CN105663123B - 含吡螨胺结构的化合物在制备抗埃博拉病毒感染药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了含吡螨胺结构的化合物在制备抗埃博拉病毒感染药物中的应用。本发明所提供的含吡螨胺结构的化合物为式(Ⅰ)所示化合物或式(Ⅱ)所示化合物。实验证明，在埃博拉假病毒感染前后，本发明提供的含吡螨胺结构的化合物均可以抑制埃博拉假病毒对HUH7细胞的侵染作用。因此，含吡螨胺结构的化合物可抑制埃博拉病毒感染靶细胞，在制备抗埃博拉病毒感染药物中具有重要的应用价值。

Description

含吡螨胺结构的化合物在制备抗埃博拉病毒感染药物中的 应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及含吡螨胺结构的化合物的一种新用途，更具体涉及含吡螨胺结构的化合物在制备抗埃博拉病毒感染药物中的应用。
背景技术
埃博拉病毒(Ebola Virus，EBOV)是传染病埃博拉出血热的病原体，该出血热于1976年首次在扎伊尔发现，其高传染性的爆发流行和高致死性很快引起了世界各国研究人员的注意。埃博拉病毒具有极强的感染性，可引起人类和其他灵长类动物高致死性的出血热综合征。研究表明，埃博拉病毒的所有组分对疾病的发展都有一定的促进作用，尤其是埃博拉病毒的囊膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)可与靶细胞发生吸附，进而进入靶细胞，在介导病毒进入靶细胞过程中发挥重要作用。埃博拉病毒的囊膜糖蛋白被认为是决定埃博拉病毒致病性一个重要因素，体外通过转染编码囊膜糖蛋白基因的质粒或腺病毒进入靶细胞，能够导致靶细胞的脱落，表明埃博拉病毒的囊膜糖蛋白具有细胞毒性，但是其机理不详。因此，抑制埃博拉病毒的囊膜糖蛋白活性是抑制埃博拉病毒感染靶细胞的重要途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题如何制备抗埃博拉病毒感染药物。
为解决上述问题，本发明首先提供了含吡螨胺结构的化合物在制备抗埃博拉病毒感染药物中的应用。
所述抗埃博拉病毒感染药物可为治疗型抗埃博拉病毒感染药物和/或预防型抗埃博拉病毒感染药物。
含吡螨胺结构的化合物在制备抑制埃博拉病毒侵染哺乳动物细胞的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
所述哺乳动物细胞具体可为人细胞。所述哺乳动物细胞具体可为哺乳动物肝癌细胞。所述哺乳动物细胞具体可为人肝癌细胞。所述人肝癌细胞具体可为HUH7细胞。
含吡螨胺结构的化合物在制备抑制埃博拉病毒囊膜糖蛋白活性的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
上述应用中，所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白可为a1)或a2)：
a1)氨基酸序列是序列表序列2所示的蛋白质；
a2)将a1)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相关的蛋白质。
上述任一所述的应用中，所述含吡螨胺结构的化合物可为式(Ⅰ)所示化合物或式(Ⅱ)所示化合物；
为解决上述问题，本发明还提供了一种产品。
本发明所提供的产品，其活性成分为含吡螨胺结构的化合物；所述产品可为如下b1)或b2)或b3)：
b1)抗埃博拉病毒感染药物；
b2)抑制埃博拉病毒侵染哺乳动物细胞的产品；
b3)抑制埃博拉病毒囊膜糖蛋白活性的产品。
上述产品中，所述抗埃博拉病毒感染药物可为治疗型抗埃博拉病毒感染药物和/或预防型抗埃博拉病毒感染药物。
上述产品中，所述哺乳动物细胞具体可为人细胞。上述产品中，所述哺乳动物细胞具体可为哺乳动物肝癌细胞。上述产品中，所述哺乳动物细胞具体可为人肝癌细胞。所述人肝癌细胞具体可为HUH7细胞。
上述产品中，所述埃博拉病毒的囊膜糖蛋白可为a1)或a2)：
a1)氨基酸序列是序列表序列2所示的蛋白质；
a2)将a1)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与埃博拉病毒的囊膜糖蛋白功能相关的蛋白质。
上述任一所述产品中，所述含吡螨胺结构的化合物可为式(Ⅰ)所示化合物或式(Ⅱ)所示化合物；
上述任一所述埃博拉病毒可为扎伊尔亚型，具体为H.sapiens wt/GIN/2014/Gueckedou-C07。
由于高致病性和传染性，本发明中所述埃博拉病毒可用埃博拉假病毒代替，所述埃博拉假病毒的制备方法可如下：
1、向质粒pcDNATM4/HisMax的限制性内切酶BamHI和XhoI的识别序列之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的双链DNA分子，得到重组质粒pcDNA4-EBOV-GP。
2、将重组质粒pcDNA4-EBOV-GP和pNL4.3-Luc-R-E-载体质粒共转染HEK 293T细胞，置于37℃、5％CO2培养箱孵育6h，用PBS缓冲液冲洗2次，然后加入DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱继续孵育48h，收集细胞上清。
3、取步骤2收集的细胞上清，3000rpm离心10min，收集上清液并用0.22μm微孔滤膜过滤，收集过滤后的液体。
4、取步骤3过滤后的液体，30000rpm离心2.5h，获得的沉淀用1mL DMEM培养基溶解，得到所述埃博拉假病毒的病毒液。
序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白为埃博拉病毒的扎伊尔亚型的H.sapiens wt/GIN/2014/Gueckedou-C07的囊膜糖蛋白。因此，含吡螨胺结构的化合物具有抑制具有序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白的假病毒的侵染能力，应该也具有抑制扎伊尔亚型的埃博拉病毒的侵染能力。扎伊尔亚型的埃博拉病毒具体可为H.sapiens wt/GIN/2014/Gueckedou-C07。
实验证明，本发明提供的含吡螨胺结构的化合物在埃博拉假病毒感染前或感染后对埃博拉假病毒的感染均具有抑制作用。因此，本发明提供的含吡螨胺结构的化合物可抑制埃博拉病毒感染靶细胞，在制备抗埃博拉病毒感染药物中具有重要的应用价值。
附图说明
图1为埃博拉假病毒感染前给予化合物Ⅰ对埃博拉假病毒感染HUH7细胞的抑制作用。
图2为埃博拉假病毒感染前给予化合物Ⅱ对埃博拉假病毒感染HUH7细胞的抑制作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
HUH7细胞(人肝癌细胞)购自日本细胞库(Japanese Collection of ResearchBioresources，JCRB)，编号为JCRB0403。胎牛血清为Sera Pro公司产品。DMEM培养基为Gibco公司产品。二甲基亚砜为Amresco公司产品。Luciferase Cell Culture Lysis 5×Reagent为Promega公司产品，货号为E1531。HEK 293T细胞为中国普通微生物保藏管理中心(简称CGMCC)产品，产品目录号为8.00020。质粒pcDNATM4/HisMax为Life technologies公司产品，货号为V86420。PBS缓冲液为BioTopped公司产品，货号为top0027。Luciferase AssaySystem 10-Pack为Promega公司产品，货号为E1501。
ZMapp 2G4单克隆抗体的制备方法参考如下文献：Q Xiangguo，W Gary，etal.Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates withZMapp.Nature.2014，514(10)：47-61.
pNL4.3-Luc-R-E-载体质粒购自BioVector中国质粒载体菌株细胞基因保藏中心-NTCC国家典型培养物保藏中心(网址为http://www.biovector.net/)，货号为3767994。
实施例1、埃博拉假病毒稀释液的制备方法
由于埃博拉病毒的高致病性和传染性，埃博拉假病毒能够代替活病毒的部分研究。本发明中使用的埃博拉假病毒的制备方法如下：
1、向质粒pcDNATM4/HisMax的限制性内切酶BamHI和XhoI的识别序列之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的双链DNA分子，得到重组质粒pcDNA4-EBOV-GP。重组质粒pcDNA4-EBOV-GP表达序列表中序列2所示的埃博拉病毒的囊膜糖蛋白(Glycoprotein，GP)，以下简称GP蛋白。
2、将步骤1构建的重组质粒pcDNA4-EBOV-GP和pNL4.3-Luc-R-E-载体质粒共转染HEK 293T细胞(每1×106个HEK 293T细胞约转染10μg重组质粒pcDNA4-EBOV-GP和10μgpNL4.3-Luc-R-E-载体质粒)，置于37℃、5％CO2培养箱孵育6h，用PBS缓冲液冲洗2次，然后加入DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱继续孵育48h，收集细胞上清。
3、取步骤2收集的细胞上清，3000rpm离心10min，收集上清液并用0.22μm微孔滤膜过滤，收集过滤后的液体。
4、取步骤3过滤后的液体，30000rpm离心2.5h，获得的沉淀用1mL DMEM培养基溶解，得到埃博拉假病毒的病毒液。该埃博拉假病毒的病毒液可表达GP蛋白。
取埃博拉假病毒的病毒液，用DMEM培养基稀释至35倍体积，得到埃博拉假病毒稀释液。
实施例2、制备化合物Ⅰ和化合物Ⅱ
按照文献(Song H，Liu Y et al.Design，synthesis，and insecticidalactivity of novel pyrazole derivatives containingα-hydroxymethyl-N-benzylcarboxamide，α-chloromethyl-N-benzyl carboxamide，and 4，5-dihydrooxazolemoieties[J].J.Agric.Food Chem.2012，60，1470-9.和Song H，Liu Y et al.Design，synthesis，and insecticidal evaluation of new pyrazole derivatives containingimine，oxime ether，oxime ester，and dihydroisoxazoline groups based on theinhibitor binding pocket of respiratory complex I.J.Agric.Food Chem.2013,61，8730-6)中记载的方法制备化合物Ⅰ和化合物Ⅱ。化合物Ⅰ的结构式如式(Ⅰ)所示，其在文献中的名称为tebufenpyrad。化合物Ⅱ的结构式如式(Ⅱ)所示，其在文献中的名称为Ethyl2-(4-(tert-Butyl)phenyl)-2-oxoacetate。
实施例3、供试药抑制埃博拉假病毒感染HUH7细胞
采用化合物Ⅰ或化合物Ⅱ作为供试药，进行如下实验：
一、埃博拉假病毒感染前给药对埃博拉假病毒的抑制效应
设置试验组，进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：
1、用胰蛋白酶消化HUH7细胞，然后用含10％(体积比)胎牛血清的DMEM培养基重悬并稀释，获得细胞密度为1×105个/mL的细胞悬浮液。
2、用二甲基亚砜(DMSO)溶解供试药，获得供试药溶液。
3、取96孔板，每孔接种100μL步骤1获得的细胞悬浮液，然后置于37℃、5％CO2的培养箱中培养12h。
4、完成步骤3后，取所述96孔板，弃上清，每孔加入DMEM培养基100μL，再加入步骤2制备的供试药溶液，得到处理体系(当供试药为化合物Ⅰ时，处理体系中的供试药的浓度为29.95μM、7.488μM、1.872μM、0.468μM或0.116μM；当供试药为化合物Ⅱ时，处理体系中的供试药的浓度为27.48μM、6.87μM、1.718μM、0.43μM或0.108μM；每个浓度设置4个复孔)，然后置于37℃、5％CO2的培养箱中培养30min。
5、完成步骤4后，取所述96孔板，每孔加入100μL实施例1制备的埃博拉假病毒稀释液，置于37℃、5％CO2的培养箱中孵育6h。
6、取所述96孔板，吸弃孔内的液体，每孔加入100μL PBS缓冲液洗涤一次；然后每孔加入100μL含5％(体积比)胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养48h。
7、取所述96孔板，吸弃孔内的液体，每孔加入100μL PBS缓冲液洗涤一次。
8、完成步骤7后，取所述96孔板，每孔加入30μL Luciferase Cell CultureLysis5×Reagent，裂解30min。
9、完成步骤8后，取所述96孔板，加入Luciferase Assay System 10-Pack，采用荧光酶标仪检测荧光值。
设置阴性对照组：用等体积二甲基亚砜代替供试药溶液，其它操作同试验组。设置4个复孔。
设置阳性对照组：用等体积ZMapp 2G4单克隆抗体代替供试药溶液，其它操作同试验组。阳性对照组中ZMapp 2G4单克隆抗体的浓度为66.667μM。设置4个复孔。
根据下述公式计算不同浓度的供试药处理后HUH7细胞的抑制率：
抑制率＝(阴性对照组的检测荧光值-试验组的检测荧光值)/阴性对照组的检测荧光值×100％。
化合物Ⅰ对埃博拉假病毒的抑制率的实验结果见图1(以供试药在处理体系中的浓度以10为底的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标)。结果表明，随着化合物Ⅰ在处理体系中的浓度的增加，抑制率也增加。可见，埃博拉假病毒感染前给予化合物Ⅰ可以抑制埃博拉假病毒对HUH7细胞的侵染作用。
化合物Ⅱ对埃博拉假病毒的抑制率的实验结果见图2(以供试药在处理体系中的浓度以10为底的对数值为横坐标，抑制率为纵坐标)。结果表明，随着化合物Ⅱ在处理体系中的浓度的增加，抑制率也增加。可见，埃博拉假病毒感染前给予化合物Ⅱ可以抑制埃博拉假病毒对HUH7细胞的侵染作用。
二、埃博拉假病毒感染后给药对埃博拉假病毒的抑制效应
设置试验组，进行三次重复试验，每次重复试验的步骤均如下：
1、用胰蛋白酶消化HUH7细胞，然后用含10％(体积比)胎牛血清的DMEM培养基重悬并稀释，获得细胞密度为1×105个/cm2的细胞悬浮液。
2、取96孔板，每孔接种100μL步骤1获得的细胞悬浮液，然后置于37℃、5％CO2的培养箱中培养12h。
3、用二甲基亚砜(DMSO)溶解供试药，获得供试药溶液。
4、另取一96孔板，每孔加入100μL步骤一制备的埃博拉假病毒稀释液和步骤3制备的供试药溶液，得到处理体系(当供试药为化合物Ⅰ时，处理体系中的供试药的浓度为14.975μM、3.744μM、0.936μM、0.234μM或0.058μM；当供试药为化合物Ⅱ时，处理体系中的供试药的浓度为13.740μM、3.435μM、0.859μM、0.215μM或0.054μM；每个浓度设置4个复孔)，然后置于37℃、5％CO2的培养箱中培养30min，得到混合液。
5、取完成步骤2后的96孔板，吸弃孔内的液体，每孔加入100μL PBS缓冲液洗涤一次；然后每孔加入100μL步骤4制备的混合液，置于37℃、5％CO2的培养箱中培养6h。
6、完成步骤5后，取所述96孔板，吸弃孔内的液体，每孔加入100μL PBS缓冲液洗涤一次，然后每孔加入100μL含5％(体积比)胎牛血清的DMEM培养基，37℃培养48h。
7、完成步骤6后，取所述96孔板，每孔加入30μL Luciferase Cell CultureLysis5×Reagent，裂解30min。
8、完成步骤7后，取所述96孔板，加入Luciferase Assay System 10-Pack，采用荧光酶标仪检测荧光值。
设置阴性对照组：用等体积二甲基亚砜代替供试药溶液，其它操作同试验组。设置4个复孔。
设置阳性对照组：用等体积ZMapp 2G4单克隆抗体代替供试药溶液，其它操作同试验组。阳性对照组中ZMapp 2G4单克隆抗体的浓度为66.667μM。设置4个复孔。
根据下述公式计算不同浓度的供试药处理后HUH7细胞的抑制率：
抑制率＝(阴性对照组的检测荧光值-试验组的检测荧光值)/阴性对照组的检测荧光值×100％。
供试药对埃博拉假病毒的抑制率的实验结果见表1。结果表明，随着供试药在处理体系中的浓度的增加，抑制率也增加。可见，供试药可以抑制埃博拉假病毒对HUH7细胞的侵染作用。
表1.供试药对埃博拉假病毒感染宿主细胞的抑制作用

Claims (3)

1.含吡螨胺结构的化合物在制备抗埃博拉病毒感染药物中的应用；
所述含吡螨胺结构的化合物为式(Ⅰ)所示化合物或式(Ⅱ)所示化合物；
2.含吡螨胺结构的化合物在制备抑制埃博拉病毒侵染哺乳动物细胞的产品中的应用；
所述含吡螨胺结构的化合物为式(Ⅰ)所示化合物或式(Ⅱ)所示化合物；
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述哺乳动物细胞为人肝癌细胞。
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Design, Synthesis, and Insecticidal Activity of Novel Pyrazole Derivatives Containing α-Hydroxymethyl-N-benzyl Carboxamide, α-Chloromethyl-N-benzyl Carboxamide, and 4,5-Dihydrooxazole Moieties;Song HJ等;《Journal of Agricultural and Food Chemistry》;20120203;第60卷(第6期);摘要，图1，表5-7 *

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