CN107014936B - 尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，包括如下步骤：样品前处理：取尿液样品，加入去离子水稀释，所述尿液样品与所述去离子水的体积比为1:1‑2；然后加入内标液，所述尿液样品与所述内标液的体积比为1:1‑3，得待测样品；富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。上述检测方法的定量限为0.0975μg/L，检测限为0.0249μg/L，精密度RSD<11％，加标回收率在89％‑110％之间，前处理时间约1.2min，检测效率高，精密度高、灵敏度高、检测通量高、成本低。
Description
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，特别是涉及一种尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法。
背景技术
尿液中褪黑素硫酸盐(MT6s)是褪黑素的主要代谢产物，通过检测尿液中 MT6s可以间接反映人体内MT水平。褪黑激素(Melatonine，MT)因为能使皮肤变白而得名，是由脑松果体分泌的激素之一。褪黑激素属于吲哚杂环类化合物，其化学名是N-乙酰基-5-甲氧基色胺，又称为松果体素、褪黑素。褪黑素合成后，储存在松果体内，交感神经兴奋支配松果体细胞释放褪黑素人血。褪黑素的分泌具有明显的昼夜节律，白天分泌受抑制，晚上分泌活跃。褪黑素可抑制下丘脑-垂体-性腺轴，使促性腺激素释放激素、促性腺激素、黄体生成素以及卵泡雌激素的含量均减低，并可直接作用于性腺，降低雄激素、雌激素及孕激素的含量。另外，MT有强大的神经内分泌免疫调节活性和清除自由基抗氧化能力，可能会成为新的抗病毒治疗的方法和途径。MT最终在肝脏中代谢，肝细胞的损伤可影响体内MT的水平。
目前尿液中褪黑素硫酸盐检测主要采用传统的放免法、酶联免疫、化学发光或者液相色谱的方法检测尿液样本中的褪黑素硫酸盐，鲜少有液相色谱串联质谱法，且普遍存在：1.尿液样本的运输和保存条件严格运输不方便；2.褪黑素硫酸盐浓度较低一般为ppb级别，且极性强，人体尿液组成复杂存在大量的结构相似的化合物，因此传统方法检测存在严重的基质干扰，特异性差，灵敏度低，准确度低等缺点。3.色谱或者质谱法存在前处理复杂，操作繁琐，周期长，检测通量小。
发明内容
基于此，本发明的目的是提供一种灵敏度高、特异性强、通量高的褪黑素硫酸盐的检测方法。
具体的技术方案如下：
一种尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，包括如下步骤：
样品前处理：取尿液样品，加入去离子水稀释，所述尿液样品与所述去离子水的体积比为1:1-2；然后加入内标液，所述尿液样品与所述内标液的体积比为1:1-3，得待测样品；
富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测。
在其中一些实施例中，所述富集、分离和检测的步骤包括：
先用流动相1洗脱富集柱中的所述待测样品，对所述待测样品进行富集、纯化；
将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物从富集柱洗脱至分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离；
断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；
其中，富集柱为C8柱，分析柱为C18柱；
流动相1：A相为乙腈，B相为水，流速为1.0-2.0ml/min；
流动相2：C相为含0.09-0.3wt％甲酸的乙腈，D相为含0.09-0.2wt％甲酸和 5-10mM醋酸铵的水，流速为0.2-1.0ml/min。
所述的二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪配置了两套泵，两套泵通过六通阀(或者其它可实现切换的方式)实现切换。起始模式下，富集柱与分析柱处于未连通状态，待测样品经进样器进入富集柱进行富集、纯化后，0.25min切换六通阀使富集柱与分析柱连通，将待测样品洗脱至分析柱，0.8min六通阀切回起始模式，断开富集柱与分析柱，待测物在分析柱中经梯度洗脱至分离后进入质谱进行检测，富集柱中的残留杂质经梯度洗脱至废液瓶中。
在其中一些实施例中，流动相采用梯度洗脱模式：
0min时，通入流动相1淋洗富集柱，对富集柱中的待测样品进行富集、纯化，流动相1中A相与B相的体积比为100:0；
0.25min时，将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物从富集柱洗脱至分析柱，流动相2中C相与D相的体积比为98:2；
0.3min时，流动相2中C相与D相的体积比为70:30；
0.3min-0.5min时，流动相2中C相与D相的体积比由70:30变化至50:50；
0.8min时，断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测，流动相2中C相与D相的体积比为50:50；用流动相 1将富集柱中的残留杂质洗脱至废液瓶中；
1.6min时，流动相2中C相与D相的体积比为50:50；
1.6min-3.0min时，流动相2中C相与D相的体积比由50:50变化至37:63；
3.1min时，流动相2中C相与D相的体积比为5:95；
3.7min时，流动相2中C相与D相的体积比为98:2；
整个梯度时间为4.5-7.0min。
在其中一些实施例中，所述流动相1的流速为1.2-1.3ml/min，所述流动相2 的流速为0.4-0.6ml/min。
在其中一些实施例中，所述内标液为含10-50μg/L内标物的乙腈溶液；所述内标物为褪黑素的C13标记物或氘代标记物。
在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM；
所述正离子模式中，目标定量离子对包括褪黑素D4定量离子对和/或褪黑素硫酸盐定量离子对；
目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：褪黑素硫酸盐的母离子的质/荷比为328.9-329.5，对应的子离子的质/荷比为189-191；褪黑素D4的母离子的质/荷比为236.8-237.5，对应的子离子的质/荷比为 177.8-178.5。
在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件还包括以下离子源参数：
电离源为电喷雾电离ESI源，气帘气压力为35-45psi，加热气压力为 35-45psi，辅助加热气压力为55-65psi，加热气温度为450-550℃，碰撞气为氮气，碰撞气压力为6.0-8.0psi，电喷雾针电压为5000-6000V。
在其中一些实施例中，所述四级杆质谱条件还包括：
尿液中褪黑素硫酸盐定量离子对的去簇电压为70-90V，入口电压为8-12V，碰撞电压为25-35V，出口电压为8-12V；褪黑素D4的定量离子对的去簇电压为 60-70V，入口电压为6-10V，碰撞电压为6-15V，出口电压为18-25V。
在其中一些实施例中，所述样品前处理步骤为：
取尿液样品，将滤纸片浸入所述尿液样品中，取出，晾干，得尿纸片；
用去离子水洗脱所述尿纸片得洗脱液，于所述洗脱液中加入所述内标液混匀，离心得待测样品；
所述洗脱液与所述内标液的体积比为1:1-3。
在其中一些实施例中，所述离心的条件为：温度0-5℃，转速 11000-13000r/min，时间4-8min。
上述尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法具有以下优点和有益效果：
(1)上述检测方法的样品前处理步骤简单只需将尿液样品稀释后即可上机，不需要萃取，氮吹浓缩，复溶等，处理时间短，处理单个样本只需1.0-2.5min，处理一批(20个)也只需要3-10min，而常用的萃取法处理单个样本至少需90min，处理一批(20个)也至少需要120min。即本发明的检测方法大大缩短了检测时间，提高了样本的检测通量。
(2)上述检测方法在仪器投入方面比普通的液相色谱串联四级杆质谱仪仅增加了一个富集柱和一组泵起到了提纯，浓缩的效果，并且采用的富集柱简单、成本低且可重复使用数千次以上，大大提高了检测效率、灵敏度、精密度等。
(3)上述检测方法富集、分离和检测的各参数(比如富集柱的选择、流动相的选择、流速等条件)进行了大量实验研究进行优化，使最后得到的检测方法可以有效去除基质干扰，特异性、抗基质干扰能力强。定量限低，灵敏度高，精密度RSD小于10％，可以准确的定性或定量检测出尿液中褪黑素硫酸盐检测含量。即与常用的检测相比，上述检测方法检测灵敏度高、精密度高、特异性强。
(4)上述检测方法还可以将尿液样品制作为尿纸片，测试者可以在家自己采集样本晾干后寄送至实验室，样本采集便捷，运输方便。
附图说明
图1为实施例1人尿液中褪黑素硫酸盐及其内标物的TIC图；
图2为实施例1褪黑素硫酸盐的线性回归曲线图；
图3为线性验证的线性回归曲线图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例的褪黑素硫酸盐的检测方法，包括以下步骤：
一、样品采集
采集某个时间(通常为：早上5-7点、早上7-9点、下午4-6点(16-18点)、晚上10-12点(22-24点)四个时间点，该时间段的数值能够比较真实反映出人体一天中褪黑素水平的变化情况)的尿液于尿杯中并将滤纸片浸入尿液中，待纸片上的尿液蔓延至刻度时取出尿纸片，自然晾干。
二、样品前处理
移取1mL的离子水洗脱尿纸片，洗脱2次，于离心机5000r/min，4℃离心分离10min，得到洗脱液，在洗脱液中加入等体积的内标液(内标液为含20μ g/L内标物的乙腈溶液；所述内标物为褪黑素的C13标记物或氘代标记物)，漩涡混匀60s后，于离心机12000r/min，4℃离心分离5min，取200μl上清液至棕色进样瓶中，即得待测样品，将其加载至液相色谱自动进样器中。
可以理解的，尿液样品也可以直接经过去离子水稀释(二者体积比为1:1)，然后加入内标液(尿液样品与内标液的体积比为1:3)，混匀离心后得待测样品。
对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离提纯和检测，方法简单，时间短通量高，灵敏度和特异性高，准确度和精密度好。通过检测得到尿液中褪黑素硫酸盐的浓度并与尿液中肌酐进行比值得到最终的结果。
二、富集、分离和检测
自动进样器自动将50ul待测样品加载到二维液相色谱系统中，对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱仪LC-MS/MS进行富集、分离与检测。
该系统配置了两套泵，两套泵通过一个六通阀实现切换(也可以通过两个六通阀或者其它的方式进行切换)，六通阀3号位连接FLOW1(流动相1)，1 号和4号位连接富集柱，5号位连接FLOW2(流动相2)，6号位连接分析柱，2 号位连接废液瓶。
其中，富集柱为C8-Phenyl(4×2.0mm)，分析柱为C18(50×2.0mm，3μm)；流动相1：A相为乙腈，B相为水，流速为1.20ml/min；流动相2：C相为含0.1％甲酸的乙腈，D相为含0.1％甲酸和9mM醋酸铵的水，流速为0.5ml/min；柱温为40℃。
六通阀的起始模式为0，即富集柱与分析柱处于未连通状态，待测样品经进样器进入富集柱进行富集、纯化，此过程中富集柱用FLOW1流动相进行洗脱； 0.25min切换六通阀为1，即富集柱与分析柱连通，将待测样品洗脱至分析柱，此过程中富集柱与分析柱中的洗脱流动相均为FLOW2流动相；0.8min六通阀切回起始模式0，断开富集柱与分析柱，待测物在分析柱中经梯度洗脱(流动相为 FLOW2流动相)至分离后进入质谱进行检测，富集柱中的残留杂质经梯度洗脱 (流动相为FLOW1流动相)至废液瓶中。流动相的梯度洗脱如表1所示。
表1流动相的洗脱梯度
上述梯度下，褪黑素硫酸盐的保留时间为2.29min。
本实施例LC-MS/MS采用具有电喷雾电离源(ESI)的Applied BiochemistryAPI4500 plus串联质谱分析仪作为检测器进行分析。其中，气帘气压力为25psi；加热气压力为35psi；辅助加热气压力为40psi；加热气温度为400℃；碰撞气为高纯氮气，压力为7psi；电喷雾针电压为5000V。
其它质谱条件：采用正离子模式，扫描方式采用多反应监测离子扫描MRM，其条件参见表2。
表2多反应监测离子扫描MRM条件
待测物随流动相流出分析柱后，在压力的作用下进入质谱仪离子源，由六通阀控制进入离子源的样品通道，和进入切换时间。在离子源内液体样品被汽化并且电离为带电分子，带电分子在电压和真空作用下，进入Q1、Q2和Q3，其中，Q1和Q3为质量过滤器，只允许根据25羟基维生素D及其内标物的质荷比选择的母离子和子离子通过，Q2为碰撞单元，母离子在此处与惰性气体原子碰撞，产生特定的碎片离子。质谱仪的第一个四极(Q1)选择具有25羟维生素 D及其内标物的特定质荷比m/z的母离子，具有这些m/z比的母离子被允许进入Q2，Q2产生的碎片离子进入到Q3，其中25羟维生素D及其内标物的碎片离子(子离子)被选择通过，而其它离子被除去。参见表3，示出了被用于鉴别和定量的褪黑素硫酸盐的离子对的质荷比m/z。
表3MT6s的质量转变表
| 被分析物 | Q1母离子(m/z) | Q3子离子(m/z) |
| 褪黑素硫酸盐 | 329.2 | 190 |
| 褪黑素硫酸盐内标 | 327.1 | 178.1 |
随着离子与检测器碰撞，它们将捕获到的离子数转化成数字信号的电子脉冲。所获得的数据被传递到计算机，其将所收集的离子数对时间作图，即得总离子流图(TIC图)(如图1所示)。
三、定性判断和定量计算
(1)依据褪黑素硫酸盐标准品的相对保留时间和检测的定量离子对与定性离子对的丰度比判断褪黑素硫酸盐的存在。
在相同试验条件下，检测样品中被测目标物质的质量色谱峰保留时间与标准溶液中对应物质的质量色谱峰保留时间一致；检测样品的色谱图中所选择的检测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子对相对丰度比的偏差(即表 4中的最大允许误差)不超过表4规定的范围，则可以判断样品中存在对应的目标物质。
表4定性判断相对丰度的最大允许误差
| 相对丰度(K) | K≥50％ | 20％≤K≤50％ | 10％≤K≤20％ | K≤10％ |
| 最大允许误差 | ±20％ | ±25％ | ±30％ | ±50％ |
(2)采用内标标准曲线法定量，以褪黑素硫酸盐与内标物的峰面积比值计算样品中的褪黑素硫酸盐的含量。
配置系列浓度的含有褪黑素硫酸盐的标准溶液，用本实施例的上述方法进行样品前处理以及分离检测，以标准溶液中褪黑素硫酸盐和内标物的峰面积的比值构建内标标准曲线，褪黑素硫酸盐的
标准曲线见图2，曲线的方程Y＝0.0033X+2.4e-6，R＝0.9993然后利用该标准曲线计算待测样品或质量控制物中的褪黑素硫酸盐的浓度。
本实施例测得褪黑素硫酸盐的峰面积为7.79e+004，其内标物的峰面积为 5.53e+005，计算得到本实施例的尿液样品中褪黑素硫酸盐的浓度为42.6ug/L；肌酐检测的肌酐为2.0g/L，那么最终得到尿液中褪黑素硫酸盐的结果为21.3ug/g 肌酐(μg/g Cr)。
实施例2方法学验证实验
本实施例对实施例1中的褪黑素硫酸盐的检测方法进行方法学验证实验。
1、精密度(Precision)实验
1.1批内精密度(Intra-assay)
a.取实际尿液样本分别加标至低、中、高三水平，得到的样本进行批内精密度实验；
b.每个浓度水平的样本平行处理20个，每个进样1次；
c.计算检测结果的平均值及相对标准偏差(RSD)，要求RSD小于20％；
d.表5即为批内精密度数据，批内精密度均小于6％，满足要求。
表5褪黑素硫酸盐的批内精密度实验结果
1.2批间精密度(Inter-assay)
a.取预先配制好的低、中、高三水平的质控品，进行批间精密度实验；
b.每个水平的样本分别做4个平行，即检测得4组数据，连续测定5天；
c.计算检测结果的平均值及相对标准偏差(RSD),要求RSD小于20％；
d.表6即为批间精密度数据，批间精密度均小于11％，满足要求。
表6褪黑素硫酸盐批间精密度实验结果
2、分析灵敏度和线性范围(Analytical Sensitivity and AnalyticalMeasurement Range and Linearity Study)
2.1方法定量限与线性范围(Limit of Quantitation and Linearity)
a.配制空白基质；
b.配置标准曲线；
c.每个浓度的样本平行处理6个，分别检测一次；
d.计算各浓度样本的平均值、RSD和回收率；
e.方法定量限的确定标准：RSD小于20％且回收率在85％-115％范围内的最低浓度点视为定量限浓度，即LOQ；
f.线性范围的确定标准：RSD小于20％，回收率在85％-115％范围内，且以理论浓度比率与实际信号响应峰面积比率绘制成的回归曲线R2>0.98，即满足线性范围的要求；
g.验证实验数据如表8和图3，MT6s的LOQ为0.0975ug/L，线性范围为 0.0975-200ug/L。
表7回归曲线中的曲线点浓度
表8 MT6s定量限实验结果
2.2方法检出限(Limit of Detection)
a.收集浓度均在定量限LOQ附近的病人样本；
b.平行处理此病人样本20个，分别检测1次；
c.计算各浓度样本的平均值、SD和方法检出限(LOD)；
d.实验结果如表9所示，MT6s的LOD为0.0249ug/L。
表9 MT6s方法检出限试验结果
2.3结论(Summary of the AMR study)
表10 MT6s分析灵敏度与线性范围结果汇总
3、方法准确度-回收率(Recovery)
a.收集一批混合尿液样本，测得基础浓度，分别加标至高、中、低三水平的样本，进行加标回收率实验；
b.未加标及加标样品，每个平行处理3个，分别进行检测，计算加标样品的回收率结果，回收率在85-115％范围内，认为方法准确；
c.回收率实验结果如表11所示。由结果可知，方法的回收率在89.94～ 109.10％之间，满足要求。
表11褪黑素硫酸盐加标回收率试验结果
由上述的检测结果显示本发明的褪黑素硫酸盐的检测方法检测尿液样品或者质控物质结果准确，定量限为0.0975μg/L，检测限为0.0249μg/L，精密度 RSD<11％，加标回收率在89％-110％之间，前处理时间约1.2min，检测效率高。说明本方法准确可靠，精密度高、灵敏度高、检测通量高、成本低。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (8)
1.一种尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
样品前处理：取尿液样品，加入去离子水稀释，所述尿液样品与所述去离子水的体积比为1:1-2；然后加入内标液，所述尿液样品与所述内标液的体积比为1:1-3，得待测样品；
富集、分离和检测：对所述待测样品采用二维液相色谱串联四级杆质谱联用仪进行富集、分离和检测；
所述富集、分离和检测的步骤包括：
先用流动相1洗脱富集柱中的所述待测样品，对所述待测样品进行富集、纯化；
将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物从富集柱洗脱至分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离；
断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测；
其中，富集柱为C8柱，分析柱为C18柱；
流动相1：A相为乙腈，B相为水，流速为1.0-2.0ml/min；
流动相2：C相为含0.09-0.3wt％甲酸的乙腈，D相为含0.09-0.2wt％甲酸和5-10mM醋酸铵的水，流速为0.2-1.0ml/min；
流动相采用梯度洗脱模式，所述梯度洗脱模式为：
0min时，通入流动相1淋洗富集柱，对富集柱中的待测样品进行富集、纯化，流动相1中A相与B相的体积比为100:0；
0.25min时，将富集柱与分析柱连通，用流动相2将待测物从富集柱洗脱至分析柱，流动相2中C相与D相的体积比为98:2；
0.3min时，流动相2中C相与D相的体积比为70:30；
0.3min-0.5min时，流动相2中C相与D相的体积比由70:30变化至50:50；
0.8min时，断开富集柱与分析柱，用流动相2将待测物从分析柱洗脱、分离至四级杆质谱进行检测，流动相2中C相与D相的体积比为50:50；用流动相1将富集柱中的残留杂质洗脱至废液瓶中；
1.6min时，流动相2中C相与D相的体积比为50:50；
1.6min-3.0min时，流动相2中C相与D相的体积比由50:50变化至37:63；
3.1min时，流动相2中C相与D相的体积比为5:95；
3.7min时，流动相2中C相与D相的体积比为98:2；
整个梯度时间为4.5-7.0min。
2.根据权利要求1所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，所述流动相1的流速为1.2-1.3ml/min，所述流动相2的流速为0.4-0.6ml/min。
3.根据权利要求1或2所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，所述内标液为含10-50μg/L内标物的乙腈溶液；所述内标物为褪黑素的C13标记物或氘代标记物。
4.根据权利要求1或2所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件为：正离子模式，扫描方式为多反应监测离子扫描MRM；
所述正离子模式中，目标定量离子对包括褪黑素D4定量离子对和/或褪黑素硫酸盐定量离子对；
目标定量离子的多反应监测离子扫描MRM的质/荷比条件包括：褪黑素硫酸盐的母离子的质/荷比为328.9-329.5，对应的子离子的质/荷比为189-191；褪黑素D4的母离子的质/荷比为236.8-237.5，对应的子离子的质/荷比为177.8-178.5。
5.根据权利要求4所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件还包括以下离子源参数：
电离源为电喷雾电离ESI源，气帘气压力为35-45psi，加热气压力为35-45psi，辅助加热气压力为55-65psi，加热气温度为450-550℃，碰撞气为氮气，碰撞气压力为6.0-8.0psi，电喷雾针电压为5000-6000V。
6.根据权利要求4所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，所述四级杆质谱条件还包括：
尿液中褪黑素硫酸盐定量离子对的去簇电压为70-90V，入口电压为8-12V，碰撞电压为25-35V，出口电压为8-12V；褪黑素D4的定量离子对的去簇电压为60-70V，入口电压为6-10V，碰撞电压为6-15V，出口电压为18-25V。
7.根据权利要求1或2所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，所述样品前处理步骤为：
取尿液样品，将滤纸片浸入所述尿液样品中，取出，晾干，得尿纸片；
用去离子水洗脱所述尿纸片得洗脱液，于所述洗脱液中加入所述内标液混匀，离心得待测样品；
所述洗脱液与所述内标液的体积比为1:1-1:3。
8.根据权利要求7所述的尿液中褪黑素硫酸盐的检测方法，其特征在于，所述离心的条件为：温度0-5℃，转速11000-13000r/min，时间4-8min。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102006012171A1 (de) * | 2006-03-14 | 2007-09-20 | Bieger, Wilfried P., Priv.-Doz. Dr.med.habil. | Verfahren und Testbestecks zur Bestimmung von neuroendokrinen gesundheitlichen Störungen |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102006012171A1 (de) * | 2006-03-14 | 2007-09-20 | Bieger, Wilfried P., Priv.-Doz. Dr.med.habil. | Verfahren und Testbestecks zur Bestimmung von neuroendokrinen gesundheitlichen Störungen |
| CN105891364A (zh) * | 2016-04-11 | 2016-08-24 | 北京洛奇临床检验所股份有限公司 | 高效液相色谱串联质谱技术检测唾液中褪黑素的方法及试剂盒 |
| CN106198784A (zh) * | 2016-06-28 | 2016-12-07 | 扬州大学 | 一种高效、准确检测芍药中褪黑素含量的方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| A novel LC–MS/MS assay for the simultaneous determination of melatonin and its two major metabolites, 6-hydroxymelatonin and 6-sulfatoxymelatonin in dog plasma: Application to a pharmacokinetic study;Huimin Zhao et al.;《Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis》;20151228;第117卷;390–397页 * |
| Anna Maria Sniecinska-Cooper et al..Determination of urinary cortisol, cortisone and 6-sulfatoxymelatonin using dilute and shoot ultra-high pressure liquid chromatography–tandem mass spectrometry.《Journal of Chromatography B》.2014,"ABSTRACT"，第19-21页第2-3节. * |
| Determination of urinary cortisol, cortisone and 6-sulfatoxymelatonin using dilute and shoot ultra-high pressure liquid chromatography–tandem mass spectrometry;Anna Maria Sniecinska-Cooper et al.;《Journal of Chromatography B》;20141203;"ABSTRACT"，第19-21页第2-3节 * |
| 褪黑激素的高效液相色谱分析;陈伟 等;《药学进展》;19971231;第21卷;164-168页 * |
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| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 510700 Room 501, Building G7, 31 Kefeng Road, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province Applicant after: Guangzhou Bohou Health Technology Co.,Ltd. Address before: 510663 Guangdong province Guangzhou Science City, Guangzhou hi tech Industrial Development Zone, No. 31 building G1 room 701 Ke Feng Lu Applicant before: Guangzhou Bohou Health Technology Co.,Ltd. |
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| CB02 | Change of applicant information | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Method for detecting melatonin sulfate in urine Effective date of registration: 20230414 Granted publication date: 20200407 Pledgee: China Construction Bank Corporation Guangzhou Development Zone Branch Pledgor: Guangzhou Bohou Health Technology Co.,Ltd. Registration number: Y2023980038135 |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 510000 Room 501, building G7, 31 Kefeng Road, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province Patentee after: BIOHOP HEALTH TECHNOLOGIES CO.,LTD. Address before: 510700 Room 501, building G7, 31 Kefeng Road, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province Patentee before: Guangzhou Bohou Health Technology Co.,Ltd. |