CN116758975B - 梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药效果检测技术领域，公开了一种梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，包括如下步骤：S1：构建陈化六堡茶提取物康养动物模型，满足“卷积神经网络‑靶向氨基酸代谢组学”关系模型、区分不同陈化六堡茶防治效果；S2：构建“差异代谢产物‑通路‑靶点”网络分析模型；S3：对特异性生物标记物‑氨基酸进行靶向测定，获得靶向测定结果数据；S4：对靶向氨基酸代谢组学数据进行处理与分析，得到作用机制模型，完成区分不同陈化六堡茶提取物干预下，岭南特色湿热证及其防治效果的检测识别。本发明采用多种现代技术手段和理论，探明了六堡茶防治岭南特色湿热证的中医药机理及效果，为六堡茶产业康养开发利用奠定基础。

Description

梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法
技术领域
本发明涉及医药效果检测技术领域，特别涉及一种基于卷积神经网络的梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法。
背景技术
我国南方大多处于亚热带季风气候，特别是岭南地区，常年气候炎热，潮湿多雨，加之现代社会生活节奏加快、饮食结构的改变，形成并加速了“湿、热”并存的特点。湿热证，是岭南地区常见病证，一般好发于春夏季梅雨季节。岭南人脾胃较弱，常有湿热内积，卫气虚弱则易感外邪；岭南气候炎热潮湿，湿热之邪易袭人体；内外合邪，郁结为疾。清代薛生白《湿热论》指出：“要知湿热之病，不独与伤寒不同，且与温病大异”，又“湿热病，属阳明，太阴者居多”。根据岭南地区3000人的中医体质调查，在内外湿的作用下，当地长期居住的人群以湿热体质居多。湿热证是一种病理状态，它是由于机体湿气和热毒过多所引起的一系列疾病，常表现为头重身困、脘腹胀满、发热、大便黏腻、小便赤黄等湿热熏蒸之外候。
目前中医在岭南特色湿热证的治疗上主要以芳香化湿、健脾行气,同时兼具清热生津为法，多选用清热解毒、淡渗利湿类药物, 但此类药物性多寒凉, 长期服用易损伤脾胃功能。随着现代技术的发展，人们对茶的养生保健功能以及药用价值的认识在不断加深。六堡茶作为中国六大黑茶之一，含多酚类、黄酮类、咖啡碱、游离氨基酸及他汀类等化合物。研究发现六堡茶具有清热祛湿，健脾和胃的功效。因此六堡茶可作为药食同源产品之一，用于改善岭南特色湿热证。
近年来人们对茶的养生保健功能以及药用价值的认识在不断加深，经过三年及以上陈化的陈化六堡茶在梧州民间被视为防病治病的良药。六堡茶作为中国六大茶之一黑茶中特有品种，其提取物含多酚类、黄酮类、咖啡碱、游离氨基酸及他汀类等。六堡茶，是广西壮族自治区梧州市特产，中国国家地理标志产品。陈化六堡茶属黑茶类，选用苍梧县群体种、广西大中叶种及其分离、选育的品种、品系茶树的鲜叶为原料，按特定的发酵等工艺进行加工，具有独特品质特征的黑茶。现有研究发现，陈化六堡茶最大的特点是祛湿、调肠胃，降三高功效明显。湿气在中医里叫“六邪”之一，跟“风”结合叫“风湿”，跟“热”结合成为“湿热”，人体的湿气在中医里是最难以调理的症结，湿气重的人煮着喝陈化六堡茶很快就见效。但是，基于诸多的技术困难，目前一方面基于代谢学的陈化六堡茶改善岭南特色湿热证的作用（干预）机理尚未探明，另一方面，医学上还缺乏使用陈化六堡茶作为手段、准确的识别患者是否患有岭南特色湿热证的研究和实验数据等支撑，限制了陈化六堡茶在中医药、康养等领域的深入开发、利用，不利于六堡茶的专业化、产业化、规模化和持久性发展。
因此，需要采用现代技术手段和理论，对陈化六堡茶提取物调控岭南特色湿热证的作用机理和效能，进行准确的检验、分析与验证，才能为对六堡茶产品的深度的医用和药用开发、利用，提供有力的试验与数据基础支持。
发明内容
针对现有技术的上述不足，本发明提供一种基于卷积神经网络的梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，基于“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”建立区分岭南特色湿热证和陈化六堡茶康养动物模型的识别方法，筛选梧州产陈化六堡茶调控岭南特色湿热证模型大鼠的潜在生物标记物，基于靶向代谢组学检测六堡茶干预湿热证大鼠血清中氨基酸含量，最终通过该模型实现对湿热证候模式大鼠和经陈化六堡茶康养作用后大鼠的识别，探明梧州陈化六堡茶防治岭南特色湿热证的中医药机理及效果，为梧州六堡茶产业康养开发利用奠定基础。
本发明为实现上述目的而采用的技术方案为：
一种基于卷积神经网络的梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，其特征在于：其包括如下步骤：
S1：构建动物模型：构建陈化六堡茶提取物康养动物模型，使其满足“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型、区分不同陈化六堡茶提取物干预、防治岭南特色湿热证效果的要求，将大鼠分为对照组、模型组和实验组，分别用不同的饲料进行喂养；其中对照组正常喂养，模型组进行湿热证建模，实验组在湿热证建模的基础上，分别用含有不同剂量的陈化六堡茶提取物的饲料进行喂养、干预；
S2：构建网络分析模型：根据网络药理学选取陈化六堡茶提取物中活性成分作用靶点，筛选陈化六堡茶提取物干预岭南特色湿热证大鼠的特异性生物标记物，构建出“差异代谢产物-通路-靶点”的网络分析模型；
S3：进行靶向测定：收集大鼠的血清，采用非靶向代谢组学技术检测大鼠血清样本，利用三重四级杆液质联用对特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定，获得特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定结果数据；
S4：岭南特色湿热证及其防治效果识别：将特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定结果数据输入到网络分析模型中，计算后获得靶向氨基酸代谢组学数据；将靶向氨基酸代谢组学数据导入“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型，对靶向氨基酸代谢组学数据进行处理与分析，得到陈化六堡茶提取物干预岭南特色湿热证的作用机制模型，通过不同浓度的陈化六堡茶提取物的干预，完成区分是否罹患岭南特色湿热证及对该证防治效果的识别。
本发明提供的基于卷积神经网络的梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，其有益效果为：
1. 本发明采用多种现代检测、分析等技术手段和理论，基于梧州产陈化六堡茶康养动物模型和“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”模型，建立区分不同六堡茶防治岭南特色湿热证效果的识别方法，筛选梧州产陈化六堡茶调控岭南特色湿热证模型大鼠的潜在生物标记物，基于靶向代谢组学检测梧州六堡茶干预湿热证大鼠血清中氨基酸含量，最终通过该模型实现对湿热证候模式大鼠和经六堡茶康养作用后大鼠的识别，探明梧州产陈化六堡茶防治岭南特色湿热证的中医药机理和效果，实现区分大鼠是否罹患岭南特色湿热证及对该证防治效果的识别，能够为梧州六堡茶产业的专业化康养开发和精准利用奠定基础。
2.本发明首先基于特别构建的“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”分析模型，建立一种采用动物模型进行区分岭南特色湿热证及防治效果的识别方法，通过现代检测与科学研究方法，发现和阐明陈化六堡茶对岭南特色湿热证的识别和干预作用、干预效果；在实验中结合中医治疗湿证经验和非靶向代谢组学检测技术，对六堡茶识别、干预岭南特色湿热证的大鼠进行实验、分析和研究，全面、高效地分析六堡茶在大鼠等生物体内的代谢物谱，再进一步通过分析代谢物谱的变化，揭示生物体内的代谢途径和代谢产物，进而深入探明湿热证的发病机制和治疗效果，为六堡茶在岭南湿热症的应用奠定基础。而现有技术中，尚未发现使用代谢组学方法并结合动物模型，研究不同浓度、生物属性的陈化六堡茶在识别、防治湿热证作用进行研究的报导。
3. 本发明运用非靶向代谢组学技术检测大鼠血清样本，筛选六堡茶干预岭南特色湿热证大鼠的特异性生物标记物。根据网络药理学，构建“差异代谢产物-通路-靶点”的网络，利用三重四级杆液质联用对特异性生物标志物进行靶向测定，揭示不同属性的六堡茶干预岭南特色湿热证的作用机制、作用效果。本发明采用的三重四级杆液质联用建立差异代谢产物的靶向测定，旨在通过对特征性生物标志物群，进行一个体内效应物质谱的精细表征，使得结果更符合循证、精准医学的理论导向。基于“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”建立六堡茶康养动物识别模型，进行岭南特色湿热证及其防治效果的识别，通过该模型实现对湿热证候模式大鼠和经六堡茶康养作用后大鼠的对比效果识别，能够为六堡茶产业的康养开发利用奠定研究基础。目前为止，尚未发现使用“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”方法研究陈化六堡茶防治湿热证作用及的相关报导。
4. 本发明建立了一种区分岭南特色湿热证与六堡茶康养动物模型相结合的实验、实证识别方法，可有效分辨未知大鼠的组别。本发明建立了六堡茶干预湿热证的代谢轮廓，寻找确定了特异性生物标志物，系统性挖掘六堡茶多靶点多通路治疗湿热证的作用机制和作用效果，能够为六堡茶作为一种潜在的药食同源产品改善湿热证相关疾病提供科学依据。
附图说明
图1是本发明实施例中非靶向代谢组学质控样品正离子模式下总离子流叠加图；
图2 是本发明实施例中非靶向代谢组学质控样品负离子模式下总离子流叠加图；
图3为本发明实施例中非靶向代谢组学数据空间分布可视化结果的正离子模式PCA得分图；
图4为本发明实施例中非靶向代谢组学数据空间分布可视化结果的正离子模式PLS-DA得分图；
图5为本发明实施例中非靶向代谢组学数据空间分布可视化结果的负离子模式PCA得分图；
图6为本发明实施例中非靶向代谢组学数据空间分布可视化结果的负离子模式PLS-DA得分图；
图7为本发明实施例中实验组与模型组 OPLS-DA得分图中的正离子模式图；
图8为本发明实施例中实验组与模型组 OPLS-DA得分图中的负离子模式图；
图9是本发明实施例中“差异代谢产物-靶点-通路”网络结构示意图；
图10是本发明实施例中氨基酸测定结果，各氨基酸统计柱状图。
具体实施方式
以下结合附图及实施例，对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本发明实施例提供的基于卷积神经网络的梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，其包括如下步骤：
S1：构建动物模型：构建陈化六堡茶提取物康养动物模型，使其满足“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型、区分不同陈化六堡茶提取物干预、防治岭南特色湿热证效果的要求，梧州产陈化六堡茶（以下简称梧州六堡茶、陈化六堡茶或六堡茶）：将大鼠（具体为SD大鼠）分为对照组、模型组和实验组，分别用不同的饲料进行喂养；其中对照组正常喂养，模型组进行湿热证建模，实验组在湿热证建模的基础上，分别用含有不同剂量的梧州产陈化六堡茶提取物的饲料进行喂养、干预；不同的陈化六堡茶提取物干预，包括采用不同浓度的陈化六堡茶提取物干预，也可以包括采用不同品类、不同浓度或其他生物属性的陈化六堡茶提取物干预，具体可以根据需要选择或搭配；本实施例中采用的时不同浓度；
其中，建立“卷积神经网络－靶向氨基酸代谢组学”关系模型的步骤S1-1包括如下步骤：
S1-1-1，选取特征并划分训练集和测试集：使陈化六堡茶提取物康养动物模型单次采集获得的靶向氨基酸代谢组学血清样本不少于36个，随机选取28个作为训练样本，剩余8个作为检验样本；
S1-1-2：数据归一化：对训练集和测试集进行标准化处理；
S1-1-3：定义卷积神经网络模型，模型包括一个输入层，一个Reshape层，一个卷积层，一个池化层，一个Flatten层，两个全连接层，一个输出层；其中，输入层的形状为（20,1）,输出层有4个节点；由上述的输入层、Reshape层、卷积层、池化层、Flatten层、全连接层和输出层，各层相互配合进行结果预测。
使构建的动物模型满足“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型、区分不同浓度的陈化六堡茶提取物干预、防治岭南特色湿热证效果要求的步骤S1-2包括如下步骤：
S1-2-1：基于“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型，将大鼠随机分为4组：对照组（不参与湿热证建模、不进行干预）、模型组（仅进行湿热证建模、不进行干预），实验组（进行湿热证建模、进行干预）包括：六堡茶高剂量实验组和六堡茶低剂量实验组，每组9只；
S1-2-2：制备不同的喂养饲料，其中，喂养饲料包括：普通饲料、高脂饲料和陈化六堡茶提取物干预高脂饲料；
S1-2-2-1：分别制备普通饲料、15wt %蜂蜜水；
S1-2-2-2：分别制备液态猪油、生理盐水；
S1-2-2-3： 陈化六堡茶提取物干预高脂饲料的制备步骤为：
制备陈化六堡茶提取物：取质量比为1：10的陈化六堡茶干物质与水，置于圆底烧瓶中，待静置浸泡1小时后、加热回流 1.5h，过滤获得六堡茶干物质残渣与滤液；将六堡茶干物质残渣采用前述方法再提取1次，合并所有滤液后过滤，使用水浴蒸馏法浓缩滤液，最后冷冻干燥，制得陈化六堡茶提取物的粉体，置于-20℃冰箱备用；
S1-2-3：建模、采用不同的饲料喂养和不同方式管理各组大鼠，并持续四周：
将对照组大鼠每日采用正常生存环境、普通饲料喂养，15 %蜂蜜水自由饮用；
将模型组、实验组大鼠每日均置于造模箱内12小时，造模箱内的温度为33~34℃、湿度为90±5%；
分别对模型组、六堡茶高剂量实验组、六堡茶低剂量实验组的大鼠，在投喂普通饲料的基础上，每只上午灌服猪油 3 ml一次；
对六堡茶高剂量实验组、六堡茶低剂量实验组的大鼠，每只下午给药灌胃，根据大鼠体重，六堡茶低剂实验组陈化六堡茶水提取物的给药量为 0.062 g/100 g，六堡茶高剂量实验组陈化六堡茶水提取物的给药量为 0.124 g/100 g，单日禁食；
分别对模型组、六堡茶高剂量实验组、六堡茶低剂量实验组的大鼠，每日灌胃等量生理盐水。
S2：构建网络分析模型：根据网络药理学选取陈化六堡茶活性成分作用靶点，筛选陈化六堡茶提取物干预岭南特色湿热证大鼠的特异性生物标记物，构建出“差异代谢产物-通路-靶点”的网络分析模型；
S2-1：首先根据网络药理学方法，在现有的陈化六堡茶成分数据库中，检索得到“六堡茶活性成分作用靶点”；
S2-2：通过MetaboAnalyst 5.0在线数据库检索非靶向代谢组学筛选所得差异性代谢物，得到“代谢物作用靶点”；
S2-3：以“damp-heat syndrome”为关键词，分别在 OMIM 和 GeneCards数据库中检索，得到“疾病靶点”；再通过“六堡茶活性成分作用靶点”与“疾病靶点”取交集，获得了“六堡茶改善疾病的靶点”；通过“代谢物作用靶点”与“疾病靶点”取交集，获得“代谢物调节疾病的靶点”；
S2-4：将“六堡茶改善疾病的靶点”与“代谢物调节疾病的靶点”合并为最终的“目标信息靶点”，利用 Omicshare平台对得到的“目标信息靶点”进行GO生物功能注释和KEGG通路富集。并对结果进行可视化作图，寻找存在关键性联系的结果（即存在着关键通路的结果）；
S2-5：通过Cytoscape3.8.0构建出“差异代谢产物-通路-靶点”网络分析模型，并建立可视化网络关系图，基于结果进行重要代谢物、靶点的筛选和预测；
S3：进行靶向测定：收集大鼠的血清，采用非靶向代谢组学技术检测大鼠血清样本，利用三重四级杆液质联用对特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定，获得特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定结果数据；
S3-1：收集大鼠的血清样本
（1）分别收集各个小组中大鼠第29天的血清样本，对每只大鼠的血清样本分别进行编号，存入-80℃ 冰箱内备用；
（2）血清样本的处理：将各血清样本按编号自 -80℃ 冰箱取出，冰上解冻至全液态，涡旋混匀30 s，吸取50 μL 至1.5 mL EP管；加入提前预冷（-30℃）的沉淀剂（乙腈：甲醇=1:1）250 μL，涡旋震荡5 min，然后4 ℃，13000 rpm离心10 min；离心后取上清液200 μL于另一套编号对应的1.5 mL EP管，-30 ℃ 冰箱静置20 min；4 ℃ 条件下，13000 rpm 离心10 min，移取上清液150 μL到对应进样瓶的内衬管中，用于上机分析；从每个样本中取10μL上清液混合成质控样本（QC）；
S3-2：血清样本的检测
制备稳定同位素标记氨基酸混合内标液，然后色谱系统 Ultimate 3000上机，使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm*100 mm色谱柱, 自动进样器温度设为 8 ℃,以0.3 mL/min的流速，40 ℃的柱温, 进样2 μL进行梯度洗脱, 流动相为0.1%甲酸水(A) — 0.1%甲酸乙腈(B)；时间程序如Table 1，进行检测，检测后得到各血清样本中的非靶向代谢组学原始数据；
S3-3：对特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定：
采用非靶向血清代谢组学技术对各组大鼠血清样品的非靶向代谢组学原始数据进行分析，利用Progenesis QI 3.0和Compound Discoverer 3.3软件对非靶向代谢组学原始数据进行处理分析，进行多元统计分析和差异代谢物鉴定；综合VIP（Variableimportance in the projection）> 1，Max fold change > 2，ANOVA P-value < 0.05，筛选出差异性代谢物；通过与HMDB数据库、m/z Cloud数据库以及自建的标准品数据库比对鉴定差异性代谢物的化学结构；最后将差异性代谢物导入MetaboAnalyst 5.0在线分析软件中进行通路富集，计算后得到特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定的数据。
S4：岭南特色湿热证及其防治效果识别：将特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定结果数据输入到网络分析模型中，计算后获得靶向氨基酸代谢组学数据；将靶向氨基酸代谢组学数据导入“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型，对靶向氨基酸代谢组学数据进行处理与分析，得到陈化六堡茶提取物干预岭南特色湿热证的作用机制模型，通过不同浓度（或者不同品类及浓度）的陈化六堡茶提取物干预，完成区分大鼠是否罹患岭南特色湿热证及对该证防治效果的识别，具体包括如下步骤：
S4-1：对氨基酸进行靶向测定的结果数据处理
对所有特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定的结果数据，均采用GraphPadPrism 8.4.2软件处理，两组间比较采用Student’st检验，多组比较采用ANOVA检验，P-value < 0.05表示具有统计学意义的差异（Mean士SEM）；
S4-2：获得靶向氨基酸代谢组学数据：将处理后的特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定的结果数据，输入到所述的“差异代谢产物-通路-靶点”网络分析模型中，计算后获得靶向氨基酸代谢组学数据；
S4-3：将靶向氨基酸代谢组学数据导入“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型进行识别；
S4-4：识别结果分析：通过构建的陈化六堡茶提取物干预岭南特色湿热证的作用机制动物模型，通过不同浓度（及品类）的陈化六堡茶提取物的干预，完成区分大鼠是否罹患岭南特色湿热证及对该证防治效果的识别：与模型组相比，六堡茶高、低剂量实验组均有显著回调，并能利用六堡茶干预岭南特色湿热证动物模型的识别方法准确与之区分；与对照组相比，六堡茶高、低剂量实验组能用该模型与之准确区分。
其中，所述的步骤S4-3，具体包括如下步骤：
S4-3-1选取特征并划分训练集和测试集：靶向氨基酸代谢组学血清样本共36个，随机选取28个作为训练样本，剩余8个作为检验样本，包括20种具有显著性差异的氨基酸作为20个特征“Cyclo-Leucine、Cystine、Hippuric acid、L-Arginine、L-Aspartic acid、L-Glutamic acid、L-Glutamine、L-Kynurenine、L-Lysine、L-Pyroglutamic acid、L-Serine、L-Tryptophan、L-Valine、Spermidine、Taurine、L-Isoleucine、L-Leucine、L-Methionine、L-Phenylalanine、L-Threonine”。
S4-3-2：对训练集和测试集进行标准化处理，将归一化处理后的数据，导入卷积神经网络模型，并进行结果预测：卷积神经网络模型以训练样本为输入，以大鼠的对照组、模型组、六堡茶低剂量实验组或六堡茶高剂量实验组4种结果为输出，该卷积神经网络模型在验证集上的准确度，能准确区分出对照组、模型组、六堡茶低剂量实验组、六堡茶高剂量实验组；
S4-3-3：得到识别结果：分别得到非靶向代谢组学数据空间分布可视化结果，得到差异代谢物鉴定结果，得到差异代谢物KEGG富集代谢通路计算结果，得到各氨基酸方法学识别结果，得到“差异代谢产物-靶点-通路”网络分析模型识别结果。
本实施例重点是针对梧州产陈化六堡茶的防治岭南特色湿热证康养机制与效果验证需要，采用多种现代检测、分析等技术手段和理论，基于梧州产陈化六堡茶康养动物模型和“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”模型，建立区分不同（浓度、品类、陈化时长等属性）六堡茶防治岭南特色湿热证效果的识别方法，筛选梧州产陈化六堡茶调控岭南特色湿热证模型大鼠的潜在生物标记物，基于靶向代谢组学检测梧州六堡茶干预湿热证大鼠血清中氨基酸含量，最终通过该模型实现对湿热证候模式大鼠和经六堡茶康养作用后大鼠的识别，探明了陈化六堡茶防治岭南特色湿热证的中医药机理和效果，能够明确进行区分大鼠是否罹患岭南特色湿热证及对该证防治效果的识别，从而能够为梧州六堡茶产业的专业化康养开发和精准利用奠定基础。
实施例2
参见附图1-10，本发明实施例在前述实施例1的基础上，更为具体的提供基于卷积神经网络的梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，其包括如下步骤：
S1：构建梧州产陈化六堡茶提取物康养动物模型，使其满足“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型、区分不同生物属性（包括陈化时长、树种、产区及采收年份等，本实施例以陈化时长和浓度作为主要属性）陈化六堡茶提取物防治岭南特色湿热证效果的要求，具体是将SD大鼠分为模型组、实验组和对照组，分别用不同的饲料进行喂养。
本实施例中，所述实验组为三年陈六堡茶实验组，采用陈化三年的陈化六堡茶提取物（分为高剂量实验组、低剂量实验组）；在其他实施例中，也可以采用其他不同陈化时长（如1~20年）以及具有其他生物属性的陈化六堡茶提取物进行实验，以进行数据对比；
制备三年陈化六堡茶提取物：将陈化六堡茶样品和水(料液比1：10)置于圆底烧瓶中，待静置浸泡1小时后加热回流 1 .5h，过滤。残渣同法再提取1次，合并所有滤液后过滤，使用水浴蒸馏法浓缩滤液，最后冷冻干燥即得陈化六堡茶水提取物，置于-20℃冰箱备用。
进一步，所述S1步骤的SD大鼠随机分为4组：对照组、模型组、六堡茶高剂量实验组、六堡茶低剂量实验组，每组9只。
除对照组外，其他各组每日置于自制的造模箱内12小时，将控制温度在33~34℃，湿度为90±5%）。模型组、六堡茶高剂量实验组、六堡茶低剂量实验组大鼠上午灌服猪油 3ml，六堡茶高、低剂量实验组下午给药灌胃，六堡茶低剂量为 0.062 g(生药)/100 g，六堡茶高剂量为 0.124 g(生药)/100 g，单日禁食，持续4周。普通粮食喂养及15 %蜂蜜水自由饮用。对照组、模型组每日灌胃等量生理盐水。生药为陈化六堡茶提取物的粉剂干重。
S2：收集各组大鼠血清，利用非靶向代谢组学技术检测大鼠血清样本，筛选陈化六堡茶干预岭南特色湿热证大鼠的特异性生物标记物，根据网络药理学，构建“差异代谢产物-通路-靶点”的网络，以揭示陈化六堡茶干预岭南特色湿热证的作用机制。
采用非靶向血清代谢组学技术对各组大鼠血清样品进行分析。
（1）血清样本处理方法：血清按编号自 -80 ℃ 冰箱取出，冰上解冻至全液态，涡旋混匀30 s，吸取50 μL 至1.5 mL EP管。加入提前预冷（-30℃）的沉淀剂（乙腈：甲醇=1:1）250 μL，涡旋震荡5 min，然后4 ℃，13000 rpm离心10 min。离心后取上清液200 μL于另一套编号对应的1.5 mL EP管，-30 ℃ 冰箱静置20 min。4 ℃ 条件下，13000 rpm 离心10min，移取上清液150 μL到对应进样瓶的内衬管中，用于上机分析。从每个样本中取10μL上清液混合成质控样本（QC）。
（2）色谱系统 Ultimate 3000，使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm*100 mm色谱柱，自动进样器温度设为 8 ℃,以0.3 mL/min的流速，40 ℃的柱温,进样2 μL进行梯度洗脱, 流动相为0.1%甲酸水(A) 和 0.1%甲酸乙腈(B)。时间程序如表1。
表1
（3）质谱系统Thermo Q Exactive Focus，离子化模式：ESI- & ESI+。质谱工作条件如表2所示。
表2
然后，利用Progenesis QI 3.0和Compound Discoverer 3.3软件对非靶向代谢组学原始数据进行处理分析，进行多元统计分析和差异代谢物鉴定。综合VIP（Variableimportance in the projection）> 1，Max fold change > 2，ANOVA P-value < 0.05，筛选出差异性代谢物。通过与HMDB数据库、m/z Cloud数据库等主流数据库以及自建的标准品数据库比对鉴定差异性代谢物的化学结构。最后将差异性代谢物导入MetaboAnalyst 5.0在线分析软件中进行通路富集。
参见附图1，其为本实施例的非靶向代谢组学质控样品正离子模式下总离子流叠加图；图2 是非靶向代谢组学质控样品负离子模式下总离子流叠加图；图3-图6为非靶向代谢组学数据空间分布可视化结果示意图，其中图3：正离子模式PCA得分图；图4：正离子模式PLS-DA得分图；图5：负离子模式PCA得分图；图6：负离子模式PLS-DA得分（图中，C：对照组，H：六堡茶高剂量实验组，L：六堡茶低剂量实验组，M：模型组）；
图7-图8为对照组 vs 模型组 OPLS-DA得分图，图中C：对照组，M：模型组；图7为正离子模式图，图8为负离子模式图。
差异代谢物鉴定结果见表3，差异代谢物KEGG富集代谢通路结果见表4。
表3
表4
再进一步的，根据网络药理学方法，利用课题组前期研究获得、现有的陈化六堡茶成分数据库（或者其他研究成果公开的已有陈化六堡茶成分数据库），可以检索得到“六堡茶活性成分作用靶点”。通过MetaboAnalyst 5.0在线数据库检索非靶向代谢组学筛选所得差异性代谢物，得到“代谢物作用靶点”。以“damp-heat syndrome”为关键词，分别在 OMIM和 GeneCards数据库中检索，得到“疾病靶点”。通过“六堡茶活性成分作用靶点”与“疾病靶点”取交集，获得了“六堡茶改善疾病的靶点”。通过“代谢物作用靶点”与“疾病靶点”取交集，获得了“代谢物调节疾病的靶点”。将“六堡茶改善疾病的靶点”与“代谢物调节疾病的靶点”合并为最终的“目标信息靶点”。利用 Omicshare平台对得到的“目标信息靶点”进行GO生物功能注释和KEGG通路富集。并对结果进行可视化作图，寻找存在关键性联系（关键通路）的结果。通过Cytoscape3.8.0构建“差异代谢产物-通路-靶点”网络，并建立可视化网络关系图，基于结果进行重要代谢物、靶点的筛选和预测。
参见图9 “差异代谢产物-靶点-通路”网络示意图，该网络图显示了20条途径、15个代谢物、55个靶点相互作用。Degree越大，连接的边越多，因此该节点在网络中更重要。其中图中正方形节点代表代谢成分，圆形节点代表关键靶点，三角形节点代表相关通路。其中TNF（程度=27）、NFKB1（程度=20）、IL6（程度=18）、RELA（程度=17）、IL1B、MAPK3、MAPK8、MAPK1（程度=15）是关键靶点。目前 TNF 多指 TNF-α，IL1B 指的是IL-1β，两者与 IL-6 是经典的促炎因子。在分析所得的信号通路中，TNF、IL-1β和 IL-6 几乎都参与其中。基于现代医学对湿热症的认识，机体存在湿热证时，会因为直接或者间接原因呈现出炎症反应及炎症细胞的组织浸润。因此，TNF-α、IL-6、IL-1β可能是治疗湿热证的核心六堡茶靶点。与这些靶点相关的代谢产物是精氨酸、谷氨酸、谷胱甘肽、精胺、二氢鞘氨醇、全反式维甲酸、二十碳五烯酸、白三烯C4，这些代谢产物在网络图中调节了多个靶点，表明六堡茶通过调节氨基酸等代谢物并发挥治疗作用。
S3：利用三重四级杆液质联用对特异性生物标志物进行靶向测定。
对特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定的步骤为：
（1）样品及标准品制备
血清样品制备：血清按编号自 -80 ℃ 冰箱取出，冰上解冻至全液态，涡旋混匀30s，吸取40 μL 至1.5 mL EP管。加入提前预冷（-30℃）的甲醇200 μL，涡旋震荡5 min，-30℃ 冰箱静置20 min，然后4 ℃，13000 rpm离心10 min。离心后取上清液20 μL于另一套编号对应的1.5 mL EP管，加入内标液20μL，再加入0.1%甲酸水180μL，涡旋振荡30s，然后4℃，13000 rpm离心10 min，移取上清液150 μL到对应进样瓶的内衬管中，用于上机分析。从每个样本中取10μL上清液混合成质控样本（QC）。
稳定同位素标记氨基酸混合内标液：将2.5mmol/L的L-Alanine-13C3,15N、 L-Arginine-13C6, L-Aspartic acid-13C4、 L-Glutamic acid-13C5、 Glycine-13C2,15N、L-Histidine-13C6、 L-Isoleucine-13C6,15N、 L-Leucine-13C6,15N、 L-Lysine-13C6、L-Methionine-13C5,15N、 L-Phenyl-13C6-alanine、 L-Proline-13C5、 L-Serine-13C3,15N、 L-Threonine-13C4、 L-Tyrosine-(phenyl-13C6)、 L-Valine-13C5 稀释至2.5nmol/mL，1.25mmol/L的L-Cystine-13C6,15N2稀释至1.25 nmol/mL。
氨基酸混合标准工作液的制备：30种氨基酸混合标曲浓度为10、30、100、300、1000、3000、4000、5000、7500、10000、20000、25000 pmol/mL，质控样液浓度为100、300、3000、5000、7500、20000 pmol/mL。按编号吸取各浓度混合标准工作液200 μL至1.5 mL EP管，然后加入20 μL内标液，涡旋振荡30 s，然后4 ℃，13000 rpm离心10 min，移取上清液150 uL到对应进样瓶的内衬管中，用于上机分析。
（2）色谱及质谱条件
色谱系统Shimadzu LC-30AD，使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm*100 mm 色谱柱，自动进样器温度设为 8 ℃，以0.25 mL/min 的流速，40 ℃ 的柱温, 进样 1 μL 进行梯度洗脱, 流动相为0.1%甲酸水(A) — 0.1%甲酸乙腈(B)。具体的色谱及质谱条件，见表5 。
表5
质谱系统SCIEX Triple Quad 6500+，离子化模式：ESI+，扫描方式：MRM。质谱系统工作条件和参数见表 6 。
表6
（3）方法学考察
线性范围、检出限、定量限：通过绘制分析物面积与内标面积之比与两种浓度之比来绘制校准曲线，在一定个数合适的浓度下，各分析物的线性关系良好。检出限和定量限基于校准曲线的参数，检出限是能被检测出的最低浓度或量，信噪比至少为3倍。定量限是指校准曲线上的最低浓度或量，其信噪比至少为10倍。精密度：对质控样品6次独立测定；稳定性：对整个分析批的质控样品进行分析。检测限、定量限以及线性范围见表7，精密度与稳定性见表8。
表7
表8
（4）靶向氨基酸代谢组学数据处理与分析
对所有数据利用GraphPad Prism 8.4.2软件处理，两组间比较采用Student’s t检验，多组比较采用ANOVA检验，P-value < 0.05表示具有统计学意义的差异（Mean士SEM）。
氨基酸测定结果见图10，其为各氨基酸统计柱状图。* (P < 0.05)，** (P <0.01)，*** (P < 0.001)，**** (P < 0.0001)。
S4：基于“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”，具体建立一种区分大鼠是否罹患岭南特色湿热证和六堡茶康养干预的动物模型的识别方法，以完成区分大鼠是否罹患岭南特色湿热证及对该证进行干预、防治效果的识别，其包括如下步骤：
（1）选取特征并划分训练集和测试集。靶向氨基酸代谢组学血清样本共36个，随机选取28个作为训练样本，剩余8个作为检验样本，包括20种具有显著性差异的氨基酸作为20个特征，具体为：“Cyclo-Leucine、Cystine、Hippuric acid、L-Arginine、L-Asparticacid、L-Glutamic acid、L-Glutamine、L-Kynurenine、L-Lysine、L-Pyroglutamic acid、L-Serine、L-Tryptophan、L-Valine、Spermidine、Taurine、L-Isoleucine、L-Leucine、L-Methionine、L-Phenylalanine、L-Threonine”。
（2）数据归一化。对训练集和测试集进行标准化处理。
定义卷积神经网络模型，模型包括一个Reshape层，一个卷积层，一个池化层，一个Flatten层，两个全连接层。输入层的形状为（20,1）,输出层有4个节点。并进行结果预测。
模型以训练样本为输入，以大鼠的对照组、模型组、六堡茶低剂量实验组或六堡茶高剂量实验组4种结果为输出。0：对照组；1：模型组；2：六堡茶低剂量实验组；3：六堡茶高剂量实验组。
模型在验证集上的准确度为Epoch 10/10 val_accuracy: 1.0000；
模型对8个检验样本的检验结果准确率为100.0％，能准确区分对照组、模型组、六堡茶低剂量实验组、六堡茶高剂量实验组。
该动物模型的识别方法可用于未知组别大鼠的分类识别，如果进一步增大样本量和对模型进行再训练，则能够得到更为精准的识别结果。
本实施例的识别结果表明，与模型组相比，六堡茶高剂量实验组、低剂量实验组均有显著回调，并能利用六堡茶干预岭南特色湿热证动物模型的识别方法准确与之区分；与对照组相比，六堡茶高剂量实验组、低剂量实验组能用该模型与之准确区分。
因此，本发明上述实施例的研究结果表明，六堡茶高剂量实验组、低剂量实验组不仅能有效防治岭南特色湿热证，还有一定的康养作用，本发明的实验过程和数据，能够给为六堡茶对岭南特色湿热证的康养作用、效果提供依据。
本发明上述实施例，重点是采用多种现代检测及分析等技术手段和理论，基于“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”建立区分岭南特色湿热证和六堡茶康养动物模型的识别方法，筛选六堡茶调控岭南特色湿热证模型大鼠的潜在生物标记物，基于靶向代谢组学检测六堡茶干预湿热证大鼠血清中氨基酸含量，最终通过该模型实现对湿热证候模式大鼠和经六堡茶康养作用后大鼠的识别，探明陈化六堡茶防治岭南特色湿热证的中医药机理，完成明确的区分出大鼠是否罹患岭南特色湿热证，及进行干预后对该证防治效果的识别，能够为六堡茶产业的专业化康养开发和精准利用奠定基础。
但以上所述仅为本发明的较佳可行实施例，并非用以局限本发明的专利范围，故凡运用本发明中记载的步骤、组分的其他实施例，及所作的等效变化，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，其特征在于：其包括如下步骤：
S1：构建动物模型：构建陈化六堡茶提取物康养动物模型，使其满足“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型、区分不同陈化六堡茶提取物干预、防治岭南特色湿热证效果的要求，将大鼠分为对照组、模型组和实验组，分别用不同的饲料进行喂养；其中对照组正常喂养，模型组进行湿热证建模，实验组在湿热证建模的基础上，分别用含有不同剂量的陈化六堡茶提取物的饲料进行喂养、干预；
S2：构建网络分析模型：根据网络药理学选取陈化六堡茶活性成分作用靶点，筛选陈化六堡茶提取物干预岭南特色湿热证大鼠的特异性生物标记物，构建出“差异代谢产物-通路-靶点”的网络分析模型；
S3：进行靶向测定：收集大鼠的血清，采用非靶向代谢组学技术检测大鼠血清样本，利用三重四级杆液质联用对特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定，获得特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定结果数据；
S4：岭南特色湿热证及其防治效果识别：将特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定结果数据输入到网络分析模型中，计算后获得靶向氨基酸代谢组学数据；将靶向氨基酸代谢组学数据导入“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型，对靶向氨基酸代谢组学数据进行处理与分析，得到陈化六堡茶提取物干预岭南特色湿热证的作用机制模型，通过不同浓度的陈化六堡茶提取物的干预，完成区分是否罹患岭南特色湿热证及对该证防治效果的识别。
2.根据权利要求1所述梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，其特征在于，所述S1中建立“卷积神经网络－靶向氨基酸代谢组学”关系模型的步骤S1-1，包括如下步骤：
S1-1-1，选取特征并划分训练集和测试集：使陈化六堡茶提取物康养动物模型单次采集获得的靶向氨基酸代谢组学血清样本不少于36个，随机选取28个作为训练样本，剩余8个作为检验样本；
S1-1-2：数据归一化：对训练集和测试集进行标准化处理；
S1-1-3：定义卷积神经网络模型，模型包括一个输入层，一个Reshape层，一个卷积层，一个池化层，一个Flatten层，两个全连接层，一个输出层；其中，输入层的形状为20×1，输出层有4个节点；由上述的输入层、Reshape层、卷积层、池化层、Flatten层、全连接层和输出层相互配合进行结果预测。
3.根据权利要求1所述梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，其特征在于，所述S1中，使构建的陈化六堡茶提取物康养动物模型满足“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型、区分不同陈化六堡茶提取物干预、防治岭南特色湿热证效果要求的步骤S1-2，包括如下步骤：
S1-2-1：基于“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型，将大鼠随机分为4组：对照组、模型组、六堡茶高剂量实验组和六堡茶低剂量实验组，每组9只；
S1-2-2：制备不同的喂养饲料，其中，喂养饲料包括：普通饲料、高脂饲料和陈化六堡茶提取物干预高脂饲料；
S1-2-2-1：分别制备普通饲料、蜂蜜水；
S1-2-2-2：分别制备液态猪油、生理盐水；
S1-2-2-3： 陈化六堡茶提取物干预高脂饲料的制备步骤为：
制备陈化六堡茶提取物：取质量比为1：10的陈化六堡茶干物质与水，置于圆底烧瓶中，待静置浸泡后、加热回流，过滤获得六堡茶干物质残渣与滤液；将六堡茶干物质残渣采用前述方法再提取，合并所有滤液后过滤，蒸馏浓缩滤液，干燥，制得陈化六堡茶提取物的粉体，置于冰箱备用；
S1-2-3：建模、采用不同的饲料喂养和不同方式管理各组大鼠，并持续四周：
将对照组大鼠每日采用正常生存环境、普通饲料喂养，蜂蜜水自由饮用；
将模型组、实验组大鼠每日均置于造模箱内12小时，造模箱内的温度为33~34℃、湿度为90±5%；
分别对模型组、六堡茶高剂量实验组、六堡茶低剂量实验组的大鼠，在投喂普通饲料的基础上，每只上午灌服猪油一次；
对六堡茶高剂量实验组、六堡茶低剂量实验组的大鼠，每只下午给药灌胃，根据大鼠体重，六堡茶低剂实验组陈化六堡茶水提取物的给药量为 0.062 g/100 g，六堡茶高剂量实验组陈化六堡茶水提取物的给药量为 0.124 g/100 g，单日禁食；
分别对模型组、六堡茶高剂量实验组、六堡茶低剂量实验组的大鼠，每日灌胃等量生理盐水。
4.根据权利要求1所述梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，其特征在于，所述的S2，具体包括如下步骤：
S2：构建网络分析模型：根据网络药理学选取陈化六堡茶活性成分作用靶点，筛选陈化六堡茶提取物干预岭南特色湿热证大鼠的特异性生物标记物，构建出“差异代谢产物-通路-靶点”的网络分析模型；
S2-1：首先根据网络药理学方法，利用现有六堡茶成分数据库，检索得到“六堡茶活性成分作用靶点”；
S2-2：通过在线数据库检索非靶向代谢组学筛选所得差异性代谢物，得到“代谢物作用靶点”；
S2-3：分别在 OMIM 和 GeneCards数据库中检索，得到“疾病靶点”；再通过“六堡茶活性成分作用靶点”与“疾病靶点”取交集，获得“六堡茶改善疾病的靶点”；通过“代谢物作用靶点”与“疾病靶点”取交集，获得“代谢物调节疾病的靶点”；
S2-4：将“六堡茶改善疾病的靶点”与“代谢物调节疾病的靶点”合并为最终的“目标信息靶点”，对得到的“目标信息靶点”进行GO生物功能注释和KEGG通路富集，并对结果进行可视化作图，寻找存在关键性联系的结果；
S2-5：构建出“差异代谢产物-通路-靶点”网络分析模型，并建立可视化网络关系图，基于结果进行重要代谢物、靶点的筛选和预测。
5. 根据权利要求1所述梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，其特征在于，所述的S3，进行靶向测定：收集大鼠的血清，采用非靶向代谢组学技术检测大鼠血清样本，利用三重四级杆液质联用对特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定，将测定结果输入到网络分析模型中，计算后获得靶向氨基酸代谢组学数据；具体包括如下步骤：
S3-1：收集大鼠的血清样本
（1）分别收集各个小组中大鼠第29天的血清样本，对每只大鼠的血清样本分别进行编号，存入冰箱内备用；
（2）血清样本的处理：将各血清样本按编号自冰箱取出，冰上解冻至全液态，涡旋混匀，吸取至EP管；加入沉淀剂，涡旋震荡，离心后取上清液于另一套编号对应的EP管，冰箱静置，离心，移取上清液到对应进样瓶的内衬管中，用于上机分析；从每个样本中取部分上清液混合成质控样本；
S3-2：血清样本的检测
制备稳定同位素标记氨基酸混合内标液，然后色谱系统上机，使用色谱柱, 设定自动进样器工作条件和程序，进行检测，检测后得到各血清样本中的非靶向代谢组学原始数据；
S3-3：对特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定：
采用非靶向血清代谢组学技术对各组大鼠血清样品的非靶向代谢组学原始数据进行分析，对非靶向代谢组学原始数据进行处理分析，进行多元统计分析和差异代谢物鉴定；综合Variable importance in the projection> 1，Max fold change > 2，ANOVA P-value< 0.05，筛选出差异性代谢物；通过与HMDB数据库、m/z Cloud数据库以及自建的标准品数据库比对鉴定差异性代谢物的化学结构；最后将差异性代谢物导入在线分析软件中进行通路富集，计算后得到特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定的数据。
6. 根据权利要求1所述梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，其特征在于，所述的S4，具体包括如下步骤：
S4-1：对氨基酸进行靶向测定的结果数据处理
对所有特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定的结果数据，均采用软件处理，两组间比较采用Student’st检验，多组比较采用ANOVA检验，P-value < 0.05表示具有统计学意义的差异；
S4-2：获得靶向氨基酸代谢组学数据：将处理后的特异性生物标记物-氨基酸进行靶向测定的结果数据，输入到所述的“差异代谢产物-通路-靶点”网络分析模型中，计算后获得靶向氨基酸代谢组学数据；
S4-3：将靶向氨基酸代谢组学数据导入“卷积神经网络-靶向氨基酸代谢组学”关系模型进行识别；
S4-4：识别结果分析：通过构建的陈化六堡茶提取物干预岭南特色湿热证的作用机制动物模型，通过不同品类或浓度的陈化六堡茶提取物干预，完成区分是否罹患岭南特色湿热证及对该证防治效果的识别：与模型组相比，六堡茶高剂量实验组、低剂量实验组均有显著回调，并能利用六堡茶干预岭南特色湿热证动物模型的识别方法准确与之区分；与对照组相比，六堡茶高剂量实验组、六堡茶低剂量实验组能用该模型与之准确区分。
7.根据权利要求6所述梧州六堡茶防治岭南特色湿热证效果的检测识别方法，其特征在于，所述的S4-3，具体包括如下步骤：
S4-3-1选取特征并划分训练集和测试集：靶向氨基酸代谢组学血清样本共36个，随机选取28个作为训练样本，剩余8个作为检验样本，包括20种具有显著性差异的氨基酸作为20个特征；
S4-3-2：对训练集和测试集进行标准化处理，将归一化处理后的数据，导入卷积神经网络模型，并进行结果预测：卷积神经网络模型以训练样本为输入，以大鼠的对照组、模型组、六堡茶低剂量实验组或六堡茶高剂量实验组4种结果为输出，该卷积神经网络模型在验证集上的准确度，能准确区分出对照组、模型组、六堡茶低剂量实验组、六堡茶高剂量实验组；
S4-3-3：得到识别结果：分别得到非靶向代谢组学数据空间分布可视化结果，得到差异代谢物鉴定结果，得到差异代谢物KEGG富集代谢通路计算结果，得到各氨基酸方法学识别结果，得到“差异代谢产物-靶点-通路”网络分析模型识别结果。
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