DE19811732A1

DE19811732A1 - Mikrotiterplatte und Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen

Info

Publication number: DE19811732A1
Application number: DE19811732A
Authority: DE
Inventors: Wolf Bertling
Original assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Current assignee: November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Priority date: 1998-03-18
Filing date: 1998-03-18
Publication date: 1999-09-30

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Mikrotiterplatte mit einer Mehrzahl an Kavitäten, wobei die Mikrotiterplatte aus Kunststoff hergestellt und innerhalb der Kavitäten eine aus Biomolekülen B gebildete Beschichtung vorgesehen ist. Zur Vereinfachung der Durchführung einer Polymerase-Kettenreaktion oder Ligase-Kettenreaktion ist erfindungsgemäß vorgesehen, daß die Beschichtung kovalent an die Kunststoffoberfläche M gebundene Oligonukleotide P1 aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft eine Mikrotiterplatte nach dem Oberbe griff des Anspruchs 1. Sie betrifft ferner ein Verfahren zum Nachweis von Molekülen, insbesondere Biomolekülen, nach dem Oberbegriff des Anspruchs 10.

Eine solche Mikrotiterplatte wird beispielsweise von der Fir ma Boehringer Mannheim GmbH, unter der Bezeichnung "Streptavidin-coated Microtiter Plates, nuclease free No. 1 768 000" vertrieben. Innerhalb der Kavitäten ist eine Streptavidin- oder Avidinbeschichtung vorgesehen. An diese Beschichtung kann zur Durchführung einer Nachweisreaktion ein spezifisches Biomolekül, z. B. ein Antikörper, gebunden wer den. Damit eignet sich die Mikrotiterplatte z. B. zum Nachweis eines spezifischen Antigens.

Eine solche Mikrotiterplatte kann auch zum Nachweis von mit tels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) oder Ligase-Ket tenreaktion (LCR) hergestellten Produkten benutzt werden. In diesem Fall wird an diese Beschichtung eine mit einem bio tinylierten Primer amplifizierte Probe gebunden. Die Proben lösung wird entfernt und die Beschichtung gewaschen. An schließend wird ein weiteres Reagenz mit der gebundenen Probe in Kontakt gebracht, mit dem mittels einer Farbreaktion die Bindung nachweisbar ist.

Insbesondere im Hinblick auf den Nachweis von PCR- oder LCR-Pro dukten ist das vorgenannte Verfahren sowie die bekannte Mikrotiterplatte nachteilig. Aufgrund mangelnder Temperatur beständigkeit der Beschichtung ist es erforderlich, die Probe in einem unbeschichteten Behälter zu amplifizieren und danach in die Kavitäten der Mikrotiterplatte zu überführen. Weiter ist es erforderlich die Probenlösung zu entfernen und die Be schichtung anschließend zu waschen. Die Schritte des Überfüh rens, Entfernens und Waschens bergen ein Kontaminationsrisi ko. Sie sind zeit- und kostenaufwendig.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Insbesondere sollen eine Mikroti terplatte und ein Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen an gegeben werden, mit denen ein einfacher und schneller Nach weis von PCR- oder LCR-Produkten möglich ist.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 10 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 9 und 11 bis 25.

Zur Lösung der Aufgabe weist die Beschichtung kovalent an die Kunststoffoberfläche gebundene Oligonukleotide auf. Eine sol che Beschichtung ist temperaturbeständig. Der Amplifizie rungsschritt einer PCR kann in den Kavitäten der Mikrotiter platte erfolgen. Das Überführen der bereits amplifizierten Probenlösung entfällt. Der Nachweis erfolgt unmittelbar unter Zuhilfenahme des kovalent ausgebildeten Oligonukleotids.

Die gebundenen Oligonukleotide können aus DNA, PNA, PTO oder Chimären davon bestehen, wobei vorteilhafterweise an die Oli gonukleotide fluorophore Moleküle oder Quencher gebunden sind oder im Laufe der Reaktion gebunden werden. Dadurch kann eine Hybridisierung der Probe mittels einer, an der Beschichtung beobachtbaren Fluoreszenzreaktion nachgewiesen werden.

Zweckmäßigerweise erstreckt sich die Beschichtung nur über einen Abschnitt der Oberfläche innerhalb der Kavitäten. Eine an der Beschichtung erfolgende Fluoreszenzreaktion ist so be sonders einfach und schnell erkennbar.

Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal kann der Kunststoff elektrisch leitfähig sein. Er ist vorzugsweise aus Polypropy len oder Polycarbonat hergestellt. Aufgrund der elektrischen Leitfähigkeit ist es möglich, die vorzugsweise 96 Kavitäten aufweisende Mikrotiterplatte zu polarisieren. In der Proben lösung enthaltende geladene Biomoleküle können so in Richtung der Beschichtung bewegt werden. Das beschleunigt die Nach weisreaktion.

Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal kann jede Kavität eines Satzes von n Kavitäten mit einer unterschiedlichen Be schichtung eines Satzes von n unterschiedlichen spezifischen Beschichtungen vorgesehen sein. So kann beispielsweise eine 96 Kavitäten aufweisende Mikrotiterplatte mit 96 verschiede nen Beschichtungen versehen sein. Jede Kavität dient in die sem Fall einer anderen Nachweisreaktion. Es ist aber auch möglich, auf einer Mikrotiterplatte zwei Sätze von jeweils 48 Kavitäten mit jeweils 48 verschiedenen Beschichtungen vorzu sehen. Auf diese Weise kann jede Nachweisreaktion zur Erhö hung der Nachweissicherheit unter Verwendung einer einzigen Mikrotiterplatte zweifach durchgeführt werden oder eine Nega tivkontrolle mitgeführt wird. Die zweckmäßigerweise einstüc kig ausgebildete Mikrotiterplatte kann Perforationen aufwei sen, so daß sie in kleine Einheiten zerbrochen werden kann.

Zur Lösung der Aufgabe ist ferner vorgesehen, daß als Biomo leküle kovalent an die Kunststoffoberfläche gebundene Oligo nukleotide verwendet werden. Die Verwendung einer solchen Be schichtung ermöglicht die Amplifizierung des nachzuweisenden Biomoleküls in der Kavität. Es kann auf eine Überführung ei ner vorher amplifizierten Probenlösung verzichtet werden. Das vereinfacht und beschleunigt das Verfahren.

Nach einem vorteilhaften Ausgestaltungsmerkmal sind an die Oligonukleotide fluorophore Moleküle oder Quencher gebunden. Der Probenlösung kann ein Primer zugesetzt sein, der mit ei nem fluorophoren Molekül markiert ist. Auch können der Pro benlösung Nukleotide zugesetzt werden, die mit einem fluoro phoren Molekül markiert sind. Eine Hybridisierung der nachzu weisenden Biomoleküle mit den Oligonukleotiden wird so vor teilhafterweise durch eine Fluoreszenzreaktion angezeigt.

Zur Beschleunigung der Nachweisreaktion kann die Kunststoff oberfläche elektrisch so polarisiert werden, daß geladene nachzuweisende Biomoleküle in Richtung der Beschichtung ange zogen werden.

Die in der Kavität aufgenommene Probenlösung wird zweckmäßi gerweise wiederkehrend erhitzt und abgekühlt, so daß das nachzuweisende Biomolekül amplifiziert wird. Um dabei eine Verdampfung von Probenlösung zu vermeiden, werden die Kavitä ten mittels eines, vorzugsweise beheizbaren, Deckelelements verschlossen.

Insbesondere zur Durchführung des Verfahrens ist ein Kit mit einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte und mindestens einem Primer vorgesehen. Der Kit kann ferner Nukleotide, Pufferbe standteile und Enzyme sowie eine Heiz-/Kühleinrichtung umfas sen. Zweckmäßigerweise liegen die Komponenten Primer, Nukleo tide, Pufferbestandteile und Enzyme in gefriergetrockneter Form vor. In diesem Fall kann die PCR oder LCR durch Zugabe von Wasser gestartet werden. Gleichfalls ist es möglich, daß die Komponenten Primer, Nukleotide, Pufferbestandteile und Enzyme in aus Kunststoff oder Wachs hergestellten Kapseln eingeschlossen sind. In diesem Fall kann die Reaktion nach Zugabe der Probe durch Temperaturerhöhung gestartet werden.

Ausführungsbeispiele des erfindungsgemäßen Verfahrens werden anhand der Zeichnung näher erläutert. Hierin zeigen:

Fig. 1 eine schematische Ansicht einer an dem ersten Pri mer hybridisierten Probe,

Fig. 2 eine schematische Ansicht nach Fig. 1 mit einem er sten Gegenstrang,

Fig. 3 eine schematische Ansicht gemäß Fig. 2 mit einem zweiten Gegenstrang,

Fig. 4 eine schematische Ansicht gemäß Fig. 2 mit einem dritten Gegenstrang, wobei der erste Primer mit ei nem fluorophoren Molekül markiert ist,

Fig. 5 die Synthese eines Strangs ausgehend von einem zweiten mit einem zweiten fluorophoren Molekül mar kierten Primer,

Fig. 6 die Anregung des zweiten fluorophoren Moleküls,

Fig. 7 die Anregung des zweiten fluorophoren Moleküls ge mäß Fig. 6, wobei am ersten Primer ein erstes fluo rophores Molekül vorgesehen ist und

Fig. 8 die Anregung von an Nukleotiden gebundenen zweiten fluorophoren Molekülen.

In Fig. 1 ist ein erster Primer P1 kovalent an eine Oberflä che M innerhalb der Kavität einer Mikrotiterplatte gebunden. Ein nachzuweisendes Biomolekül N bindet mit einem zum ersten Primer P1 korrespondierenden Sequenzabschnitt A1 an den er sten Primer P1. Unter Vermittlung einer Taq-Polymerase er folgt ausgehend vom ersten Primer P1 in Pfeilrichtung die Synthese eines Gegenstrangs G.

Bei der Synthese des Gegenstrangs G werden in der Probenlö sung befindliche Nukleotide eingebaut. Die Nukleotide können mit einem ersten fluorophoren Molekül F1 markiert sein. In diesem Fall reichen sich in der Nähe der Oberfläche M erste fluorophore Moleküle F1 an. Das ist in Fig. 2 gezeigt.

Gemäß Fig. 3 kann eine erste Gruppe von Nukleotiden mit einem ersten fluorophoren Molekül F1 und eine zweite Gruppe von Nu kleotiden mit einem zweiten fluorophoren Molekül F2 markiert sein. Beim ersten fluorophoren Molekül F1 kann es sich um ei ne Donor-Gruppe beim zweiten fluorophoren Molekül F2 um eine Akzeptor-Gruppe handeln. Aufgrund von zwischen dem ersten fluorophoren Molekül F1 und dem zweiten fluorophoren Molekül F2 sich ausbildenden Wechselwirkungen kann es nach dem För ster-Effekt zu einer verstärkten Fluoreszenz durch strah lungslosen oder auch direkten Energieübergang am zweiten flu orophoren Molekül F2 kommen.

Eine solche die Fluoreszenz verstärkende oder schwächende Wechselwirkung kann auch dadurch erzeugt werden, daß am er sten Primer P1 das erste fluorophore Molekül F1 vorgesehen ist und die Nukleotide mit dem zweiten fluorophoren Molekül F2 markiert sind. Durch Energieübergang kann es am zweiten fluorophoren Molekül F2 bei entsprechender Anregung zu einer Fluoreszenzreaktion kommen. Auch das ist schematisch in Fig. 4 gezeigt.

Fig. 5 zeigt die Situation nach einem ersten Amplifizierungs zyklus. Dabei wird ein Strang S ausgehend von einem zweiten Primer P2 in Pfeilrichtung synthetisiert. Der zweite Primer P2 ist mit dem zweiten fluorophoren Molekül F2 markiert. Bei einer Anregung des zweiten fluorophoren Moleküls F2 kommt es - wie in Fig. 6 gezeigt ist - zur Fluoreszenz.

Wie in Fig. 7 gezeigt ist, kann es zu einer Wechselwirkung mit einem am ersten Primer P1 befindlichen ersten fluoropho ren Molekül F1 und dem am zweiten Primer 2 gebundenen zweiten fluorophoren Molekül F2 kommen. Dabei kommt es zu einer Ver stärkung der Fluoreszenzreaktion oder zu einer Verschiebung des Fluoreszenzspektrums.

In Fig. 8 ist der zweite Primer P2 mit dem ersten fluoropho ren Molekül F1 markiert. Sowohl im Gegenstrang G als auch im Strang S sind Nukleotide eingebaut, welche mit dem zweiten fluorophoren Molekül F2 markiert sind. Durch Energieübergang vom ersten F1 auf das zweite fluorophore Molekül F2 wird am zweiten fluorophoren Molekül F2 eine verstärkte oder verän derte Fluoreszenzreaktion erzeugt.

Bezugszeichenliste

M Oberfläche der Kavität
P1 erster Primer
P2 zweiter Primer
A1 korrespondierender Abschnitt
N nachzuweisendes Molekül
F1 erstes fluorophores Molekül
F2 zweites fluorophores Molekül
G Gegenstrang
S Strang

Claims

1. Mikrotiterplatte mit einer Mehrzahl an Kavitäten, wobei die Mikrotiterplatte aus Kunststoff hergestellt und in nerhalb der Kavitäten eine aus Biomolekülen gebildete Be schichtung vorgesehen ist, dadurch gekennzeichnet, daß die Beschichtung kovalent an die Kunststoffoberfläche (M) gebundene Oligonukleotide (P1) aufweist.

2. Mikrotiterplatte nach Anspruch 1, wobei die Oligonukleo tide (P1) aus DNA, PNA, PTO oder Chimären davon bestehen.

3. Mikrotiterplatte nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei an die Oligonukleotide (P1) fluorophore Moleküle (F1, F2) oder Quencher gebunden sind.

4. Mikrotiterplatte nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Beschichtung sich nur über einen Abschnitt der Kunststoffoberfläche (M) innerhalb der Kavitäten er streckt.

5. Mikrotiterplatte nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kunststoff elektrisch leitfähig ist.

6. Mikrotiterplatte nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Kunststoff aus Polypropylen oder Polycarbonat hergestellt ist.

7. Mikrotiterplatte nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mikrotiterplatte 96 Kavitäten aufweist.

8. Mikrotiterplatte nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jede Kavität eines Satzes von n Kavitäten mit einer Beschichtung eines Satzes von n unterschiedlichen spezi fischen Beschichtungen versehen ist, so daß bei Zugabe der Probenlösung in die n Kavitäten n unterschiedliche Nachweisreaktionen gleichzeitig durchführbar sind.

9. Mikrotiterplatte nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein, vorzugsweise beheizbares, Deckelelement zum Verschließen der Kavitäten vorgesehen ist.

10. Verfahren zum Nachweis von Biomolekülen, wobei eine das nachzuweisende Molekül enthaltende Probenlösung herge stellt und mit einer in einer Kavität einer aus Kunst stoff hergestellten Mikrotiterplatte vorgesehenen aus Biomolekülen gebildeten Beschichtung in Kontakt gebracht wird, dadurch gekennzeichnet, daß als Biomoleküle kova lent an die Kunststoffoberfläche (M) gebundene Oligonu kleotide (P1) verwendet werden.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Oligonukleotide (P1) aus DNA, PNA, PTO oder Chimären davon gebildet sind.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, wobei an die Oligonukleotide (P1) fluorophore Moleküle (F1, F2) oder Quencher gebunden sind.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei der Probenlösung ein Primer (P2) zugesetzt wird, der mit ei nem fluorophoren Molekül (F1, F2) markiert ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, wobei der Probenlösung Nukleotide zugesetzt werden, die mit einem fluorophoren Molekül (F1, F2) markiert sind.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, wobei eine Hybridisierung der nachzuweisenden Moleküle mit den Oli gonukleotiden (P1) durch eine Fluoreszenzreaktion ange zeigt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15, wobei die Kunststoffoberfläche (M) elektrisch so polarisiert wird, daß geladene nachzuweisende Moleküle in Richtung der Be schichtung angezogen werden.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, wobei die in der Kavität aufgenommene Probenlösung durch wiederkeh rend erhitzt und abgekühlt wird, so daß das nachzuweisen de Molekül amplifiziert wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 17, wobei die Kavitäten mittels eines, vorzugsweise beheizbares, Decke lelements verschlossen werden.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 18, wobei das nachzuweisende Molekül (N) in der Beschichtung angerei chert werden.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 19, wobei jede Kavität eines Satzes von n Kavitäten mit einer Beschich tung eines Satzes von n unterschiedlichen spezifischen Beschichtungen versehen ist, so daß bei Zugabe der Pro benlösung in die n Kavitäten n unterschiedliche Nachweis reaktionen gleichzeitig durchgeführt werden.

21. Kit mit einer Mikrotiterplatte nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und mindestens einem Primer (P2)

22. Kit nach Anspruch 21, umfassend ferner Nukleotide, Puf ferbestandteile und Enzyme.

23. Kit nach Anspruch 21 oder 22, umfassend ferner eine Heiz-/Kühleinrichtung.

24. Kit nach einem der Ansprüche 22 bis 23, wobei die Kompo nenten Primer (P2), Nukleotide, Pufferbestandteile und Enzyme in gefriergetrockneter Form vorliegen.

25. Kit nach einem der Ansprüche 22 bis 24, wobei die Kompo nenten Primer (P2), Nukleotide, Pufferbestandteile und Enzyme in aus Kunststoff oder Wachs hergestellte Kapseln eingeschlossen sind.