CN112656734A - 一种蒲公英提取物的制备方法、其提取物及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含有蒲公英提取物的制备方法、其提取物及应用，所述蒲公英提取物采用溶出提取设备制备，所述制备方法中提取溶剂为1,3丁二醇，1,2己二醇与乙基己基甘油及去离子水组成的复合溶剂。所得的溶出法蒲公英提取物，在时钟节律紊乱修复层面表现良好效果，进而修复由于时钟节律紊乱引起的皮肤老化，皱纹形成、肤色损失和皮肤下垂等现象。本发明原料为纯天然植物，且性质温和、易于吸收、无刺激，本提取工艺采用非乙醇法的浸处提取工艺，符合人们对化妆品安全有效、零负担的要求，可广泛应用于皮肤护理化妆品等。
Description
技术领域
本发明属于化妆品领域，具体涉及一种以蒲公英提取物为有效成分，针对时钟节律紊乱所引起的DNA损伤，有显著修复功效的提取物及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤和身体的所有器官一样，都在老化，皮肤老化的原因有身体老化引起的皮肤老化(内因)和各种有害环境暴露引起的皮肤老化(外因)。在人体的时钟节律紊乱时，往往导致DNA损伤、氧化应激和炎症等一系列症状。如受到辐射后，诱导嘧啶二聚体(CPDs)和6-4光降解产物(6-4PPs)的形成，导致细胞DNA损伤、细胞老化和死亡进而引发一系列的皮肤问题。现有技术：彗星实验(Comet assay)也被称为单细胞凝胶电泳实验(Single cell gelelectrophoresis，SCGE)，是在单细胞水平上检测DNA损伤的技术。如果DNA没有损伤无拖尾出现；如果DNA受损形成拖尾，DNA受损越严重迁移距离也越长。荧光染色后就能看见“彗星”样尾长并且荧光强度增强。因此可采用彗星试验测定DNA的修复功效测定。
另一方面，时钟节律紊乱的DNA损伤反应也由生物钟(昼夜时钟节律)和miRNA调控。生物钟控制着包括人类在内的几乎所有生物的行为，如荷尔蒙分泌、体温和睡眠模式。BMAL1(Brain and muscle arnt-like1)基因是10种昼夜时钟节律基因的核心元件之一，通过正负反馈通路、自身的表达调控和其他辅助调节机制而产生昼夜时钟节律。且通过miR-142-3p负反馈调节BMAL1的表达，形成BMAL1自我调控的负反馈环，因此可以通过测定BMAL1蛋白表达水平，通过qRT-PCR测定miR-142-3p的表达水平来侧面评价DNA损伤修复的功效性。但是，目前常规方法大多采用刺激性的提取溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)提取，在用于化妆品时受到局限。
蒲公英为菊科蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.Mazz.、碱地蒲公英Taraxacumborealisinense Kitam.或同属数种植物的干燥全株。现代药理研究表明，蒲公英中的黄酮成分具有抗菌、抗炎、抗癌、抗血栓等药理作用。其含酚酸类物质，如绿原酸、隐绿原酸、新绿原酸、香豆酸、咖啡酸、阿魏酸等；黄酮类中则含有槲皮素；三萜类化合物有蒲公英醇、蒲公英甾醇等活性成分。
因此，本领域缺乏可以在化妆品领域广泛使用的蒲公英提取物。
发明内容
本发明主要目的在于提供蒲公英提取物的制备方法，以蒲公英在化妆品领域，改善时钟节律紊乱为应用目标，采用药用溶出提取设备的提取工艺，以多元醇复配体系复配提取工艺为切入点，获得一款天然且具备改善时钟节律紊乱，加快DNA损伤修复效应的植物提取物。
本发明的第一方面，提供一种蒲公英提取物的制备方法，所述蒲公英提取物采用溶出提取设备制备，所述制备方法中提取溶剂为1,3丁二醇，1,2己二醇与乙基己基甘油及去离子水组成的复合溶剂。
上述制备方法中，所述蒲公英提取物提取自蒲公英干燥全草，所述蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz或碱地蒲公英Taraxa-cum sinicumKitag。
上述制备方法包括以下步骤：
(a)取蒲公英干燥全草，粉碎至0.1mm以下，灭菌；
(b)在灭菌后的粉碎蒲公英中加入提取溶剂，并用溶出提取设备提取粗提液；
(c)微滤膜负压过滤步骤(b)获得的粗提液二次后得到粗滤液；
(d)步骤(c)中的粗滤液中加入提取溶剂后，采用超滤膜过滤，获得最终产品，即蒲公英提取物。
上述提取溶剂的组成为：
1,3丁二醇，5％；
1,2己二醇，3％；
乙基己基甘油，0.05％；其余为去离子水，以上为重量百分比；所述提取溶剂经灭菌后使用。
上述步骤(d)中，提取溶剂的加入量为粗滤液的0.2-2倍。
上述制备方法包括以下步骤:
(1)将蒲公英全草干燥原料粉碎后，过200目筛；
(2)加入1,3丁二醇，1,2己二醇及乙基己基甘油及去离子水的混合溶液作为提取溶剂提取；
(3)提取设备为Distek系列药用溶出仪，原料与提取溶剂的质量比为0.02:1-0.16:1，提取温度为25-55℃，提取时间为0.5-6h,得到粗提液；
(4)将步骤(3)得到的粗提液冷却至20-30℃，以微滤膜负压过滤，得第一次滤液；
(5)将步骤(4)得到的第一次滤液离心20-50min，转速为5000-8000rpm，用微滤膜进行第二次过滤，收集滤液，得粗滤液；
(6)将步骤(5)得到的粗滤液中加入提取溶剂，搅拌或超声混匀；
(7)将步骤(6)得到的溶液用超滤膜进行过滤，收集滤液，获得蒲公英提取物。
上述溶出提取设备提取蒲公英提取物时，提取料液比为：0.06:1-0.16:1，提取时间：0.5-6h；提取温度35-55℃。
上述提取料液比为：0.06-0.1:1，提取温度45-55℃，提取时间1.5-3h，所述溶出提取设备为药物溶出仪。
上述微滤膜孔径为0.1-1.0μm；所述超滤膜孔径为0.01-0.05μm。
上述提取料液比为：0.06:1，提取温度55℃，提取时间1.5h。
上述料液比为：0.10:1，提取温度45℃，提取时间3h。
上述料液比为：0.08:1，提取温度50℃，提取时间3h。
上述药物溶出仪为Distek药用溶出设备。
上述步骤(c)中先将粗提液冷却至20-30℃，以微滤膜负压过滤，得第一次滤液；将第一次滤液离心20-50min，转速为5000-8000rpm，用微滤膜进行第二次负压过滤，收集滤液，得粗滤液。
上述步骤(5)中的微滤膜孔径为0.1-1.0μm。
上述步骤(6)中的二次滤液，所述提取溶剂的加入量为粗滤液的0.2-2倍。
上述步骤(7)中超滤膜孔径为0.01-0.05μm。
本发明第二方面提供上述制备方法制备的蒲公英提取物。
本发明第三方面，提供一种组合物，所述组合物含有重量百分比1％-5％的范围内上述蒲公英提取物和赋形剂。
本发明所述赋形剂可以是液体赋形剂或固体赋形剂。如片剂中的黏合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂；中药丸剂中的酒、醋、药汁等；半固体制剂软膏剂、霜剂中的基质部分；液体制剂如化妆品中的防腐剂、抗氧剂、矫味剂、芳香剂、助溶剂、乳化剂、增溶剂、渗透压调节剂、着色剂等均可称为赋形剂，也可以称为辅料。
本发明第四方面上述蒲公英提取物在制备化妆品中的应用。
上述植物提取物，以HaCaT细胞测试作为时钟节律紊乱效果修复为评价指标：在HaCaT细胞中，蒲公英提取物在较低浓度下(200μg/mg)时，呈现低细胞毒性。时钟节律紊乱修复时，在一定程度上抑制miR-142-3p的表达，增加了BAML1蛋白的表达，促进了由于时钟节律紊乱造成的DNA修复活性的提升，进而修复由于时钟节律紊乱带来的DNA损伤引起的皮肤老化，皱纹形成、肤色损失和皮肤下垂等现象。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明采用多元醇体系为提取溶剂提取-微滤-超滤逐级过滤，联合实现提取、纯化、精制的目的，相比传统常规醇法方法，未引入对人刺激性的提取溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)，提取过程采用专业溶出提取设备，操作简便，能耗低、效果好，且提取液稳定。
(2)本发明提供一种具有时钟节律紊乱修复效应的植物提取物，所述原料为天然植物，利用蒲公英所含有的有效活性成分，结合现有新提取技术，实现了在时钟节律紊乱修复领域的一种天然植物提取物，且是一种安全、无刺激、易吸收的天然植物，符合当下人们对化妆品活性成分及效应的需求。
附图说明
图1使用不同提取物前后测RT-PCR测定BMAL1蛋白表达水平。
图2使用不同提取物前后Westerblot测定BMAL1蛋白表达水平。
图3使用不同提取物前后qRT-PCR测定miR-142-3p的表达水平。
图4使用不同提取物前后彗星拖尾试验。
具体实施方式
以下，参照实施例对本发明进行更详细和具体地描述，但下述实施例并不意在限制本发明。
在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。
本发明蒲公英提取物的制备方法包括以下步骤：
(a)取蒲公英干燥全草，粉碎至0.1mm以下，灭菌；
(b)在灭菌后的粉碎蒲公英中加入提取溶剂，并用溶出提取设备提取粗提液；
(c)微滤膜负压过滤步骤(b)获得的粗提液二次后得到粗滤液；
(d)步骤(c)中的粗滤液中加入提取溶剂后，采用超滤膜过滤，获得最终产品，即蒲公英提取物。
实施例1时钟节律紊乱修复蒲公英提取物的制备
在本发明下述的实施例及对比例中，时钟节律紊乱修复蒲公英提取物采用以下工艺制备。
1.蒲公英提取物的制备
(1)将蒲公英全草干燥原料粉碎后，过200目筛；
(2)加入一定的1,3丁二醇，1,2己二醇，乙基己基甘油及去离子水提取，此为提取溶剂。
(3)提取设备为采用Distek系列药用溶出仪，原料与提取溶剂的质量比为0.02:1-0.16:1，提取温度为25-55℃，提取时间为0.5-6h，得到粗提液；
(4)将步骤(3)得到的粗提液冷却至20-30℃，以微滤膜负压过滤，得第一次滤液；
(5)将步骤(4)得到的溶液离心20-50min，转速为5000-8000rpm，用微滤膜进行负压过滤，收集第二次滤液，即粗滤液；
(6)将步骤(5)得到的粗滤液中加入提取溶剂，搅拌或超声混匀；
(7)将步骤(6)得到的溶液用超滤膜进行负压过滤，收集滤液，获得蒲公英提取物。该提取物具有时钟节律紊乱修复功效的作用。
上述步骤(2)和步骤(6)中的提取溶剂为1,3丁二醇，1,2己二醇，乙基己基甘油中的一种或几种，优选混合物成分比例为:1,3丁二醇:1,2己二醇:乙基己基甘油:去离子水＝5％:3％:0.05％:91.95％。
上述步骤(5)中的微滤膜孔径为0.1-1.0μm。
上述步骤(6)中的粗滤液中，提取溶剂的加入量为粗滤液液的0.2-2倍。本实施例中提取溶剂的质量比为1,3丁二醇：1,2己二醇：乙基己基甘油质量比＝5:3:0.05，余量水；
上述步骤(7)中超滤膜孔径为0.01-0.05μm。本实施例中将步骤(6)得到的溶液用孔径0.05μm的超滤膜进行过滤，收集滤液，即得到蒲公英提取物。
2.对比例1蒲公英提取物提取工艺：
提取溶剂：1,3丁二醇：1,2己二醇：乙基己基甘油质量比＝5:3:0.05，余量水；料液比：0.16:1；提取时间24h；提取温度55℃；此条件下各项指标均饱和，用来计算提取率。
对比例1与提取物1的提取设备相同，料液比，提取时间，提取温度均选择了最大值，设定其提取浓度为100％，用于对比在较低料液比，较少提取时间下的提取率也能达到最大值，进而确定合适的料液比、提取时间范围。
3.对比例2蒲公英提取物提取工艺：
提取溶剂：30％乙醇溶液；料液比：0.16:1；超声提取功率：1200W，提取时间：3h；提取温度：55℃；浓缩干粉后，以1,3丁二醇：1,2己二醇：乙基己基甘油：去离子水＝5:3:0.05:91.95的比例，配制为Distek溶出仪同等含量比例条件下的提取物，对比计算提取率。
4.对比例3蒲公英提取物提取工艺：
提取溶剂：60％乙醇溶液；料液比：0.16:1；超声提取功率：1200W，提取时间：3h；提取温度：55℃；浓缩干粉后，以1,3丁二醇：1,2己二醇：乙基己基甘油：去离子水＝5:3:0.05:91.95的比例，配制为Distek溶出仪同等含量比例条件下的提取物，对比计算提取率。
5.对比例4蒲公英提取物提取工艺：
提取溶剂：90％乙醇溶液；料液比：0.16:1；超声提取功率：1200W，提取时间：3h，提取温度：55℃；浓缩干粉后，以1,3丁二醇：1,2己二醇：乙基己基甘油：去离子水＝5:3:0.05:91.95的比例，配制为Distek溶出仪同等含量比例条件下的提取物，对比计算提取率。
对比例给出了不同的试剂和条件，未说的同蒲公英提取物1中的条件。
按照表1中的比例采用1中的制备方法制备获得提取物1-19，对比例1-4，并将不同工艺下所得组合物进行下述时钟节律紊乱修复测试及安全性测试。
表1各工艺条件下提取参数
效果验证
在本发明采用上述工艺制备的植物提取物中，提取工艺参数确定及时钟节律紊乱修复测试方法和结果见后续实施例。
实施例2紫外分光光度计全波长长扫描确定提取工艺条件
全波长扫描：以提取溶剂做为空白样校准全波长扫描基线；以Distek药用溶出设备，提取溶剂为1,3丁二醇，1,2己二醇与乙基己基甘油及去离子水的复合溶剂，提取料液比为：0.02:1-0.16:1，提取时间：0.5-6h；提取温度25-55℃。如表1中各提取参数条件下获得的蒲公英提取物(本发明也称为植物提取物)全波长吸收峰面积积分。各工艺条件下峰面积与对比例1峰面积比值工艺确定条件。
实验结果：见表2，植物提取物1-19及对比例工艺参数：
1)料液比0.08:1条件下的即可达到溶解平衡，随着温度的提升，提取时间缩短；
2)在不同的工艺条件下，提取工艺条件范围优选为原料与提取溶剂的质量比为上述提取工艺料液比为：0.06:1-0.16:1，提取时间：0.5-6h；提取温度35-55℃。更优选为提取工艺料液比为：0.06-0.1:1，提取温度45-55℃，提取时间1.5-3h。具体优选实施例中，提取工艺料液比为：0.06:1，提取温度55℃，提取时间1.5h；提取工艺料液比为：0.10:1，提取温度45℃，提取时间3h。提取工艺料液比为：0.08:1，提取温度50℃，提取时间3h。
表2组合物1-19及对比例提取率
结果分析：同等料液比条件下，同等配方体系下，采用溶出仪溶出法的出的提取成分含量显著高于常规醇法活性成分含量。如提取物6，提取物11及提取物16与对比例2-4，显著的在新的提取工艺下的天然成分含量占比较高。
实施例3细胞毒性测评试验：
MTT assay是通过对活细胞数进行测定，在检测细胞毒性或细胞增殖时广泛使用的实验方法，其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase或mitochondrial dehydrogenase)能使水溶性的黄色盐MTT(3-[4,5-dimethlythiazole-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)还原为水不溶性的蓝色并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。生成的结晶甲臜(formazan)一般加入DMSO(dimethlysulfoxide)溶解后测定吸光度。具体的实验方法是在96well multi plate(corning)中按照1X104cells/well的密度接种含有10％牛血清的DMEM培养基和角质形成细胞(HaCaT)各100μL，培养24小时后换成无血清培养基。在无血清培养基中分别加入不同浓度的样品进行处理后培养24小时。之后去除培养基，用20μL的MTT溶液进行处理，在37℃下使其反应2小时。在去除MTT溶液的细胞中加入200μL异丙醇，轻轻地震荡30min，完全溶解结晶甲臜，在570nm处测定吸光度，根据如下公式计算细胞存活率。测定结果显示在权利要求工艺范围内，植物提取物在有效浓度下，细胞存活率均高于80％，表现出较低的细胞毒性；同时也对常规醇法提取工艺下的提取物进行了验证，安全性通过，但对时钟节律紊乱改善效果欠佳。
空白组不加入样品进行试验。细胞毒性相关结果见表3。
表3提取物5-19和对照组的MTT实验结果
实施例4安全性斑贴测试
滴加20μL的待测液于斑试器中，对照孔为空白对照(去离子水)；将加有受试物的斑试器贴到受试人员前臂屈侧，用手掌轻压，均匀贴敷于皮肤，持续24小时；分别于去除受试物斑试器后30min、24小时、48小时后按表4观察皮肤刺激性和致敏性，并记录结果。
表4皮肤封闭型斑贴试验皮肤反应分级标准
实验结果：对组合物17、18、19进行人体皮肤斑贴测试，结果见表5。人体皮肤斑贴试验结果显示，15人中无皮肤不良反应。
表5化妆品人体皮肤斑贴试验结果
实施例5蒲公英提取物对HaCaT细胞BMAL1表达测定
选用100μg/mL、200μg/mL蒲公英提取物为添加量标准。用不含血清的培养基对HaCaT细胞培养24h后，以PBS进行冲洗。
对照组1：不采用辐射诱导损伤和不采用溶出法蒲公英提取物处理HaCaT细胞；
对照组2：以紫外辐射量(12.5mJ/cm2)条件下进行模拟细胞损伤；
测试组1:对紫外辐射照射后的HaCaT细胞立即用100μg/mL剂量的溶出法蒲公英提取物处理并反应8h。
测试组2:对紫外辐射照射后的HaCaT细胞立即用200μg/mL剂量的溶出法蒲公英提取物处理并反应8h。
对处理后的细胞，采用试剂提取细胞的总RNA，以紫外分光光度计测定总RNA浓度，并利用PCR预混物将RNA合成cDNA，以合成的cDNA与BAML1预聚物以94℃30s进行30周期，60℃1min，72℃30s的条件下进行PCR。
通过RT-PCR检测BMAL1 mRNA的表达，如图1；在相同条件处理条件下采用WesternBlot测定BAML1的蛋白表达，如图2，两种测试结果下BMAL1蛋白表达量均向正常水平恢复。
通过qRT-PCR检测miR-142-3p的表达水平，经蒲公英提取物处理后的细胞，miR-142-3p的表达量具备向正常水平恢复的趋势，侧面反映了溶出法蒲公英提取物具有DNA损伤修复功效，具备时钟节律紊乱修复的能力，如图3。在对比常规醇法提取条件下，得到的蒲公英提取的miR-142-3p的表达水平修复上，溶出法显示出了更好的改善作用效果。
通过以上测试均可侧面反映出经溶出法蒲公英提取物处理过的细胞，具有在受到辐射损伤后，恢复正常水平的趋势的技术优势。
实施例6蒲公英提取物对损伤细胞的彗星拖尾试验测试
为了进一步评估溶出法蒲公英提取物对时钟节律紊乱的修复效果，通过彗星实验(Comet assay)测量了DNA短片。参照实施例4对照组1，2；测试组1，2对细胞的处理方案一致。
首先，用不含血清的培养基将HaCaT细胞培养24h后，用PBS冲洗。此后，将少量覆盖PBS的HaCaT细胞暴露在紫外灯辐射强度(12.5mJ/cm2)辐射后(对照组2，测试组1,2)，立即向细胞处理测试组1,2各相应浓度的蒲公英提取物，反应8h。之后收集对照组1,2和测试组1,2的各细胞，放置在CometslideTM载玻片上。将负载细胞的载玻片在4℃的lysis buffer中反应1h。然后，将各载玻片在重力状态的50V电压中进行电泳后，用蒸馏水和70％乙醇冲洗。最后，用SYBR green染色10min后，采用显微镜进行观察。结果显示受到辐射后的HaCaT细胞DNA出现拖尾现象，经蒲公英提取物处理后，拖尾现象有显著的抑制作用，显示了受损细胞DNA的修复趋势的能力及时钟节律紊乱修复效果，如图4所示。
此外应理解，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (12)
1.一种蒲公英提取物的制备方法，其特征在于，所述蒲公英提取物采用溶出提取设备制备，所述制备方法中提取溶剂为1,3丁二醇，1,2己二醇与乙基己基甘油及去离子水组成的复合溶剂。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，所述蒲公英提取物提取自蒲公英干燥全草，所述蒲公英为菊科植物蒲公英或碱地蒲公英。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(a)取蒲公英干燥全草，粉碎至0.1mm以下，灭菌；
(b)在灭菌后的粉碎蒲公英中加入提取溶剂，并用溶出提取设备提取粗提液；
(c)微滤膜负压过滤步骤(b)获得的粗提液二次后得到粗滤液；
(d)步骤(c)中的粗滤液中加入提取溶剂后，采用超滤膜过滤，获得最终产品，即蒲公英提取物。
4.如权利要求1-3任一权利要求所述的制备方法，其特征在于，所述提取溶剂的组成为：
1,3丁二醇，5％；
1,2己二醇，3％；
乙基己基甘油，0.05％；
其余为去离子水，以上为重量百分比；所述提取溶剂经灭菌后使用。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述溶出提取设备提取蒲公英提取物时，提取料液比为：0.06:1-0.16:1，提取时间：0.5-6h；提取温度35-55℃；步骤(d)中所述提取溶剂的加入量为粗滤液的0.2-2倍。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述提取料液比为：0.06-0.1:1，提取温度45-55℃，提取时间1.5-3h，所述溶出提取设备为药物溶出仪；所述微滤膜孔径为0.1-1.0μm；所述超滤膜孔径为0.01-0.05μm；所述步骤(d)中所述提取溶剂的加入量为粗滤液的0.2-2倍。
7.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述提取料液比为：0.06:1，提取温度55℃，提取时间1.5h；所述步骤(c)中先将粗提液冷却至20-30℃，以微滤膜负压过滤，得第一次滤液；将第一次滤液离心20-50min，转速为5000-8000rpm，用微滤膜进行第二次负压过滤，收集滤液，得粗滤液。
8.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述料液比为：0.10:1，提取温度45℃，提取时间3h；所述步骤(c)中先将粗提液冷却至20-30℃，以微滤膜负压过滤，得第一次滤液；将第一次滤液离心20-50min，转速为5000-8000rpm，用微滤膜进行第二次负压过滤，收集滤液，得粗滤液。
9.如权利要求5或6所述的制备方法，其特征在于，所述料液比为：0.08:1，提取温度50℃，提取时间3h；所述步骤(c)中先将粗提液冷却至20-30℃，以微滤膜负压过滤，得第一次滤液；将第一次滤液离心20-50min，转速为5000-8000rpm，用微滤膜进行第二次负压过滤，收集滤液，得粗滤液。
10.如权利要求1-3、5或6任一权利要求所述的制备方法制备的蒲公英提取物。
11.一种具备时钟节律紊乱修复功效的组合物，其特征在于，所述组合物含有重量百分比1％-5％的范围内权利要求10所述的蒲公英提取物和赋形剂。
12.如权利要求10所述蒲公英提取物在制备化妆品中的应用。
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