CN109265559A - 嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的nk细胞及治疗hbv感染的应用 - Google Patents

嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的nk细胞及治疗hbv感染的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及治疗HBV感染的应用，嵌合抗原受体，包含leader核酸人工序列、HBsAg单链抗体核酸人工序列、CD8α铰链区核酸人工序列、NKG2D跨膜区核酸人工序列、2B4共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、IFN‑α核酸人工序列、RQR8分子开关区核酸人工序列。本发明针对共同“α”决定簇特异性抗体，可以识别不同亚型中的HBsAg，因此本发明Anti‑HBsAg‑IFN‑α‑CAR NK细胞对所有HBV亚型感染都有治疗作用，同时也减少治疗剂量和毒副反应。

Description

嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及治疗HBV 感染的应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及治疗HBV感染的应用。
背景技术
HBV感染是一个威胁人类健康的全球性公共卫生问题，是由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)引起的传染病。据估计，全世界大约有20亿人口曾经感染过乙型肝炎病毒，其中慢性HBV感染者达到了近2.4亿至3.5亿，其中25％的患者因HBV引起终生感染而导致肝硬化或癌症。目前公认的化学治疗方法包括干扰素-α(Interferon-α，IFN-α)和核苷类似物。核苷类似物是通过多功能逆转录酶来阻断病毒DNA的合成。口服核苷酸类似物可以有效降低病人体内HBV-DNA的水平，但存在停药后病毒爆发的危险。因此病人需要长期服药，然而长期服用核苷酸类似物又会导致抗药性的产生。干扰素能通过抑制病毒DNA复制和激活机体抗病毒免疫来达到治疗效果。但是在接受干扰素治疗的病人中只有不足10％产生持续的治疗作用。并且干扰素的副作用多(比如流感样症状、疲劳和血球计数低等)且具有严格的适应症。如何控制和清除HBV 的感染、减缓甚至终止肝硬化的发展，降低肝癌的发生率是目前医学界的重大课题。
HBV属于DNA病毒，基因组长约3200bp，是一种相当小的病毒，为部分双链环状DNA，由一条较短的正链及一条较长的负链构成，其中负链有四个开放式阅读框，即S、P、C及X区，能够编码全部的病毒蛋白，包括表面抗原(HBsAg)、核心抗原(HBcAg)、X蛋白和病毒聚合酶在内的四种蛋白。目前对于HBV的分类方法有两种，一是根据HBsAg表面抗原决定簇的不同，可以将其分为不同亚型，主要包括：adw、adr、ayw和ayr；另一个则是以据HBV全基因组序列差异性不小于8％的标准或者S因组序列差异性不小于4.2％的标准，将HBV分为 A-H八类。不同HBV基因型的分布具有明确的地域特征，我国以B型及C型为主，且南方多为C基因型，而北方多为B基因型。
HBV具有严格的种属特性主要感染人类及灵长类动物。其感染宿主肝细胞及增殖过程大致如下；HBV可以附着到细胞表面并结合进入钠离子-牛磺胆酸共转运多肽受体。期间或即刻启动进入程序，首先脱去包膜蛋白(即乙肝表面抗原HBsAg)，后脱去包膜的病毒衣壳进入肝细胞，衣壳中含有HBV松弛状的双链DNA(Relaxed circular DNA，rcDNA)，然后rcDNA被运输至细胞核。在细胞核内rcDNA一部分整合到基因组上，另一部分可以转化成共价闭合环状的超螺旋DNA分子即cccDNA，其过程是DNA聚合酶将具有缺口的rcDNA的两条链补齐，形成cccDNA。然后cccDNA作为模板，利用宿主RNA聚合II，转录生成mRNA，其中长度为3.5kb的mRNA携带HBV DNA序列的所有上遗传信息，称为前基因组RNA(Pregenomic RNA，pgRNA)。pgRNA出细胞核同P区编码的聚合酶结合，后被核心蛋白包裹，到此核衣壳形成。然后在HBV聚合酶的作用下，以pgRNA为模板，合成负链DNA，然后再以负链为模板合成正链DNA，由此产生了子代的部分双链环状DNA，最后到达内质网膜进行包膜，形成完整的HBV 被释放至肝细胞外。肝细胞质中的子代部分双链环状DNA也可进入细胞核内，再形成cccDNA并继续复制。
由于HBV病毒亚型众多，目前的嵌合抗原受体及细胞无法对不同的亚型识别，导致治疗的范围比较局限。
因此，开发新的嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及治疗HBV感染的应用，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及治疗HBV感染的应用，以识别不同亚型中的HBsAg。
第一方面，本发明提供了嵌合抗原受体，包含leader核酸人工序列、HBsAg 单链抗体核酸人工序列、CD8α铰链区核酸人工序列、NKG2D跨膜区核酸人工序列、2B4共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、IFN-α核酸人工序列、RQR8分子开关区核酸人工序列。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述嵌合抗原受体包含依序连接的
如SEQ ID NO.2所述的leader核酸人工序列；
如SEQ ID NO.3所述HBsAg单链抗体核酸人工序列；
如SEQ ID NO.4所述CD8α铰链区核酸人工序列；
如SEQ ID NO.5所述NKG2D跨膜区核酸人工序列；
如SEQ ID NO.6所述2B4共刺激区核酸人工序列；
如SEQ ID NO.7所述CD3ζ信号传导区核酸人工序列；
如SEQ ID NO.8所述T2A自剪切区核酸人工序列；
如SEQ ID NO.9所述IFN-α核酸人工序列；
如SEQ ID NO.8所述T2A自剪切区核酸人工序列；
如SEQ ID NO.10所述RQR8分子开关区核酸人工序列。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述嵌合抗原受体的核酸序列如 SEQ IDNO.1所述。
其中，分子开关RQR8是由利妥昔单抗结合的最小表位肽(R)，QBEND10 单抗结合的最小表位肽(Q)，利妥昔单抗结合的最小表位肽(R)，CD8铰链跨膜区依次串联而成(8)。利妥昔单抗和QBEND10单抗都可以通过抗体的ADCC、 CDC、直接诱导Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞凋亡，避免Anti-EGFRvIII CAR-NK 输入体内后因活性过度或活性失控而导致严重的毒副作用，如靶点毒性、细胞因子风暴和肿瘤溶解征等。
第二方面，本发明提供了嵌合抗原受体的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别按leader核酸人工序列、HBsAg单链抗体核酸人工序列、CD8 α铰链区核酸人工序列、NKG2D跨膜区核酸人工序列、2B4共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、IFN-α核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、RQR8分子开关区核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，得到pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR；
(2)将pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR进行双酶切，利用琼胶电泳将 Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit 溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段，即为嵌合抗原受体。
第三方面，本发明提供了利用嵌合抗原受体修饰的NK细胞，该NK细胞含有如上所述的嵌合抗原受体。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述NK细胞采用包括如下步骤的方法制备得到：首先将pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染免疫细胞。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR 质粒是将融合基因片段Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到的pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR 质粒采用包括如下步骤的制备方法得到：将纯化的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段在16℃进行过夜连接形成 pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒；连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA： 4μl。
本发明中，作为一种优选的技术方案，pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒采用如下步骤进行慢病毒包装：将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS培养皿中，贴壁率为70％-80％时准备转染；取无菌15ml离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：4ml；pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR 质粒：10μg；GM easyTM Lentiviral Mix：10μl(10μg)；HG TransgeneTM Reagent：60μl；混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养；转染24小时后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10％血清新鲜的培养基继续培养； 48h后吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45 μm滤器过滤后转移到新的离心管中；上清液中即含有慢病毒包装后的 pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒。
第四方面，本发明提供了嵌合抗原受体的应用，是指嵌合抗原受体在制备治疗HBV感染方面的药物中的应用。所述药物形式包括但不限于试剂盒。
在本发明中，作为一种优选的技术方案，该试剂盒，包括
(1)获得如上所述的稳定表达Anti-HBsAg-IFN-α-CAR的载体；
(2)载体稀释液。
由于采用以上技术方案，本发明具有如下有益效果：
HBV表面蛋白质或抗原(HBsAg)是由preS(preS1和preS2)区域及S区域的基因通过三种起始密码子各自进行交替翻译编码的三种包膜蛋白(L蛋白，M蛋白和S蛋白)是感染HBV后最早出现在血液中的标志物，并且持续表达在感染的肝细胞表面。L-HBsAg是约400个氨基酸组成(根据乙肝不同亚型， ay型389个，ad型400个)，包括preS1域，preS2域及S域；M-HBsAg是由 281个氨基酸组成，包括S和preS2区域；S-HBsAg由226个氨基酸组成，仅包括S区域，包括N端(aa 1-99)，主要亲水区(aa 100-169)和C端(aa 170-226)，其中“α”决定簇(aa124-147)位于主要亲水区内“α”决定簇位于HBsAg 第124-147号氨基酸残基，由3个二硫键连接5个半胱氨基残基组成。“α”决定簇高度保守，为所有亚型所共有。其作用在于维持HBsAg的稳定性、空间构象及免疫原性。此外，免疫应答细胞和抗体通过定位这个区域以识别HBsAg，从而对所有HBV亚型产生抵抗力。其中通过二硫键连接所形成的两个环就是单克隆抗体定位的结构区域。第一环位于第124-137号氨基酸残基，而第二环位于第139-147号氨基酸残基。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)修饰的T细胞免疫疗法是当前过继性细胞治疗技术中最新技术之一，实现了从基础免疫学机制研究到临床免疫治疗应用的进步。近年来，应用CAR-T技术治疗肿瘤取得了突破性进展，特别是靶向CD19识别B细胞的CAR-T技术，在治疗急性和慢性白血病方面取得了很好的效果。该技术也可应用于抗病毒治疗，包括HIV-1和HCV (hepatitis C virus)等病毒感染的治疗。以HIV-1感染的治疗为例，该技术的具体过程是通过将HIV-1特异性的单链抗体的可变区(single-chain variablefragment，scFv))或天然的CD4分子中的抗原识别/结合区域连接到CD8+T淋巴细胞受体的胞内T细胞激活区域产生了HIV-1特异性的CAR-T 细胞，该细胞可以杀伤表达HIV-1包膜蛋白的细胞。因此，以为HBsAg靶点嵌合抗原受体为基础的细胞免疫治疗新策略会给HBV感染患者带来新的希望。
本发明就是根据以上原理进行设计，嵌合抗原受体的单链抗体是针对共同“α”决定簇特异性抗体，可以识别不同亚型中的HBsAg，因此本发明 Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞对所有HBV亚型感染都有治疗作用。
本发明嵌合抗原受体经逆转录后表达在NK细胞表面，使NK细胞能够识别并裂解HBsAg阳性的肝细胞，最重要的是，本发明Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK 细胞回输到HBV感染的小鼠体内，肝内会聚集大量的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞。并且本发明的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞可以完全清除HBV耐受小鼠血清中HBsAg，降低HBV DNA含量。
本发明Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞可以表达IFN-α，使之成为乙肝导向干扰素。它是以Anti-HBsAg-CAR-NK作为导向载体，将重组IFNα特异性地导向受HBV感染的肝细胞。Anti-HBsAg-CAR-NK本身有助于清除细胞的病毒感染，介导干扰素治疗可发挥两者的协同作用，大大减少治疗剂量和毒副反应，提高治愈率，在理论上认为这种导向治疗可以取得高效低毒的效果。
综上所述，本发明针对共同“α”决定簇特异性抗体，可以识别不同亚型中的HBsAg，因此本发明Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞对所有HBV亚型感染都有治疗作用，同时也减少治疗剂量和毒副反应。
附图说明
图1为本发明所述嵌合抗原受体Leader-scFv(HBsAg)-CD8α -NKG2D-2B4-CD3ζ-T2A-IFN-α-T2A-RQR8原理设计图。
图2为本发明Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞的表达Anti-HBsAg-IFN- α-CAR的效率为55.6％(右为流式峰图，左为散点图)。
图3为对照组、Anti-HBsAg-CAR NK细胞组与Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK 细胞组杀伤靶细胞对比图。
图4为对照组、Anti-HBsAg-CAR NK细胞组与Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK 细胞组治疗HBV感染小鼠方案图。
图5为对照组、Anti-HBsAg-CAR NK细胞组与Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK 细胞组的HBV感染小鼠肝组织定位对比图。
图6为对照组、Anti-HBsAg-CAR NK细胞组与Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK 细胞组的HBV感染小鼠HBV DNA水平对比图。
图7为对照组、Anti-HBsAg-CAR NK细胞组与Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK 细胞组的HBV感染小鼠血清中HBsAg抗原水平对比图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明技术方案进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
嵌合抗原受体，如图1所示，包含leader核酸人工序列、HBsAg单链抗体核酸人工序列、CD8α铰链区核酸人工序列、NKG2D跨膜区核酸人工序列、 2B4共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、IFN-α核酸人工序列、RQR8分子开关区核酸人工序列。
其中，RQR8核酸序列具有如SEQ ID NO.10所述的核酸序列。RQR8是由信号肽核酸序列、CD20的模拟表位核酸序列、CD34的模拟表位核酸序列、CD20 的模拟表位核酸序列、CD8铰链跨膜区核酸序列依次串联而成，完整核酸序列见SEQ ID NO.10。委托生工生物工程(上海)有限公司合成该核苷酸序列。
本实施例中，所述嵌合抗原受体包含依序连接的如SEQ ID NO.2所述的 leader核酸人工序列；如SEQ ID NO.3所述HBsAg单链抗体核酸人工序列；如SEQ ID NO.4所述CD8α铰链区核酸人工序列；如SEQ ID NO.5所述NKG2D 跨膜区核酸人工序列；如SEQ ID NO.6所述2B4共刺激区核酸人工序列；如 SEQ ID NO.7所述CD3ζ信号传导区核酸人工序列；如SEQ IDNO.8所述T2A 自剪切区核酸人工序列；如SEQ ID NO.9所述IFN-α核酸人工序列；T2A自剪切区核酸人工序列；如SEQ ID NO.10所述RQR8分子开关区核酸人工序列。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述嵌合抗原受体的核酸序列如 SEQ IDNO.1所述。
实施例2
嵌合抗原受体的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别按leader核酸人工序列、HBsAg单链抗体核酸人工序列、CD8 α铰链区核酸人工序列、NKG2D跨膜区核酸人工序列、2B4共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、IFN-α核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、RQR8分子开关区核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，得到pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR；
(2)将pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR进行双酶切，利用琼胶电泳将 Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit 溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段，即为嵌合抗原受体。
在本实施例中，更详细的说，嵌合抗原受体的制备方法，步骤如下：
分别按Leader核酸人工序列、HBsAg单链抗体核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、NKG2D跨膜区核酸人工序列、2B4共刺激区核酸人工序列、CD3 ζ信号传导区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、IFN-α分子开关区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、RQR8分子开关区核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，因此命名为pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR；
同时将pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR进行Fast Digest AsiSI(购自 ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切， 37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI 酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。
利用琼胶电泳将把含有pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司) 将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后， 14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的Anti-HBsAg-IFN-α -CAR DNA片段。
实施例3
制备含有Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段的质粒，将纯化的 Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒，包括如下步骤：
分别按Leader核酸人工序列、HBsAg单链抗体核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、NKG2D跨膜区核酸人工序列、2B4共刺激区核酸人工序列、CD3 ζ信号传导区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、IFN-α分子开关区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、RQR8分子开关区核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，因此命名为pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR，同时将pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR 和pLent-C-GFP载体进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和 FastDigest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。 100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶： 3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有pUC-Anti-HBsAg-IFN- α-CAR片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段和线性化的 pLent-C-GFPDNA片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-Anti-HBsAg-IFN- α-CAR质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；Anti-HBsAg-IFN- α-CAR DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μl。
将上述pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR转化到E.coli(DH5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。
实施例4
质粒的纯化。
次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen 公司)提取pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml 菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管 4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6) 弃滤过液，加500μl BufferHBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)再加750μl WashBuffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加100μl无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上， 10000×g离心5min，收集质粒DNA。(11)和预知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒浓度为365ng/μl。
将上述的pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒委托生工生物工程(上海) 有限公司进行测序。经测序正确后备用。
实施例5
将pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒进行慢病毒包装。步骤如下：
采用Lentiviral Packaging Kit慢病毒包装试剂盒(购自吉满生物)，具体方法如下：将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染。取无菌15ml 离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：4ml；pLent-Anti-HBsAg-IFN- α-CAR质粒：10μg；GM easyTM LentiviralMix：10μl(10μg)；HG TransgeneTM Reagent：60μl。混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有 293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。转染24后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10％血清新鲜的培养基继续培养。48h后吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。此时上清液中的病毒颗粒可以直接去检测滴度。取上述100μl病毒液采用慢病毒载体(HIVP24)快速检测卡(购自北京博奥龙免疫技术有限公司)测定滴度，重组慢病毒的滴度1.25×107TU/ml。
实施例6
利用该嵌合抗原受体修饰的NK细胞，首先将pLent-Anti-HBsAg-IFN-α -CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染免疫细胞。采用如下制备方法得到：
(1)NK细胞的制备
1)血浆的提取
取脐血50ml，平均分装于2支50ml离心管中，于室温下650g离心15 min，取上层淡黄色血浆至新的50ml离心管中(下层红色液体用于提取单个核细胞)，于56℃水浴锅中灭活30min，然后900g离心10min，取上清，置于-20℃，15min，再次离心，900g，10min，取上清，置于4℃保存。(离心机调节升速1，降速1)
2)单核细胞的分离
A.取上一步血浆提取中得到的下层红色液体用生理盐水等体积稀释，总体积约20ml，颠倒混均，备用。B.另取2支新的50ml的离心管，每管加入淋巴细胞分离液20ml(购自友康恒业生物科技有限公司)。C.仔细地将20ml 稀释后的血液加入到含20ml淋巴细胞分离液的离心管中，使血液和淋巴细胞分离液形成一个明显的分层，注意不要将稀释血液混入到淋巴细胞分离液中，室温650g离心30min。C.轻轻吸取单核细胞(白膜层)以及它下面一半的淋巴细胞分离液并转移至新的50ml离心管内；加入等体积生理盐水，室温650g 离心10min。弃上清。重复清洗步骤，用生理盐水重悬细胞，同时取少量细胞悬液台盼蓝染色计数，计数后260g离心10min，弃上清，备用。
3)单核细胞的接种与诱导活化
A.第0天，细胞计数，按细胞密度2×106cells/ml接种25ml含YC005 (购自友康恒业生物科技有限公司)的NK无血清细胞培养基，添加5％比例的自体血浆，置于二氧化碳培养箱中孵育1h，再添加YC00B(购自友康恒业生物科技有限公司)，混均后继续培养。B.第三天，添加诱导因子YC00C(购自友康恒业生物科技有限公司)一支，补加50ml含YC005的NK无血清细胞培养基，添加5％比例的自体血浆。C.第5天，按照175ml补液即可，同时添加诱导因子YC00D(购自友康恒业生物科技有限公司)一支，以及添加8.75ml自体血浆。D.第7天根据密度补液，添加因子YC00E(购自友康恒业生物科技有限公司)一支以及剩余血浆。补液密度维持在0.6-0.8×106cells/ml。E. 第9天根据密度补液，补液密度维持在0.6-0.8×106cells/ml。F.第12天根据密度补液，补液密度维持在0.6-0.8×106cells/ml。培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3-、CD56+的表达率(CD3-FITC，CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3-CD56+->80％，视为NK诱导成功，并留取该 NK待病毒感染。
(2)慢病毒感染NK细胞及感染后NK细胞的扩增培养
以MOI＝5用上述重组慢病毒感染NK细胞。感染后的细胞37℃，5％CO2 培养箱中培养12小时后，收集细胞弃上清，重新加入等量病毒液，Polybrene(8 μg/ml)(购自吉满生物)和细胞培养液，37℃，5％CO2培养箱中继续培养， 12h后吸弃培养上清，重新加入新鲜CORNING培养基，继续扩大培养，培养17 天至细胞扩增至足够的用量。
通过FC500流式细胞仪(购自BECKMAN公司)FL1通道检测嵌合抗原受体表达(图2)。以未感染的NK淋巴细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染NK细胞其阳性率55.6％。
实施例7
Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞的体外杀伤活性。
表达HBsAg包膜糖蛋白细胞株293T作为靶细胞，效应细胞分别为 Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK、Anti-HBsAg-CAR NK(其结构为：Leader-scFv(HBsAg)-CD8α-NKG2D-2B4-CD3ζ-T2A-RQR8)和NK细胞。
按E：T为1：1，加入1×106个靶细胞，待细胞完全贴壁后，收集 Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK、Anti-HBsAg-CAR NK和NK细胞，分别调整细胞浓度为1×107/ml，每孔加入100μL，37℃，5％的CO2条件下培养72h。观察细胞形态，确定Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK、Anti-HBsAg-CAR NK和NK细胞对靶细胞杀伤效果。由图3可知Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK对靶细胞的杀伤效果最强，其次是Anti-HBsAg-CAR NK和NK。由此可知，重组IFN-α可以提高CAR-NK的杀伤效果，两者的结合可以发挥协同作用。
实施例8
Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞的体内杀伤活性。
慢性HBV感染模型的建立，6-8周龄C57BL/6小鼠(购自广州中医药大学，雌性，属SPF(III)级动物)，尾静脉高压注射法注射10μg pAAV/HBV1.2质粒(购自北京五加和分子医学研究所有限公司)。在感染之后4周建立稳定的 HBV耐受及慢性HBV感染模型。通过该模型，我们验证本发明的知 Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞，准备三组进行对比，分别是空白对照组、 Anti-HBsAg-CAR NK细胞组和本发明的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞组。
空白对照组不进行任何处理；
Anti-HBsAg-CAR NK细胞组：以1.5×107个细胞/次尾部注射Anti-HBsAg-CAR NK进行免疫治疗(为第0天)，从第1天起每3天注射一次 IL2(10000unit)/鼠，直至到第21天。同时，前7天每天都要注射IL15(10ng) /鼠。
本发明的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞组：以1.5×107个细胞/次尾部注射本发明Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞组进行免疫治疗，从第1天起每3天注射一次IL2(10000unit)/鼠，直至到第21天。同时，前7天每天都要注射IL15(10ng)/鼠。
注射细胞后第7天和第21天，取各组小鼠以10g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉，解剖取部分肝脏组织用40g/L中性福尔马林固定，脱水、石蜡包埋，切片，荧光显微镜下通过绿色荧光观察NK细胞在肝脏聚集的情况。并抽取小鼠静脉血采用ELISA诊断试剂盒检测血清中的HBsAg(购自上海华美生物工程公司)，采用HBV DNA荧光定量PCR试剂盒(购自广州中山大学达安基因股份有限公司) 检测HBV DNA水平。
由结果可知，与其它实验组相比，本发明的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK 细胞组的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK可以定向到乙肝病毒感染的肝细胞，并在小鼠肝内大量聚集发挥高效杀伤作用。除此之外，Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞可以完全清除HBV耐受小鼠血清中HBsAg，降低HBV DNA含量。因此本发明所制备的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR NK细胞对HBV感染具有良好的治疗效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。
序列表
<110> 山东兴瑞生物科技有限公司
<120> 嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及治疗HBV感染的应用
<130> 2018
<160> 10
<170> SIPO Sequence Listing 1.0
<210> 1
<211> 2893
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 1
ggatccgcga tcgcatggcc ctgcctgtga cagccctgct gctgcctctg gctctgctgc 60
tgcatgccgc tagacccgag gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtcaagcctg 120
gagggtccct gagactctcc tgttcagcct ctggattctc ccttactaag tacaagatga 180
cctgggtccg ccaggctcca gggaaggggc tggagtgggt ttcatcaatt agtagtacta 240
gtagagacat tgattacgca gactctgtga agggccgatt caccatctcc agggacaacg 300
ccaagaactc actgtttctg caaatgagta gcctgagagt cgatgacacg gccgtttatt 360
actgtacgag agatggatgg ctttggggat gggacgttcg gagtaactac tactacaacg 420
ccttggacgt ctggggccaa ggcaccactg tcaccgtctc ctcgggagga ggaggaagtg 480
gaggaggagg atctggagga ggaggatctg acatcgtggt gacccagtct ccatcctccc 540
tgtctgcatc tgtaggagac agagtcacca tcacttgccg ggcgagtcag ggcatttaca 600
attctatagc ctggtatcag cagaaaccag ggaaagcccc taagctcctg ctctattcta 660
catccacatt gctaagtggg gtcccatcca ggttcagtgg cagtggatct gggacggatt 720
acactctcac catcacgaac ctgcagcctg aagattttgc aacttattac tgtcaacagt 780
attttgtaac ccctgaaact tttggccagg ggaccaagct ggagatcaaa cgagctagca 840
ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt 900
ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg 960
acttcgcctg tgatccattt tttttctgct gcttcatcgc tgtagccatg ggaatccgtt 1020
tcattattat ggtagcatgg aggagaaaga ggaaggagaa gcagtcagag accagtccca 1080
aggaattttt gacaatttac gaagatgtca aggatctgaa aaccaggaga aatcacgagc 1140
aggagcagac ttttcctgga ggggggagca ccatctactc tatgatccag tcccagtctt 1200
ctgctcccac gtcacaagaa cctgcatata cattatattc attaattcag ccttccagga 1260
agtctgggtc caggaagagg aaccacagcc cttccttcaa tagcactatc tatgaagtga 1320
ttggaaagag tcaacctaaa gcccagaacc ctgctcgatt gagccgcaaa gagctggaga 1380
actttgatgt ttattccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc 1440
agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt 1500
tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc 1560
aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg 1620
ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta 1680
cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcgaaggcc 1740
gagggagcct gctgacatgt ggcgatgtgg aggaaaaccc aggaccaatg gccttgacct 1800
ttgctttact ggtggccctc ctggtgctca gctgcaagtc aagctgctct gtgggctgtg 1860
atctgcctca aacccacagc ctgggtagca ggaggacctt gatgctcctg gcacagatga 1920
ggagaatctc tcttttctcc tgcttgaagg acagacatga ctttggattt ccccaggagg 1980
agtttggcaa ccagttccaa aaggctgaaa ccatccctgt cctccatgag atgatccagc 2040
agatcttcaa tctcttcagc acaaaggact catctgctgc ttgggatgag accctcctag 2100
acaaattcta cactgaactc taccagcagc tgaatgacct ggaagcctgt gtgatacagg 2160
gggtgggggt gacagagact cccctgatga aggaggactc cattctggct gtgaggaaat 2220
acttccaaag aatcactctc tatctgaaag agaagaaata cagcccttgt gcctgggagg 2280
ttgtcagagc agaaatcatg agatcttttt ctttgtcaac aaacttgcaa gaaagtttaa 2340
gaagtaagga agaaggccga gggagcctgc tgacatgtgg cgatgtggag gaaaacccag 2400
gaccaatggg caccagcctc ctctgctgga tggccctgtg tctcctgggg gcagatcacg 2460
cagatgcttg tccttactct aacccctctc tctgttctgg aggtggagga tctgagttac 2520
ctacccaggg aacattttca aatgtttcta caaatgtatc ccctgctaag cctacaacaa 2580
ctgcatgtcc ttactctaac ccctctctct gttctggagg tggaggatct cctgctcctc 2640
gtcctcctac ccctgctcct actatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt 2700
gccggccagc ggcgggtggc gcagtgcaca cgaggggtct ggacttcgcc tgtgatatct 2760
acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc 2820
tttactgcaa ccacagaaat aggagaagag tttgcaagtg tcctagacct gttgtttaga 2880
cgcgtgcggc cgc 2893
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 2
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
ccc 63
<210> 3
<211> 756
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 3
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgttcag cctctggatt ctcccttact aagtacaaga tgacctgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggagtg ggtttcatca attagtagta ctagtagaga cattgattac 180
gcagactctg tgaagggccg attcaccatc tccagggaca acgccaagaa ctcactgttt 240
ctgcaaatga gtagcctgag agtcgatgac acggccgttt attactgtac gagagatgga 300
tggctttggg gatgggacgt tcggagtaac tactactaca acgccttgga cgtctggggc 360
caaggcacca ctgtcaccgt ctcctcggga ggaggaggaa gtggaggagg aggatctgga 420
ggaggaggat ctgacatcgt ggtgacccag tctccatcct ccctgtctgc atctgtagga 480
gacagagtca ccatcacttg ccgggcgagt cagggcattt acaattctat agcctggtat 540
cagcagaaac cagggaaagc ccctaagctc ctgctctatt ctacatccac attgctaagt 600
ggggtcccat ccaggttcag tggcagtgga tctgggacgg attacactct caccatcacg 660
aacctgcagc ctgaagattt tgcaacttat tactgtcaac agtattttgt aacccctgaa 720
acttttggcc aggggaccaa gctggagatc aaacga 756
<210> 4
<211> 135
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 4
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 5
ccattttttt tctgctgctt catcgctgta gccatgggaa tccgtttcat tattatggta 60
gca 63
<210> 6
<211> 360
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 6
tggaggagaa agaggaagga gaagcagtca gagaccagtc ccaaggaatt tttgacaatt 60
tacgaagatg tcaaggatct gaaaaccagg agaaatcacg agcaggagca gacttttcct 120
ggagggggga gcaccatcta ctctatgatc cagtcccagt cttctgctcc cacgtcacaa 180
gaacctgcat atacattata ttcattaatt cagccttcca ggaagtctgg gtccaggaag 240
aggaaccaca gcccttcctt caatagcact atctatgaag tgattggaaa gagtcaacct 300
aaagcccaga accctgctcg attgagccgc aaagagctgg agaactttga tgtttattcc 360
<210> 7
<211> 336
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 7
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 8
gaaggccgag ggagcctgct gacatgtggc gatgtggagg aaaacccagg acca 54
<210> 9
<211> 564
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 9
atggccttga cctttgcttt actggtggcc ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc 60
tctgtgggct gtgatctgcc tcaaacccac agcctgggta gcaggaggac cttgatgctc 120
ctggcacaga tgaggagaat ctctcttttc tcctgcttga aggacagaca tgactttgga 180
tttccccagg aggagtttgg caaccagttc caaaaggctg aaaccatccc tgtcctccat 240
gagatgatcc agcagatctt caatctcttc agcacaaagg actcatctgc tgcttgggat 300
gagaccctcc tagacaaatt ctacactgaa ctctaccagc agctgaatga cctggaagcc 360
tgtgtgatac agggggtggg ggtgacagag actcccctga tgaaggagga ctccattctg 420
gctgtgagga aatacttcca aagaatcact ctctatctga aagagaagaa atacagccct 480
tgtgcctggg aggttgtcag agcagaaatc atgagatctt tttctttgtc aacaaacttg 540
caagaaagtt taagaagtaa ggaa 564
<210> 10
<211> 471
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 10
atgggcacca gcctcctctg ctggatggcc ctgtgtctcc tgggggcaga tcacgcagat 60
gcttgtcctt actctaaccc ctctctctgt tctggaggtg gaggatctga gttacctacc 120
cagggaacat tttcaaatgt ttctacaaat gtatcccctg ctaagcctac aacaactgca 180
tgtccttact ctaacccctc tctctgttct ggaggtggag gatctcctgc tcctcgtcct 240
cctacccctg ctcctactat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 300
ccagcggcgg gtggcgcagt gcacacgagg ggtctggact tcgcctgtga tatctacatc 360
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 420
tgcaaccaca gaaataggag aagagtttgc aagtgtccta gacctgttgt t 471

Claims (10)

1.嵌合抗原受体，其特征在于：包含leader核酸人工序列、HBsAg单链抗体核酸人工序列、CD8α铰链区核酸人工序列、NKG2D跨膜区核酸人工序列、2B4共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、IFN-α核酸人工序列、RQR8分子开关区核酸人工序列。
2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：包含依序连接的
如SEQ ID NO.2所述的leader核酸人工序列；
如SEQ ID NO.3所述HBsAg单链抗体核酸人工序列；
如SEQ ID NO.4所述CD8α铰链区核酸人工序列；
如SEQ ID NO.5所述NKG2D跨膜区核酸人工序列；
如SEQ ID NO.6所述2B4共刺激区核酸人工序列；
如SEQ ID NO.7所述CD3ζ信号传导区核酸人工序列；
如SEQ ID NO.8所述T2A自剪切区核酸人工序列；
如SEQ ID NO.9所述IFN-α核酸人工序列；
如SEQ ID NO.8所述T2A自剪切区核酸人工序列；
如SEQ ID NO.10所述RQR8分子开关区核酸人工序列。
3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.1所述。
4.嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)分别按leader核酸人工序列、HBsAg单链抗体核酸人工序列、CD8α铰链区核酸人工序列、NKG2D跨膜区核酸人工序列、2B4共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、IFN-α核酸人工序列、T2A自剪切区核酸人工序列、RQR8分子开关区核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，得到pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR；
(2)将pUC-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR进行双酶切，利用琼胶电泳将Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段，即为嵌合抗原受体。
5.NK细胞，其特征在于：该NK细胞含有如权利要求3所述的嵌合抗原受体。
6.如权利要求5所述的NK细胞，其特征在于：所述NK细胞采用包括如下步骤的方法制备得到：首先将pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染免疫细胞。
7.如权利要求6所述的NK细胞，其特征在于：所述pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒是将融合基因片段Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到的pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒。
8.如权利要求7所述的NK细胞，其特征在于：所述pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒采用包括如下步骤的制备方法得到：将纯化的Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒；连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；Anti-HBsAg-IFN-α-CAR DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μl。
9.如权利要求8所述的NK细胞，其特征在于：pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒采用如下步骤进行慢病毒包装：将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS培养皿中，贴壁率为70％-80％时准备转染；取无菌15ml离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：4ml；pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒：10μg；GM easyTM Lentiviral Mix：10μl(10μg)；HG TransgeneTM Reagent：60μl；混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养；转染24小时后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10％血清新鲜的培养基继续培养；48h后吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中；上清液中即含有慢病毒包装后的pLent-Anti-HBsAg-IFN-α-CAR质粒。
10.嵌合抗原受体在制备治疗HBV感染方面的药物中的应用。
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