CN112979578A - 一类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一类化合物及其制备方法和用途，属于药学技术领域，该化合物为式I或式II所示的化合物，或其药学上可接受的盐或酯，及其在制备预防和/或治疗与肺癌有关疾病的药物中的应用。

Description

一类化合物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一类化合物及其制备方法和用途，属于药学技 术领域。
背景技术
信号转导子和转录激活因子3(STAT3)与人类癌症的发生和发展密切相关。研究发现STAT3的 异常激活会导致癌症转移，但是，临床上并没有相关STAT3抑制剂用于癌症治疗。
发明内容
LY1是一种新型有效的STAT3小分子抑制剂，是抗肿瘤候选新药。化学名为3-((2-(哌嗪-1- 基)苯基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物，在STATs家族成员中具有高度选择性， 可以特异性抑制STAT3 Tyr-705位点的磷酸化，从而阻断STAT3信号传导传递过程。研究表明LY1 可以有效抑制结肠癌细胞系和肺癌细胞系的增殖，集落形成，迁移和侵袭，动物实验中，通过口服给 药有明显的肿瘤抑制活性，同时在多次有效剂量下，它不会引起明显的毒性。结构式如下：
Figure BDA0002945233110000011
因此LY1可以通过阻断STAT3信号通路抑制肿瘤的生长和转移，可能成为癌症的治疗药物。
本发明合成一系列结构类似，抗肿瘤活性强、对新冠肺炎有效的化合物。
本发明提供一系列化合物的制备方法，该制备方法高效实用经济、生产周期短，收率较高，易于 工业化生产。
本发明验证了系列化合物抗肿瘤活性，对化合物LY-1进行了系统的验证，为抗肿瘤药物、抗新 冠药物提供潜在药物分子。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种化合物，所述化合物的结构式如下
Figure BDA0002945233110000021
本发明采用的技术方案为：
第一方面，提供一类化合物，为式I或式II所示的化合物，或其药学上可接受的盐或酯：
Figure BDA0002945233110000022
其中，A环可以是五、六、七元饱和或者不饱和环，环内存在一到两个杂原子，杂原子指N、O、 S；
R1为一个或多个取代基，各自独立地选自氢、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨 基、羧基或C1～C3烷氧酰基；
R2为一个或者两个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、C1～C3烷氧基、所述卤素指氟、氯、 溴或碘。
R3为取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～ C3烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘。
R4为一个或多个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、 羧基或C1～C3烷氧酰基，芳香族、杂芳族、环或杂环，所述卤素指氟、氯、溴或碘、
Figure BDA0002945233110000023
Figure BDA0002945233110000024
在一些实施例中，A环吡咯基、咪唑基、吡唑基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、四氢呋喃基、 噻唑基、苯环、、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、
Figure BDA0002945233110000025
作为优选为 苯环。所述R1为一个或多个取代基，各自独立地选自氢、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝 基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基，作为优选为氢。
所述R2为一个或者两个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、C1～C3烷氧基、或C1～C3 烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘，作为优选为甲基。
所述R3为取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基 或C1～C3烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘，作为优选为氢、甲基、羟基、卤素。
所述R4为一个或多个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、 氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基，芳香族、杂芳族、环或杂环，
Figure BDA0002945233110000031
Figure BDA0002945233110000032
所述卤素指氟、氯、溴或碘，、作为优选为
Figure BDA0002945233110000033
在上述优选的基础上，化合物为3-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5- 酮1,1-二氧化物，简称化合物LY1，结构式如下
Figure BDA0002945233110000034
药理实验证明，发现该化合物对新冠病毒有明显的抑制作用。
本发明的目的之一在于提供式I/式II通式所示的化合物的制备方法，合成路线如下：
Figure BDA0002945233110000035
本发明的另一目的在于提供化合物LY1的制备方法，合成路线如下：化合物LY1的制备方法， 其特征在于，合成路线如下：
Figure BDA0002945233110000041
包括：
(1)(化合物1)1-萘磺酰氯经取代反应制得(化合物2)1-萘磺酰胺；
(2)(化合物2)1-萘磺酰胺经氧化反应制得(化合物3)5，8-二氧代-二氢萘；
(3)(化合物3)5，8-二氧代-二氢萘再与(化合物4)叔丁基4-(2-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸酯发 生取代反应得到(化合物5)(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌 嗪-1-羧酸叔丁酯)；
(4)(化合物5)(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1- 羧酸叔丁酯)氨基脱保护得到目标化合物(化合物LY1)4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨)-5H-萘并[1，8-cd] 异噻唑-5-酮1，1-二氧化物。
进一步的，步骤(1)具体是指：将化合物1加入到盛有溶剂的反应器中，搅拌，在冰浴中滴加 0℃的氨水，滴加完毕后，薄层跟踪检测反应，反应完成后，减压蒸馏，析出固体，过滤，真空干燥， 得化合物2。
优选的，所述的溶剂为非质子性溶剂中的一种或几种。
步骤(2)具体是指：将(化合物2)1-萘磺酰胺加入盛有有机溶剂的反应器中，控温65℃-70℃ 并搅拌；将十倍当量硫酸高铈用2mol/L的稀硫酸溶解，控温65℃-70℃并搅拌，缓慢滴加入至体系中， 从滴加开始计时，25-35分钟后停止反应，放置冷却后抽滤，随后在滤液中加入二氯甲烷萃取，取二 氯甲烷层，真空干燥，得5，8-二氧代-二氢萘。作为更优选，温度为65℃，反应时间为27分钟。
进一步的，步骤(2)中，所述有机溶剂为冰乙酸、三氟醋酸中的一种或几种。
步骤(3)具体是指：将化合物3、化合物4与催化剂用冰乙酸溶解，常温下搅拌反应25-30小时； 减压蒸馏除去溶剂，得粗品，粗品经纯化得化合物5；
所述催化剂为一水合乙酸铜、三氯化铈、三乙胺中的一种或几种；更优选为一水合乙酸铜。
步骤(4)具体是指：化合物5脱去氨基保护得到化合物LY1；具体包括：用有机溶剂二氯甲烷 溶解化合物5，通入盐酸气体，室温搅拌，薄层跟踪检测反应；反应结束后，过滤，即得化合物LY1。
步骤(4)中，所述有机溶剂为二氯甲烷、氯仿，二氧六环中的一种或几种。
优选的，步骤(3)中，粗品经纯化得化合物5，包括：
在粗品中加入无水乙醇，110℃加热沸腾，液相监测反应产物全部转化后，停止加热，自然冷却 搅拌6h，过滤得滤饼，柱层析后，加入10倍当量的有机溶剂完全溶解后，滴加入25倍当量的醇类 有机溶剂，旋蒸后除去有机溶剂，待晶体全部析出，过滤得化合物5。
进一步的，纯化过程中，所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或几种，优选为二氯甲烷； 醇类有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种，优选为异丙醇。
本发明还要求保护一种化合物，所述化合物的结构式如下
Figure BDA0002945233110000051
采用上述的制备方法制得。
本发明提供的化合物LY1系列化合物的制备纯化方法，制备方法简单，成本低，收率高，以萘 磺酰氯为原料，以较低的成本方便地制备了有良好抗肿瘤活性的化合物LY1。
第三方面，提供所述的化合物在制备预防和/或治疗与肿瘤有关疾病的药物中的应用，与肿瘤有 关疾病尤其是肺癌。
该化合物通过高特异性与高结合亲和力来抑制STAT3的活化，用作STAT3抑制剂。
能够作为特异性的抑制STAT3靶基因的表达的药物。
能够作为治疗STAT3介导的疾病的药物。
能够作为治疗包括肺癌、乳腺癌和结直肠癌、新型冠状病毒肺炎在内的癌症的药物。
能够作为治疗包括结直肠癌，肺癌、新型冠状病毒肺炎在内的对STAT3抑制剂类药物或者吉非 替尼产生耐药性的疾病的药物。
其中化合物LY1效果尤佳。
附图说明
图1为：MTT法结果显示A549/GR和PC-9/GR细胞对吉非替尼的敏感度升高；
图2为：经过LY1处理，A549/GR和PC-9/GR细胞的耐药指数(RI)为54.06和43.68；
图3为：STAT3敲除抑制了A549/GR和PC-9/GR细胞中的集落形成；
图4为：在LY1处理之后，A549和PC-9的细胞存活率以剂量依赖性方式显着降低；
图5为：在LY1处理之后，A549和PC-9的p-STAT3和ZEB1的表达被抑制；
图6为：LY1下调了A549和PC-9细胞中ZEB1，survivin，c-myc和bcl-2的mRNA水平；
图7为：LY1以剂量依赖的方式在A549和PC-9细胞中引起G2/M周期停滞；
图8为：LY1处理后，所有血细胞指数均维持在正常范围内；
图9为：与吉非替尼联合使用LY1显著降低了细胞存活率，抑制了A549/GR和PC-9/GR的增 殖；
图10为：LY1加吉非替尼在A549/GR和PC-9/GR细胞中具有更多的侵袭抑制作用；
图11为：联合药物组(LY1+吉非替尼)中的A549/GR细胞源性异种移植肿瘤的体积比单独使 用LY1或吉非替尼治疗的肿瘤小；
图12为：LY1加吉非替尼组的总生存率高于LY1或吉非替尼组；
图13为：联合药物组的肿瘤重量明显小于LY1或吉非替尼组；
图14为：LY1加吉非替尼组的总生存率高于LY1或吉非替尼组；
图15为：经过LY1处理后，在肿瘤中ZEB1和p-STAT3的表达显着降低。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本 发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
一、化合物及其制备
前体准备
1)、制备1-萘磺酰胺
Figure BDA0002945233110000061
将1-萘磺酰氯(5g，21.9mmol)加入到盛有200ml丙酮的1L圆底烧瓶中，搅拌，在冰浴中滴加240 ml 0℃的氨水，滴加完毕后，薄层跟踪检测反应，反应完成后，减压蒸馏出有机溶剂和氨水分解出的 氨气，析出固体，过滤，真空干燥，得1-萘磺酰胺(4.35g，收率96.7％)。该化合物无需进一步纯化， 直接用于下一步反应。实验数据如下：
Mp 147～149℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.65(d,J＝8.5Hz,1H),8.19(d,J＝8.2Hz,1H), 8.14(d,J＝6.8Hz,1H),8.08(d,J＝7.4Hz,1H),7.76–7.59(m,5H).HR-MS(ESI)calcd for C10H9NO2S [M+Na]+230.0246,found 230.0244
2)、制备5，8-二氧代-二氢萘
Figure BDA0002945233110000071
将无水硫酸高铈(160g，677.45mmol)用750ml 2mol/L稀硫酸溶解，控温65℃。将1-萘磺酰胺 (10g，48.49mmol)加入盛有200ml冰乙酸的500ml圆底烧瓶中，控温65℃，该温度下搅拌，缓慢滴 加入至硫酸高铈水相体系中，从滴加开始计时，薄层色谱监测，27分钟后停止反应，待反应液冷却后， 过滤，滤液用1200ml二氯甲烷萃取，干燥除水后低压旋蒸，得到淡黄色固体，真空干燥，得5，8-二 氧代-二氢萘(6.72g，收率58.43％)。直接用于下一步反应无需纯化。实验数据如下：
Mp 186～188℃.HR-MS(ESI)calcd for C10H7NO4S[M+Na]+259.9988,found259.9989
实施例1
Figure BDA0002945233110000072
1.1制备(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)
Figure BDA0002945233110000081
将5，8-二氧代-二氢萘(56.5g，238.17mmol)、叔丁基4-(2-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸酯(60g， 217.90mmol)与一水合乙酸铜(5.6g，28.05mmol)加入到盛有1200ml冰乙酸的2L圆底烧瓶中，25℃反应， 该温度下搅拌反应26小时；减压蒸馏除去溶剂，得粗品。
在粗品中加入1500ml的无水乙醇，110℃加热沸腾，液相监测反应产物全部转化后，停止加热， 自然冷却搅拌6h，过滤得滤饼，柱层析后除去一般杂质，后加入10倍当量的二氯甲烷完全溶解后，缓 慢滴加25倍当量的异丙醇，33℃低压旋蒸后除去相同量的二氯甲烷，待晶体全部析出，过滤，得紫红 色晶体，低压干燥得4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸 叔丁酯，纯度为97％.(67.53g，收率83％)。
实验数据如下：
Mp 189～190℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.85(s,1H),8.39(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.29(dd, J＝7.8,1.3Hz,1H),8.05(t,J＝7.8Hz,1H),7.46–7.40(m,3H),7.23(d,J＝4.2Hz,2H),6.12(s,1H), 3.45(t,J＝4.8Hz,4H),2.82(t,J＝5.0Hz,4H),1.40(s,9H).HR-MS(ESI)calcd for C25H28N4O6S,[M+Na] + 535.1622, found 535.1619
1.2制备4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)胺)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1-二氧化物
Figure BDA0002945233110000082
将(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(2g， 3.78mmol)加入到盛有2ml二氯甲烷的50ml圆底烧瓶中，随后通入盐酸气，薄层跟踪检测反应；反应 结束后，过滤得滤饼，减压干燥分离出4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)胺)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1- 二氧化物(1.95g，收率97％)。实验数据如下：
Mp 200～201℃.1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：9.11(s，1H)，8.74(s，2H)，8.42(d，J＝7.4Hz，1H)，8.08(m，2H)，7.44(d，J＝7.8Hz，1H)，7.32(t，J＝7.7Hz，1H)，7.28–7.19(m，2H)，5.86 (s，1H)，3.18–3.10(m，8H).HR-MS(ESI)calcd for C20H18N4O3S,[M+H]+395.1172,found 395.1171 实施例2
Figure BDA0002945233110000091
2.1制备(1,4-二氧代5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)-烟酸
Figure BDA0002945233110000092
将5，8-二氧代-二氢萘1(237mg,1mmol)、5-氨基烟酸(172mg,1.2mmol).与一水合乙酸铜(20mg, 0.1mmol)加入到盛有5ml冰乙酸的25ml圆底烧瓶中，加热回流，该温度下搅拌反应3小时；减压蒸 馏除去溶剂，液相色谱分离出3-(萘-2-基氨基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物(221mg，收 率71％)。
实验数据如下
1H NMR(500MHz,DMSO):δ8.31(s,1H),8.04(d,J＝7.6Hz,1H),7.98(d,J＝2.5Hz,1H),7.94(d, J＝7.5Hz,1H),7.78(t,J＝7.5Hz,1H),7.44(s,1H),7.40(s,2H),5.62(s,1H),5.34(s,2H).HRMS(ESI) for C16H11N3O6SNa[M+Na]+:calcd,396.0266；found,396.0270.
实施例3
Figure BDA0002945233110000093
3.1制备(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)
Figure BDA0002945233110000101
将5，8-二氧代-二氢萘(0.5g，2.11mmol)、叔丁基4-(2-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸酯(0.787g，2.53mmol) 与一水合乙酸铜(42mg，0.21mmol)加入到盛有12ml冰乙酸的25ml圆底烧瓶中，118℃加热回流，该 温度下搅拌反应3小时；减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离出化合物(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺 酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(0.568g，收率51％)。实验数据如下：
Mp 189～190℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.85(s,1H),8.39(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.29(dd, J＝7.8,1.3Hz,1H),8.05(t,J＝7.8Hz,1H),7.46–7.40(m,3H),7.23(d,J＝4.2Hz,2H),6.12(s,1H), 3.45(t,J＝4.8Hz,4H),2.82(t,J＝5.0Hz,4H),1.40(s,9H).HR-MS(ESI)calcd for C25H28N4O6S,[M+Na] + 535.1622, found 535.1619
3.2制备4-((2-(哌嗪-1-基)苯基)胺)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1-二氧化物
Figure BDA0002945233110000102
将(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(200 mg，0.378mmol)加入到盛有2ml二氯甲烷的10ml圆底烧瓶中，随后加入2ml三氟醋酸，室温搅拌， 薄层跟踪检测反应；反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离出化合物制备4-((2-(哌嗪-1-基) 苯基)胺)-5H-萘并[1，8-cd]异噻唑-5-酮1，1-二氧化物(149mg，收率95％)。实验数据如下：
Mp 200～201℃.1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δ：9.11(s，1H)，8.74(s，2H)，8.42(d，J＝7.4Hz， 1H)，8.08(m，2H)，7.44(d，J＝7.8Hz，1H)，7.32(t，J＝7.7Hz，1H)，7.28–7.19(m，2H)，5.86 (s，1H)，3.18–3.10(m，8H).HR-MS(ESI)calcd for C20H18N4O3S,[M+H]+395.1172,found 395.1171。
实施例4
Figure BDA0002945233110000111
制备7-((4-羟苯基)氨基)-5,8-二氧-5,8-二氢萘-1-磺酰胺
Figure BDA0002945233110000112
将5，8-二氧代-二氢萘(100mg，0.421mmol)、4-氨基苯酚(55.2mg，0.506mmol)与一水合乙酸 铜(16.83mg，0.084mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入5ml冰乙酸，使之溶解，在室温下反应3小时， 反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离得到7-((4-羟苯基)氨基)-5,8-二氧-5,8-二氢萘-1- 磺酰胺。
实验数据如下.
1H NMR(400MHz,DMSO)δ9.67(s,1H),)δ9.63(s,1H)8.39(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.07(dd,J ＝7.8,1.3Hz,1H),8.05(t,J＝7.8Hz,1H)7.23(d,J＝4.2Hz,2H))6.93(s,1H)7.23(d,J＝4.2Hz,2H), 5.88(S,H)HR-MS(ESI)calcd forC16H12N2O5S,[M+H]345.0467,found 345.0460
实施例5
Figure BDA0002945233110000113
5.1制备3-((4-(二乙氨基)苯基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物
Figure BDA0002945233110000114
将5,8-二氧代-二氢萘3(300mg，1.26mmol)、N,N-二乙基对苯二胺4(249.26mg，1.52mmol)与 一水合乙酸铜(20mg，0.1mmol)加入到盛有15ml冰乙酸的100ml圆底烧瓶中，室温下搅拌24小时； 减压蒸馏除去溶剂，加入无水乙醇加热，冷凝回流，将大部分溶剂蒸去后过滤，柱层析分离滤饼出3- ((4-(二乙氨基)苯基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物(37mg，收率7.67％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.66(s,1H),8.39(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.07(dd,J＝7.8,1.3Hz, 1H),8.05(t,J＝7.8Hz,1H)7.20(d,J＝8.9Hz 2H),6.78–6.70(d,J＝8.9Hz,2H),5.99(s,1H),3.37(d, J＝7.0Hz,4H),,1.11(t,J＝7.0Hz,6H).HR-MS(ESI)calcdforC20H19N3O3S,[M+H]382.1147,found 382.1147
实施例6
Figure BDA0002945233110000121
6.1制备3-((2-氨基苯基)氨基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物
Figure BDA0002945233110000122
将5,8-二氧代-二氢萘1(237mg,1mmol)、1,2-二氨基苯胺(130mg,1.2mmol)。与一水合乙酸 铜(20mg,0.1mmol)加入到盛有10ml冰乙酸的50ml茄形瓶中，室温搅拌反应16小时；减压蒸馏 除去溶剂，液相色谱测得3-((2-氨基苯基)氨基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物(234mg， 收率72％)
实验数据如下；黄色粉末状固体mp(262℃-267℃).1H NMR(300MHz,DMSO)δ8.70(dd,J＝1.0 Hz,2H),8.24-7.90(m,7H),7.23(s,1H),6.43-6.58(m,1H) HRMS(ESI)ofC16H12N3O3S[M+H]+326.0
实施例7
Figure BDA0002945233110000123
7.1制备3-(4-氟-2-(三氟甲基)苄基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物
Figure BDA0002945233110000131
将5，8-二氧代-二氢萘1(100mg)、4-氟-2-(三氟甲基)苯胺(90.6mg).与一水合乙酸铜(28.4mg)加 入到盛有5ml冰乙酸的25ml圆底烧瓶中，加热回流，该温度下搅拌反应34小时；反应结束后，得到产 物粗产品47.6mg(收率47.6％)。随后加入DCM溶解后加入5g100目硅胶制砂，制砂结束后进行柱层 析分离纯化。分离结束后得到初步纯化产物，进LC-MS中分析得到里面有397分子量产物，可以进一 步纯化。进一步柱层析纯化得到纯化后产物3-(4-氟-2-(三氟甲基)苄基)-5H-萘[1,8-cd]异噻唑-5- 酮1,1-二氧化物26.2mg(收率26.2％)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.20(s,1H),8.37(d,J＝7.6Hz,1H),8.26(d,J＝7.6Hz,1H),8.02 (t,J＝7.6Hz,1H),7.64(dd,J＝8.8,5.1Hz,3H),5.76(s,1H),HRMS(ESI)of C17H8F4N2O3S[M+H] 397.3152
实施例8
Figure BDA0002945233110000132
8.1制备3-((6-氟吡啶-3-基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd]异噻唑-5-酮1,1-二氧化物
Figure BDA0002945233110000133
将5，8-二氧代-二氢萘(100mg，0.421mmol)、2-氟-5氨基吡啶(56.71mg，0.506mmol)与一水合 乙酸铜(16.83mg，0.084mmol)加入25mL圆底烧瓶中，加入5ml冰乙酸，使之溶解，在室温下反应3小 时，反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，液相色谱分离得到3-((6-氟吡啶-3-基)氨基)-5H-萘并[1,8-cd] 异噻唑-5-酮1,1-二氧化物。
实验数据如下
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.87(s,1H),8.64(dd,J＝7.9,1.1Hz,1H)8.37(d,J＝7.6Hz,1H), 8.26(d,J＝7.6Hz,1H),8.02(t,J＝7.6Hz,1H)7.67(dd,J＝7.4,2.7Hz,1H)7.40(d,J＝7.4Hz,1H)6.06 (s,1H)HR-MS(ESI)calcd for C15H8FN3O3S,[M+H]330.02,found330.02
实施例9
Figure BDA0002945233110000141
9.1制备N-甲基萘-1-磺酰胺
Figure BDA0002945233110000142
将1-萘磺酰氯(5g，21.9mmol)加入到盛有200ml丙酮的1L圆底烧瓶中，搅拌，在冰浴中滴加240 ml 0℃的甲胺，滴加完毕后，薄层跟踪检测反应，反应完成后，减压蒸馏出有机溶剂和氨水分解出的 氨气，析出固体，过滤，真空干燥，得N-甲基萘-1-磺酰胺(4.82g，收率95.66％)。该化合物无需进一 步纯化，直接用于下一步反应。
9.2制备N-甲基-5,8-二氢萘-1-磺酰胺
Figure BDA0002945233110000143
将无水硫酸高铈(160g，677.45mmol)用750ml 2mol/L稀硫酸溶解，控温65℃。将N-甲基萘-1- 磺酰胺(10g，48.49mmol)加入盛有200ml冰乙酸的500ml圆底烧瓶中，控温65℃，该温度下搅拌， 缓慢滴加入至硫酸高铈水相体系中，从滴加开始计时，薄层色谱监测，27分钟后停止反应，待反应液 冷却后，过滤，滤液用1200ml二氯甲烷萃取，干燥除水后低压旋蒸，得到淡黄色固体，真空干燥，得 N-甲基-5,8-二氢萘-1-磺酰胺(6g，收率54.22％)。直接用于下一步反应无需纯化
9.3 4-(2-(((8-(N-甲基氨磺酰基)-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁 酯
Figure BDA0002945233110000151
将N-甲基-5,8-二氢萘-1-磺酰胺(56.5g，238.17mmol)、叔丁基4-(2-氨基苯基)哌嗪-1-甲酸酯(60g， 217.90mmol)与一水合乙酸铜(5.6g，28.05mmol)加入到盛有1200ml冰乙酸的2L圆底烧瓶中，25℃反应， 该温度下搅拌反应26小时；减压蒸馏除去溶剂，得粗品。
在粗品中加入1500ml的无水乙醇，110℃加热沸腾，液相监测反应产物全部转化后，停止加热， 自然冷却搅拌6h，过滤得滤饼，柱层析后除去一般杂质，后加入10倍当量的二氯甲烷完全溶解后，缓 慢滴加25倍当量的异丙醇，33℃低压旋蒸后除去相同量的二氯甲烷，待晶体全部析出，过滤，得紫红 色晶体，低压干燥得4-(2-(((8-(N-甲基氨磺酰基)-1,4-二氧代-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基) 哌嗪-1-羧酸叔丁酯.(54.33g，收率78.32％)。
9.4制备N-甲基-5,8-二氧杂-7-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5,8-二氢萘-1-磺酰胺
Figure BDA0002945233110000152
将(4-(2-((1,4-二氧代-5-氨磺酰基-1,4-二氢萘-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯)(2g， 3.78mmol)加入到盛有20ml二氯甲烷的50ml圆底烧瓶中，随后通入盐酸气，薄层跟踪检测反应；反应 结束后，过滤得滤饼，减压干燥分离出N-甲基-5,8-二氧杂-7-((2-(哌嗪-1-基)苯基)氨基)-5,8- 二氢萘-1-磺酰胺(1.82g，收率98％)。实验数据如下：
1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ8.58(s,1H),8.47(dq,J＝7.9,1.4Hz,2H),7.93(t,J＝7.8Hz,1H), 7.46(tq,J＝4.6,2.7Hz,1H),7.21(t,J＝3.4Hz,3H),6.65(s,1H),6.37(s,1H),3.17(t,J＝4.6Hz,4H), 2.93(dd,J＝5.9,3.4Hz,4H),2.80(d,J＝3.0Hz,3H),2.04(s,1H)HR-MS(ESI)calcd forC21H22N4O4S, [M+H]+427.1362,found 427.1361
二、药理部分(肺癌)
1.细胞系和化学物质
人A549和PC9细胞系购自美国典型培养物保藏中心(ATCC，ATCC,Manassas,Virginia)。将 细胞维持在补充有10％胎牛血清(Gibco,American)，100μg/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM 培养基中(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,California)。将所有细胞系在37℃下在5％CO 2湿 润的条件中培养。用于功能验证实验的吉非替尼购自Selleck Chemicals。
2.MTT测定
将细胞在96孔板中接种过夜，并与指定的化合物一起孵育。化合物处理后，MTT用于检测24 小时，48小时和72小时三个时间点的细胞活力。向每个孔中加入10微升MTT，并在37℃下孵育 4小时。使用PowerWavex(BioTEK Instruments，Winooski，VT)在490nm处测量吸光度。用经处 理的细胞与经DMSO处理的细胞的吸光度比值计算细胞存活率的百分比。
3.流式细胞仪分析
将细胞铺在12孔板中过夜，并与指定的化合物一起孵育。染色15分钟后，对样品进行流式细胞 仪FACS Calibur检测(BD Bioscience，Franklin Lakes，NJ)，并使用CellQuest Pro软件(BD Bioscience， Franklin Lakes，NJ)分析细胞凋亡。凋亡早期的细胞膜联蛋白V-FITC呈阳性，PI阴性，并且两种染 色在细胞凋亡的晚期均呈阳性。
4.蛋白质印迹
使用补充了蛋白酶抑制剂(Halt Protease inhibitor cocktail，ThermoScientific)和40μg/ml PMSF (Sigma)的RIPA缓冲液制备总细胞裂解液。将细胞提取物溶解在10％SDS-PAGE中，并转移至PVDF 膜(PerkinElmer，Waltham,MA)。在室温下，将膜用含0.1％Tween-20(TBST)的5％脱脂乳在TBS 中封闭2h，然后与识别p-STAT3(Tyr705)和STAT3的一抗孵育过夜(均来自Cell Signaling，Danvers, MA)。然后将膜在TBST中洗涤三次，并与辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育1小时。连续洗涤后，使 用化学发光试剂盒(PerkinElmer，Waltham，MA)观察膜。
5.体内吉非替尼耐药NSCLC异种移植模型
这项研究是根据蚌埠医学院动物保护与使用委员会批准的指南进行的。以前，体内产生了对吉非 替尼耐药的体内NSCLC模型。将40只小鼠随机分为四组：1)运载体对照；2)50mg/kg吉非替 尼；3)LY1；4)50mg/kg吉非替尼和LY1。一旦肿瘤体积达到约25mm3，就用载体对照(5％的 二甲亚砜，50％的生理盐水和50％的PEG400)，吉非替尼和/或LY1通过口服灌胃法治疗小鼠。每周 两次进行体重和肿瘤测量，并根据以下公式计算肿瘤体积：长×宽2×0.5。实验结束时，处死小鼠，然 后切除肿瘤进行进一步分析。
6.RNA interference
按照制造商的说明，使用Lipofectamin RNAiMAX(Invitrogen，Carlsbad，CA)，将对照和STAT3 siRNA转染进吉非替尼耐药细胞。STAT3(VHS40491)和阴性通用对照(46-2001)siRNA购自Invitrogen (Carlsbad，CA)。通过蛋白质印迹分析STAT3的表达水平，作为指示时间的STAT3 siRNA转染。根 据制造商的说明，使用lipofectamine2000(Invitrogen，Carlsbad，CA)将人类STAT3 siRNA和阴性 对照siRNA(Real基因)转染到A549和PC9细胞中。将细胞孵育48小时，然后收集细胞并裂解以 进行蛋白质分析或进行细胞生存力分析。
7.STAT3 siRNA序列:
STAT3#1[sense(5’-3’):GGGACCUGGUGUGUGAAUUAUTT；antisense(5’-3’):AUAAUUCACACCAGGUCCCTT],
STAT3#2[sense(5’-3’):CCCGGAAAUUUAACAUUCUTT；antisense(5’-3’):AGAAUGUUAAAUUUCCGGGTT],
STAT3#3[sense(5’-3’):GGUACAUCAUGGGCUUUAUTT；antisense(5’-3’):AUAAAGCCCAUGAUGUACCTT].
8.线粒体膜电位检测
将细胞(10×104)悬浮在每2mL DMEM中，将细胞接种在6孔板中，孵育24小时，然后用DMSO 或吉非替尼/LY1处理细胞24小时。处理后，洗涤细胞并用冷PBS收获。根据制造商的说明，使用 JC-1细胞凋亡检测试剂盒检测了线粒体膜电位。在显微镜下(奥林巴斯，东京，日本)观察细胞。
9.活性氧分析
将A549和PC9细胞以每孔3×105个细胞的密度接种在6孔板中。用DMSO或吉非替尼/LY1处 理细胞24小时。将DCFH-DA溶于无血清培养基中，并稀释至最终浓度为10μM。LY1处理后，将细 胞与探针在37℃下孵育20分钟。收获细胞并用无血清培养基洗涤，并通过流式细胞仪分析。
实施例1.STAT3介导肺癌组织和细胞对吉非替尼的耐药性。
为了探索吉非替尼在肺癌中的耐药性，我们建立了吉非替尼耐药的A549和PC-9细胞系，分别 命名为A549/GR和PC-9/GR，并使用MTT法检测A549/GR和PC-9/GR细胞对吉非替尼的敏感 度。将细胞在96孔板中接种过夜，并与指定的化合物一起孵育。化合物处理后，MTT用于检测24 小时，48小时和72小时三个时间点的细胞活力。向每个孔中加入10微升MTT，并在37℃下孵育 4小时。使用PowerWavex(BioTEK Instruments，Winooski，VT)在490nm处测量吸光度。用经处 理的细胞与经DMSO处理的细胞的吸光度比值计算细胞存活率的百分比。结果表明，与亲本A549 和PC-9细胞相比，半数最大抑制浓度(IC50)显着提高，并且A549/GR和PC-9/GR细胞的耐药 指数(RI)为54.06和43.68(图1和2)。这表明STAT3在吉非替尼耐药中起关键作用。以上这些数 据表明STAT3可能是吉非替尼耐药的关键靶标。
实施例2.STAT3促进肺癌对吉非替尼的耐药性
此外，通过将敲除STAT3了的A549/GR和PC-9/GR细胞接种在六孔板中，孵育过夜，七天 后，细胞通过结晶紫染色并在光学显微镜下计数。我们发现与亲代A549和PC-9细胞相比，STAT3 敲除抑制了A549/GR和PC-9/GR细胞中的集落形成(图3)。此外，我们评估了STAT3敲低对细 胞侵袭和转移的影响。这些数据表明增加的STAT3水平促进了肺癌细胞的耐药性。
实施例3.LY1特异性阻止STAT3的激活
LY1是一种新型的小分子STAT3抑制剂，它与STAT3蛋白特异性结合。在LY1处理之后，A549 和PC-9的细胞存活率以剂量依赖性方式显着降低，并且p-STAT3和ZEB1的表达被抑制(图4和5)。 此外，LY1下调了A549和PC-9细胞中ZEB1，survivin，c-myc和bcl-2的mRNA水平(图6)。进 一步的结果表明，LY1以剂量依赖的方式在A549和PC-9细胞中引起G2/M周期停滞(图7)。为了 评估LY1在体内的安全性，我们在小鼠中检测到它对血液，心脏，肝脏，脾脏和肾脏的毒性。LY1 处理后，所有血细胞指数均维持在正常范围内(图8)。
实施例4.吉非替尼和LY1的组合可逆转肺癌细胞的耐药性。
为了进一步确认LY1是否使A549/GR和PC-9/GR细胞对吉非替尼敏感，我们研究了LY1与吉 非替尼联合治疗后肺癌的增殖，凋亡和转移。与单独使用吉非替尼治疗相比，与吉非替尼联合使用 LY1显著降低了细胞存活率，抑制了A549/GR和PC-9/GR的增殖(图9)。结果证明虽然单独使用 吉非替尼进行处理可在A549/GR和PC-9/GR细胞中引起一定程度的细胞死亡，但LY1与吉非替尼 组合可诱导更多的细胞死亡。此外，Transwell法证明与单独使用吉非替尼或LY1进行治疗相比，LY1 加吉非替尼在A549/GR和PC-9/GR细胞中具有更多的侵袭抑制作用(图10)。
实施例5.吉非替尼加LY1的联合治疗有效抑制体内肿瘤的进展。
鉴于体外研究结果，我们进一步评估了LY1与吉非替尼联合在异种移植模型中对A549/GR细 胞的体内抗肿瘤功效。将40只小鼠随机分为四组：1)运载体对照；2)50mg/kg吉非替尼；3) LY1；4)50mg/kg吉非替尼和LY1。一旦肿瘤体积达到约25mm3，就用载体对照(5％的二甲亚砜， 50％的生理盐水和50％的PEG400)，吉非替尼和/或LY1通过口服灌胃法治疗小鼠。每周两次进行体 重和肿瘤测量，并根据以下公式计算肿瘤体积：长×宽2×0.5。实验结束时，处死小鼠，然后切除肿 瘤进行进一步分析。联合药物组(LY1+吉非替尼)中的A549/GR细胞源性异种移植肿瘤的体积比 单独使用LY1或吉非替尼治疗的肿瘤小，并且LY1加吉非替尼组的总生存率高于LY1或吉非替尼组 (图11和12)。此外，在LY1的治疗期间，裸鼠的体重没有显着波动(图13)，但是联合药物组的 肿瘤重量明显小于LY1或吉非替尼组(图14)。为了进一步证实LY1在体内的有效性，我们检测了 p-STAT3，STAT3和ZEB1的表达。在肿瘤中ZEB1和p-STAT3显着降低(图15)。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一类化合物及其制备方法和用途
<140> 2021101952098
<141> 2021-02-20
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gggaccuggu gugugaauua u 21
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
auaauucaca ccagguccc 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cccggaaauu uaacauucu 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agaauguuaa auuuccggg 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gguacaucau gggcuuuau 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
auaaagccca ugauguacc 19

Claims (10)

1.一类化合物，为式I或式II所示的化合物，或其药学上可接受的盐或酯：
Figure FDA0002945233100000011
其中，A环为五、六、七元饱和、不饱和碳环或杂环，杂环环内存在一到两个杂原子，杂原子各自独立地选自N、O、S；
R1为一个或多个取代基，各自独立地选自氢、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基；
R2为取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、C1～C3烷氧基、或C1～C3烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘；
R3为取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基，所述卤素指氟、氯、溴或碘；
R4为一个或多个取代基，选自氢、卤素、C1～C3烷基、羟基、C1～C3烷氧基、硝基、氨基、羧基或C1～C3烷氧酰基，芳香族、杂芳族的碳环或杂环，杂环环内存在一到两个杂原子，杂原子各自独立地选自N、O、S；所述卤素指氟、氯、溴或碘；
或R4选自
Figure FDA0002945233100000012
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，
所述A环选自苯环、吡咯基、咪唑基、吡唑基、呋喃基、四氢呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、
Figure FDA0002945233100000013
优选为苯环；
和/或，所述R1为一个或多个取代基，优选为氢；
和/或，所述R2优选为甲基；
和/或，所述R3优选为氢、甲基、羟基、卤素；
和/或，所述R4为一个取代基，优选为
Figure FDA0002945233100000014
3.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，式I所示的化合物选自：
Figure FDA0002945233100000021
和/或，式II所示的化合物选自：
Figure FDA0002945233100000031
4.式I所示的化合物的制备方法，其特征在于，合成路线如下：
Figure FDA0002945233100000032
5.式II所示的化合物的制备方法，其特征在于，合成路线如下：
Figure FDA0002945233100000041
6.如权利要求1-3任一项所述的化合物在制备预防和/或治疗与肺癌有关疾病的药物中的应用。
7.化合物LY1的制备方法，其特征在于，合成路线如下：
Figure FDA0002945233100000042
8.根据权利要求7所述的化合物LY1的制备方法，其特征在于，包括：
(1)化合物1经取代反应制得化合物2；
(2)化合物2经氧化反应制得化合物3；
(3)化合物3与化合物4发生取代反应得到化合物5；
(4)化合物5脱去氨基保护得到化合物LY1。
9.根据权利要求8所述的化合物LY1的制备方法，其特征在于，
步骤(1)具体是指：将化合物1加入到盛有溶剂的反应器中，搅拌，在冰浴中滴加0℃的氨水，滴加完毕后，薄层跟踪检测反应，反应完成后，减压蒸馏，析出固体，过滤，真空干燥，得化合物2；
进一步的，所述的溶剂为非质子性溶剂中的一种或几种；
和/或，步骤(2)具体是指：将化合物2加入盛有有机溶剂的反应器中，控温65℃-70℃并搅拌；将十倍当量硫酸高铈用2mol/L的稀硫酸溶解，控温65℃-70℃并搅拌，缓慢滴加入至体系中，从滴加开始计时，25-35分钟后停止反应，放置冷却后抽滤，随后在滤液中加入二氯甲烷萃取，取二氯甲烷层，真空干燥，得5，8-二氧代-二氢萘；作为更优选，温度为65℃，反应时间为27分钟；
进一步的，步骤(2)中，所述有机溶剂为冰乙酸、三氟醋酸中的一种或几种；
和/或，步骤(3)具体是指：将化合物3、化合物4与催化剂用冰乙酸溶解，常温下搅拌反应25-30小时；减压蒸馏除去溶剂，得粗品，粗品经纯化得化合物5；
所述催化剂为一水合乙酸铜、三氯化铈、三乙胺中的一种或几种；更优选为一水合乙酸铜；
和/或，步骤(4)具体是指：化合物5脱去氨基保护得到化合物LY1；具体包括：用有机溶剂二氯甲烷溶解化合物5，通入盐酸气体，室温搅拌，薄层跟踪检测反应；反应结束后，过滤，即得化合物LY1。
10.根据权利要求9所述的化合物LY1的制备方法，其特征在于，粗品经纯化得化合物5，包括：
在粗品中加入无水乙醇，110℃加热沸腾，液相监测反应产物全部转化后，停止加热，自然冷却搅拌6h，过滤得滤饼，柱层析后，加入10倍当量的有机溶剂完全溶解后，滴加入25倍当量的醇类有机溶剂，旋蒸后除去有机溶剂，待晶体全部析出，过滤得化合物5；
进一步的，纯化过程中，所述有机溶剂为二氯甲烷、乙酸乙酯中的一种或几种，优选为二氯甲烷；醇类有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇中的一种或几种，优选为异丙醇。
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