EP0951647A2 - Probenzführung - Google Patents

Probenzführung

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Publication number
EP0951647A2
EP0951647A2 EP98907938A EP98907938A EP0951647A2 EP 0951647 A2 EP0951647 A2 EP 0951647A2 EP 98907938 A EP98907938 A EP 98907938A EP 98907938 A EP98907938 A EP 98907938A EP 0951647 A2 EP0951647 A2 EP 0951647A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
porous material
liquid
supply part
reaction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP98907938A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Wilhelm Ansorge
Holger Erfle
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Original Assignee
Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL filed Critical Europaisches Laboratorium fuer Molekularbiologie EMBL
Publication of EP0951647A2 publication Critical patent/EP0951647A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
    • G01N27/416—Systems
    • G01N27/447—Systems using electrophoresis
    • G01N27/44704—Details; Accessories
    • G01N27/44743—Introducing samples
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
    • G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
    • G01N2035/1027—General features of the devices
    • G01N2035/1034—Transferring microquantities of liquid
    • G01N2035/1037—Using surface tension, e.g. pins or wires

Definitions

  • the invention relates to a method for feeding sample material by means of a sample feed part from a sample addition point to a sample receiving point of a sample processing device, preferably a sample analysis device.
  • the sample material is removed from a sample vessel unit with the aid of a pipetting device and fed to the sample processing device in the form of a vertically oriented electrophoresis device (DE 38 05 808 AI, FIGS. 10 and 11). It is also possible to take several samples at the same time with the aid of a corresponding number of pipettes and to feed corresponding sample receiving pockets on the upper edge of the gel.
  • the mechanical outlay for this known type of sample supply is great, especially when particularly thin gel layers are used and a large number of samples are to be analyzed simultaneously.
  • the gap between the glass plates on both sides of the gel which corresponds to the gel thickness, is in the range of less than one millimeter in the case of the small gel planks sought today; the distance between successive sample pockets is in the range of a few millimeters.
  • up to 100 sample recesses can then be arranged side by side.
  • the effort for the corresponding number of pipettes is correspondingly high, as are the requirements for the positioning accuracy. Only a vertical orientation of the gel is practically possible, otherwise the sample recesses could leak.
  • a method of the type mentioned at the outset is known from WO 94/11529.
  • the sample material is specifically chemically bonded to the teeth of the comb-like sample feed part.
  • the comb-like sample feeder has only eight teeth, so that accordingly only eight samples can be analyzed at the same time. This may be due to the fact that sufficient sample material can only be provided with relatively wide teeth.
  • the invention has for its object to provide a method of the type mentioned, which allows an effective sample material supply in a simple manner.
  • the sample supply part has at least one material section made of porous material with such a pore size of the porous material that the sample material is in the liquid phase due to the sample processing device at least when the sample is added to the sample supply part and when the sample is processed by the sample processing device is held by capillary forces.
  • the sample material is therefore kept in the liquid phase, at least when adding or removing samples, only due to capillary forces in the sample material.
  • the sample material may, but need not, be present in the pores of the porous material in a dried form. In any case, complicated mechanics, such as multi-pipetting devices, are spared.
  • the porous material only has to be brought into contact with the sample material in the liquid phase; Reactions to chemically bind the sample material to the sample feed part are in no way necessary, just as chemical reactions during sample delivery to release the chemical bond between sample material from the sample feed part are not necessary. Since the capillary forces hold the sample material in the liquid phase during sample delivery until it is transferred to the sample processing device, regardless of the direction of gravity, there is no longer any restriction Regarding the orientation of the sample processing device.
  • the porous material can have a sheet shape so that it can be easily pushed between the glass plates of a gel electrophoresis device. At least the material section of the sample supply part preferably consists of porous material throughout, so that the capacity of the material section for the sample material is comparatively high. Small-sized material sections are therefore sufficient, so that a corresponding number of material sections can be used in smaller spaces. The number of samples to be analyzed at a given width of the electrophoresis gel can therefore be increased significantly, for example to 192 to 384 samples.
  • the sample material be dried after the sample has been added to the sample supply part and that the sample supply part be supplied to a liquid phase before the sample is released.
  • the sample supply part which has been dry in the meantime, is particularly easy to handle; the risk of interim contamination is significantly reduced.
  • the sample supply part can, for example, be mechanically processed, e.g. B. are mechanically compressed or blown by compressed gas.
  • an electrical field passing through the porous material section is generated in the area of the sample acceptance point in order to cause a flow of electrically charged molecules, macromolecules or particles of the sample material from the porous material section into the sample processing device.
  • the strength of the electric field is chosen depending on the electric charge so that the capillary forces are overcome.
  • the use of this method step in electrophoresis is particularly advantageous since the means for generating the electric field are provided there from the outset.
  • the sample supply part loaded with the sample material is easy to handle, there is the advantageous possibility that after the sample has been added the sample supply part is transported from the sample addition point to the sample acceptance point.
  • the addition of the sample can therefore take place at a location which is arbitrarily distant from the sample processing device.
  • the transport of the sample from the sample addition point to the sample acceptance point can also take place in that when the sample addition point is physically connected to the sample acceptance point, the capillary forces ensure the sample transport through the porous material section of the sample supply part.
  • This type of sample supply will be used above all if the sample receiving point is particularly inaccessible or restricted to a very small space, as can be the case with microchip sensors, in particular DNA sensors.
  • a separate section of material is generally used for each sample, which is independent of the material sections of the other samples in order to avoid "crosstalk", i.e. H. a mixing of sample material to prevent from the outset, which would otherwise be possible due to the comparatively large amounts of sample material to be used.
  • the possibility of mixing can also be specifically exploited by wetting the porous material with the substances to be mixed at different points or in succession at the same point.
  • proteins eg antigens
  • proteins can be mixed with antibodies by adding them in the porous material, or DNA with complementary hybridization DNA or DNA with labeling agents.
  • porous material sections Due to the ease of handling mentioned and the relatively high sample material capacity of the porous material sections, there is the preferred possibility that a corresponding number of porous material sections are used in a sample processing device with a large number of sample receiving points.
  • the sample supply part comprises, according to the invention, a material section carrier which carries the material sections in an arrangement corresponding to the geometric arrangement of the sample receiving points.
  • the sample supply part can be shaped essentially like a comb if the sample receiving points are arranged in a linear or arcuate manner.
  • the sample supply part can be produced particularly easily, for example by stamping, if it comprises a sheet of porous material having all porous material sections.
  • the material section carrier can also carry a corresponding plurality of separate material sections. Such an arrangement is recommended when the risk of cross-talk cannot otherwise be excluded.
  • the material section carrier can be formed by a base film or can also take another form, such as that of a clamping device.
  • a porous material with an average pore size below 100 ⁇ m, preferably below 10 ⁇ m, preferably below 1 ⁇ m, or with an average pore size between 1.5 ⁇ m and 0.2 ⁇ m, preferably around 0.5 ⁇ m, is preferably used .
  • Such porous material has sufficiently high capillary forces for the sample materials usually used, particularly in the biochemical field.
  • Porous material made of porous cellulose acetate or porous polyethylene or porous glass or agarose gel or other wide-meshed gel matrices has proven to be particularly suitable.
  • the sample acceptance of the sample material by the sample processing device under the influence of the named electric field requires an electrical charge of the substances to be moved. This charge can be obtained in the desired manner in the case of biological macromolecules by adjusting the pH of the liquid phase in a corresponding manner.
  • a sample vessel unit be used with a large number of sample receptacles in a geometric arrangement corresponding to the geometric arrangement of the material sections of the sample supply part. It is therefore sufficient if the comb-like sample feed part with all comb teeth is immersed simultaneously in the large number of sample receptacles.
  • the described method can be used for a large number of sample processing devices, in particular for the detection and / or for the production of a biochemical reaction product.
  • Another application example is a mass spectrometer.
  • the use for supplying sample liquid for an electrophoresis device or a chromotography device is particularly preferred.
  • the separating agent, preferably separating gel, of the electrophoresis device can not only be oriented vertically as before, but also horizontally or in any spatial orientation.
  • a liquid phase preferably a buffer solution
  • the liquid phase serves to dissolve the sample material reversibly adsorbed in the pores within the pores.
  • the capillary forces that then occur keep the sample material in the pores as long as no external forces attack as long as the electrical field forces of the electrophoresis device.
  • the sample liquid addition points in the separating agent form sample liquid recesses for receiving corresponding porous material sections of the sample feed part.
  • the sample liquid recesses can be made independently of the sample supply part and before the sample supply part is supplied or, alternatively, by inserting the comb-shaped sample supply part already provided with sample material into the separating gel material prior to its polymerization.
  • the method can also be used to supply sample liquid to a microchip arrangement, in which case the sample supply part or several sample supply parts in the form of separate material sections can also be stationary in order to cover inaccessible sensor areas with dimensions of, for example, 2 mm ⁇ 2 mm to be permanently connected with more accessible addition points.
  • the invention also relates to a sample supply part for carrying out the described method with at least one material section made of a correspondingly porous material.
  • the invention also relates to an electrophoresis device with a sample feed part for carrying out the aforementioned method, wherein, as also mentioned above, in addition to the previously vertical arrangement, a horizontal arrangement or any arrangement of the separating gel is also possible.
  • Another aspect of the invention relates to a method for carrying out a reaction between at least a first and at least a second reaction partner, preferably for the detection or / and for the production of a biochemical reaction product in a sample liquid, which is characterized in that at least one first reaction partner, which is reversibly adsorbed on a porous material, is brought into contact with at least one second reaction partner in a liquid phase, the Pore size of the porous material is such that the liquid phase is at least partially held in the porous material due to capillary forces.
  • the reaction in the process just described is preferably a biochemical reaction, i. H. a reaction in which biological macromolecules such as proteins, glycoproteins and / or nucleic acids or complexes of such macromolecules, e.g. B. immune complexes between antibodies and antigens, protein-nucleic acid complexes or nucleic acid hybridization complexes are involved as reaction partners or arise as reaction products.
  • the method is particularly suitable for a reaction to nucleic acids, e.g. B. an in vitro transcription, nucleic acid sequencing or nucleic acid amplification.
  • a first reaction partner is used, which is reversibly adsorbed on a porous material with a suitable pore size, i. H. adsorption on the porous material does not take place via chemical covalent bonds or high-affinity interactions (eg biotin-streptavidin), so that elution of the first reaction partner and / or the reaction products from the porous material is essentially completely successful under suitable conditions .
  • a suitable pore size i. H. adsorption on the porous material does not take place via chemical covalent bonds or high-affinity interactions (eg biotin-streptavidin), so that elution of the first reaction partner and / or the reaction products from the porous material is essentially completely successful under suitable conditions .
  • first reaction partners can also be adsorbed on the porous material. This can be done, for example, by soaking the material with a liquid containing several reactants at the same time, or by successive or at different points in the porous material. soak the material with several liquids.
  • the porous material can be used so that the first reactant is adsorbed onto the porous material either dry or wet. Dry adsorption is preferred in order to improve the shelf life of the adsorbed reaction partner or to reduce the reaction volume.
  • the drying of the porous material can be done in the usual way, e.g. B. by freeze drying or vacuum drying.
  • the reaction carried out is a detection reaction for determining an analyte in a sample of biological origin, eg. B. a sample that comprises a body fluid, such as serum, blood, plasma, urine, saliva, etc.
  • a sample of biological origin eg. B. a sample that comprises a body fluid, such as serum, blood, plasma, urine, saliva, etc.
  • body fluid such as serum, blood, plasma, urine, saliva, etc.
  • other biological samples z. B. tissue samples can be used.
  • the detection reaction for determining an analyte is the first reaction partner which is reversibly adsorbed on the porous material, preferably a substance which is specifically capable of binding with the analyte to be determined or a substance which competes with the analyte for a further binding partner.
  • the analyte is, for example, an immunochemically detectable antigen
  • the first reaction partner can be an antibody which is capable of binding to the analyte or an analyte analogue which can compete with the analyte for binding to an antibody.
  • the first reaction partner can be a nucleic acid which is complementary to the analyte or a corresponding nucleic acid analog (for example a peptidic nucleic acid).
  • the reaction it is expedient for the reaction to have a labeling group which indicates the occurrence and / or the strength of the reaction and thus enables a qualitative or quantitative determination of the analyte.
  • the labeling group is preferably a non-radioactive labeling group, e.g. B. a fluorescent or luminescent group, an enzyme, a metal particle, an NMR active group or another labeling group familiar to those skilled in the field of biochemical detection methods.
  • the reaction is carried out in such a way that the reaction products are kept essentially completely in the pores. It is further preferred that the reaction products are essentially completely removable from the porous material. In this way, a quantitative determination of the reaction is possible.
  • the sample liquid containing the reaction product can - as described above - be fed to a sample processing device, preferably a sample analysis device.
  • Another advantage in carrying out a reaction according to the invention in the pores of a porous material is that after the desired reaction time has elapsed, no non-aqueous stop or denaturing reagent, e.g. B. formamide, must be added.
  • a non-aqueous stop or denaturing reagent e.g. B. formamide
  • the addition of such a formamide reagent is necessary in order to achieve sufficient denaturation of the nucleic acids present in the sample.
  • this formamide addition can be dispensed with in the process according to the invention.
  • Another object of the invention is a reagent for carrying out a reaction, in particular for detecting and / or for producing a biochemical reaction product, which comprises a part with at least one portion of material made of porous material, wherein at least one reactive substance is reversibly adsorbed on the porous material and wherein the pore size of the porous material is such that the reactive substance at least partially in contact with liquid in the porous material due to capillary forces is held.
  • This reagent according to the invention can be used in addition to other test components as part of a reagent kit.
  • the invention also relates to an electrophoresis device with a porous, preferably comb-shaped sample feed part, comprising a separating agent, preferably separating gel, and an electric field arrangement for applying an electric field to the separating agent.
  • the object of the invention is to provide an electrophoresis device of the type mentioned, which provides improved measurement results, in particular with higher resolution.
  • the porous sample feed part inserted into the electrophoresis device is arranged at a non-zero distance from the separating means and that the electric field arrangement is designed to generate an electric field in the distance area for transferring sample material from the sample feed part into the Release agent.
  • the electric field arrangement is designed to generate an electric field in the distance area for transferring sample material from the sample feed part into the Release agent.
  • the said distance must in any case be so large that it precludes direct mechanical contact between the sample feed part and the release agent. In order to avoid crosstalk to neighboring samples, the distance should not be too large.
  • a range between 0.2 mm and 2 mm has proven to be particularly favorable.
  • a volume area between the sample feed part and the release agent have an electrically insulating and / or higher density than liquid. speed, preferably Ficoll ® solution or dextran solution.
  • the precision of the electrophoresis measurement, in particular the selectivity of the bands, is in turn improved by this measure. This may be due to the fact that the increased density of the liquid makes it difficult for the biomolecules to migrate out of the porous sample supply part, so that the biomolecules only penetrate into the liquid when the electric field is applied, ie at a well-defined point in time.
  • the use of the electrically insulating liquid may have the effect that, apart from the migration of the biomolecules, no ion migration takes place, which could otherwise impair the homogeneity of the electric field, at least in the region of the bevel, and thus also lead to a deterioration in the resolution.
  • the invention also relates to a method for providing the smallest sample volumes of sample material containing biological macromolecules, preferably for the subsequent capillary-force-receiving by a porous, preferably comb-shaped sample feed part.
  • the object of the invention is to provide a method which leads in a simple manner to the smallest sample volumes, for example in the range of 0.5 ⁇ l. This process is characterized by the successive steps: A) providing an initial sample comprising sample material and a first volume of a first solution liquid (preferably water),
  • Formamide has proven to be a particularly suitable second solvent, also because it has other properties which are advantageous in connection with DNA electrophoresis, namely, it denatures DNA and can also be used as a stop solution. Dextran is also suitable as a second solvent.
  • a comparatively small amount of second solution liquid is therefore added - the sample material can be dissolved in both solution liquids.
  • the first solution liquid has evaporated, so that only the second solution liquid with the sample material contained therein remains.
  • the residual volume (corresponding approximately to the second volume) is therefore independent of the first volume of the first liquid.
  • the remaining volume can also be pressed below the second volume if only a partial volume of the intermediate sample is used in step C, for example half.
  • the remaining volume is then only half of the second volume. For example, assuming a volume of the initial sample of 4 ⁇ l and adding a stop solution of 2 ⁇ l consisting of 1 ⁇ l formamide and 1 ⁇ l buffer solution, a total of 6 ⁇ l is obtained.
  • the resulting formamide-containing sample can then be taken up by direct contact with the porous sample feed part, since it is sucked into the sample feed part due to corresponding capillary forces. It has been found that the sample supply part prepared in this way can be temporarily stored without further measures before it is supplied to the electrophoresis device.
  • the sample feed part Before being inserted into the electrophoresis device, the sample feed part is moistened according to a further development of the invention, and preferably with the same liquid that is also used in the space between the sample feed part used and the release agent. This pre-moistening of the sample feed part prevents blistering of the sample feed part used. Such bubbles can interfere with the biomolecule movement.
  • FIG. 1 is a top view, partially cut along the section line II in FIG. 2, of a first embodiment of an electrophoresis device according to the invention with a comb-like sample feed part
  • FIG. 2 shows a side view of the electrophoresis device according to FIG. 1 cut along the section line II-II in FIG. 1,
  • FIG. 3 is a top view, similar to FIG. 1, of a second embodiment with a smooth-contoured gel molded body
  • FIG. 4 shows a top view of the electrophoresis device, partly or partially cut along the section line IV-IV in FIG. 5, but with a modified sample supply part,
  • FIG. 5 shows a side view of the embodiment according to FIG. 4, cut along the section line V-V in FIG. 4
  • FIG. 5A shows a detail VA of FIG. 5,
  • FIG. 6 is a top view, sectioned along the line VI-VI, of a third embodiment of the electrophoresis device with a plurality of separation capillaries, with a corresponding sample supply part,
  • FIG. 7 is a sectional view of the arrangement according to FIG. 6 cut along the line VII-VII,
  • FIG. 8 is a sectional front view of a comb-like sample feed part inserted into the sample receptacles of a sample vessel unit
  • FIG. 11 shows a simplified isometric view of a further modified electrophoresis device with a sample feed part.
  • the first embodiment shown in FIGS. 1 and 2 of the sample processing device according to the invention in the form of an electrophoresis device is generally designated 10. It comprises a first glass plate 12 and a second glass plate 14 arranged parallel to the latter, which is held at a defined distance from the first glass plate 125 by two spacers arranged laterally, hereinafter also called spacers 16.
  • the resulting cavity between the two glass plates 12 and 14 and the spacers 16 is filled with a layer 18 of polymerized gel.
  • Different gels can be used, e.g. B. polyacrylamide gels, agarose gels or hydroxyethyl cellulose gels.
  • the gel layer 18 On one o of the two end faces, the gel layer 18 has a comb-like structure, which is composed of a multiplicity of depressions, so-called sample receiving points 20, and gel walls 22 lying between the depressions.
  • This structure is known to be produced by (DE-C2- 3 024 288) that a comb-like molded body made of gel-repellent material between the two glass plates 12 and 14 of the gel layer 18 and between the two spacers 16 at the appropriate place in the not yet polymerized gel is pressed in 0 and remains there until the gel has polymerized.
  • a comb-like structure is understood here to mean that the contour of the face of the gel in the top view according to FIG. 15 forms a linear succession of rectangular teeth.
  • Protruding sections 24 of a comb-like sample feed part 26 are inserted into the sample receiving points 20 of the gel layer 18.
  • the first glass plate 12 projects significantly beyond the second glass plate 14. This facilitates the insertion of the protruding sections 24 of the sample supply part 26 into the sample receiving points 24 provided for this purpose in the gel.
  • the sample supply part 26 has a thickness D which is smaller than that of the gel layer 18 (in the range between 0.1 mm and 0.3 mm).
  • the length L of the sections ("teeth") 24 is approximately 3 mm to 8 mm and their width B is approximately 1 mm (essentially corresponding to the depth and width of the sampling points 20).
  • the clear distance A between successive sections 29 is in generally 1 mm to 3 mm corresponding to the thickness of the gel walls 22.
  • the sample receiving points 20 can also be produced in the form of the multiplicity of depressions with gel walls 22 lying between the depressions in that instead of the comb-like molded body made of gel-repellent material, the sample supply part 26 itself is inserted between the glass plates 12 and 14 during gel manufacture.
  • the sample feed part 26 which has already been impregnated with sample material or a sample feed part which has been dried after the impregnation with the various samples.
  • a sample feed part free of sample material can also be inserted into the gel material, sample material then being finished by polymerization before the actual measurement is brought into the area of the individual material sections 24, for example, by feeding by means of a pipette.
  • the sample material is transported into the area of the gel solely by the capillary forces.
  • FIG. 3 shows an electrophoresis device which has essentially the same structure as that according to FIG. 1.
  • the end face of the gel layer 28 has a linear contour instead of a comb-like structure.
  • This linear contour is produced in that a suitable shaped body 30 with flat or also curved end faces extending along a straight line surfaces 32 between the two glass plates 12 and 14 is pressed into the not yet polymerized gel and remains there until the gel is polymerized.
  • the comb-like sample feed part 26 5 can then be fed, the shape of which can correspond to FIGS. 1 and 2.
  • the clear distance A between successive sections 24 can be reduced, since it is no longer necessary to take into account the sufficient stability of the corresponding gel walls 22, as in the exemplary embodiment according to FIGS. 1 and 2.
  • a larger number of tracks 19 can thus be realized, so that a larger number of samples can be measured simultaneously. Nevertheless, after inserting the sample supply part 26, mixing of sample liquid of adjacent comb sections
  • the addition of electrolyte liquid in the area of the introduced sample supply part 26 can wait until immediately before the build-up of the electric field, so that a previous lateral migration of sample liquid
  • FIGS. 4 and 5 Another embodiment, designated 26 ', is shown in FIGS. 4 and 5.
  • a large number of separate sample feed material sections 34 are covered by a material
  • This material section carrier 36 is composed of two plates 38 and 40 arranged parallel to one another, which are connected by two connecting elements 52, e.g. B. cap screws, are pressed together.
  • the material sections 34 are between these two plates 38 and 40
  • FIGS. 4 and 5 corresponds to the embodiment according to FIG. 3 except for a bevel of the second glass plate 14 'in the region between the gel face 43 and the glass plate face 45 on the inside of the glass plate facing the first glass plate 12.
  • the bevel angle a is shown in FIG. 5; the lower transverse edge 47 of the beveled surface in FIGS. 4 and 5 is indicated in FIGS. 4 and 5.
  • This beveling of the second glass plate 14 ' is independent of the design of the sample feed part 26 or 26' and can therefore also be used, for example, in the arrangement according to FIGS. 1 and 2 or FIG. 3.
  • FIG. 5A clarifies that the beveled area designated there with 49 facilitates the introduction of the sample feed part 26, which is shown here as a sheet element according to FIG. 3 for the sake of simplicity.
  • the bevel angle a need only be chosen accordingly large.
  • FIG. 5A further clarifies, in a particularly preferred embodiment of the invention there is a clear distance a between the preferably linearly running edge 51 of the separating gel and the outer ends 53 of the projecting comb sections 24.
  • the distance range, as well as that which adjoins upwards, almost up to the top end of the plate 14 thus reaching and adjacent to the Abschrägungsflache 49 Volumenbe- is rich filled by a liquid which contains 1% Ficoll ® and is accordingly denoted in Figure 5A.
  • this liquid is electrically insulating (di-electrical tric liquid) and on the other hand it also has a density exceeding the density of water.
  • Ficoll ® is understood to mean hydrophilic copolymers made from sucrose and epichlorohydrin and having a molecular weight between 70,000 and 400,000.
  • the Ficoll ® solution ensures a homogeneous electric field despite the wedge shape of the space above the separating gel due to the bevel surface 49.
  • FIG. 5A this is also shown as a possible variant in FIG. 4; where the upper dash-dotted edge of the separating gel is also designated 51. It can be seen that the edge 51 (in contrast to the embodiment according to FIGS. 1 and 2) runs linearly, which simplifies production and allows a larger number of samples (ie tooth-shaped tooth sections 24).
  • sample feed part 26, 26 is also conceivable, such as the use of a material section carrier in the form of an underlay film, e.g. B. in comb form, which in turn carries a corresponding number of individual material sections 34 or a comb-like sheet made of porous material.
  • a material section carrier in the form of an underlay film, e.g. B. in comb form, which in turn carries a corresponding number of individual material sections 34 or a comb-like sheet made of porous material.
  • FIGS. 6 and 7 show a further embodiment of the invention, in which the electrophoresis device 50 has no has a flat gel, but a multiplicity of gel-filled separating capillaries 54 within a base body 52.
  • the protruding sections 62 of a comb-like sample supply part 56 are introduced into the openings of the separating capillaries 54, which, as shown, is either formed as a single sheet of porous material or, according to FIGS. 4, 5, is formed by a material section carrier with a multiplicity of separate porous material sections.
  • the comb-like sample supply part 56 made of porous material also facilitates the sample supply to a large number of closely adjacent sample acceptance points (here openings of the separating capillaries 54), even if the risk of mixing sample liquid from adjacent sample acceptance points ("crosstalk") is low from the outset.
  • the insertion of the free ends of the sections 62 into the openings of the separating capillaries 54 can be facilitated by tapering or rounding off the sections 62 or (in a manner not shown analogously to FIG. 5) by correspondingly tapering the separating capillary openings.
  • all sections 62 deliver their sample liquid to the respective sample receiving point practically simultaneously, so that the risk that the sample liquid diffuses prematurely into the gel in some samples, as is the case with sequential sample supply, for example using a pipette, which is the case here does not exist.
  • the capillary forces ensure that sample liquid only escapes from the porous material if a sufficiently large electric field is applied.
  • the start of diffusion can also be postponed accordingly by delaying the addition of electrolyte.
  • the comb-like sample supply part described above in its various embodiments made of continuously porous material or porous material sections also enables simple and rapid supply of sample liquid to the sample supply part.
  • the geometrical arrangement of these corresponds to the geometrical arrangement of the protruding sections (teeth) 62 of the sample feed part 60. If, as shown, the teeth are arranged linearly one after the other, the sample receptacles 64 are accordingly linear Row arranged.
  • all sections 62 of the sample supply part can be simultaneously soaked with sample liquid by appropriately immersing them in the receptacles 64.
  • the sample supply part 60 is then fed to the respective electrophoresis device.
  • the loading of the sample vessel unit 66 can be carried out in advance, e.g. B. by means of a corresponding manual or automatic multiple pipetting device, that is to say independently of the actual sample loading of the electrophoresis device by means of sample supply part 60.
  • sample liquid can be fed to the respective electrophoresis device in a simple manner, the distance between adjacent porous sections and thus also the distance between the individual samples from one another, which can be kept small Measuring effectiveness of the electrophoresis device significantly increased. Simultaneous start of the migration of the electrically charged components of the sample liquid at the start of the electrophoresis is ensured, so that the precision of the electrophoresis measurements, in particular with regard to the comparison of neighboring tracks, is high.
  • porous material for taking up sample liquid also gives the possibility of treating the sample liquid within the porous material.
  • the porous material thus serves as a sample vessel or reaction vessel.
  • the porous material can be added one after the other or at different points in the porous material with the liquids to be reacted soak, in the latter case the liquids in the porous material are mixed as a result of the capillary forces. It is also possible to impregnate and dry the porous material beforehand with at least one of the reaction liquids, so that the porous material is "impregnated” accordingly. At any later point in time, the porous material can then be added to the further reagent liquid, e.g. B. the sample liquid and / or other reagent solutions, are immersed to allow the desired reaction to take place.
  • the further reagent liquid e.g. B. the sample liquid and / or other reagent solutions
  • the reaction can be any biochemical reaction, e.g. B. an enzymatic reaction, a nucleic acid hybridization reaction, an immunochemical reaction or the like.
  • Reactions on nucleic acids are preferably carried out, such as in vitro transcription, an RNA strand being generated by an RNA polymerase on a nucleic acid matrix, sequencing, preferably by enzymatic reactions, eg. B. with T7 DNA polymerase, the nucleotide sequence of a nucleic acid is determined, or an amplification, the amount of nucleic acid present in the sample liquid can be increased by enzymatic reactions.
  • a preferred example of an amplification is the PCR (polymerase chain reaction).
  • the PCR is preferably carried out at elevated temperatures, the enzymatic reaction at 65 ° C. to 80 ° C., particularly preferably at 72 ° C. to 75 ° C. and the cleavage reaction at 80 ° C. to 100 ° C., particularly preferably at 90 ° C. expires up to 95 ° C.
  • thermocycling with thermostable enzymes.
  • the sensitivity of the sample analysis can be increased considerably by PCR or another amplification reaction.
  • the porous material withstands the drastic conditions during thermocycling, without the decomposition of the porous material which significantly impairs the subsequent analysis or isolation of the reaction product.
  • Fig. 9a shows a comb-like sample supply part 70 in the form of a sheet of porous material.
  • the protruding portions 72 of the sample supply part are with the aid of a dosing device 74 with suitable reagents, such as. B. dyes, enzymes, nucleic acids or the like soaked.
  • suitable reagents such as. B. dyes, enzymes, nucleic acids or the like soaked.
  • These reagents are used to facilitate sample liquid analysis, e.g. B. by coloring, increasing the resolution or the like, or they are added to trigger certain chemical or biochemical reactions before analysis or to retain certain sample proportions.
  • This step can also be carried out several times in succession with different reagents, in order in this way to prepare the porous material sections 72 of the sample supply part 60 for a specific sample analysis.
  • FIG. 9 b shows how the recesses 76 of a sample vessel unit 78 are filled with sample liquid separately via a pipette 80. This step can also be carried out automatically with the aid of an appropriate multiple pipetting device.
  • sample supply part 70 made of porous material, with its protruding sections 72, is inserted into the recesses 76 of the sample vessel unit 78.
  • sample liquid sample addition
  • the protruding sections 72 of the sample feed part 70 are subsequently removed from the recesses 76, the sample liquid remains adhering to the pores of the respective material sections 72 due to the capillary forces.
  • sample liquid can be transferred from the sample vessel unit 78 to the sample processing device 82, e.g. B. electrophoresis or chromatography device, as shown in Fig. 9d.
  • FIG. 9B symbolizes a special way of producing particularly small sample volumes, for example in the range of 0.5 ⁇ l.
  • a starting sample which comprises the biological material to be examined, in particular DNA fragments, and a first volume of a solution liquid S1, preferably water.
  • the volume can be 4 ⁇ l, for example.
  • 0.2 ⁇ l of a stop solution is added, which in turn consists of 1 ⁇ l of a second solution liquid (formamide (formic acid amide)) and 1 ⁇ l of a buffer solution.
  • the resulting intermediate sample of 6 ⁇ l is taken up by the automatic pipetting device and half of it (3 ⁇ l) is filled into the respective bowl-shaped recess 76 of the sample vessel unit 78.
  • the first solution liquid (water) is then evaporated, preferably supported by a blower 81 indicated by a broken line in FIG. 9B. soft of the first solution liquid S1 is also indicated there with corresponding arrows.
  • the second solution liquid S2 (formamide) remains, which then also contains the DNA fragments.
  • the sample volume is only 0.5 ⁇ l, depending on the formamide content.
  • sample volumes can then be picked up by immersing the teeth of the sample feed part 70, the pretreatment of the sample feed part 70 according to FIG. 9A possibly. can also be omitted.
  • the use of the second solution liquid S2 with a comparatively low diffusion rate also makes it possible to temporarily store the correspondingly impregnated sample feed part 70 (FIG. 9e) before it is fed to the electrophoresis or chromatography device according to FIG. 9d.
  • sample supply part 70 is temporarily stored or not, it is advantageous if it is moistened immediately before being inserted into the electrophoresis or chromatography device, as indicated in FIG. 9f.
  • the moistening prevents air bubbles from forming after inserting the sample supply part 70 into the electrophoresis or chromatography device, which can impair the measurement.
  • the same liquid can be used for moistening as is also used in the spacing area (FIG. 5A). This is preferably a one-percent Ficoll ® solution.
  • the sample processing device 82 can have a different structure. Thus, all of the previously described embodiments can be used.
  • the sample liquid is prepared in such a way that the biomolecules contained therein, e.g. B. proteins are electrically charged.
  • the capillary forces that hold the sample liquid in the sample supply part 70 are overcome and thus cause the charged molecules to move in accordance with the electrical forces acting on them.
  • the sample liquid can either enter the gel layer through direct contact between the sample supply part 70 and the gel layer of the sample processing device 82 or via a suitable electrolyte solution, in which case there is a distance of up to a few millimeters between the sample supply part and the gel layer can.
  • sample liquid is sufficient to impregnate the projecting sections 72 of the sample feed part 70.
  • sample liquid is of course to be avoided in order to prevent sample liquid from passing from one section 72 to the next section 72 via the porous material itself.
  • the porous material is also suitable for the forwarding of sample liquid to sample reception points that are otherwise difficult to access.
  • sample liquid supply to a microchip arrangement, in particular a DNA sensor arrangement, as is greatly simplified, is mentioned as an example in FIG. 10.
  • sample liquid can be supplied directly only with great difficulty.
  • sample feed parts 94 made of porous material, however, sample feed can be carried out very easily.
  • any other geometric arrangement can also be selected, such as, for example, B. parallel next to each other, preferably with varying length of feed part from sample feed part. In this way, the distance between the addition ends of the sample feed parts can be increased. With these arrangements, too, the forwarding of the sample material from the sample feed part to the respective sensor area can be forced by a corresponding electric field.
  • a further electrophoresis device 100 is shown in simplified form in FIG. 11, consisting of a lower glass plate 102, an upper glass plate 104 and an intermediate one Gel layer 106, wherein the gel layer 106 here extends to the lower left end of the upper glass plate 104 in FIG. 11.
  • the electrophoresis device 100 like the electrophoresis devices described above, can also be operated in any other spatial orientation, since here, as in known electrophoresis devices with sample pockets on the edge of the gel, there is no danger that the sample material will flow out.
  • the porous material holds the sample material due to capillary forces; it is only the electric field that causes the sample material to migrate into the gel.
  • a support strip 112 can be used, as shown, with a gap between it which essentially corresponds to the thickness of the sample feed part 108 and the end face 110.
  • the ends of the material sections ("teeth") 114 of the sample supply part 108 loaded with the sample material are either held directly on the corresponding end face 116 of the gel layer 106 or at a short distance therefrom.
  • the electric field is built up in the usual way by forming a cathode or anode in the region of the two end regions of the gel layer or on the distal edge of the sample feed part.

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Abstract

Beim Verfahren zur Zuführung von Probenmaterial mittels eines Probenzuführteils (26) von einer Probenzugabestelle zu einer Probenannahmestelle (20) einer Probenbearbeitungseinrichtung (10) wird vorgeschlagen, daß das Probenzuführteil (26) wenigstens einen Materialabschnitt aus porösem Material aufweist mit einer derartigen Porengröße des porösen Materials, daß das Probenmaterial zumindest bei der Probenzugabe in das Probenzuführteil (26) und bei der Probenannahme durch die Probenbearbeitungseinrichtung (10) im porösen Material in flüssiger Phase aufgrund von Kapillarkräften gehalten wird.

Description

PROBENZFÜHRUNG
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Zuführung von Probenmaterial mittels eines Probenzuführteils von einer Probenzugabestelle zu einer Probenannahmestelle einer Probenbearbeitungseinrichtung, vorzugsweise Probenanalyseneinrichtung.
Bei einem bekannten Verfahren wird das Probenmaterial mit Hilfe einer Pipettiereinrichtung von einer Probengefäßeinheit entnommen und der Probenbearbeitungseinrichtung in Form einer vertikal orientierten Elektrophoreseeinrichtung zugeführt (DE 38 05 808 AI, Fig. 10 und 11) . Es können auch mehrere Proben gleichzeitig mit Hilfe einer entsprechenden Vielzahl von Pipetten aufgenommen und entsprechenden Probenaufnahmetaschen am oberen Gelrand zugeführt werden. Der mechanische Aufwand für diese bekannte Art der Probenzuführung ist groß, zumal dann, wenn besonders dünne Gelschichten eingesetzt werden, und eine hohe Anzahl von Proben gleichzeitig analysiert werden soll. Der der Geldicke entsprechende Spalt zwischen den Glasplatten beidseits des Gels liegt bei den heutzutage angestrebten geringen Geldicken im Bereich unter einem Millimeter; der Ab- stand zwischen aufeinanderfolgenden Probentaschen liegt im Bereich weniger Millimeter. Je nach Breite des Gels können dann bis zu 100 Probenausnehmungen nebeneinander angeordnet sein. Der Aufwand für die entsprechende Vielzahl an Pipetten ist dementsprechend hoch sowie die Anforderungen an die Posi- tioniergenauigkeit . Es kommt praktisch nur eine vertikale Orientierung des Gels in Frage, da ansonsten die Probenausnehmungen auslaufen könnten.
Aus der WO 94/11529 ist ein Verfahren der eingangs genannten Art bekannt. An den Zähnen des kammartigen Probenzuführteils ist das Probenmaterial spezifisch chemisch gebunden. Nach dem
Heranführen des Probenzuführteils an das Elektrophoresegel wird die spezifische chemische Bindung durch Zugabe eines entsprechenden Mittels (Formamid) gelöst, so daß dann das Probenmaterial sich vom Probenzuführteil lösen kann und in das Gel unter der Einwirkung des elektrischen Feldes eindringen kann. Das kammartige Probenzuführteil weist lediglich acht Zähne auf, so daß dementsprechend nur acht Proben gleichzeitig analysiert werden können. Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, daß nur bei relativ breiten Zähnen ausreichend Probenmaterial bereitgestellt werden kann.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren der genannten Art bereitzustellen, welches in einfacher Weise eine effektive Probenmaterialzuführung erlaubt.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß das Probenzuführteil wenigstens einen Materialabschnitt aus porösem Material aufweist mit einer derartigen Porengrδße des porösen Materials, daß das Probenmaterial zumindest bei der Probenzugabe in das Probenzuführteil und bei der Probenannahme durch die Proben- bearbeitungseinrichtung im porösen Material in flüssiger Phase aufgrund von Kapillarkräften gehalten wird. Das Probenmaterial wird also, zumindest bei der Probenzugabe bzw. Probenabgabe, in flüssiger Phase lediglich aufgrund von Kapillarkräften im Probenmaterial gehalten. Zwischenzeitlich kann, jedoch muß nicht, das Probenmaterial in getrockneter Form in den Poren des porösen Materials vorliegen. Jedenfalls erspart man sich komplizierte Mechaniken, wie Multi-Pipettiereinrichtungen. Auch muß zur Probenzugabe das poröse Material lediglich mit dem in flüssiger Phase vorliegenden Probenmaterial in Kontakt gebracht werden; Reaktionen zur chemischen Bindung des Probenmaterials am Probenzuführteil sind keineswegs erforderlich, ebenso wenig wie chemische Reaktionen bei der Probenabgabe zum Lösen der chemischen Bindung zwischen Probenmaterial vom Probenzuführteil. Da die Kapillarkräfte das Probenmaterial in der flüssigen Phase bei der Probenabgabe bis zum Übertritt in die Probenbearbeitungseinrichtung, unabhängig von der Schwerkraft- richtung halten, besteht auch keine Einschränkung mehr in Bezug auf die Orientierung der Probenbearbeitungseinrichtung. Das poröse Material kann Blattform aufweisen, so daß es problemlos zwischen die Glasplatten einer Gelelektrophoreseeinrichtung geschoben werden kann. Zumindest der Materialab- schnitt des Probenzuführteils besteht vorzugsweise durchgehend aus porösem Material, so daß das Fassungsvermögen des Materialabschnitts für das Probenmaterial vergleichsweise hoch ist. Es genügen daher kleinformatige Materialabschnitte, so daß eine entsprechende Vielzahl von Materialabschnitten auf gerin- gern Räume eingesetzt werden können. Die Anzahl der gleichzeitig zu analysierenden Proben bei vorgegebener Breite des Elektrophoresegels läßt sich daher deutlich steigern, beispielsweise auf 192 bis 384 Proben.
In Weiterbildung der Erfindung wird vorgeschlagen, daß man das Probenmaterial nach Probenzugabe in das Probenzuführteil trocknet und daß man das Probenzuführteil vor der Probenabgabe einer flüssigen Phase zuführt. Das zwischenzeitlich trockene Probenzuführteil kann besonders leicht gehandhabt werden; die Gefahr zwischenzeitlicher Kontamination ist wesentlich reduziert .
Um eine Probenabgabe vom Probenzuführteil an die Probenbearbeitungseinrichtung zu erzwingen, kann das Probenzuführteil beispielsweise mechanisch bearbeitet werden, z. B. mechanisch zusammengedrückt werden oder von Druckgas durchblasen werden. Besonders bevorzugt ist es jedoch, wenn man im Bereich der Probenannahmestelle ein den porösen Materialabschnitt durchsetzendes elektrisches Feld erzeugt, um einen Fluß elektrisch geladener Moleküle, Makromoleküle oder Teilchen des Probenmaterials vom porösen Materialabschnitt in die Probenbearbeitungseinrichtung zu bewirken. Die Stärke des elektrischen Felds wird in Abhängigkeit von der elektrischen Ladung so gewählt, daß die Kapillarkräfte überwunden werden. Besonders vorteilhaft ist die Anwendung dieses Verfahrensschritts bei der Elektrophorese, da dort von vornherein die Mittel zur Erzeugung des elektrischen Feldes vorgesehen sind. Da, wie angesprochen, das mit dem Probenmaterial beladene Probenzuführteil einfach handhabbar ist, ergibt sich die vorteilhafte Möglichkeit, daß man nach der Zugabe der Probe das Probenzuführteil von der Probenzugabestelle zur Probenannahme- stelle transportiert. Die Zugabe der Probe kann also an einem beliebig von der Probenbearbeitungseinrichtung entfernten Ort vor sich gehen.
Alternativ hierzu kann der Transport der Probe von der Proben- zugabestelle zur Probenannahmestelle auch dadurch erfolgen, daß bei körperlicher Verbindung der Probenzugabestelle mit der Probenannahmestelle durch den porösen Materialabschnitt des Probenzuführteils die Kapillarkräfte für den Probentransport sorgen. Diese Art der Probenzuführung wird man vor allem dann einsetzen, wenn die Probenannahmestelle besonders unzugänglich liegt oder sich auf einen sehr kleinen Raum beschränkt, wie dies bei Mikrochipsensoren, insbesondere DNA-Sensoren, der Fall sein kann. In einem solchen Falle wird man in der Regel für jede Probe einen gesonderten Materialabschnitt einsetzen, der von den Materialabschnitten der übrigen Proben unabhängig ist, um ein "Übersprechen", d. h. ein Mischen von Probenmaterial, von vornherein zu verhindern, was ansonsten aufgrund der vergleichsweisen großen Mengen an einzusetzendem Probenmaterial möglich wäre.
Man kann die Möglichkeit des Mischens jedoch auch gezielt ausnutzen, indem man das poröse Material an verschiedenen Stellen oder nacheinander an der gleichen Stelle mit den zu vermischenden Substanzen benetzt. So kann man durch entspre- chende Zugabe im porösen Material Proteine (z. B. Antigene) mit Antikörpern mischen oder DNA mit komplementärer Hybridi- sierungs-DNA oder DNA mit Labeling-Mitteln.
Bei der zuerst angesprochenen Alternative mit körperlichem Transport des Probenzuführteils von Probenzugabestelle zur
Probenannahmestelle kann mit wesentlich geringeren Mengen an
Probenmaterial gearbeitet werden, so daß die Gefahr des Über- Sprechens auch bei miteinander in Verbindung stehenden Materialabschnitten im allgemeinen zu vernachlässigen ist.
Aufgrund der angesprochenen einfachen Handhabbarkeit sowie der relativ hohen Probenmaterialkapazität der porösen Materialabschnitte besteht die bevorzugte Möglichkeit, daß man bei einer Probenbearbeitungseinrichtung mit einer Vielzahl von Probenannahmestellen eine entsprechende Vielzahl poröser Materialabschnitte einsetzt.
Es können, wie erwähnt, jeweils für sich gesonderte Material- abschnitte eingesetzt werden mit dem Vorzug strikter Trennung, ohne die Gefahr eines Übersprechens. Herstellung und Handhabung der Materialabschnitte vereinfacht sich jedoch dann wesentlich, wenn das Probenzuführteil erfindungsgemäß einen Materialabschnittsträger umfaßt, welcher die Materialabschnitte in einer der geometrischen Anordnung der Probenannahmestellen entsprechenden Anordnung trägt. Dabei kann das Probenzuführteil im wesentlichen kammartig geformt sein, wenn die Probenannahmestellen linear oder bogenförmig angeordnet sind.
Besonders einfach läßt sich das Probenzuführteil herstellen, beispielsweise durch Stanzen, wenn dieses ein sämtliche poröse Materialabschnitte aufweisendes Blatt aus porösem Material umfaßt .
Der Materialabschnittsträger kann jedoch auch eine entsprechende Vielzahl voneinander gesonderter Materialabschnitte tragen. Eine derartige Anordnung empfiehlt sich dann, wenn die Gefahr eines Übersprechens ansonsten nicht auszuschließen ist.
Der Materialabschnittsträger kann von einer Unterlagsfolie gebildet sein, oder auch andere Form annehmen, wie beispiels- weise die einer Klemmvorrichtung. Bevorzugt wird ein poröses Material mit einer mittleren Porengröße unter 100 μm, vorzugsweise unter 10 μm, am besten unter 1 μm, eingesetzt bzw. mit einer mittleren Porengröße zwischen 1,5 μm und 0,2 μm, am besten bei etwa 0,5 μm. Derartiges porö- ses Material weist für die üblicherweise eingesetzten Probenmaterialien, insbesondere im biochemischen Bereich, ausreichend hoher Kapillarkräfte auf.
Als besonders geeignet hat sich poröses Material aus porösem Celluloseacetat oder porösem Polyethylen oder porösem Glas oder Agarosegel oder anderen weitmaschigen Gel-Matrizen herausgestellt .
Die Probenannahme des Probenmaterials durch die Probenbearbei- tungseinrichtung unter Einwirkung des genannten elektrischen Feldes setzt eine elektrische Ladung der zu bewegenden Substanzen voraus. Diese Ladung kann bei biologischen Makromolekülen in gewünschter Weise erhalten werden, indem man den pH- Wert der flüssigen Phase in entsprechender Weise einstellt.
Es hat sich herausgestellt, daß unter dem elektrischen Feld praktisch das gesamte Probenmaterial vom Probenzuführteil abgegeben und der Probenbearbeitungseinrichtung zugeführt wird. Dies eröffnet die Möglichkeit, daß man das Probenzuführ- teil mehrmals hintereinander zur Zuführung von Probenflüssigkeit einsetzt. Der Aufwand für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird hierdurch wiederum reduziert.
Um die Beladung des Probenzuführteils mit einer Vielzahl von Proben zu erleichtern, wird vorgeschlagen, daß man eine Probengefäßeinheit einsetzt mit einer Vielzahl von Probenaufnahmen in einer der geometrischen Anordnung der Materialabschnitte des Probenzuführteils entsprechenden geometrischen Anordnung. Es genügt daher, wenn man das beispielsweise kamm- artige Probenzuführteil mit allen Kammzähnen gleichzeitig in die Vielzahl von Probenaufnahmen eintaucht. Das beschriebene Verfahren kann für eine Vielzahl von Probenbearbeitungseinrichtungen, insbesondere zum Nachweis und/oder zur Herstellung eines biochemischen Reaktionsprodukts eingesetzt werden. Ein weiteres Anwendungsbeispiel ist ein Massen- spektrometer. Besonders bevorzugt ist der Einsatz für die Zuführung von Probenflüssigkeit für eine Elektrophoreseeinrichtung oder eine Chromotographieeinrichtung.
Dabei kann das Trennmittel, vorzugsweise Trenngel, der Elek- trophoreseeinrichtung nicht nur, wie bisher, vertikal orientiert sein, sondern auch horizontal oder in beliebiger Raumorientierung .
Weiter wird vorgeschlagen, daß man eine flüssige Phase, vor- zugsweise Pufferlösung, in einen Bereich an einem Zugabeende eines Trennmittels der Elektrophoreseeinrichtung bzw. Chromatographieeinrichtung zugibt und zwar vor oder nach dem Heranführen des Probenzuführteils. Im Falle eines zwischenzeitlich getrockneten Probenzuführteils dient die flüssige Phase dazu, das in den Poren reversibel adsorbierte Probenmaterial innerhalb der Poren zu lösen. Die dann auftretenden Kapillarkräfte halten das Probenmaterial in den Poren solange keine äußeren Kräfte angreifen, wie die elektrischen Feldkräfte der Elektrophoreseeinrichtung. Durch die Zugabe der flüssigen Pha- se, insbesondere Pufferlösung, läßt sich somit der fruheste Beginn der Probenmaterialwanderung festlegen; dies gilt auch dann, wenn das Probenmaterial nicht zwischenzeitlich getrocknet wurde .
Aufgrund der Einwirkung des elektrischen Feldes ist ein unmittelbarer Übergang des Probenmaterials in das Trennmittel möglich; aufgrund der Anwesenheit der flüssigen Phase, vorzugsweise Pufferlösung, kann zwischen dem Probenzuführteil und dem Zugabeende des Trennmittels jedoch auch ein Abstand bis zu mehreren Millimetern bestehen. Ferner wird vorgeschlagen, daß bei einem zur gleichzeitigen Trennung mehrerer Probenflüssigkeiten geeigneten Trennmittel mit mehreren Probenflüssigkeit-Zugabestellen längs einer Trennmittelkante die Probenflüssigkeit-Zugabestellen im Trenn- mittel Probenflüssigkeit-Ausnehmungen ausbilden zur Aufnahme entsprechender poröser Materialabschnitte des Probenzuführteils. Die Probenflüssigkeit-Ausnehmungen können hierbei unabhängig vom Probenzuführteil und vor dem Zuführen des Probenzuführteils hergestellt werden oder, alternativ, durch Ein- setzen des bereits mit Probenmaterial versehenen kammformigen Probenzuführteils in das Trenngelmaterial vor dessen Polymeri- sierung .
Durch die Probenflüssigkei -Ausnehmungen wird ein Vermischen von verschiedenen Proben an der Trennmittelkante von vornherein vermieden.
Es hat sich jedoch herausgestellt, daß es auch möglich ist, bei einem zur gleichzeitigen Trennung mehrerer Probenflüssig- keiten geeigneten Trennmittel mit mehreren Probenzugabestellen längs der Trennmittelkante das Probenzuführteil mit seinen voneinander in Richtung der Trennmittelkante beabstandeten Materialabschnitten in Kontakt mit der Trennmittelkante zu bringen oder in einem bis zu einige Millimeter betragenden Abstand von der Kante anzuordnen. In diesem Falle sind also keine Probenflüssigkeit-Ausnehmungen ausgebildet, so daß das Trennmittel durchgehend längs der geraden oder bogenförmigen Trennmittelkante endet. Dies erleichtert die Herstellung des Trennmittels. Darüber hinaus hat sich herausgestellt, daß durch den Wegfall der Gelmaterialstege zwischen den Ausnehmungen die lineare Probendichte (parallel zur Trennmittelkante) weiter erhöht werden kann, ohne Beeinträchtigung der Messung, insbesondere ohne die Gefahr der Probenvermischung. Auch ergeben sich präzise, parallel zueinander verlaufende Elektropho- rese-Spuren, die eine genaue vergleichende Auswertung benachbarter Spuren ermöglichen, zumal der Elektrophoresebeginn jeder Spur erfindungsgemäß genau gleichzeitig ausgelöst werden kann. Die Ursache für diese entscheidenden Vorteile mag darin liegen, daß erfindungsgemäß der Austritt von Probenmaterial aus dem Probenzuführteil und damit der Eintritt in das Elektrophoresegel ausschließlich durch das elektrische Feld ausge- löst wird mit erzwungener Wanderung der geladenen Teilchen in Feldrichtung. Eine anderweitige Bewegung, insbesondere Diffusionsbewegung in Querrichtung, wird von vornherein unterbunden.
Die beschriebenen Vorteile der Erfindung kommen wenigstens zum Teil auch dann zum Tragen, wenn sie zur Zuführung von Probenflüssigkeit zu einer mehrere Trennkapillaren aufweisenden Elektrophoreseeinrichtung oder Chromatographieeinrichtung eingesetzt wird. Auch hier ist eine hohe Probendichte bei einfacher Handhabung realisierbar.
Das Verfahren kann auch, wie bereits angesprochen, zur Zuführung von Probenflüssigkeit zu einer Mikrochip-Anordnung eingesetzt werden, wobei dann das Probenzuführteil bzw. mehrere Probenzuführteile in Form gesonderter Materialabschnitte auch ortsfest sein können, um unzugängliche Sensorbereiche mit Abmessungen beispielsweise von 2 mm X 2 mm mit besser zugänglichen Zugabestellen dauernd zu verbinden.
Die Erfindung betrifft auch ein Probenzuführteil zur Durchführung des geschilderten Verfahrens mit wenigstens einem Materialabschnitt aus entsprechend porösem Material.
Die Erfindung betrifft auch eine Elektrophoreseeinrichtung mit Probenzuführteil zur Durchführung des genannten Verfahrens, wobei, wie ebenfalls bereits erwähnt, neben der bisher vertikalen Anordnung auch eine horizontale Anordnung bzw. eine beliebige Anordnung des Trenngels möglich ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zwischen mindestens einem ersten und mindestens einem zweiten Reaktionspartner, vorzugsweise zum Nachweis oder/und zur Herstellung eines biochemischen Reaktionsprodukts in einer Probenflüssigkeit, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man mindestens einen ersten Reaktionspartner, der auf einem porösen Material reversibel adsorbiert ist, in einer flüssigen Phase in Kontakt mit mindestens einem zweiten Reaktionspartner bringt, wobei die Porengröße des porösen Materials derart ist, daß die flüssige Phase zumindest teilweise im porösen Material aufgrund von Kapillarkräften gehalten wird.
Die Reaktion im eben beschriebenen Verfahren ist vorzugsweise eine biochemische Reaktion, d. h. eine Reaktion, an der biologische Makromoleküle, wie etwa Proteine, Glykoproteine oder/und Nukleinsäuren bzw. Komplexe solcher Makromoleküle, z. B. Immunkomplexe zwischen Antikörpern und Antigenen, Pro- tein-Nukleinsäure-Komplexe oder Nukleinsäure-Hybridisierungs- komplexe als Reaktionspartner beteiligt sind bzw. als Reaktionsprodukte entstehen. Besonders geeignet ist das Verfahren für eine Reaktion an Nukleinsäuren, z. B. eine in vitro-Trans- kription, eine Nukleinsäuresequenzierung oder eine Nukleinsäu- reamplifizierung.
Bei dem eben beschriebenen Verfahren wird ein erster Reak- tionspartner verwendet, der auf einem porösen Material mit geeigneter Porengröße reversibel adsorbiert ist, d. h. die Adsorption auf dem porösen Material erfolgt nicht über chemische kovalente Bindungen oder hochaffine Wechselwirkungen (z. B. Biotin-Streptavidin) , so daß eine Elution des ersten Reaktionspartners oder/und der Reaktionsprodukte aus dem porö- sen Material unter geeigneten Bedingungen im wesentlichen vollständig gelingt.
An das poröse Material können auch mehrere erste Reaktionspartner adsorbiert sein. Dies kann beispielsweise durch Trän- ken des Materials mit einer gleichzeitig mehrere Reaktionspartner enthaltenden Flüssigkeit bzw. durch aufeinanderfolgendes oder an verschiedenen Stellen des porösen Materials erfol- gendes Tränken des Materials mit mehreren Flüssigkeiten erfolgen.
Für das erfindungsgemäße Verfahren kann das poröse Material so eingesetzt werden, daß der erste Reaktionspartner entweder trocken oder feucht auf dem porösen Material adsorbiert ist. Um die Haltbarkeit des adsorbierten Reaktionspartners zu verbessern bzw. das Reaktionsvolumen zu verringern, ist die trockene Adsorption bevorzugt. Die Trocknung des porösen Mate- rials kann auf übliche Weise, z. B. durch Gefriertrocknen oder Vakuumtrocknen, erfolgen.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei der durchgeführten Reaktion um eine Nach- weisreaktion zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe biologischen Ursprungs, z. B. einer Probe, die eine Körper- flüssigkeit umfaßt, wie etwa Serum, Blut, Plasma, Urin, Speichel etc. Ebenso können jedoch auch andere biologische Proben, z. B. Gewebeproben, verwendet werden.
Bei der Nachweisreaktion zur Bestimmung eines Analyten handelt es sich bei dem ersten, auf dem porösen Material reversibel adsorbierten Reaktionspartner, vorzugsweise um eine mit dem zu bestimmenden Analyten spezifisch bindefähige Substanz oder um eine mit dem Analyten um einen weiteren Bindepartner konkurrierende Substanz. Wenn es sich bei dem Analyten beispielsweise um ein immunchemisch nachweisbares Antigen handelt, kann der erste Reaktionspartner ein mit dem Analyten bindefähiger Antikörper oder ein Analyt- Analogon sein, welches mit dem Analyten um die Bindung an einen Antikörper konkurrieren kann. Wenn es sich bei dem Analyten beispielsweise um eine Nuklein- säure handelt, kann der erste Reaktionspartner eine zu dem Analyten komplementäre Nukleinsäure bzw. ein entsprechendes Nukleinsäure-Analogon (z. B. eine peptidische Nukleinsäure) sein. Für Nachweisverfahren ist es zweckmäßig, daß bei der Reaktion eine Markierungsgruppe vorhanden ist, die das Auftreten oder/ und die Stärke der Reaktion anzeigt und somit eine qualitative bzw. quantitative Bestimmung des Analyten ermöglicht. Vorzugs- weise ist die Markierungsgruppe eine nicht radioaktive Markierungsgruppe, z. B. eine fluoreszierende oder lumineszierende Gruppe, ein Enzym, ein Metallpartikel, eine NMR-aktive Gruppe oder eine andere, dem Fachmann auf dem Gebiet biochemischer Nachweisverfahren geläufige Markierungsgruppe.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Reaktion so durchgeführt, daß die Reaktionsprodukte im wesentlichen vollständig in den Poren gehalten werden. Weiterhin ist es bevorzugt, daß die Reaktionsprodukte im wesentlichen voll- ständig wieder aus dem porösen Material entfernbar sind. Auf diese Weise ist eine quantitative Bestimmung der Reaktion möglich.
Die das Reaktionsprodukt enthaltende Probenflüssigkeit kann - wie zuvor beschrieben - einer Probenbearbeitungseinrichtung, vorzugsweise einer Probenanalyseeinrichtung, zugeführt werden.
Ein weiterer Vorteil bei der Durchführung einer erfindungsgemäßen Reaktion in den Poren eines porösen Materials besteht darin, daß nach Ablauf der gewünschten Reaktionsdauer kein nichtwässriges Stop- oder Denaturierungsreagenz , z. B. Forma- mid, zugegeben werden muß. Bei Verfahren des Standes der Technik, insbesondere bei Reaktionen an Nukleinsäuren, ist die Zugabe eines solchen Formamid-Reagenz erforderlich, um eine ausreichende Denaturierung der in der Probe vorhandenen Nukleinsäuren zu erreichen. Überraschenderweise wurde festgestellt, daß beim erfindungsgemäßen Verfahren auf diese Forma- mid-Zugabe verzichtet werden kann.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Reagenz zur Durchführung einer Reaktion, insbesondere zum Nachweis oder/ und zur Herstellung eines biochemischen Reaktionsprodukts, welches ein Teil mit wenigstens einem Materialabschnitt aus porösem Material umfaßt, wobei mindestens eine reaktive Substanz auf dem porösen Material reversibel adsorbiert ist und wobei die Porengröße des porösen Materials derart ist, daß die reaktive Substanz bei Kontakt mit Flüssigkeit zumindest teilweise im porösen Material aufgrund von Kapillarkräften gehalten wird. Dieses erfindungsgemäße Reagenz kann neben anderen Testkomponenten als Bestandteil eines Reagenzienkits eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch eine Elektrophoreseeinrichtung mit einem porösen, vorzugsweise kammformigen Probenzuführteil, umfassend ein Trennmittel, vorzugsweise Trenngel, und eine Elektrofeld-Anordnung zum Anlegen eines elektrischen Feldes an das Trennmittel.
Eine derartige Anordnung ist an sich bekannt (US-A-5 , 464 , 515 und EP-A1-0 493 996) . Sämtliche Zähne des kammformigen porösen Probenzuführteils haben zumindest an einem Punkt Körperkontakt mit dem Gel, um den Übergang des Probenmaterials (hier Proteine) in das Gel zu gewährleisten. Bislang konnten mit derartigen Anordnungen jedoch keine voll befriedigenden Ergebnisse erzielt werden.
Die Aufgabe der Erfindung liegt darin, eine Elektrophoreseeinrichtung der genannten Art bereitzustellen, welche verbesserte Meßergebnisse, insbesondere mit höherer Auflösung, liefert.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß das in die Elektrophoreseeinrichtung eingesetzte poröse Probenzuführteil in einem von Null verschiedenen Abstand vom Trennmittel angeordnet ist und daß die Elektrofeld-Anordnung zur Erzeugung eines elektrischen Feldes im Abstandsbereich ausgebildet ist zur Über- führung von Probenmaterial aus dem Probenzuführteil in das Trennmittel. Erfindungsgemäß erfolgt also kein unmittelbarer Probenmaterialübertrag aus dem porösen Probenzuführteil in das Trennmittel, da das Probenmaterial als erstes unter Überwindung der Kapillarkräfte durch das elektrische Feld in den Abstandsraum eindringt und dann erst in das Trennmittel . Dabei ist die Wanderungsgeschwindigkeit der elektrisch geladenen Biomoleküle, insbesondere DNA-Abschnitte, innerhalb der den Abstandsraum ausfüllenden Flüssigkeit beträchtlich größer als die Wanderungsgeschwindigkeit im Trennmittel, insbesondere Trenngel. Dies gibt eine Art Aufstau-Effekt (Stacking-Effekt ) mit räumlicher Konzentration sämtlicher Biomoleküle am Rand des Trennmittels in der Anfangsphase der Elektrophorese-Messung. Man erhält am Ende der Folge extrem scharfe durch das Trenngel wandernde Bänder.
Der besagte Abstand muß jedenfalls so groß sein, daß er einen unmittelbaren mechanischen Kontakt zwischen Probenzuführteil und Trennmittel ausschließt. Um ein Übersprechen zu benachbarten Proben auszuschließen, sollte der Abstand auch nicht allzu groß sein. Als besonders günstig hat sich ein Bereich zwischen 0.2 mm und 2 mm herausgestellt.
Um möglichst hohe Trennschärfe bei geringem Materialeinsatz an Trennmittel zu erhalten, werden möglichst geringe Trennmittel- dicken angestrebt. So liegen Trenngeldicken vielfach bei 0,5 mm und darunter. Das korrekte Einführen des u.U. recht flexiblen porösen kammformigen Probenzuführteils zwischen die das Trennmittel zwischen sich haltenden Platten verlangt daher äußerste Sorgfalt. In diesem Zusammenhang wird vorgeschlagen, daß bei Einsatz eines zwei Platten miteinander verbindenden Trennmittels wenigstens eine der beiden Platten mit einer trennmittelseitigen Abschrägung zur Erleichterung der Einführung des Probenzuführteils versehen ist. Es können somit auch Anlernkräfte zum Einsetzen der Probenzuführteile eingesetzt werde .
Ferner wird vorgeschlagen, daß ein Volumenbereich zwischen Probenzuführteil und Trennmittel mit einer elektrisch isolierenden und/oder höhere Dichte als Wasser aufweisenden Flüssig- keit, vorzugsweise Ficoll®-Lösung oder Dextran-Lösung, ausgefüllt ist. Die Präzision der Elektrophoresemessung, insbesondere die Trennschärfe der Banden, wird durch diese Maßnahme wiederum verbessert. Dies mag darauf zurückzuführen sein, daß die erhöhte Dichte der Flüssigkeit ein Herauswandern der Biomoleküle aus dem porösen Probenzuführteil an sich erschwert, so daß erst bei Anlegen des elektrischen Feldes, d.h. zu einem wohl definierten Zeitpunkt, die Biomoleküle in die Flüssigkeit eindringen. Der Einsatz der elektrisch isolierenden Flüssig- keit mag den Effekt haben, daß bis auf die Wanderung der Biomoleküle keine Ionenwanderung stattfindet, was zumindest im Bereich der Abschrägung ansonsten zu einer Beeinträchtigung der Homogenität des elektrischen Feldes führen könnte und damit auch zu einer Verschlechterung der Auflösung.
Die Erfindung betrifft ferner auch ein Verfahren zur Bereitstellung kleinster Probenvolumina aus biologische Makromoleküle enthaltendem Probenmaterial, vorzugsweise zur anschließenden kapillarkraftbewirkten Aufnahme durch ein poröses, vorzugsweise kammförmiges Probenzuführteil.
Es ist leicht einzusehen, daß die Trennschärfe der Elektrophorese zunimmt, wenn das jeweils eingesetzte Probenvolumen abnimmt, und das heißt, sich auf immer kleinerem Raum, zum Bei- spiel an den Enden der Kammzinken, konzentriert. Von der Meßtechnik ist eine untere Grenze lediglich die Nachweisempfindlichkeit. Die Bereitstellung derartig geringer Probenvolumina von beispielsweise 0,5 μl ist jedoch problematisch, vor allem bei dem angestrebten Einsatz von Pipettierautomaten, da diese zumeist erst größere Probenvolumina im Mikroliterbereich bereitstellen können. Die Aufgabe der Erfindung liegt dem gegenüber darin, ein Verfahren anzugeben, welches in einfacher Weise zu kleinsten Probenvolumina, beispielsweise im Bereich von 0,5 μl, führt. Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch die aufeinanderfolgenden Schritte: A) Bereitstellen einer Ausgangsprobe, die Probenmaterial und ein erstes Volumen einer ersten Lösungsflüssigkeit (vorzugsweise Wasser) umfaßt,
B) Bereitstellen einer Zwischenprobe, die durch Hinzufügen eines zweiten Volumens einer zweiten Lösungsflüssigkeit mit geringerer Verdunstungsrate als die erste Lösungs- flüssigkeit zur Ausgangsprobe erhalten wird,
C) Verdunstenlassen der ersten Lösungsflüssigkeit der Zwischenprobe, wobei das erhaltene Restvolumen das ge- wünschte Probenvolumen ist .
Als besonders geeignetes zweites Lösungsmittel hat sich Forma- mid herausgestellt, und zwar auch deshalb, weil es noch weitere im Zusammenhang mit der DNA-Elektrophorese vorteilhafte Eigenschaften aufweist, nämlich, es denaturiert DNA und kann auch als Stopp-Lösung eingesetzt werden. Auch eignet sich Dextran als zweites Lösungsmittel.
Erfindungsgemäß wird also eine vergleichsweise geringe Menge an zweiter Lösungsflüssigkeit zugegeben - das Probenmaterial ist in beiden Lösungsflüssigkeiten lösbar. Nach dem Schritt C ist die erste Lösungsflüssigkeit verdunstet, so daß lediglich die zweite Lösungsflüssigkeit mit dem darin enthaltenen Probenmaterial übrigbleibt. Das (etwa dem zweiten Volumen ent- sprechende) Restvolumen ist also unabhängig vom ersten Volumen der ersten Flüssigkeit. Man kann das Restvolumen auch noch unter das zweite Volumen drücken, wenn man im Schritt C lediglich ein Teilvolumen der Zwischenprobe verwendet, beispielsweise die Hälfte. Das Restvolumen ist dann lediglich die Hälfe des zweiten Volumens. Geht man beispielsweise von einem Volumen der Ausgangsprobe von 4 μl aus und fügt eine Stopp-Lösung von 2 μl hinzu bestehend aus 1 μl Formamid und 1 μl Pufferlösung, erhält man insgesamt 6 μl . Wird hiervon die Hälfte, also 3 μl, in eine Probenaufnahmeschale abgegeben und anschließend sämtliche Flüssigkeit bis auf den 0,5 μl Formamid-Anteil verdunstet, so ergibt sich ein Probenvolumen von 0,5 μl . Die Verdunstung kann durch Einsatz eines Gebläses (zum Beispiel in Form eines Labor-Föns) beschleunigt werden.
Die sich ergebende formamidhaltige Probe kann dann durch un- mittelbaren Kontakt mit dem porösen Probenzuführteil aufgenommen werden, da es aufgrund entsprechender Kapillarkräfte in das Probenzuführteil eingesogen wird. Es hat sich herausgestellt, daß das derart präparierte Probenzuführteil ohne weitere Maßnahmen zwischengelagert werden kann, bevor es der Elektrophoreseeinrichtung zugeführt wird.
Vor dem Einsetzen in die Elektrophoreseeinrichtung wird das Probenzuführteil gemäß einer Weiterbildung der Erfindung befeuchtet, und dies bevorzugt mit derselben Flüssigkeit, die auch in den Abstandsraum zwischen dem eingesetzten Probenzuführteil und dem Trennmittel eingesetzt wird. Diese Vorbefeuchtung des Probenzuführteils verhindert Blasenbildung des eingesetzten Probenzuführteils. Derartige Blasen können die Biomolekül-Bewegung stören.
Sämtliche vorstehend beschriebenen jeweils für sich oder in Kombination einsetzbaren Maßnahmen führen zu einer deutlichen Verbesserung der Trennschärfe einzelner Elektrophoresebanden innerhalb einer Elektrophoresebahn sowie dazu, daß schmälere und dichter nebeneinanderliegende Bahnen möglich sind, so daß eine größere Anzahl von Proben gleichzeitig in einer Elektrophoresemessung behandelt werden können. Auch ist die Handhabung erleichtert sowie die Möglichkeit des Einsatzes von Dispenser-Robotern .
Die Erfindung wird im folgenden an bevorzugten Ausführungsbei- spielen anhand der Zeichnungen erläutert. Es zeigt:
Fig. 1 eine entlang der Schnittlinie I-I in Fig. 2 teil- weise geschnittene Draufsicht einer ersten Ausführungform einer erfindungsgemäßen Elektrophoreseeinrichtung mit kammartigem Probenzuführteil, Fig. 2 eine entlang der Schnittlinie II-II in Fig. 1 geschnittene Seitenansicht der Elektrophoreseeinrichtung gemäß Fig. 1,
5 Fig. 3 eine analog zur Fig. 1 geschnittene Draufsicht einer zweiten Ausführungsform mit glattkonturigem Gel- Formkörper,
Fig. 4 eine entlang der Schnittlinie IV-IV in Fig. 5 teil- o weise geschnittene Draufsicht der Elektrophoreseeinrichtung, jedoch mit abgewandeltem Probenzuführteil ,
Fig. 5 eine entlang der Schnittlinie V-V in Fig. 4 ge- 5 schnittene Seitenansicht der Ausführungsform gemäß
Fig. 4,
Fig. 5A ein Detail VA der Figur 5,
o Fig. 6 eine entlang der Linie VI-VI geschnittene Draufsicht einer mehrere Trennkapillaren aufweisenden dritten Ausführungsform der Elektrophoreseeinrichtung mit entsprechendem Probenzuführteil,
5 Fig. 7 eine entlang der Linie VII-VII geschnittene Schnittansicht der Anordnung gemäß Fig. 6,
Fig. 8 eine geschnittene Vorderansicht eines in die Probenaufnahmen einer Probengefäßeinheit eingesetzten, 0 kammartigen Probenzuführteils,
Fig. 9 die die Verwendung des Probenzuführteils kennzeichnenden Verfahrensschritte,
5 Fig. 10 eine Verwendungsmöglichkeit separater Probenzuführ- teilabschnitte zum Zuführen von Probenflüssigkeit zu einer kreisförmig angeordneten, DNA-Sensoren aufweisenden Mikrochipanordnung, und
Fig. 11 eine vereinfachte isometrische Ansicht einer weiter 5 abgewandelten Elektrophoreseeinrichtung mit Probenzuführteil .
Die in den Fig. 1 und 2 gezeigte erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Probenbearbeitungseinrichtung in Form einer o Elektrophoreseeinrichtung ist allgemein mit 10 bezeichnet. Sie umfaßt eine erste Glasplatte 12 und eine zu dieser parallel angeordnete zweite Glasplatte 14, die durch zwei seitlich angeordnete Abstandshalter, im folgenden auch Spacer 16 genannt, in einem definierten Abstand zur ersten Glasplatte 12 5 gehalten wird. Der sich ergebende Hohlraum zwischen den beiden Glasplatten 12 und 14 und den Spacern 16 ist durch eine Schicht 18 polymerisierten Gels ausgefüllt. Es können verschiedene Gele zum Einsatz kommen, wie z. B. Polyacrylamid- Gele, Agarose-Gele oder Hydroxyethylcellulose-Gele . An einer o der beiden Stirnflächen weist die Gelschicht 18 eine kammartige Struktur auf, die sich aus einer Vielzahl von Vertiefungen, sogenannten Probenannahmestellen 20, und zwischen den Vertiefungen liegenden Gelwänden 22 zusammensetzt.
5 Diese Struktur wird bekanntermaßen dadurch hergestellt (DE-C2- 3 024 288) , daß an der entsprechenden Stelle in das noch nicht polymerisierte Gel ein kammartiger Formkörper aus gelabweisendem Material zwischen die beiden Glasplatten 12 und 14 der Gelschicht 18 und zwischen den beiden Spacern 16 eingedrückt 0 wird und dort solange verbleibt, bis das Gel polymerisiert ist. Beim vorsichtigen Entfernen des kammartigen Formkörpers entsteht dann die erwünschte kammartige Struktur der Gelstirnfläche. Unter kammartiger Struktur sei hier verstanden, daß die Kontur der Gelstirnfläche in der Draufsicht gemäß Fig. 1 5 eine lineare Aufeinanderfolge von Rechteckzähnen bildet. In die Probenannahmestellen 20 der Gelschicht 18 sind hervorstehende Abschnitte 24 eines kammartigen Probenzuführteils 26 eingefügt. Wie in Fig. 2 zu erkennen ist, steht im Stirnbereich der Elektrophoreseeinrichtung 10 die erste Glasplatte 12 deutlich über die zweite Glasplatte 14 vor. Dies erleichtert das Einführen der vorstehenden Abschnitte 24 des Probenzuführteils 26 in die dafür im Gel vorgesehenen Probenannahmestellen 24.
Das Probenzuführteil 26 weist eine Dicke D auf, die kleiner als die der Gelschicht 18 (im Bereich zwischen 0 , 1 mm und 0,3 mm) ist. Die Länge L der Abschnitte ("Zähne") 24 beträgt etwa 3 mm bis 8 mm und ihre Breite B etwa 1 mm (im wesentlichen entsprechend der Tiefe und Breite der Probenannahmestel- len 20) Der lichte Abstand A zwischen aufeinander folgenden Abschnitten 29 beträgt im allgemeinen 1 mm bis 3 mm entsprechend der Dicke der Gelwände 22.
Das Probenzuführteil 26 besteht aus porösem Material, wie z. B. porösem Celluloseacetat (mit D = 0,15 mm bis 0,2 mm), porösem Polyethylen oder porösem Glas, dessen Porengröße derart ausgebildet ist, daß es bei Kontakt mit Probenflüssigkeit diese aufgrund von Kapillarkräften aufnimmt und hält . Bevorzugt werden Porengrößen im Bereich von 0,5 μm eingesetzt. Es können unter Umständen aber auch Materialien mit größeren oder kleineren Poren verwendet werden. Aufgrund der Kapillarkräfte wird dann die aufgenommene Probenflüssigkeit in den Poren des porösen Materials des Probenzuführteils 26 gehalten, solange keine die Kapillarkräfte überwindende Kraft auf die Proben- flüssigkeit wirkt.
Durch Anlegen des üblichen elektrischen Feldes an die Elektrophoreseeinrichtung 10 wird auf die elektrisch geladenen Bestandteile der Probenflüssigkeit in den Poren des porösen Materials des Probenzuführteils 26 eine die Kapillarkräfte übersteigende Kraft ausgeübt mit der Folge, daß diese Bestandteile das Probenzuführteil 26 verlassen und in die Gelschicht 18 eindringen und dort entlang der üblichen, zueinander parallelen Bahnen 19 wandern mit zunehmender örtlicher Trennung entsprechend der jeweiligen Ladung und Beweglichkeit im Gel. Auf die Handhabung des Probenzuführteils 26 wird später in Verbindung mit Fig. 9 noch näher eingegangen.
Abweichend zum vorstehend Beschriebenen können die Probenannahmestellen 20 in Form der Vielzahl von Vertiefungen mit zwischen den Vertiefungen liegenden Gelwänden 22 auch dadurch hergestellt werden, daß anstelle des kammartigen Formkörpers aus gelabweisendem Material das Probenzuführteil 26 selbst bei der Gelherstellung zwischen die Glasplatten 12 und 14 eingesetzt wird. Dabei wird man im allgemeinen ein bereits mit Probenmaterial getränktes Probenzuführteil 26 einsetzen oder ein Probenzuführteil, welches nach dem Tränken mit den verschiedenen Proben getrocknet worden ist . Bei entsprechender Gestaltung des Probenzuführteils 26, beispielsweise ähnlich der noch zu beschreibenden Fig. 4 und 5, mit voneinander getrennten Materialabschnitten kann auch ein probenmaterial- freies Probenzuführteil in das Gelmaterial eingesetzt werden, wobei dann nach der Fertigstellung des Gels durch Polymerisation vor der eigentlichen Messung Probenmaterial jeweils in den Bereich der einzelnen Materialabschnitte 24 gebracht wird, beispielsweise durch Zuführung mittels Pipette. Der Material- transport des Probenmaterials in den Bereich des Gels erfolgt in diesem Fall allein durch die Kapillarkräfte. Eine nach diesem Prinzip arbeitende Anordnung wird nachfolgend noch anhand der Fig. 10 erläutert.
Fig. 3 zeigt eine Elektrophoreseeinrichtung, die im wesentlichen denselben Aufbau, wie die gemäß Fig. 1, besitzt.
Bei der Ausführungsform gemäß Fig. 3 weist allerdings die Stirnfläche der Gelschicht 28 statt einer kammartigen Struktur eine lineare Kontur auf. Diese lineare Kontur wird dadurch hergestellt, daß ein geeigneter Formkörper 30 mit sich längs einer Geraden erstreckenden ebenen oder auch gewölbten Stirn- flächen 32 zwischen die beiden Glasplatten 12 und 14 in das noch nicht polymerisierte Gel eingedrückt wird und dort verbleibt, bis das Gel polymerisiert ist. Nach dem Entfernen des Formkörpers 30 kann dann das kammartige Probenzuführteil 26 5 zugeführt werden, welches in seiner Form demgemäß Fig. 1 und 2 entsprechen kann. Unter Umständen kann der lichte Abstand A zwischen aufeinander folgenden Abschnitten 24 reduziert werden, da nicht mehr auf die ausreichende Stabilität der entsprechenden Gelwände 22, wie beim Ausführungsbeispiel gemäß ιo Fig. 1 und 2 Rücksicht genommen werden muß. Somit läßt sich eine größere Anzahl von Spuren 19 verwirklichen, so daß eine größere Anzahl von Proben gleichzeitig gemessen werden kann. Dennoch wird nach dem Einsetzen des Probenzuführteils 26 ein Vermischen von Probenflüssigkeit benachbarter Kammabschnitte
15 24 verhindert, da die Kapillarkräfte in den Abschnitten 24 ein seitliches Austreten der Probenflüssigkeit im allgemeinen verhindern. Erst durch Anlegen des elektrischen Feldes wird erreicht, daß die Probenflüssigkeit in Richtung des Feldes
(parallel zur Längsrichtung der Spuren 19) austritt, also
20 nicht in Querrichtung zu den benachbarten Kammabschnitten 24. Zusätzlich kann man mit der Zugabe von Elektrolytflüssigkeit in den Bereich des eingeführten Probenzuführteils 26 bis unmittelbar vor Aufbau des elektrischen Feldes warten, so daß ein vorheriges laterales Wandern von Probenflüssigkeit zwi-
25 sehen benachbarten Kammabschnitten 24 ausgeschlossen ist .
Eine weitere, mit 26' bezeichnete Ausführungsform ist in den Fig. 4 und 5 dargestellt. Hierbei werden eine Vielzahl gesonderter Probenzuführ-Materialabschnitte 34 durch einen Materi-
30 alabschnittsträger 36 gehalten. Dieser Materialabschnittsträger 36 setzt sich aus zwei parallel zueinander angeordneten Platten 38 und 40 zusammen, die durch zwei Verbindungselemente 52, z. B. Kopfschrauben, aneinander gepreßt werden. Zwischen diese beiden Platten 38 und 40 sind die Materialabschnitte 34
35 eingelegt. Durch ein Verspannen der beiden Platten 38 und 40 mit Hilfe der Verbindungselemente 42 werden die Materialabschnitte 34 fixiert. Der generelle Aufbau der Elektrophoreseeinrichtung gemäß Fig. 4 und 5 entspricht der Ausführungsform gemäß Fig. 3 bis auf eine Abschrägung der zweiten Glasplatte 14' im Bereich zwischen Gelstirnfläche 43 und Glasplattenstirnfläche 45 an der der ersten Glasplatte 12 zugewandten Glasplatteninnenseite. Der Abschrägwinkel a ist in Fig. 5 eingezeichnet; die in den Fig. 4 und 5 untere Querkante 47 der Abschrägungsflache ist in den Fig. 4 und 5 angedeutet. Man erhält auf diese Weise einen keilförmigen Probenzuführbereich 44, was das Einführen der Materialabschnitte 34 des Probenzuführteils 26' erleichtert. Diese Abschrägung der zweiten Glasplatte 14' ist unabhängig von der Ausbildung des Probenzuführteils 26 bzw. 26' und kann daher beispielsweise auch in der Anordnung gemäß Fig. 1 und 2 bzw. Fig. 3 eingesetzt werden.
Die Detailabbildung gemäß Figur 5A verdeutlicht, daß die dort mit 49 bezeichnete Abschrägungsflache die Einführung des Probenzuführteils 26 erleichtert, welches hier der Einfachheit halber als Blattelement gemäß Figur 3 dargestellt ist. Mit einer unterbrochenen Umrißlinie ist eine Einführposition 26" angedeutet. Selbst bei einer gewissen Welligkeit des flexiblen Blattes mit den nach unten abstehenden zahnartigen Kammabschnitten 24 gelingt das Einführen ohne besondere Mühe, und dies selbst bei einer Geldicke b zwischen 0,1 mm und 0,3 mm. Der Abschrägwinkel a braucht nur dementsprechend groß gewählt zu werden.
Wie Figur 5A weiter verdeutlicht, besteht in einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ein lichter Abstand a zwischen dem bevorzugt linear verlaufenden Rand 51 des Trenngels und den äußeren Enden 53 der vorstehenden Kammabschnitte 24. Der Abstandsbereich wie auch der sich nach oben anschließende bis fast zum oberen Ende der Platte 14 reichende und somit an die Abschrägungsflache 49 angrenzende Volumenbe- reich ist durch eine Flüssigkeit ausgefüllt, die 1% Ficoll® enthält und dementsprechend in Figur 5A bezeichnet ist. Diese Flüssigkeit ist zum einen elektrisch isolierend (di-elek- trische Flüssigkeit) und zum anderen weist sie auch eine die Dichte von Wasser übersteigende Dichte auf. Unter Ficoll® versteht man aus Saccharose und Epichlorhydrin hergestellte hydrophile Copolymerisate mit Molekulargewicht zwischen 70.000 und 400.000.
Aufgrund des eingangs erläuterten "Stacking-Effekts" erhält man besonders scharfe Elektrophorese-Banden. Die Ficoll®-Lö- sung sorgt für ein homogenes elektrisches Feld trotz der Keil- form des Raums oberhalb des Trenngels aufgrund der Abschrägungsflache 49. Zur Veranschaulichung des Abstands a gemäß Figur 5A ist dieser auch als mögliche Variante in Figur 4 eingezeichnet; wobei dort die obere strichpunktiert dargestellte Kante des Trenngels ebenfalls mit 51 bezeichnet ist. Man erkennt, daß die Kante 51 (im Gegensatz zur Ausführungsform gemäß Figuren 1 und 2) linear verläuft, was die Herstellung vereinfacht und eine größere Anzahl von Proben (d.h. zahnförmigen Zahnabschnitten 24) erlaubt.
Die in Figur 5 gezeigte Verwendung einer Vielzahl gesonderter, poröser Materialabschnitte, die in einem Materialabschnittsträger 36 fixiert sind, bringt den Vorteil mit sich, daß der Abstand zwischen und die Anzahl der Materialabschnitte 34 individuell auf verschiedene Probenbedingungen abgestimmt werden können. Auch ist eine Probenmaterialwanderung durch das poröse Material von Materialabschnitt zu Materialabschnitt von vornherein ausgeschlossen.
Es sind auch andere Bauformen des Probenzuführteils 26, 26' denkbar, wie beispielsweise der Einsatz eines Materialabschnittsträgers in Form einer Unterlagsfolie, z. B. in Kammform, die wiederum eine entsprechende Anzahl einzelner Materialabschnitte 34 oder ein ebenfalls kammartiges Blatt aus porösem Material trägt.
Fig. 6 und 7 zeigen eine weitere Ausführungsform der Erfindung, bei der die Elektrophoreseeinrichtung 50 kein durchge- hendes ebenes Gel aufweist, sondern eine Vielzahl von gelgefüllten Trennkapillaren 54 innerhalb eines Grundkörpers 52. In die Öffnungen der Trennkapillaren 54 sind die hervorstehenden Abschnitte 62 eines kammartigen Probenzuführteils 56 einge- führt, das entweder, wie dargestellt, als einzelnes Blatt aus porösem Material ausgebildet ist oder, gemäß Fig. 4, 5, von einem Materialabschnittsträger mit einer Vielzahl von gesonderten porösen Materialabschnitten gebildet ist. Das kammartige Probenzuführteil 56 aus porösem Material erleichtert auch hier die Probenzufuhr zu einer Vielzahl von eng benachbarten Probenannahmestellen (hier Öffnungen der Trennkapillaren 54) , wenn auch hier die Gefahr des Vermischens von Probenflüssigkeit benachbarter Probenannahmestellen ("übersprechen") von vornherein gering ist. Das Einführen der freien Enden der Abschnitte 62 in die Öffnungen der Trennkapillaren 54 kann durch Zuspitzen oder Abrunden der Abschnitte 62 erleichtert werden oder (in nicht dargestellter Weise analog Fig. 5) durch entsprechendes konisches Aufweiten der Trennkapillarenöffnungen. Vorteilhaft ist bei dieser wie auch bei sämtlichen ande- ren Ausführungsbeispielen, daß sämtliche Abschnitte 62 ihre Probenflüssigkeit praktisch gleichzeitig an die jeweilige Probenannahmestelle abgeben, so daß die Gefahr, daß bei einigen Proben die Probenflüssigkeit vorzeitig in das Gel diffundiert, wie dies bei sequentieller Probenzuführung, beispiels- weise mittels Pipette, der Fall ist, hier nicht besteht. Hinzu kommt, daß in den meisten Fällen die Kapillarkräfte dafür sorgen, daß nur dann Probenflüssigkeit aus dem porösen Material austritt, wenn ein ausreichend großes elektrisches Feld angelegt wird. Schließlich läßt sich auch noch durch Verzöge- rung der Zugabe von Elektrolyt der Diffusionsbeginn dementsprechend herausschieben.
Das vorstehend beschriebene kammartige Probenzuführteil in seinen verschiedenen Ausführungsformen aus durchgehend porösem Material oder porösen Materialabschnitten ermöglicht auch eine einfache und rasche Zuführung von Probenflüssigkeit zum Probenzuführteil. Hierzu dient eine in Fig. 8 vereinfacht im Schnitt dargestellte Probengefäßeinheit 66 mit einer Vielzahl von Probenaufnahmen 64. Diese entsprechen in ihrer geometrischen Anordnung der geometrischen Anordnung der hervorstehenden Abschnitte (Zähne) 62 des Probenzuführteils 60. Sind, wie dargestellt, die Zähne linear hintereinander angeordnet, so sind die Probenaufnahmen 64 dementsprechend in linearer Reihe angeordnet. Somit können sämtliche Abschnitte 62 des Probenzuführteils durch entsprechendes Eintauchen in die Aufnahmen 64 gleichzeitig mit Probenflüssigkeit getränkt werden. Nach dem Tränken der Abschnitte 62 wird das Probenzuführteil 60 dann der jeweiligen Elektrophoreseeinrichtung zugeführt. Die Beladung der Probengefäßeinheit 66 kann vorab, z. B. mittels einer entsprechenden manuellen oder automatischen Vielfach- Pipettiereinrichtung, erfolgen, also unabhängig von der ei- gentliehen Probenbeladung der Elektrophoreseeinrichtung mittels Probenzuführteil 60.
Mit Hilfe des Probenzuführteils mit porösen Abschnitten zum Aufnehmen und Halten von Probenflüssigkeit läßt sich, wie vorstehend erläutert, in einfacher Weise Probenflüssigkeit der jeweiligen Elektrophoreseeinrichtung zuführen, wobei der Abstand benachbarter poröser Abschnitte und damit auch der Abstand der einzelnen Proben voneinander kleingehalten werden kann, was die Meßeffektivität der Elektrophoreseeinrichtung wesentlich erhöht. Gleichzeitiger Start der Wanderung der elektrisch geladenen Bestandteile der Probenflüssigkeit beim Beginn der Elektrophorese ist sichergestellt, so daß die Präzision der Elektrophoresemessungen, insbesondere in bezug auf den Vergleich benachbarter Spuren, hoch ist.
Hiervon unabhängig gibt der Einsatz von porösem Material zur Aufnahme von Probenflüssigkeit auch die Möglichkeit zur Behandlung der Probenflüssigkeit innerhalb des porösen Materials. Das poröse Material dient somit gleichsam als Probengefäß bzw. Reaktionsgefäß. Hierzu kann man das poröse Material nacheinander oder an verschiedenen Stellen des porösen Materials, mit den miteinander in Reaktion zu bringenden Flüssigkeiten tränken, wobei in letzterem Falle eine Vermischung der Flüssigkeiten im porösen Material infolge der Kapillarkräfte erfolgt. Auch ist es möglich, das poröse Material vorab mit mindestens einer der Reaktionsflüssigkeiten zu tränken und zu trocknen, so daß das poröse Material dementsprechend "imprägniert" ist. Zu einem beliebigen späteren Zeitpunkt kann dann das poröse Material in die weitere Reagenzflüssigkeit, z. B. die Probenflüssigkeit oder/und weitere Reagenzlösungen, getaucht werden, um die gewünschte Reaktion ablaufen zu lassen.
Bei der Reaktion kann es sich um eine beliebige biochemische Reaktion handeln, z. B. eine enzymatische Reaktion, eine Nu- kleinsäure-Hybridisierungsreaktion, eine immunchemische Reaktion oder dergleichen. Bevorzugt werden Reaktionen an Nuklein- säuren durchgeführt, wie etwa eine in vitro-Transkription, wobei ein RNA-Strang durch eine RNA-Polymerase an einer Nu- kleinsäurematrize erzeugt wird, eine Sequenzierung, wobei vorzugsweise durch enzymatische Reaktionen, z. B. mit T7 DNA- Polymerase, die Nukleotidsequenz einer Nukleinsäure bestimmt wird, oder eine Amplifizierung, wobei durch enzymatische Reaktionen die Menge der in der Probenflüssigkeit vorhandenen Nukleinsäure erhöht werden kann. Ein bevorzugtes Beispiel für eine Amplifizierung ist die PCR (Polymerase-Kettenreaktion) . Sie umfaßt drei nacheinander ablaufende Reaktionsschritte, nämlich eine Spaltungsreaktion der DNA in Einzelstränge, eine Hybridisierungsreaktion und eine enzymatische Nukleinsäure- elongation. Üblicherweise werden für eine PCR mehrere Zyklen dieser Reaktionsschritte durchgeführt, bevorzugt 20 bis 30 Zyklen, was zu einer hohen Vervielfältigung der gewünschten Nukleinsäure führt. Bevorzugt wird die PCR bei erhöhten Temperaturen durchgeführt, wobei die enzymatische Reaktion bei 65 °C bis 80 °C, besonders bevorzugt bei 72 °C bis 75 °C und die Spaltungsreaktion bei 80 °C bis 100 °C, besonders bevorzugt bei 90 °C bis 95 °C abläuft. In diesem Fall spricht man auch von Thermocycling mit thermostabilen Enzymen. Durch die PCR oder eine andere Amplifizierungsreaktion kann die Sensiti- vität der Probenanalyse erheblich gesteigert werden. Überraschenderweise hält das poröse Material den drastischen Bedingungen beim Thermocycling stand, ohne daß eine die nachfolgende Analyse bzw. Isolierung des Reaktionsprodukts signifikant beeinträchtigende Zersetzung des porösen Materials stattfindet.
Besonders vorteilhaft ist die Kombination des eben beschriebenen Verfahrens mit dem eingangs beschriebenen Verfahren, d. h. daß das poröse Material nach Durchführung der genannten Reak- tionen im porösen Material dann einer Probenbearbeitungseinrichtung, insbesondere Probenanalyseeinrichtung, zugeführt wird, um das Reaktionsergebnis zu untersuchen. In den vorstehend beschriebenen Ausführungsformen wird eine Elektrophoreseeinrichtung eingesetzt. Es ist jedoch auch denkbar, andere Analyseeinrichtungen zu verwenden, wie z. B. Chromatographie- Einrichtungen oder einem Massenspektrographen.
Diese Vorgehensweise soll im folgenden anhand der Fig. 9 erläutert werden.
Fig. 9a zeigt ein kammartiges Probenzuführteil 70 in Form eines Blattes aus porösem Material. Die hervorstehenden Abschnitte 72 des Probenzuführteils werden mit Hilfe einer Dosiervorrichtung 74 mit geeigneten Reagenzien, wie z. B. Farb- Stoffen, Enzymen, Nukleinsäuren oder dergleichen getränkt. Diese Reagenzien dienen zur Erleichterung der Probenflüssigkeitsanalyse, z. B. durch Farbgebung, Erhöhung der Auflösung oder ähnlichem, oder sie werden zugegeben, um vor der Analyse bestimmte chemische oder biochemische Reaktionen auszulösen oder um bestimmte Probenanteile zurückzuhalten. Dieser Schritt kann auch mehrmals hintereinander mit verschiedenen Reagenzien durchgeführt werden, um somit die porösen Materialabschnitte 72 des Probenzuführteils 60 für eine bestimmte Probenanalyse zu präparieren. Gegebenenfalls wird das Probenzuführteil zwi- schengelagert , bis die Reagenzien im porösen Material eingetrocknet sind. In Fig. 9b ist gezeigt, wie die Ausnehmungen 76 einer Probengefäßeinheit 78 jeweils gesondert über eine Pipette 80 mit Probenflüssigkeit befüllt werden. Dieser Schritt kann auch automatisch mit Hilfe einer entsprechenden Vielfach-Pipettier- Vorrichtung erfolgen.
Im Anschluß an das Befüllen der Ausnehmung 76 der Probengefäßeinheit 78 wird, wie in Fig. 9c gezeigt, das entsprechende Probenzuführteil 70 aus porösem Material jeweils mit seinen hervorstehenden Abschnitten 72 in die Ausnehmungen 76 der Probengefäßeinheit 78 eingeführt. Dabei saugen sich die Poren des porösen Materials des Probenzuführteils 70 mit Probenflüssigkeit voll (= Probenzugabe) . Beim anschließenden Entfernen der hervorstehenden Abschnitte 72 des Probenzuführteils 70 aus den Ausnehmungen 76 bleibt aufgrund der Kapillarkräfte die Probenflüssigkeit in den Poren der jeweiligen Materialabschnitte 72 haften. Somit kann Probenflüssigkeit von der Probengefäßeinheit 78 zur Probenbearbeitungseinrichtung 82, z. B. Elektrophorese- oder Chromatographieeinrichtung, transportiert werden, wie in Fig. 9d gezeigt.
In Figur 9B ist eine spezielle Art der Herstellung besonders kleiner Probenvolumina, beispielsweise im Bereich von 0,5 μl, symbolisiert. In einem nicht dargestellten ersten Schritt A wird eine Ausgangsprobe bereitgestellt, die das zu untersuchende biologische Material, insbesondere DNA-Fragmente, sowie ein erstes Volumen einer Lösungsflüssigkeit Sl, vorzugsweise Wasser, umfaßt. Das Volumen kann beispielsweise 4 μl betragen. Anschließend wird in einem Schritt B 0,2 μl einer Stopp-Lösung zugegeben, die wiederum aus 1 μl einer zweiten Lösungsflüssigkeit (Formamid (Ameisensäureamid) ) und 1 μl einer Pufferlösung besteht. Die sich ergebende Zwischenprobe vom 6 μl wird vom Pipettierautomaten aufgenommen und davon die Hälfte (3 μl) in die jeweilige schalenförmige Ausnehmung 76 der Probengefäß- einheit 78 eingefüllt. Anschließend wird die erste Lösungsflüssigkeit (Wasser) verdunstet, bevorzugt unterstützt durch ein in Figur 9B strichliert angedeutetes Gebläse 81. Das Ent- weichen der ersten Lösungsflüssigkeit Sl ist dort auch mit entsprechenden Pfeilen angedeutet. Es bleibt die zweite Lösungsflüssigkeit S2 (Formamid) zurück, in der dann auch die DNA-Bruchstücke enthalten sind. Das Probenvolumen beträgt entsprechend dem Formamid-Anteil lediglich 0,5 μl .
Diese Probenvolumina können dann, wie erläutert, durch Eintauchen der Zähne des Probenzuführteils 70 aufgenommen werden, wobei die Vorbehandlung des Probenzuführteils 70 gemäß Figur 9A u.U. auch entfallen kann.
Der Einsatz der zweiten Lösungsflüssigkeit S2 mit vergleichsweise geringer Diffusionsrate erlaubt es auch, das dementsprechend getränkte Probenzuführteil 70 auch zwischenzulagern (Fig. 9e) , bevor es der Elektrophorese- oder Chromatographie- Einrichtung gemäß Figur 9d zugeführt wird.
Unabhängig davon, ob das Probenzuführteil 70 zwischengelagert wird oder nicht, ist es von Vorteil, wenn dieses unmittelbar vor dem Einsetzen in die Elektrophorese- oder Chromatographie- Einrichtung befeuchtet wird, wie in Figur 9f angedeutet ist. Die Befeuchtung verhindert, daß sich nach dem Einsetzen des Probenzuführteils 70 in die Elektrophorese- oder Chromatographie-Einrichtung Luftblasen bilden, die die Messung beein- trächtigen können. Zur Befeuchtung kann die gleiche Flüssigkeit verwendet werden, wie diese auch im Abstandsbereich (Figur 5A) eingesetzt wird. Es ist dies bevorzugt eine einprozen- tige Ficoll®-Lösung. Die Vorbefeuchtung des Probenzuführteils 70 durch die 1%- bis 10%ige Ficoll®-Lösung oder Dextran-Lösung hat zudem zur Folge, daß die das Probenzuführteil 70 an seiner vom Trenngel entfernten Seite benetzende Pufferlösung erst später durch das poröse Probenzuführteil strömt, was die Messung möglicherweise beeinträchtigen könnte.
Die Probenbearbeitungseinrichtung 82 kann verschiedenen Aufbau aufweisen. So sind alle der bisher beschriebenen Ausführungsformen einsetzbar. Durch eine pH-Wert-Einstellung und einen wirksamen pH-Puffer wird die Probenflüssigkeit derart aufbereitet, daß die darin enthaltenen Biomoleküle, z. B. Proteine, elektrisch geladen sind. Durch das Anlegen einer ausreichend hohen elektrischen Spannung werden die Kapillarkräfte, die die Probenflüssigkeit im Probenzuführteil 70 halten, überwunden und somit eine Bewegung der geladenen Moleküle entsprechend der auf sie wirkenden elektrischen Kräfte bewirkt. Die Probenflüssigkeit kann nun bei angelegtem elektrischem Feld entweder durch direkten Kontakt zwischen dem Probenzuführteil 70 und der Gelschicht der Probenbearbeitungseinrichtung 82 in die Gelschicht eintreten oder über eine geeignete Elektrolytlö- sung, wobei in diesem letzten Fall eine Distanz bis zu einigen Millimetern zwischen Probenzuführteil und Gelschicht liegen kann.
Aufgrund der Empfindlichkeit der üblichen Elektrophoreseeinrichtungen genügt bereits eine geringe Menge an Probenflüssigkeit, mit der die vorstehenden Abschnitte 72 des Probenzuführteils 70 zu tränken sind. Allzu große Mengen an Probenflüssig- keit sind natürlich zu vermeiden, um zu verhindern, daß Probenflüssigkeit über das poröse Material selbst von einem Abschnitt 72 zum nächsten Abschnitt 72 gelangt.
Es hat sich in der Praxis herausgestellt, daß bei diesen rela- tiv geringen Probenmengen zum einen ein "Übersprechen" zwischen den Abschnitten 72 durch Kapillarleitung über das poröse Material von vonherein ausgeschlossen ist. Des weiteren sorgt bei der Elektrophorese das elektrische Feld zuverlässig dafür, daß praktisch die gesamte Probenflüssigkeitsmenge aus dem jeweiligen Abschnitt 72 austritt. Es besteht daher die vorteilhafte Möglichkeit, ein und dasselbe Probenzuführteil 70 auch mehrfach zu verwenden. Dabei können in das gleiche Gel zeitlich nacheinander auch mehrere Probenreihen zugeführt werden, indem das Probenzuführteil 70 in entsprechendem zeit- liehen Abstand, jeweils mit neuen Probenflüssigkeiten versehen, der Elektrophoreseeinrichtung zugeführt wird. Aufgrund der zwischenzeitlichen Wanderungen der Probenreihen sind diese verschiedenen Probenreihen örtlich voneinander abgesetzt, d. h. in Richtung des elektrischen Feldes voneinander beabstandet .
Das poröse Material eignet sich darüber hinaus auch zur Weiterleitung von Probenflüssigkeit zu ansonsten nur schlecht zugänglichen Probenannahmestellen. Als Beispiel sei die Probenflüssigkeitszufuhr zu einer Mikrochipanordnung, insbesondere DNA-Sensor-Anordnung erwähnt, wie diese stark verein- facht, in Fig. 10 angedeutet ist.
Auf einem Träger 90 befinden sich verschiedene Sensorbereiche 92, denen aufgrund ihrer geringen Größe (z. B. 2 mm X 2 mm) nur sehr schwer direkt Probenflüssigkeit zugeführt werden kann. Mit Hilfe von gesonderten Probenzuführteilen 94 aus porösem Material kann jedoch sehr leicht eine Probenzufuhr erfolgen. Durch Zugabe von Probenflüssigkeit mit Hilfe einer Pipette 96 in verhältnismäßig großflächigen Bereichen der porösen Probenzuführteile 94 mit anschließendem Wandern der Probenflüssigkeit im porösen Material aufgrund der Kapillarkräfte zu den Mikrobereichen hin kann gezielt eine Probenflüssigkeitszufuhr erreicht werden.
Anstelle der dargestellten sternförmigen Anordnung der geson- derten Probenzuführteile 94, kann auch eine beliebig andere geometrische Anordnung gewählt werden, wie z. B. parallel nebeneinander, vorzugsweise mit von Probenzuführteil zu Probenzuführteil variierender Zuführteillänge. Auf diese Weise kann der Abstand zwischen den Zugabeenden der Probenzuführ- teile vergrößert werden. Auch bei diesen Anordnungen kann die Weiterleitung des Probenmaterials vom Probenzuführteil zum jeweiligen Sensorbereich durch ein entsprechendes elektrisches Feld erzwungen werden.
In Fig. 11 ist eine weitere Elektrophoreseeinrichtung 100 vereinfacht dargestellt, aus einer unteren Glasplatte 102, einer oberen Glasplatte 104 und einer dazwischenliegenden Gelschicht 106, wobei sich die Gelschicht 106 hier bis zum in Fig. 11 linken unteren Ende der oberen Glasplatte 104 erstreckt. Dies vereinfacht die Gelherstellung. Zudem gibt dies die Möglichkeit, die ebenfalls kammartigen Probenzuführteile 108 im wesentlichen senkrecht zur (hier horizontalen) Ebene der Gelschicht 106 anzuordnen. Die Elektrophoreseeinrichtung 100 kann, ebenso wie die vorstehend beschriebenen Elektrophoreseeinrichtungen, auch in beliebig anderer Raumorientierung betrieben werden, da hier nicht, wie bei bekannten Elektropho- reseeinrichtungen mit Probeaufnahmetaschen am Gelrand, die Gefahr besteht, daß das Probenmaterial ausfließt. Das poröse Material hält, wie mehrfach angesprochen, das Probenmaterial aufgrund von Kapillarkräften in sich; erst das elektrische Feld sorgt für eine gerichtete Wanderung des Probenmaterials in das Gel.
Um das kammförmige Probenzuführteil 108 in der dargestellten Position in Anlage an der Stirnfläche 110 der oberen (vergleichsweise kürzeren) Glasplatte 104 zu halten, kann, wie dargestellt, eine Stützleiste 112 eingesetzt werden mit Bildung eines der Dicke des Probenzuführteils 108 im wesentlichen entsprechenden Spalts zwischen sich und der Stirnfläche 110. Auf diese Weise werden die mit dem Probenmaterial beladenen Enden der Materialabschnitte ("Zähne") 114 des Probenzuführ- teils 108 entweder unmittelbar an der entsprechenden Stirnfläche 116 der Gelschicht 106 gehalten oder in geringem Abstand hierzu. Nach Zuführen von Elektrolyt und Einschalten des elektrischen Feldes erfolgt dann die gewünschte gerichtete Wanderung des Probenmaterials aus dem Probenzuführteil 108 in die Gelschicht 106 (= Probenannahme) . Da die Zähne des Probenzuführteils 108 nicht mehr zwischen die beiden eng benachbarten Glasscheiben 104 und 106 eingefädelt werden müssen, vereinfacht sich die Handhabung wiederum.
Zum generellen Aufbau der vorstehend beschriebenen Elektrophoreseeinrichtungen sei noch ergänzt, daß das elektrische Feld in üblicher Weise aufgebaut wird durch Ausbilden einer Kathode bzw. Anode im Bereich der beiden Endbereiche der Gelschicht bzw. am gelfernen Rand des Probenzuführteils.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Zuführung von Probenmaterial mittels eines Probenzuführteils von einer Probenzugabestelle zu einer
Probenannahmestelle einer Probenbearbeitungseinrichtung, vorzugsweise Probenanalyseeinrichtung, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenzuführteil wenigstens einen Materialab- schnitt aus porösem Material aufweist mit einer derartigen Porengröße des porösen Materials, daß das Probenmaterial zumindest bei der Probenzugabe in das Probenzuführteil und bei der Probenannahme durch die Probenbearbeitungseinrichtung im porösen Material in flüssiger Phase aufgrund von Kapillarkräften gehalten wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Probenmaterial nach Probenzugabe in das Probenzuführteil trocknet und daß man das Probenzuführteil vor der Probenabgabe einer flüssigen Phase zuführt .
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man im Bereich der Probenannahmestelle ein den porösen Materialabschnitt durchsetzendes elektrisches Feld erzeugt, um einen Fluß elektrisch geladener Moleküle, Makromoleküle oder Teilchen des Probenmaterials vom porösen Materialabschnitt in die Probenbearbeitungseinrichtung zu bewirken.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der Zugabe der Probe das Probenzuführteil von der Probenzugabestelle zur Probenannahmestelle transportiert.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der poröse Materialabschnitt des Probenzuführteils die Probenzugabestelle mit der Probenannahmestelle körperlich verbindet (Fig. 10) .
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Probenbearbeitungseinrichtung mit einer Vielzahl von Probenannahmestellen eine entsprechende Vielzahl poröser Materialabschnitte einsetzt.
ιo
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenzuführteil einen Materialabschnittsträger umfaßt, welcher die Materialabschnitte in einer der geometrischen Anordnung der Probenannahmestellen entsprechenden Anordnung trägt .
15
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenzuführteil bei einer linearen oder bogenförmigen Anordnung der Probenannahmestellen im wesentlichen kammartig geformt ist.
20
9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenzuführteil ein sämtliche poröse Materialabschnitte aufweisendes Blatt aus porösem Material umfaßt.
25
10. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Materialabschnittsträger eine entsprechende Vielzahl gesonderter Materialabschnitte trägt.
30 11. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Materialabschnittsträger von einer Unterlagsfolie gebildet ist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, da- 35 durch gekennzeichnet, daß man poröses Material mit einer mittleren Porengröße unter 100 μm, vorzugsweise unter 10 μm, am besten unter 1 μm einsetzt.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man poröses Material mit einer mittleren Porengröße zwischen 1,5 μm und 0,2 μm, am besten bei etwa 0,5 μm einsetzt .
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man poröses Material aus porösem Celluloseacetat oder Cellulose-Mischester oder porösem Polyethylen oder porösem Glas oder Agarosegel oder anderen weitmaschigen Gel-Matrizen einsetzt.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert der flüssigen Phase derart einstellt, daß biologische Makromoleküle in der Probenflüssigkeit elektrisch geladen sind.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Probenzuführteil mehrmals hintereinander zur Zuführung von Probenflüssigkeit einsetzt.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Probengefäßeinheit einsetzt mit einer Vielzahl von Probenauf ahmen in einer der geo- metrischen Anordnung der Materialabschnitte des Probenzuführteils entsprechenden geometrischen Anordnung.
18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren zur Zuführung von Probenflüssigkeit zu einer Elektrophoreseeinrichtung oder einer Chromatographieeinrichtung einsetzt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrophoreseeinrichtung ein horizontal oder ver- tikal orientiertes Trennmittel, vorzugsweise Trenngel, aufweist .
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine flüssige Phase, vorzugsweise Pufferlösung, in einen Bereich an einem Zugabeende eines Trennmittels der Elektrophoreseeinrichtung bzw. Chromatographieeinrichtung zugibt und zwar vor oder nach dem Heranführen des Probenzuführteils.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem wenigstens einen porösen Materialabschnitt ιo des herangeführten Probenzuführteils und dem Zugabeende des Trennmittels kein Abstand oder ein Abstand bis zu mehreren Millimetern besteht.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch is gekennzeichnet, daß bei einem zur gleichzeitigen Trennung mehrerer Probenflüssigkeiten geeigneten Trennmittel mit mehreren Probenflüssigkeit-Zugabestellen längs einer Trennmittelkante an den Probenflüssigkeit-Zugabestellen im Trennmittel Probenflüssigkeit-Ausnehmungen ausbilden 20 zur Aufnahme entsprechender poröser Materialabschnitte des Probenzuführteils (Fig. 1, 2) .
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probenflüssigkeit-Ausnehmungen unabhängig vom
25 Probenzuführteil und vor Zuführen des Probenzuführteils herstellt oder durch Einsetzen des bereits mit Probenmaterials versehenen kammformigen Probenzuführteils in das Trenngel-Material vor dessen Polymerisierung.
30 24. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß bei einem zur gleichzeitigen Trennung mehrerer Probenflüssigkeiten geeigneten Trennmittel mit mehreren Probenzugabestellen längs der Trennmittelkante das Probenzuführteil mit seinen voneinander in Richtung
35 der Trennmittelkante beabstandeten Materialabschnitten in Kontakt mit der Trennmittelkante bringt oder in einem bis zu einigen Millimetern Abstand von der Kante anzuordnen. (Fig. 3 bis 5) .
25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß
5 die Materialabschnitte im wesentlichen in einer zur Ebene des Trennmittels gemeinsamen Fläche angeordnet sind, welche Fläche entweder in der Ebene des Trennmittels liegt oder senkrecht zu dieser angeordnet ist.
ιo
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren zur Zuführung von Pi benflüssigkeit zu einer mehrere Trennkapillaren aufweisenden Elektrophoreseeinrichtung oder Chromatographie- einrichtung einsetzt.
15
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man das Verfahren zur Zuführung von Probenflüssigkeit zu einer mehrere Sensoren, vorzugsweise DNA-Sensoren, aufweisenden Mikrochipanordnung einsetzt.
20
28. Probenzuführteil zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit wenigstens einem Materialabschnitt aus porösem Material.
25 29. Elektrophoreseeinrichtung mit Probenzuführteil zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 28.
30. Verfahren zur Durchführung einer Reaktion zwischen mindestens einem ersten und mindestens einem zweiten Reak-
30 tionspartner, vorzugsweise zum Nachweis oder/und zur Herstellung eines biochemischen Reaktionsprodukts in einer Probenflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens einen ersten Reaktionspartner, der auf
35 einem porösen Material reversibel adsorbiert ist, in einer flüssigen Phase in Kontakt mit mindestens einem zweiten Reaktionspartner bringt, wobei die Porengröße des porösen Materials derart ist, daß die flüssige Phase zumindest teilweise im porösen Material aufgrund von Kapillarkräften gehalten wird.
31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der erste Reaktionspartner trocken auf dem porösen Material adsorbiert ist.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 oder 31, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der durchgeführten Reaktion um eine Nachweisreaktion zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe biologischen Ursprungs handelt.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine Körperflüssigkeit umfaßt .
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 oder 33, dadurch gekennzeichnet, daß es sich beim ersten Reaktionspartner um eine mit dem Analyten spezifisch bindefähige Substanz oder um eine mit dem Analyten um einen Bindepartner konkurrierende Substanz handelt .
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 26 bis 34, dadurch gekennzeichnet, daß bei der Reaktion eine Markierungsgruppe vorhanden ist, die das Auftreten und/oder die Stärke der Reaktion anzeigt.
36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um eine nichtradioaktive Markierungsgruppe handelt.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 36, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Reaktion um eine Reaktion an Nukleinsäuren, z. B. eine in vitro-Transkrip- tion, eine Sequenzierung oder eine Amplifizierung handelt.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsprodukte im wesentlichen vollständig in den Poren gehalten werden.
5 39. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 38, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsprodukte im wesentlichen vollständig aus dem porösen Material entfernbar sind.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 39, dadurch ιo gekennzeichnet, daß man die das Reaktionsprodukt enthaltende Probeflüssigkeit gemäß dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26 einer Probenbearbeitungseinrichtung, vorzugsweise Probenanalyseeinrichtung, zuführt.
15 41. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 40, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Ablauf der gewünschten Reaktionsdauer kein nichtwässriges Stop- oder/und Denaturie- rungsreagenz zugibt .
20 42. Reagenz zur Durchführung einer Reaktion, insbesondere zum Nachweis oder/und zur Herstellung eines biochemischen Reaktionsprodukts, umfassend ein Teil mit wenigstens einem Materialabschnitt aus porösem Material, wobei mindestens eine reaktive Substanz auf dem porösen Material
25 reversibel adsorbiert ist, wobei die Porengröße des porösen Materials derart ist und daß die reaktive Substanz bei Kontakt mit Flüssigkeit zumindest teilweise im porösen Material aufgrund von Kapillarkräften gehalten wird.
30 43. Reagenzienkit zur Durchführung einer Reaktion, insbesondere zum Nachweis oder/und zur Herstellung eines biochemischen Reaktionsprodukts, umfassend mindestens ein Reagenz nach Anspruch 42.
35 44. Elektrophoreseeinrichtung mit einem porösen, vorzugsweise kammformigen Probenzuführteil (26) , umfassend ein Trennmittel, vorzugsweise Trenngel (18) , und eine Elektrofeld-
Anordnung zum Anlegen eines elektrischen Feldes an das Trennmittel, dadurch gekennzeichnet, daß das in die Elektrophoreseeinrichtung eingesetzte poröse Probenzuführteil (26) in einem von Null verschiedenen Abstand (a) vom 5 Trennmittel angeordnet ist und daß die Elektrofeld-Anordnung zur Erzeugung eines elektrischen Feldes im Abstands- bereich ausgebildet ist zur Überführung von Probenmaterial aus dem Probenzuführteil (26) in das Trennmittel.
ιo 45. Elektrophoreseeinrichtung nach Anspruch 44, dadurch gekennzeichnet, daß der Abstand (a) 0,2mm bis 2mm beträgt.
46. Elektrophoreseeinrichtung nach Anspruch 44 oder 45, dadurch gekennzeichnet, daß bei Einsatz eines zwei Platten is (12, 14) miteinander verbindenden Trennmittels wenigstens eine der beiden Platten (12, 14) mit einer trennmittel- seitigen Abschrägung (49) zur Erleichterung der Einführung des Probenzuführteils (26) versehen ist.
20 47. Elektrophoreseeinrichtung nach einem der Ansprüche 44 bis 46, dadurch gekennzeichnet, daß ein Volumenbereich zwischen Probenzuführteil und Trennmittel mit einer elektrisch isolierenden und/oder höhere Dichte als Wasser aufweisenden Flüssigkeit, vorzugsweise Ficoll®-Lösung
25 oder Dextran-Lösung, ausgefüllt ist.
48. Elektrophoreseeinrichtung nach Anspruch 46 und 47, dadurch gekennzeichnet, daß der Volumenbereich an die Abschrägung angrenzt .
30
49. Verfahren zum Bereitstellen kleinster Probenvolumina aus biologische Makromoleküle enthaltendem Probenmaterial, vorzugsweise zur anschließenden kapillarkraftbewirkten Aufnahme durch ein poröses, vorzugsweise kammförmiges
35 Probenzuführteil, gekennzeichnet durch die aufeinanderfolgenden Schritte: A) Bereitstellen einer Ausgangsprobe, die Probenmaterial (z.B. DNA) und ein erstes Volumen einer ersten Lösungsflüssigkeit (Sl) , vorzugsweise Wasser umfaßt,
B) Bereitstellen einer Zwischenprobe, die durch Hinzu- 5 fügen eines zweiten Volumens einer zweiten Lösungs- flüssigkeit (S2) mit geringerer Verdunstungsrate als die erste Lösungsflüssigkeit (Sl) zur Ausgangsprobe erhalten wird,
C) Verdunstenlassen der ersten Lösungsflüssigkeit der ιo Zwischenprobe, wobei das erhaltene Restvolumen das
Probenvolumen ist (Fig. 9b) .
50. Verfahren nach Anspruch 49, gekennzeichnet durch die Verwendung eines Gebläses oder dgl . im Schritt C.
15
51. Verfahren nach Anspruch 49 oder 50, dadurch gekennzeichnet, daß man im Schritt C lediglich ein Teilvolumen der Zwischenprobe verwendet.
20 52. Verfahren nach einem der Ansprüche 49 bis 51, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsflüssigkeit Formamid verwendet .
53. Verfahren nach einem der Ansprüche 49 bis 52, dadurch 25 gekennzeichnet, daß man nach Aufnahme des Probenvolumens durch das poröse Probenzuführteil (26) und vor dem Einführen des Probenzuführteils in eine Elektrophoreseeinrichtung das Probenzuführteil in einem Schritt D befeuchtet, vorzugsweise mit einer Flüssigkeit gemäß Anspruch 47 30 (Fig. 9f) .
54. Verfahren nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet, daß man das poröse Probenzuführteil nach Aufnahme des Probenvolumens und vor dem Schritt D zwischenlagert (Fig. 9e) .
35
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