JP4174599B2 - 高速液体クロマトグラフの分画装置 - Google Patents

Description

本発明は高速液体クロマトグラフに関し、特に高速液体クロマトグラフからの溶出液をマイクロプレートやサンプルプレートに滴下して分画する装置に関する。

タンパク質やペプチドなどの構造や働きの解明を行なうプロテオーム解析の分野では、最近注目されているＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ（マトリックス支援レーザ脱離イオン化法質量分析）などを用いた分析が行なわれている。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳは生体試料にマトリックスを添加しレーザ光線を当てることによりイオン化し質量分析を行なう方法であるが、その際使用される試料は数μＬと微量である。

その際、試料を分析できる状態にするために前処理を行なうが、その一つの方法として、ペプチドなどを高速液体クロマトグラフを用いて分離分画しマトリックス液を添加する方法がある。
生体試料は貴重であること及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳで分析が可能な最大試料量が数μＬであることから、用いられる高速液体クロマトグラフの流量域は数μＬ／ｍｉｎ以下、好ましくは１μＬ／ｍｉｎ以下の領域である。

通常の高速液体クロマトグラフにおける流量域の分画の場合、流量が大きいため、通常、電磁弁などを用いたフラクションコレクタが用いられる。しかし、微少流量域のミクロ高速液体クロマトグラフの場合には電磁弁は使えず、溶出液を分画して捕集する際は、その最終的な出口となるプローブをＭＡＬＤＩプレートやＭＴＰ（マイクロタイタープレート）等の目的スポットの上部に配置し、プレートをプローブに接近させて溶出液がプレートに接触するまで待機し、プレートの目的スポットに溶出液が付着するのを待つか、又は溶出液が滴下するのを待つといった手法をとっていた。

溶出液の付着又は滴下を待つ手法では、溶出液の成分が表面張力の大きい液体である場合に、プローブの出口先端に溶出液が液滴状に大きく膨らんで付着してしまうので、プレート上に分画する溶出液の微量調整ができない。
そこで本発明は、滴下する液滴量の微調節が可能な分画装置を提供することを目的とするものである。

本発明は、液体クロマトグラフから送られる溶出液を先端から滴下させて分画する分画装置であって、溶出液以外の添加成分を溶出液に混合させる混合流路と、先端からの液の離脱を促す気体を噴出する気体噴出口とを備えたプローブを備えていることを特徴とするものである。

本発明の分画装置において、プローブの先端部が多重管構造であり、溶出液が中央、添加成分がその外側、気体が最も外側の流路を通り、さらに、最外側の管の先端が内側の管の先端よりも突出している構造とすることができる。

また、プローブの材質によってはプローブ先端に液滴が溜まり、表面張力の大きい成分を含んだ溶出液であれば、液滴が膨張してプローブ表面まで達してしまい、スポットごとに均一な滴下を行なうことができなくなるだけでなく、溶出液成分の汚染を招く可能性がある。そこで、プローブの最外側表面を疎水性物質でコーティングをしてもよい。

プローブ中の流路を流れる添加成分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用のマトリックス溶液とすることができる。
また、複数の液体クロマトグラフからの溶出液と複数種類の添加成分を混合することができるようにすることもできる。

本発明では、プローブが溶出液以外の添加成分を溶出液に混合させる混合流路と、先端から液の離脱を促す気体を噴出する気体噴出口とを備えているので、先端から液体を滴下する際に気体を噴出しプローブ先端に付着した液滴の離脱を促し、適量の液体を滴下させることが可能となり、滴下量の微量調節が可能となる。また、溶出液が目的スポットに付着又は滴下するのを待つ必要がない。

プローブの先端部を多重管構造とし、溶出液が中央、添加成分がその外側、気体が最も外側の流路を通るようにすれば、気体の噴出による液滴の滴下促進の効果を向上させ、より効率のよい分画捕集を行なうことが可能となる。さらに、最外側の管の先端が内側の管の先端よりも突出している構造とすれば、プローブの先端部に液が溜まる空間を設けることができる。

プローブの最外側表面を疎水性物質でコーティングすれば、表面張力の大きい成分の溶出液であっても、滴下する際にプローブ先端において液滴が膨張しプローブ表面まで達することを防止し溶出液の汚染を防ぐことができる。

プローブ中の流路を流れる添加成分をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用のマトリックス溶液とすれば、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析専用の分画装置とすることができる。
また、複数の液体クロマトグラフからの溶出液と複数種類の添加成分を混合することができるようにすれば、一般の高速液体クロマトグラフでみられるポストカラム反応をミクロスケールで行なうことができるようになる。

図１は一実施例を示す概略構成図である。
溶離液を送るポンプ４８、試料を注入するインジェクター４６、試料成分に分離するカラム４４、及び検出器４２を溶離液の流路に沿って配置したミクロ液体クロマトグラフの検出器４２の下流にキャピラリ２を介して液滴を滴下するプローブ１が接続されている。
プローブ１はＴ型３方ジョイントＪ１,Ｊ２を備え、上流側のジョイントＪ１は溶出液を送液するキャピラリ２とマトリックス液などの添加剤を送液する管１６とを接続させ、下流側のジョイントＪ２は空気を供給する管１８を接続させ、プローブ１の出口側の先端部は３重管構造を形成する。

溶離液がポンプ４８によって送られ、インジェクター４６から試料が注入される。インジェクター４６に注入された試料はカラム４４で成分ごとに分離され検出器４２で検出される。溶出液はキャピラリ２を通ってプローブ１よりサンプル容器Ｓ上に滴下され捕集される。

マトリックス液などの添加剤は、ポンプ４９によってＴ型３方ジョイントＪ１でキャピラリ２と接続されている管１６中を送液され、キャピラリ２の外側を流れてプローブ１の先端部で溶出液と混合される。
空気供給管１８はＴ型３方ジョイントＪ２によって溶出液が流れるキャピラリ２及び添加剤が流れる管と接続され、空気は添加剤が流れる管のさらに外側を流れ、プローブ１の先端から液滴を滴下する際に噴出し、プローブ１の出口先端に液滴状に付着した液体を押し出し離脱を促す。

次に本発明の特徴であるプローブ１について詳細に説明する。
図２はプローブ１の構造を示す図であり、（Ａ）はプローブ１の断面図、（Ｂ）は出口部Ｋの拡大図である。

（Ａ）に示されるように、上流側の第１のＴ型３方ジョイントＪ１の直交しないジョイントａ,ｂの２つを高速液体クロマトグラフからの溶出液が送液される一番細いキャピラリ２が横断する。キャピラリ２としては例えば内径５０μｍ,外径１５０μｍの溶融石英キャピラリを使用する。上流側のジョイントａはメイルナットなどの配管部品１０ａを用いて密封するが、その際必要に応じてスリーブ１２などを用いる。

Ｔ型３方ジョイントＪ１の直交するジョイントｃにはマトリックス液などの添加剤が送液される配管１６が接続され、メイルナットなどの配管部品１０ｃで密封する。一番細いキャピラリ２が出ているジョイントｂには、例えば内径２００μｍ,外径３７０μｍの溶融石英キャピラリ４をかぶせてメイルナットなどの配管部品１０ｂを用いて密封するが、その際必要に応じてスリーブ２２などを用いる。

下流側のＴ型３方ジョイントＪ２には、上流側のジョイントａからキャピラリ２,４が挿入され、メイルナットなどの配管部品２０ａを用いて密封するが、その際必要に応じてスリーブ３２などを用いる。キャピラリ２,４と直交するジョイントｃには空気を供給する管１８が接続され、メイルナットなどの配管部品２０ｃで密封する。最も下流側のジョイントｂには、例えば内径５００μｍ,外径１６００μｍのステンレス製の配管８をかぶせてメイルナットなどの配管部品２０ｂを用いて密封する。

次に出口部Ｋについて図２（Ｂ）を参照しながら詳細に説明する。（Ｂ）は（Ａ）の破線の円で囲まれた部分の拡大図である。
本実施例のプローブ１の出口部は３重管構造であり、最も内側の流路２ａを高速液体クロマトグラフからの溶出液が流れ、その外側の流路４ａをマトリックス液が流れ、最も外側の流路８ａを空気が流れるようになっている。

最外側の配管８の先端は内側の２重管の先端よりも１,２ｍｍ長くなっていて液溜め部１１を形成している。この液溜め部１１に溜まる液は高速液体クロマトグラフからの溶出液とマトリックス液との混合液であり、この混合液が適量になったときに流路１４から空気を噴出して滴下させ、液量を調節して滴下を行なう。また、最外側の配管８の先端が内側の管の先端よりも突出していることで、空気のプローブ先端の外周方向への噴出がなくなり内側方向への噴出が強くなるので、液滴の滴下促進の効果を向上させ、より効率のよい分画捕集を行なうことができるようになる。

通常、高速液体クロマトグラフの送液流量は１μＬ／ｍｉｎであるため、マトリックス液の濃度を調節してミクロ高速液体クロマトグラフの送液流量と同じ１μＬ／ｍｉｎで送液を行なう。したがって、プローブ１出口先端の液溜め部１１には２μＬ／ｍｉｎの割合で混合液１２が溜まっていく。

最外側の配管８の内径が５００μｍの場合、最外側の配管８が内側の２重管より突出している部分の長さが１ｍｍであれば液溜め部１１の容量が２００ｎＬになる。したがって、液溜め部１１には６秒で２００ｎＬの混合液が溜まるので、６秒ごとに空気を噴出し液溜め部１１に溜まった成分を押し出す。そのとき、押し出す空気の量・スピードをコントロールすることにより液滴を再現よく滴下することが可能である。

通常、空気などの気体を噴出しないで混合液を送液し続けると、プローブ先端に液滴が形成され、混合液の成分が水などの表面張力の大きいものである場合、その容量は約５μＬ程度となる。したがって、空気などの気体を噴出しないで滴下させる際の液滴の大きさは最小でも５μＬとなってしまい、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析上不都合である。また、ミクロ高速液体クロマトグラフでグラジエント分析を行なう場合は、溶出液が有機溶媒濃度の濃い状態に変化していき、有機溶媒の表面張力が小さいため、時間とともにその液滴は小さくなっていき、均一な滴下量を期待できない。

また、最外側配管８の外側表面は、疎水性であるテフロン（登録商標）などでコーティングされているのが好ましい。そのため、先端より混合液があふれてプローブ先端に液泡を形成することがあっても、最外側配管８の外側表面まで液が達することがなく、分画成分の相互汚染を防ぐことができる。
ステンレス製の配管８に代えて、例えばＰＥＥＫ（ポリエーテルエーテルケトン）チューブなどを用いてもよい。

図３は第２の実施例を表わしたものであり、マトリックス液に代えて複数の添加剤を添加できるようにしたものである。
図１の実施例では３方ジョイントＪ１でマトリックス液などの添加剤を供給する流路が接続されていたが、図３の実施例ではその３方ジョイントＪ１で複数の添加剤Ａ〜Ｃを供給する流路が接続されている。添加剤Ａ〜Ｃはそれぞれの送液ポンプ４９ａ〜４９ｃによって送られ、ジョイント５０で合流させられてキャピラリ２と接続されている管１６中を送液され、キャピラリ２の外側を流れてプローブ１の先端部で溶出液と混合される。
この実施例により、一般の高速液体クロマトグラフでみられるポストカラム反応をミクロスケールで行なうことができるようになる。

本発明の分画装置は高速液体クロマトグラフからの溶出液をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析用の試料に調製したり、次段の分析用の試料とするためのポストカラム反応を行なう装置などとして利用することができる。

一実施例を液体クロマトグラフとともに示す概略構成図である。 一実施例におけるプローブを示す図であり、（Ａ）はプローブの断面図、（Ｂ）は出口部Ｋの拡大図である。 他の実施例を液体クロマトグラフとともに示す概略構成図である。

符号の説明

１ プローブ
２,４ キャピラリ
８ 配管
１０ａ,１０ｂ,１０ｃ,２０ａ,２０ｂ,２０ｃ 配管部品
１１ 液溜め部
１２,２２,３２ スリーブ
１６ 添加剤供給管
１８ 空気供給管
２ａ 空気用流路
４ａ マトリックス液用流路
８ａ 溶出液用流路
４２ 検出器
４４ カラム
４６ インジェクター
４８,４９，４９ａ，４９ｂ，４９ｃ ポンプ
Ｓ サンプル容器
Ｋ 出口部
Ｊ１,Ｊ２ Ｔ型３方ジョイント

Claims (4)

1. 液体クロマトグラフから送られる溶出液を先端から滴下させて分画する分画装置において、
   溶出液以外の添加成分を溶出液に混合させる混合流路と、先端からの液の離脱を促す気体を噴出する気体噴出口とを備えたプローブを備え、
   前記プローブはその先端部が多重管構造であり、溶出液が中央、添加成分がその外側、気体が最も外側の流路を通る構造となっていて、さらに、最外側の管の先端が内側の管の先端よりも突出していることを特徴とする分画装置。
2. 前記プローブの最外側表面は疎水性物質によってコーティングされている請求項１に記載の分画装置。
3. 前記添加成分はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ用のマトリックス溶液である請求項１又は２に記載の分画装置。
4. 前記プローブの出口先端部において、複数の高速液体クロマトグラフからの溶出液と複数種類の添加成分とを混合することができるようになっている請求項１から３のいずれか一項に記載の分画装置。

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