3.821(s,3H,-Ar-OCH3),3.828(s,3H,Ar-OCH3),3.838(s,3H,Ar-OCH3),3.888(s,3H,Ar-OCH3),6.52(s,1H,Ar-H),6.58(s,1H,Ar-H),6.86(s,1H,Ar-H),7.04(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H),7.20(s,1H,Ar-H),7.22(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.34(d,2H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.56(d,2H,J＝8.4Hz,Ar-H).
实施例4(9H-芴-9-基)甲基-2-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯氨基甲酰基)苯基氨基甲酸酯(化合物14)的制备
取化合物(2-氨基-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺(1-c)0.8631g(2mmol，1eq)于圆底烧瓶，加入10mL CH2Cl2溶解，然后加入NaHCO30.336g(4mmol，2eq)，再加入芴甲氧羰酰氯(购自北京偶合科技有限公司)0.620g(2.4mmol，1.2eq)。将混合物室温搅拌直至TLC检测确定反应终点。反应结束后，加入CH2Cl2稀释，然后用饱和NaHCO3溶液(20mL)洗涤以除去未反应的酰氯，再用水洗除去NaHCO3，合并有机相，用无水Na2SO4干燥，过滤，真空蒸除溶剂，得到固体粗产品。TLC(DCM：MeOH＝15:1)分离纯化粗产品，得到目标产物(9H-芴-9-基)甲基-2-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉 -2(1H)-基)乙基)苯氨基甲酰基)苯基氨基甲酸酯(化合物14)。
LC-MS m/z:652.29[M-1]+.
IRνmax(KBr):3988.52,3743.57,3446.56,2925.81,2852.52,2335.64,1730.03,1649.02,1593.09,1517.87,1448.44,1409.87,1367.44,1326.93,1261.36,1215.07,1118.64,1043.42,908.41cm-1.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.8-3.5(m,8H,-CH2-),3.78(s,3H,Ar-OCH3),3.80(s,3H,Ar-OCH3),3.90(s,2H,-N-CH2-Ar),4.22(s，1H,-CH＝),4.37(s，2H,-CH2-O-),6.45(s,1H,Ar-H),6.55(s,1H,Ar-H),7.03(s,1H,Ar-H),7.10(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.34-7.40(m,4H,Ar-H),7.54-7.60(m,5H,Ar-H),7.71(d,4H,J＝8.0Hz,Ar-H),8.25(s,1H,Ar-H),8.87(s，1H,-NH-),10.50(s,1H,-NH-CO-).
实施例5N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-十二烷甲酰氨基苯甲酰胺(化合物15)的制备
1)月桂酰氯的制备
于100mL圆底烧瓶中加入0.44g(2.2mmol)月桂酸，加入10mL二氯亚砜。将得到的混合物于90℃加热回流2小时，待溶液澄清后，继续搅拌回流2-3h。反应结束后，停止加热，蒸出多余二氯亚砜，即可得到月桂酰氯。
2)N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-十二烷甲酰氨基苯甲酰胺(化合物15)的制备
按照实施例4相同的制备方法，除了用月桂酰氯酰化化合物1-c，得到目标产物N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)-2-十二烷甲酰氨基苯甲酰胺(化合物15)。
LC-MS m/z:612.5[M-1]+.
IRνmax(KBr):3894.01,3743.57,3620.14,3278.76,2921.96,2850.59,2364.57,2322.13,1658.67,1596.95,1515.94,1446.51,1409.87,1323.08,1257.5,1130.21,1014.49,825.48cm-1.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):0.87(t,3H,J＝6.6Hz,-CH2-CH3),1.25-1.4(m,16H,-CH2-CH2-),1.71(t,2H,J＝8.0Hz,-CH2-),2.35(t,2H,J＝8.0Hz,-CH2-O-),2.09(s,3H,-COCH3),2.76-2.95(m,8H,-CH2-),3.66(s,2H,-N-CH2-Ar),3.84(s,6H,Ar-OCH3),6.55(s,1H,Ar-H),6.61(s,1H,Ar-H),7.03(t,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.28(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.37(t,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.54(d,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.58(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),8.44(d,1H,J＝7.6Hz),8.47-8.51(m,1H,Ar-H),10.64(s,1H,-NH-).
实施例62-肉桂酸甲酰氨基-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺(化合物16)的制备
按照实施例4相同的制备方法，除了用肉桂酸酰化化合物1-c，得到目标产物2-肉桂酸甲酰氨基-N-(4-(2-(6,7-二甲氧基-3,4-二氢异喹啉-2(1H)-基)乙基)苯基)苯甲酰胺(化合物16)。
ESI-MS(m/z):560.517[M-1]+.
IRνmax(KBr):3448.49，3263.33,2933.53,2825.25,1685.67,1679.88,1625.88,1595.02,1525.59,1458.17,1263.29,966.27cm-1.
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm):2.74-2.93(m,8H,-CH2-),3.64(s,2H,-N-CH2-Ar),3.82(s,3H,Ar-OCH3),3.83(s,3H,Ar-OCH3),6.53(s,1H,Ar-H),6.56(d，1H,J＝16Hz,-CH＝CH-),6.59(s,1H,Ar-H),7.08(t,1H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.28(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.36(s,1H,Ar-H),7.37(d,2H,J＝8.0Hz,Ar-H),7.47(t,1H,J＝7.6Hz,Ar-H),7.54-7.59(m,4H,Ar-H),7.71(s,1H,Ar-H),7.75(s,1H,-CO-NH-)，8.18-8.21(m,1H,Ar-H)，8.68(d,1H,J＝8.4Hz,Ar-H),11.0(s,1H,-NH-).
试验例
试验例1采用MTT法筛选化合物对于正常细胞和结肠癌细胞的细胞毒性作用
试验材料
结肠癌细胞HCT116、结肠癌细胞SW620、正常人结肠成纤维细胞CCD-18Co、正常胃上皮细胞HFE购买于ATCC(美国典型培养物保藏所)，大鼠原代肝细胞按照文献方法(Moravcova A,Cervinkova Z,Kucera et al..Acta Medica(Hradec Kralove).2014,57(1):3-8.)由发明人从正常SD大鼠肝组织自行分离提取，SW620-Ad300细胞由香港中文大学Kenneth试验室稳定转染P-gp于SW620得到(Hu T,To KK,Wang L,Phytomedicine.2014,25；21(11):1264-72)。Tariquidar由北京科技大学李旭琴试验室参考文献方法(Michael Roe,Adrian Folkes,Philip Ashworth,et al.Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,1999,9,595-600)合成得到。
试验方法
将上述各细胞以一定的细胞密度(8000个细胞/孔)接种于96孔板，37℃，5％二氧化碳培养，贴壁24h，除试验组外，设立空白对照组、溶剂对照组及阳性 对照组，向培养细胞中加入系列浓度的溶于DMSO的本发明化合物及阳性对照化合物Tariquida(0-100μM)于培养细胞中，作用48h或72h(正常胃上皮细胞是72h)后在培养板中加入MTT(终浓度0.5mg/ml)，继续孵育4h，吸除上清，加入DMSO(100μl/孔)，溶解充分后于490/630双波长检测吸光度(OD值)(伯乐uQuant全波长酶标仪)，确定细胞活力。细胞活力抑制率按照以下公式计算：％抑制率＝(空白对照组OD值-试验组OD值)/(空白对照组OD值)×100，绘制浓度-抑制率曲线，计算半数致死浓度(LC50)。
本发明化合物对正常细胞和结肠癌细胞的细胞存活率影响的结果示于下表1-4。
表1本发明化合物对结肠癌细胞的细胞毒性(48h)
表2本发明化合物对大鼠原代肝细胞的细胞毒性(48h)
表3本发明化合物对正常人结肠成纤维细胞CCD-18co的细胞毒性(48h)
表4本发明化合物对人正常胃上皮细胞HFE的细胞毒性(72h)
由上表中结果可以看出，本发明化合物对结肠癌细胞的细胞毒性作用均远远低于阳性对照Tariquidar(表1)。此外，本发明化合物在小鼠原代肝细胞、正常人结肠成纤维细胞CCD-18co细胞、人正常胃上皮HFE细胞中的毒性结果(表2-4)显示本发明化合物比阳性对照Tariquidar在正常细胞中的细胞毒性大大降低。这表明本发明化合物的安全性高于Tariquidar。
试验例2流式细胞术检测本发明化合物对P-gp外排的抑制作用
2-1、本发明化合物对P-gp高表达的R-HepG2细胞中阿霉素(doxorubicin)外排的抑制作用
试验材料
R-HepG2：P-gp过度表达的阿霉素耐药性肝癌细胞(香港中文大学kenneth试验室通过阿霉素(doxorubicin)持续增量冲击构建(Tang PM,Chan JY,Zhang DM,Cancer BiolTher.2007Apr；6(4):504-9)，试验验证此细胞株中P-gp高表达，阳性对照维拉帕米及试验所用胰蛋白酶购自Sigma化学公司，Tariquidar由北京科技大学李旭琴试验室合成(如试验例1)。
试验方法
R-HepG2细胞以2×105每孔接种于24孔板中，37℃、5％二氧化碳培养，贴壁48h。将细胞于无酚红培养液中继续培养，除试验组外，设立空白对照组(只含培养液)、溶剂对照组(0.1％DMSO)及阳性对照组(Tariquidar或维拉帕米)，向培养细胞中加入溶于DMSO的本发明化合物(1μM)及阳性对照Tariquidar(1μM)或维拉帕米(100μM)，预处理15分钟，然后加入阿霉素(10μM)继续孵育30分钟。孵育结束后，胰蛋白酶消化，离心(6分钟，转速为1100rpm)收集细胞，用冰冷PBS(phosphate-buffered saline)洗涤细胞沉淀两次，并用冰冷PBS重悬细胞沉淀，冰上避光保存样品，于流式细胞分析仪(BD LSR Fortessa)进行荧光底物阿霉素的细胞内荧光强度测定，所用激发波长470nm，发射波长585nm，典型结果示于图1。数据以平均荧光强度值±标准误差值表示，N＝3，差异显著性分析采用单因素方差分析。*p>0.05和***p>0.001表示与空白对照组有显著性差异。ns代表与阳性对照维拉帕米组没有显著性差异。
试验结果
如图1所示，本发明化合物(5、12、13、8、9、2、3、1)能够显著地抑制P-gp介导的从R-HepG2细胞外排阿霉素的能力。其中，化合物8、9、2、3、1(1μM)的抑制效果与阳性对照药维拉帕米和Tariquidar没有显著性差异。
2-2、本发明化合物对结肠癌细胞Caco-2中P-gp底物地高辛吸收的促进作用
试验材料
结肠癌细胞Caco-2购自ATCC)，培养板购自康宁生物，EVOM2跨 膜细胞电阻仪购自美国密理博生物公司，地高辛购自sigma公司，Tariquidar由北京科技大学李旭琴试验室合成(如试验例1)。
试验方法
结肠癌细胞Caco-2以2.5×105细胞/ml的密度培育在通透性嵌套中，孵育21天，隔天换液，21天后，使用STX2双杆电极EVOM电压电阻仪测量细胞跨膜电阻值(transepithelial electrical resistance，TEER)，选TEER≥200Ω/cm2的单层膜用于转运试验。试验设置溶剂对照组(1％DMSO)、阳性对照组(Tariquidar)及试验组。转运试验前去除培养液，在孔中加入HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)，分别向培养细胞中加入本发明化合物(1μM)及阳性对照化合物Tariquidar(1μM)，预处理1小时。然后将地高辛(50μM)加入每个细胞的供体腔，分6个时间点(15、30、45、60、90、120分钟)从受体腔收取500μL的样品，并同时加入相同体积的预温过的HBSS以维持每个腔中液体的体积不变，然后移出。试验结束后，再次测量TEER值以确定试验过程中单分子膜的完整性。样品中地高辛浓度使用高效液相色谱法检测，计算其表观渗透系数(Apparent Permeability，Papp)，计算公式如下：
Papp＝(Vr/C0)(1/S)(dC/dt)
其中：
Vr代表受体腔中媒介的体积
C0是供体腔中地高辛起始浓度
S是单层表面积
dC/dt是稀释后受体腔中地高辛浓度随时间的线性斜率
流出速率RE通过下式计算：
RE＝PBA/PAB
其中：PBA和PAB分别代表从细胞单层膜基底侧到顶侧以及从顶侧到单层膜基底侧的地高辛Papp值。
试验结果
如下表5所示，本发明化合物均表现出潜在的P-gp抑制效果，本发明化合物3和13的作用与阳性对照药Tarquidar接近
表5本发明化合物对地高辛在Caco-2单分子膜双向转运地高辛流出比例的抑制作用
2-3、流式细胞术检测本发明化合物对P-gp高表达的SW620-Ad300细胞中阿霉素外排的抑制作用
试验材料
SW620-Ad300细胞由香港中文大学Kenneth试验室P-gp稳定转染SW620细胞构建(如试验例1所述)，阳性对照维拉帕米及试验所用胰蛋白酶购自Sigma化学公司，Tariquidar由北京科技大学李旭琴试验室合成(如试验例1)。
试验方法
SW620-Ad300细胞以2×105每孔接种于24孔板中，37℃、5％二氧化碳培养，贴壁48h。将细胞于无酚红培养液中继续培养，除试验组外，设立空白对照组(只含细胞培养液)、溶剂对照组(0.1％DMSO)及阳性对照组(Tariquidar和维拉帕米)，向培养细胞中加入溶解于DMSO的本发明化合物(1μM)及阳性对照Tariquidar(1μM)或维拉帕米(50μM)，预处理15分钟，然后加入阿霉素(10μM)继续孵育30分钟。孵育结束后，胰蛋白酶消化，离心(6分钟，转速为1100rpm)收集细胞，用冰冷PBS洗涤细胞沉淀两次，并用冰冷PBS重悬细胞沉淀，冰上避光保存样品，于流式细胞分析仪(BD LSR Fortessa)进行荧光底物阿霉素的细胞内荧光强度测定，所用激发波长470nm，发射波长585nm，典型结果示于图2。数据以平均荧光强度值±标准误差值表示，N＝3，差异显著性分析采用单因素方差分析。*p>0.05和***p>0.001表示与空白对照组(0.1％DMSO)有显著性差异。ns代表与阳性对照维拉帕米组没有显著性差异。
试验结果
图2显示SW620-Ad300细胞中不同处理组的阿霉素的累积。如图2所示，本发明化合物中，化合物1、5表现出与阳性对照药Tarquidar和维拉帕米接近的P-gp抑制活性，化合物11也具有P-gp抑制活性，但活性低于阳性对照药。
试验例3本发明化合物对P-gp介导的阿霉素多药耐药的逆转作用
试验材料
SW620-Ad300细胞由香港中文大学Kenneth试验室P-gp稳定转染sw620细胞构建(如试验例1)，MTT及阿霉素购自Sigma公司，Tariquidar由北京科技大学李旭琴试验室合成(如试验例1)。
试验方法
SW620-Ad300细胞接种于96孔板中，37℃、5％二氧化碳培养，贴壁24h,除试验组外，设立空白对照组(只含培养液)、溶剂对照组(0.1％DMSO)及阳性对照组(Tariquidar)，试验向培养细胞中加入溶于DMSO的本发明化合物(1μM)及阳性对照Tariquidar(1μM)预处理1h，然后加入系列浓度(0-100μM)的阿霉 素联合处理48h，孵育结束后在培养板中加入MTT(终浓度0.5mg/ml)，继续孵育4h，吸除上清，加入DMSO(100μl/孔)，溶解充分后于490/630双波长检测吸光度(OD值)(如试验例1)，确定细胞活力。细胞活力抑制率按照以下公式计算：％抑制率＝(空白对照组OD值-试验组OD值)/(空白对照组OD值)×100，绘制阿霉素单独处理和与本发明化合物联合处理的浓度-抑制率曲线，计算相应的半数抑制浓度(IC50)。
试验结果
表6显示通过MTT试验检测的本发明化合物细胞活力的IC50。由表6可知，本发明与阿霉素联合处理SW620-Ad300细胞后，细胞存活率下降，IC50明显下降，因此本发明化合物1、5可显著抑制P-gp介导的阿霉素(Dox)耐药。
表6通过MTT试验检测的本发明化合物细胞活力的IC50
试验例4本发明化合物对P-gp或ABCG2介导的药物外排的抑制作用
试验材料
人白血病细胞K562细胞及稳定转染P-gp或ABCG2的K562细胞均来源于香港中文大学Kenneth实验室(由美国国立癌症研究中心Susan Bates博士赠送)。P-gp荧光底物罗丹明123(Rh123)、ABCG2荧光底物脱镁叶绿酸A(PhA，1M)以及胰蛋白酶购自Sigma公司。
试验方法
将稳定转染P-gp或ABCG2的K562细胞接种于24孔板，于DMEM培养基(含10％胎牛血清(Gibco)，100unit/ml的青霉素及链霉素(sigma)，2mg/mL的G418(Gibco))中培养，培养条件为37℃、5％二氧化碳，贴壁24h。设置空白对照组(只含荧光底物)、溶剂对照组(0.1％DMSO)、阳性对照组(Tariquidar)及试验组，阳性对照组中加入Tariquidar(0.5μM)，试验组中加入本发明化合物(0.5μM)，于无酚红1640完全培养基中用Rh123(0.5μg/mL)或PhA(1μM)预处理30分钟。孵育结束后，胰蛋白酶消化并收集细胞，加入冰冷PBS洗涤两次，于37℃在无底物培养液中用本发明化合物或Tariquidar对照继续处理1小时，空白对照组除荧光底物外不加入任何化合物。各组中荧光强度的差异使用学生检验(Student’s t-test)进行统计学分析，*p<0.05表示差异具有统计学意义。样品使用流式细胞仪(BD Biosciences，SanJose，CA)进行检测。Rh123的检测激发波长为488nm，发射波长为530nm。PhA的检测激发波长为488nm，发射波长为670nm。3次独立试验 的结果用于统计学分析。
试验结果
本发明化合物11、5、1、16在P-gp转染的K562/P-gp细胞中能不同程度地抑制Rh123的外排(参见图3)。另一方面，化合物16也可以抑制K562/ABCG2细胞中PhA的外排(参见图4)。而化合物16则表现出弱于Tariquidar的ABCG2抑制效果。据报道Tariquidar对P-gp和ABCG2均具有抑制效果，而本发明中结构修饰后的化合物11、5、1仅具有对P-gp专一性的抑制作用。
试验例5本发明化合物对P-gp和ABCG2介导的多药耐药的逆转作用
试验材料
人乳腺癌MCF-7细胞及稳定转染ABCG2的MCF-7FLV1000细胞(由美国国立癌症研究中心Susan Bates博士赠送)，人乳腺癌LCC6及稳定转染P-gp的LCC6MDR细胞(由美国乔治城大学Robert Clarke教授赠送)，人结肠癌SW620细胞及稳定转染P-gp的SW620-Ad300细胞，人肝癌细胞HepG2细胞及P-gp过表达的R-hepG2细胞，均来源于香港中文大学Kenneth试验室(如试验例1所述)。米托蒽醌(Mitoxantrone)、紫杉醇(paclitaxel)、阿霉素及黄酰罗丹明B购自Sigma公司。
试验方法
细胞活力按照文献报道使用黄酰罗丹明B蛋白染色法分析测定，具体方法简述如下。将上述稳定转染细胞(人乳腺癌MCF-7细胞及稳定转染ABCG2的MCF-7FLV1000细胞，人乳腺癌LCC6及稳定转染P-gp的LCC6MDR细胞，人结肠癌SW620细胞及稳定转染P-gp的SW620-Ad300细胞，人肝癌细胞HepG2细胞及P-gp过表达的R-hepG2细胞)接种于96孔培养板，于DMEM培养基(含10％胎牛血清，100unit/ml的青霉素及链霉素，2mg/mL的G418)中培养，培养条件为37℃、5％二氧化碳，贴壁24h。设置空白对照组(只含培养液)，溶剂对照组(0.1％DMSO)，米托蒽醌单独给药组(0-50μM)，阿霉素单独给药组(0-50μM)，紫杉醇单独给药组(0-50μM)，联合用药组中除上述相应化疗药物外，同时加入阳性对照药Tariquidar(0.2μM)或本发明化合物(0.2μM)，处理48h或72h。处理结束后，每孔加入用1％冰醋酸配置的4mg/mlSRB(Sigma)溶液100μl/孔，室温染色15分钟。染色后倾去上清液，用1％冰醋酸洗涤5次，空气中干燥，加入150μl/孔的10mM的Tris液，摇匀测板，515nm处测定OD值(同试验例1)。细胞活力抑制率按照以下公式计算：％抑制率＝(空白对照组OD值-试验组OD值)/(空白对照组OD值)×100，绘制浓度-抑制率曲线，计算半数抑制浓度(IC50)。差异使用单因素方差分析进行组间比较，N＝3，*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001表示耐药细胞株中化疗药物单独用药与联合用药的作用具有统计学显著差异。
试验结果
下表7显示了本发明化合物对P-gp及ABCG2介导的肿瘤多药耐药性的抑制作用，可见耐药癌细胞对于相应的运输底物抗癌药具有显著的耐药性(P-gp-过表达的LCC6MDR以1:125倍对紫杉醇耐药；ABCG2过表达的MCF-7FLV1000以1:208倍对米托蒽醌耐药)。本发明化合物5、11在测试浓度(200nM)本身对肿瘤细胞增殖没有明显抑制作用，但结果显示它们显著增强抗癌药物在多药耐药肿瘤细胞相应转运蛋白-过表达细胞系的抗癌活性，且本发明化合物逆转耐药的作用与对相应膜转运蛋白的外排抑制作用一致。而在无转运蛋白过表达的母系细胞中没有观察到这一现象。
表7本发明化合物对P-gp及ABCG2介导的肿瘤多药耐药的抑制作用
*p<0.05；在耐药细胞株中与抗癌药物单独比较
**P<0.01；在耐药细胞株中与抗癌药物单独比较
试验例6本发明化合物对荧光标记的P-gp或ABCG2单克隆抗体UIC2或5D3迁移的作用
UIC2和5D3是构象敏感的单克隆抗体，分别识别人P-gp和ABCG2的细胞外抗原决定部位。UIC2/5D3可以结合到转运蛋白细胞外环，依赖底物/抑制剂的结合与ATP泵的作用，以某种结构的转运蛋白的增加体现(也就是UIC2或5D3迁移)(Nagy H,Goda K,Fenyvesi F,等人,Biochem Biophys Res Commun 2004；315:942-949；Ozvegy-Laczka,Varady G,KoblosG,等人,J Biol Chem 2005；280:4219-4227)。因此本研究分别在K562/P-gp和K562/ABCG2中进行UIC2和5D3迁移试验，来阐释本发明化合物和两种MDR转运蛋白的相互作用。
试验材料
PE(藻红蛋白)标记的抗P-gp抗体UIC2，PE偶联的抗ABCG2抗体5D3及PE偶联的小鼠IgG2b阴性对照抗体，均购自eBioscience Inc(San Diego，CA)。K562/P-gp和K562/ABCG2细胞来自香港中文大学Kennneth试验室(如试验例4)。特异性P-gp抑制剂PSC833和特异性ABCG2抑制剂FTC购自Sigma公司。Tariquidar由北京科技大学李旭琴试验室合成(如试验例1)。
试验方法
K562/P-gp和K562/ABCG2细胞接种于24孔板，于DMEM培养基(含10％胎牛血清，100unit/ml的青霉素及链霉素，2mg/mL的G418)中培养，培养条件为37℃、5％二氧化碳。用本发明化合物及阳性对照药Tariquidar预处理10分钟后，分别加入0.5g/mL PE标记的抗P-gp抗体UIC2、PE偶联的抗ABCG2抗体5D3或PE偶联的小鼠IgG2b阴性对照抗体，继续孵育45分钟。1M PSC833和5M FTC被用作阳性对照，标记最大抑制作用。选择针对P-gp无效的本发明化合物(12和3)作为阴性对照。各组中荧光强度的差异使用学生检验(Student’s t-test)进行统计学分析，*p<0.05表示差异具有统计学意义。样品使用流式细胞仪(BDBiosciences，San Jose，CA)进行检测。
试验结果
本发明化合物11、5、16能显著增加UIC2的迁移，相比于阳性对照药Tariquidar其作用分别是70.7+2.8％、47.0+1.0％、46.3+0.9％(参见图5)。同样地，试验结果表明本发明化合物16可以产生显著增加5D3的迁移，相比于阳性对照药Tariquidar其作用是118.6+7.4％(参见图6)。提示本发明化合物与P-gp或ABCG2转运蛋白有相互作用。
试验例7本发明化合物对P-gp和ABCG2的ATP酶活性的影响
P-gp和ABCG2的药物转运活性跟转运蛋白的底物或抑制剂调节的ATP水解有关。为了进一步了解本发明化合物对P-gp和ABCG2的抑制机理，在不同浓度化合物中测试了两种转运蛋白的钒酸酯-敏感的ATP酶活性。
试验材料
P-gp或ABCG2过表达的细胞粗制膜由Dr Suresh Ambudkar提供(美国国立癌症研究所)，所用检测化学试剂均购自Sigma公司。Tariquidar由北京科技大学李旭琴实验室合成(如试验例1)。
试验方法
在加入或不加入原钒酸钠(检测p-gpATP酶时加0.3μM，检测ABCG2ATP酶时加1.2μM)的条件下，向P-gp或ABCG2过表达的细胞粗制膜中加入系列浓度(0-1000nM)的本发明化合物或阳性对照药Tariquidar，然后于ATP酶检测缓冲液(50mM氯化钾，5mM叠氮钠，2mM乙二胺四乙酸，10mM氯化镁，1mM二硫苏糖醇，pH 6.8)中反应5分钟。之后加入5mM Mg-ATP(终体积为60μL)开始ATP水解反应，37℃孵育20分钟(P-gp)或10分钟(ABCG2)。然后，加入SDS溶液(10％SDS，终体积为30μl)终止反应。加入检测试剂(35mM钼酸铵，15mM醋酸锌，10％抗坏血酸)，于37℃孵育20分钟，于750nm检测吸光度(OD值)(伯乐uQuant全波长酶标仪)。使用梯度稀释的无机磷酸盐标准品绘制标准曲线。释放的无机磷酸盐数量根据标准曲线测定。通过比较原钒酸钠存在与不存在 条件下化合物促进无机磷酸盐释放量的差异测定本发明化合物及Tariquidar对P-gpATP酶或ABCG2ATP酶活性的影响。
试验结果
图7显示本发明化合物对P-gp ATP酶的活性抑制作用，可知其与阳性对照药Tariquidar接近，本发明化合物11、5、16以浓度依赖的方式抑制P-gp ATP酶活性，这些化合物的最大P-gp ATP酶抑制相对强弱与它们对P-gp外排的抑制效果一致。另一方面，图8显示本发明化合物对ABCG2ATP酶的活性促进作用，可知本发明化合物16也与Tariquidar类似，具有促进ABCG2ATP酶活性的作用，证明它们是ABCG2的特异性底物，对ABCG2其它底物具有竞争性抑制作用，其趋势与它们的ABCG2抑制活性一致。

Claims (19)

1.一种通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，
其中：
R1和R2彼此相同为-S(O)2R7，或者R1为-C(O)R8且R2为氢；
R3和R4相同或不同，彼此独立地选自氢、卤素、C1～6烷基或C1～6烷氧基；
R5和R6相同或不同，彼此独立地选自氢、卤素、C1～6烷基或C1～6烷氧基；
R7选自C6-10芳基，所述C6-10芳基任选进一步被一个或多个选自卤素、C1～4烷基、C1～4卤代烷基的基团取代；
R8选自C1～4烷氧基、或C2～6烯基，所述C1～4烷氧基或C2～6烯基进一步被芳基取代。
2.根据权利要求1所述的通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3和R4彼此相同。
3.根据权利要求1或2所述的通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5和R6彼此相同。
4.根据权利要求1所述的通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中R7选自苯基或萘基，所述苯基或萘基任选进一步被一个或多个选自卤素、C1～4烷基、C1～4卤代烷基的基团取代。
5.根据权利要求4所述的通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其为通式(III)所示的化合物或其药学上可接受的盐，
其中，
R选自氢、卤素、C1～4烷基、C1～4卤代烷基，
n为1至3的整数，
R3～R6如权利要求1所定义。
6.根据权利要求1所述的通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐，其中所述化合物选自：
7.一种制备根据权利要求1所述的通式(I)所示的化合物或其药学上可接受的盐的方法，其包括以下步骤：
第一步：将式Ia的化合物制成酰氯，然后与式Id的芳胺反应，得到式Ib的化合物；
第二步：将式Ib的化合物用Pd/C，甲酸铵还原得到式Ic的化合物；
第三步：将式Ic的化合物在吡啶的催化下与磺酰氯或酰氯反应得到通式(I)化合物；
或者，第一步直接使用式Ie的靛红酸酐在酸性条件下与式Id的芳胺反应，然后经磺酰氯或酰氯酰化得到通式(I)的化合物，
其中：R1～R6如权利要求1中所定义。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其中使用靛红酸酐与式Id的芳胺反应的酸性条件由乙酸提供。
9.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1-6任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂。
10.根据权利要求1-6任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自肝癌、结肠癌。
11.根据权利要求9所述的药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途，其中所述癌症选自肝癌、结肠癌。
12.根据权利要求10或11所述的用途，其中所述癌症为多药耐药癌症。
13.根据权利要求10或11所述的用途，其中所述药物可以包含另一种治疗有效成分，所述另一种治疗有效成分选自抗癌剂。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述抗癌剂选自紫杉醇、Daunrubicin、丝裂霉素C、喜树碱的半合成衍生物、雌激素类药、鬼臼毒素类药物、抗生素类抗癌药。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述喜树碱的半合成衍生物选自拓扑替康、长春碱、或长春新碱。
16.根据权利要求14所述的用途，其中所述雌激素类药选自雌二醇。
17.根据权利要求14所述的用途，其中所述鬼臼毒素类药物选自鬼臼噻吩甙。
18.根据权利要求14所述的用途，其中所述抗生素类抗癌药选自阿霉素、米托蒽醌、柔红霉素、和放线菌素D。
19.根据权利要求12所述的用途，其中所述多药耐药癌症与P-gp或ABCG2的过度表达相关。
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