CN101982184A - 一种蒲公英提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

一种蒲公英提取物的制备方法，是一种集细胞破壁-酸水浸提-溶解沉析-柱层析分离的新方法。用该方法对新鲜蒲公英药材进行加工，可制备较高纯度绿原酸、咖啡酸等多酚物质的蒲公英提取物。采用螺旋榨汁机进行细胞破壁；用酸水浸提；丙酮溶解沉析；大孔树脂柱层析填料采用罗姆哈斯XAD-8树脂等，流动相为乙酸乙酯溶剂；色谱精制纯化采用C18反相硅胶为固定相，乙醇水为流动相。产品含量高达90％以上。该提取分离工艺，方法简便、成本低、易于工业生产应用。

Description

一种蒲公英提取物的制备方法

一、技术领域

本发明涉及一种植物中草药中活性物质的制备方法，确切地说是一种从中药材蒲公英中提取分离富含活性物质提取物的方法。

二、背景技术

蒲公英，别名蒲公草、黄花地丁、尿床草、婆婆丁，属菊科属多年生草本植物，是药食兼用的植物。中华人们共和国药典2005年版(一部)规定本品为菊科植物蒲公英Taraxacunmongolicum Hand-Mazz、碱地蒲公英Taraxacum sinicum Kitag或同属数种植物的干燥全草。蒲公英原产欧洲，全世界约2000余种。我国有70种，至少有27种中药蒲公英来源于本属，其中以蒲公英T.mongolicum分布最广，几遍及全国多数地区。

蒲公英是一种中草药。《本草纲目》记载：“蒲公英主治妇人乳痈肿，水煮汁饮及封之立消。解食毒，散滞气，清热毒，化食毒，消恶肿、结核、疔肿。”2005年版中国药典蒲公英项中标明蒲公英的功能为清热解毒、消肿散结、利尿通淋，用于治疗疔疮肿毒、乳痈、目赤、咽痛、肺痈、肠痈、湿热黄疸和热淋涩痛。很多研究表明蒲公英具有广谱抗菌作用、抗胃损伤作用、保肝胆作用、抗肿瘤作用、抗内毒素作用、免疫调节作用、抗氧自由基作用等。另外蒲公英对女性甾体激素有影响，蒲公英具有催乳作用，也可用于泌乳不畅引起的乳房肿胀；具有改善胆固醇血症与刺激雌激素分泌的作用。

蒲公英具有上述等功效，是因为叶子和花中有多酚类物质，其中含量最丰富的酚类物质是羟基苯乙烯酸衍生物，尤其是咖啡酸和绿原酸等含量较高，为蒲公英的主要药理活性成分。凌云等从蒲公英中得到咖啡酸(caffeic acid)和绿原酸(chlorogenic acid)，其中绿原酸为首次从蒲公英属植物中分得，为蒲公英抗菌的主要有效成分(凌云、郑俊华.中药蒲公英的研究进展.中国现代应用药学杂志，1998，15(3)：11)；从碱地蒲公英T.sinicum的干燥全草中分得咖啡酸、阿魏酸、绿原酸。

绿原酸是植物在有氧呼吸过程产生的一种苯丙素类化合物，具有抗氧化、抗病毒、抗菌功能作用。特别是绿原酸的生物活性，能促进人体的新陈代谢，调节人体各部功能的平衡等功效，且毒性和副作用小。绿原酸能不可逆地抑制葡萄糖-6-磷酸酶的水解作用，降低肝糖原的分解并减少外源葡萄糖的吸收。动物体内的研究证明，使用绿原酸可以降低由使用胰高血糖素引起的高血糖峰值。绿原酸可以降低血糖水平，提高肝脏葡萄糖-6-磷酸和肝糖原的浓度。因此绿原酸的研究和利用越来越受到人们的重视。

咖啡酸结构中含有两个酚羟基，是天然的自由基淬灭剂，具有优异的抗氧化特性，已有的药理学研究表明，咖啡酸具有广谱抗菌、消炎利胆、利尿通淋、活血化淤、镇咳、祛痰、抗氧化、抗肿瘤等功效，用于高血压以及癌症的治疗。据报道，咖啡酸可以降低进食各种碳水化合物引起的正常小鼠的餐后血糖升高，并对葡萄糖苷酶的活性有较强的抑制作用。

考虑到绿原酸、咖啡酸在蒲公英中具有上述特殊功效，有必要进行提取分离。而国内对蒲公英活性物质的提取分离研究较少。主要采用乙醇水等溶剂进行提取，获得浸膏，再采大孔树脂进行分离纯化，获得富含酚酸类化合物的蒲公英提取物(例如，路保通，张鸯，胡新安，鲜海梅，谢宝东，王艳丽.蒲公英有效成分提取及其抑菌活性作用.《中国兽医杂志》，2008，44(5)：45-46；王昌利，吕卓，张明.大孔吸附树脂纯化蒲公英总酚酸的工艺研究.《陕西中医》，2009，30(12)：1656-1657)。

经由国家知识产权局网站检索，截至2010年9月30日，与蒲公英活性物质提取分离方法直接相关的授权发明专利或申请主要有：

(1)ZL03132343.X(《含有蒲公英、白芨提取物的化妆品复合添加剂及其制备工艺和在化妆品中的应用》)：本发明公开了一种含有蒲公英、白芨提取物的化妆品复合添加剂及其制备工艺和在化妆品中的应用。该制备工艺通过将蒲公英去杂、清洗、切碎，超声水浸法提取，过滤，絮凝，离心，超滤，上大孔树脂吸附，醇洗，浓缩，得蒲公英标准提取物。

(2)CN1907314A(申请号200610052977.3，《蒲公英中酚酸类有效部位抑制妇科乳腺炎症的用途》)：本发明公开了一种具有预防和治疗妇科乳腺感染疾病的蒲公英植物提取物的新医药用途。本发明的蒲公英植物提取物由蒲公英植物鲜品或干品经醇水提取、柱层析、醇溶剂洗脱精制而成，提取物中酚酸类化合物作为有效成分含量在20％以上。

(3)CN1583134A(申请号200410046193.0，《一种蒲公英泡腾片及其制备方法》)：该发明公开了一种蒲公英泡腾片及其制备方法，它的原料药材为蒲公英，其特征是采用醇提和水提(40％-90％乙醇水)相结合的工艺，提取处方中药材的有效成分，得到的提取物再与药用辅料组合，制备成泡腾片。

(4)CN101023972A(申请号200710067772.7，《蒲公英中酚酸类有效部位治疗口腔溃疡的用途》)：该发明公开了一种预防和治疗单纯疱疹病毒感染的蒲公英植物酚酸类有效部位及其在制备防治口腔溃疡药物中的应用。本发明中的蒲公英植物酚酸类有效部位由蒲公英植物鲜品或干品经醇水提取、柱层析、醇溶剂洗脱精制而成，提取物中酚酸类化合物为有效成分含量在20％以上。

(5)CN101112409A(申请号200610036674.2，《蒲公英中酚酸类有效部位的制备及其抑制流感病毒的用途》)：该发明公开了一种具有预防和治疗流感病毒感染疾病的蒲公英植物提取物及其制备方法和医药用途。本发明的蒲公英植物提取物由蒲公英植物鲜品或干品经醇水提取、柱层析、醇溶剂洗脱精制而成，提取物中酚类化合物作为有效成分含量在20％以上。

三、发明内容

本发明旨在为开发中药新药或保健食品提供高质量的原料-蒲公英提取物，所要解决的技术问题是蒲公英中多酚类化合物的提取、分离和富集，使提取物中富含绿原酸和咖啡酸。

本发明的技术方案是以新鲜蒲公英为起始原料，包括破碎、提取、浓缩、萃取、分离和纯化，与现有技术的区别是所述的破碎是采用螺旋榨汁机打碎使细胞破壁，所述的提取是破碎后的蒲公英用pH3-5的酸水于45-65℃下搅拌提取至少两次，每次不少于1.5小时，过滤分离合并得到提取液；提取液真空浓缩成浸膏，用丙酮萃取至少两次，分离合并得到萃取液，萃取液脱溶后得到粉末状粗提物；粗提物用固定相为罗姆哈斯XAD-8树脂(美国FDA认可的类型)层析柱进行纯化，依次用去离子水和乙酸乙酯洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，脱溶后得到绿原酸、咖啡酸总含量≥50％的蒲公英提取物。

为进一步提高提取物中多酚类化合物的含量，对提取物采用C18反相硅胶填料色谱柱进一步纯化，用85-95％(体积百分浓度，下同)乙醇混合流动相洗脱，收集洗脱液，脱溶后得到绿原酸、咖啡酸总含量≥90％的高纯优质蒲公英提取物。

具体的技术方案是：

将新鲜蒲公英选择采用转速200-400转/分的螺旋榨汁机实现高效细胞破壁，以提高后续有效成分的提取率；在酸性水中进行动态提取，提取液浓缩成浸膏，添加丙酮萃取除杂，萃取液浓缩后上层析柱，分离填料为罗姆哈斯XAD-8系列树脂，先用去离子水洗脱，再用乙酸乙酯洗脱，收集绿原酸或咖啡酸含量≥20％的乙酸乙酯洗脱液、浓缩，得绿原酸、咖啡酸总含量≥50％的蒲公英提取物；进一步进行精制纯化，采用C18反相硅胶填料进行色谱分离，采用85-95％乙醇洗脱，可制得蒲公英多酚类活性物质含量≥90％的高纯蒲公英提取物。

具体操作步骤是

(1)首先将新鲜蒲公英通过转速200-400转/分的螺旋榨汁机进行破壁打碎；溶于10-20倍体积的pH3-5的酸性温水(45-65℃)中，动态搅拌，转速60r/min，时间120min左右，过80-100目筛网，提取至少2次；

(2)合并上述提取液，真空浓缩为浸膏，再添加5-8倍体积的丙酮进行萃取，获得上清萃取液，重复1次，合并上清萃取液，浓缩成粉末，再用2倍体积离子水溶解，用于上柱；

(3)进行柱层析分离，分离介质(固定相)选自罗姆哈斯XAD-8树脂(为美国FDA认可的类型)等，流动相选择去离子水、乙酸乙酯，分别依次进行洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液；

(4)将上述收集到的流分合并，真空浓缩成浸膏，提取物中绿原酸、咖啡酸多酚物质总含量超过50％；

(5)精制纯化，将上述提取物进行反相硅胶色谱分离，固定相为C18反相硅胶，流动相85-95％乙醇，可制得纯度90％以上高纯蒲公英多酚类活性物质。

备注：绿原酸、咖啡酸采用高效液相色谱法检测，具体见中华人民共和国药典2005版(上部)附录VI。

本发明为相关企业提供一种集成廉价螺旋压榨高效细胞破壁+酸水浸提+柱层析分离分离纯化的方法，制备纯度达90％高纯蒲公英多酚类活性物质。适合不同纯度的蒲公英多酚类活性物质的制备。本法工艺简单，无需大量有机溶剂进行提取，绿色、环保。

四、具体实施方式

实施例1：

1、称取10kg蒲公英，通过螺旋榨汁机进行破壁打碎，溶于15倍体积的pH＝4、50℃纯净水中，动态搅拌，转速60r/min，时间120min左右，过100目筛网，并提取2次；

2、将提取液合并，真空浓缩至干，再添加6倍体积的丙酮进行萃取，共2次，合并上清液，并浓缩成粉末，再用2倍体积去离子水溶解，用于上柱；

3、柱层析分离，分离介质为罗姆哈斯XAD-8树脂，先用3倍柱体积去离子水洗脱，再用乙酸乙酯洗脱，主要收集纯度20％以上的绿原酸或咖啡酸流份；

4、将上述收集到流份合并，真空浓缩成浸膏，绿原酸、咖啡酸总酚的纯度达50％以上；

5、精制纯化，将上述提取物进行反相硅胶色谱分离，固定相为C18反相硅胶，流动相乙醇-水(90％，V/V)；

6、可制得0.24g纯度达91.1％的高纯蒲公英多酚类活性物质。

实施例2：

1、称取10kg蒲公英，通过螺旋榨汁机进行破壁打碎，溶于12倍体积的pH＝5、60℃纯净水中，动态搅拌，转速60r/min，时间120min左右，过80目筛网，并提取2次；

2、将提取液合并，真空浓缩至干，再添加8倍体积的丙酮进行萃取，共2次，合并上清液，并浓缩成粉末，再用2倍体积去离子水溶解，用于上柱；

3、柱层析分离，分离介质为罗姆哈斯XAD-8树脂，先用3倍柱体积去离子水洗脱，再用乙酸乙酯洗脱，主要收集纯度20％以上的绿原酸或咖啡酸流份；

4、将上述收集到流份合并，真空浓缩成浸膏，绿原酸、咖啡酸总酚的纯度达50％以上；

5、精制纯化，将上述提取物进行反相硅胶色谱分离，固定相为C18反相硅胶，流动相乙醇-水(95％，V/V)；

6、可制得0.27g纯度达90.3％的高纯蒲公英多酚类活性物质。

Claims (2)

1.一种蒲公英提取物的制备方法，以中药材新鲜蒲公英为起始原料，包括破碎、提取、浓缩、萃取、分离和纯化，其特征在于：所述的破碎是采用螺旋榨汁机打碎使细胞破壁，所述的提取是破碎后的蒲公英用pH3-5的酸水于45-65℃下搅拌提取至少两次，得到提取液；提取液浓缩成浸膏，用丙酮萃取至少两次，得到萃取液；萃取液脱溶后得到粉末状粗提物；粗提物用固定相为罗姆哈斯XAD-8树脂的层析柱分离纯化，依次用去离子水和乙酸乙酯洗脱，收集乙酸乙酯洗脱液，脱溶后得到绿原酸、咖啡酸总含量≥50％的蒲公英提取物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：绿原酸、咖啡酸总含量≥50％的蒲公英提取物用反相硅胶C18填料色谱柱进行纯化，用85-95％乙醇混合流动相洗脱，收集洗脱液，脱溶后得到绿原酸、咖啡酸总含量≥90％的蒲公英提取物。