CN102917727B - Apoe肽及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供包含ApoE衍生的肽二聚体的新型药物组合物。特别地，本发明的ApoE肽二聚体包含至少两个ApoE模拟域，并且能够包含一个或多个蛋白转导域。还公开了通过施用本发明的药物组合物治疗多种状况，如癌症、炎症状况和神经变性疾病的方法。

Description

APOE肽及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求享受2010年1月6日提交的美国临时专利申请第61/292,668号的权益，本文通过提述并入该申请的全部内容。

关于电子提交的文本文件的描述

通过提述并入下列电子提交的文本文件的全部内容：序列表的计算机可读形式拷贝(文件名：COGO_022_01 WO_SeqList_ST25.txt，数据录入：2011年1月6日，文件大小：40千字节)。

发明领域

本发明涉及包含源自载脂蛋白E(ApoE)的肽二聚体的药物组合物。本发明还涉及用所述新组合物来治疗多种疾病状态，如癌症和神经变性疾病的方法。

发明背景

癌症是一类疾病，其中某一群细胞呈现不受控制的生长、侵入和破坏邻近组织，以及转移(异常细胞向体内其他位置的播散)，或者其中细胞在合适的时间未能发生程序性细胞死亡(例如凋亡)。癌症造成的死亡占全世界死亡人数的大约13％，并且据美国癌症学会称，2007年全世界死于癌症的人数达7600万。现有的癌症治疗依赖于癌症的具体类型和涉及的组织，但是包括手术、化疗、放疗、免疫治疗、单克隆抗体治疗、以及其他方法。虽然这些方法在某些病例中获得了成功，它们受到了不良反应或功效有限的阻碍。例如，通过手术去除肿瘤来消除癌性组织的功效往往受到癌症易于侵犯邻近组织以及转移到身体内其他部位的倾向的限制。化疗和放疗往往受到毒性或对身体内其他组织的损伤的限制。由此，癌症仍然是严重的健康问题，对于更好的癌症治疗方法存在需求。

炎症与癌症的启动、进展和转移有强烈的关联(Mantovani et al.(2008)Nature,Vol.454:436-444)。促炎症介导物如前列腺素、细胞因子、活性氧/氮种类、以及生长因子等等可活化PI3K/Akt信号传导，后者可增加促生存、增殖和转移过程(Dillon et al.(2007)Oncogene,Vol.26:1338-1345;Qiao et al.(2008)Cell Cycle,Vol.7:2991-2996;Prueittet al.(2007)International Journal of Cancer，Vol.120:796-805;Wang and DuBois(2006)Gut,Vol.55:1 15-122)。在人类癌症中PI3K/Akt途径中的突变是常见的，该突变导致PI3K/Akt信号传导失调(Carnero et al.(2008)Curr Cancer Drug Targets,Vol.8:187-98;Dillon et al,2007;Yuan and Cantley(2008)Oncogene,Vol.27:5497-5510)。因此对PI3K/Akt信号传导轴的药理学控制是癌症治疗的一个目标。

Akt激酶活性受肿瘤阻遏蛋白磷酸酶2A (PP2A)的直接调控。PP2A起对Akt的苏氨酸308和丝氨酸473去磷酸化的功能(Andjelkovic et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.93:5699-5704;Resj5 et al.(2002)Cellular Signalling,Vol.14:231-238)。但是，PP2A活性在人类癌症中普遍被降低(Chen et al.(2004)Cancer Cell,Vol.5:127-136)。癌症中PP2A活性被遏制的机制之一是与内源蛋白抑制物如CIP2A和I₂PP2A等形成复合物(Junttila et al.(2007)Cell,Vol.130:51-62;Li et al.(1996)J.Biol.Chem.,Vol.271:1 1059-11062)。I₂PP2A，又称SET，是PP2A的强抑制物，已被发现与AML和急变期CML有牵连(Li et al,1996;Neviani et al.(2005)Cancer Cell,Vol.8:355-368)。虽然PP2A活性在多种人类癌症中被内源抑制，但其可以被药理学地提高，并且是癌症治疗的潜在分子靶(Guichard et al.(2006)Carcinogenesis,Vol.27:1812-1827;Perrotti and Neviani(2008)Cancer and Metastasis Reviews,Vol.27:159-168;Switzer et al.(2009)Oncogene,Vol.28:3837-3846)。

源自ApoE的肽在炎症相关的神经病，如阿尔兹海默病、多发性硬化和创伤性脑损伤中已经显示出富有前景的减轻损伤的效果(Hoane et al.(2009)Journal ofNeurotrauma,Vol.26:121-129;Li et al.(2006)J Pharmacol Exp Ther,Vol.318:956-965;Wang et al.(2007)Neuroscience,Vol.144:1324-33;WO2006/029028;WO 2003/026479)。炎症是神经疾病和癌症二者的常见特征，而且PI3K/Akt信号传导在神经变性疾病如阿尔兹海默病中也失调(Griffin et al.(2005)J Neurochem,Vol.93:105-17;Pei etal.(2003)Acta Neuropathol,Vol.105:381-92)。此外，PP2A亚单位的表达在阿尔兹海默病患者中降低，这与该病中观察到的增加的tau高磷酸化(tau hyperphosphorylation)相一致(Vogelsberg-Ragaglia et al.(2001)Experimental Neurology,Vol.168:402-412)。ApoE肽据报道还可通过解除SET所致的抑制来增加PP2A活性(见例如WO2008/080082)。因此，ApoE肽是治疗多种状况，包括癌症、炎症状况和神经变性疾病的一种可行的治疗手段。

虽然已经证明了数种ApoE肽治疗特定状况的有效性，本领域中仍存在开发新的具有更高的强度和更宽的安全窗口的源自ApoE的肽的需求。尤其是，最好能开发出能够有效治疗多种状况的新的基于ApoE的肽治疗剂。

发明概述

本发明至少部分地基于如下发现，即ApoE肽的二聚化增加它们的生物学活性。因此，本发明提供与单体ApoE肽相比具有更高的功效的新型ApoE肽治疗剂。例如，在一个实施方案中，本发明的肽二聚体包含第一ApoE肽和第二ApoE肽。其中所述第一和第二ApoE肽通过连接模块共价连接。在某些实施方案中，所述第一和第二ApoE肽含有源自天然ApoE全蛋白质的LDL受体结合域的序列。所述第一和第二ApoE肽可以是相同的或者可以是不同的。

在一些实施方案中，所述二聚体的ApoE肽中的至少一个与蛋白转导域缀合，任选地藉由一个或多个连接残基与蛋白转导域缀合。在其他实施方案中，所述二聚体的第一和第二ApoE肽各自与蛋白转导域缀合，任选地藉由一个或多个连接残基与蛋白转导域缀合。所述一个或多个连接残基可包括半胱氨酸残基、或者修饰的氨基酸如叠氮高丙氨酸(azidohomoalanine)或炔丙基甘氨酸。所述蛋白转导域可以是源自触角足(antennapedia)、TAT、SynBl、SynB3、SynB5、和聚精氨酸的肽。

本发明的二聚体中的第一和第二ApoE肽可以通过连接模块共价连接。所述连接模块可包括二硫桥、双马来酰亚胺(例如双马来酰亚胺-乙烷(bismaleimido-ethane)或双马来酰亚胺-己烷(bismaleimido-hexane))、1,4-二取代的三唑、以及N,N-二炔丙胺。

本发明还包括本发明的ApoE肽二聚体的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物包含有效量的如本文中所述的ApoE肽二聚体，和可药用的担载体。在一些实施方案中，根据要治疗的具体状况，所述药物组合物还可以包含其他的治疗化合物。

本发明还提供通过施用有效量的至少一种如本文所述的ApoE肽二聚体用于治疗、预防或缓解多种状况或疾病的方法，所述状况或疾病包括癌症、神经变性疾病(例如ALS、阿尔茨海默病、帕金森氏病、和亨廷顿氏病)，和炎症状况(例如多发性硬化、炎性肠病、克罗恩氏病、和类风湿性关节炎)。

本发明还提供预测或评估用于在患者中治疗癌症的治疗性介入的功效的方法。在一个实施方案中，所述方法包括测量来自患者的生物样品中的SET蛋白的表达水平，并将测得的水平与对照样品中的SET蛋白表达水平比较，其中测得的SET蛋白表达水平指示所述治疗性介入的治疗功效。在某些实施方案中，所述治疗性介入是如本文所述的ApoE肽或肽二聚体。所述生物样品可以是，例如，来自实体瘤的肿瘤活检或从血液样品分离的单核细胞。在一个实施方案中，所述生物样品是CD 19+/CD5+白血病细胞。

本发明还涵盖用于预测ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗癌症的治疗功效的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于测量生物样品中SET蛋白表达的试剂，以及关于测量SET蛋白表达以预测或评估ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗癌症的功效的说明。

附图简要说明

图1.COG112抑制BV2小胶质细胞中LPS诱导的炎症细胞因子的产生。COG112针对BV2小胶质细胞的NO(绿色方块)、TNFα(红色菱形)、和IL-6(蓝色三角)的产生的抑制曲线。与100ng/mL LPS一道添加化合物至图上标示的终浓度。24小时后移出培养基并用双位点ELISA(BioSource)进行分析，并相对于同一平板上的标准曲线进行定量。

图2.原始批次#313的、经还原的、和经化学氧化的COG112的质谱。通过用于检测质量的正模式下带电喷雾离子化的LC/MS获取了质谱。A.原始批次#313的COG112的质谱。B.用二硫苏糖醇还原后的原始批次#313的COG112的质谱。C.暴露于氧化环境以形成二聚体的COG112的质谱。红色箭头标示出COG112二硫桥连二聚体的特征峰。

图3.COG449的NO抑制曲线用图上标示的终浓度的COG449与100ng/mL的LPS一道处理BV2小胶质细胞。24小时后移出培养基并用双位点ELISA(BioSource)进行分析，并相对于同一平板上的标准曲线进行定量。

图4.BMOE连接的二聚体肽COG449在CML细胞中活化PP2A。A.32D-BCR/Abl慢性髓性白血病细胞用COG449(1μM),COG445(1μM)(二硫化物连接的COG112二聚体)处理或无处理，并测量PP2A活性。B.32D:BCR/Abl细胞培养物不用化合物处理，或用1μM COG449、或5μMFTY720处理30分钟，然后在NP40裂解缓冲液中裂解。用PP2A免疫沉淀试剂盒(Upstate)根据制造商的说明对PP2A进行免疫沉淀和测定。

图5.A.COG449对来自4名白血病患者的CLL细胞的细胞毒性的剂量响应曲线。从血液样品分离人CLL细胞并分析COG449细胞毒性。将COG449施加到B-CLL细胞(在96孔板中0.25x10⁶个细胞/孔)，72小时后，使用MTS测定(Pharmacia)分析活细胞，以确定有效杀死50%的输入CLL细胞的COG449浓度(EC50)。B.COG445对来自7名患者的CLL细胞或来自5名患者的正常B细胞的剂量效应曲线。分离了人CLL细胞和PBMC并用其测定COG45的细胞毒性。

图6.A.标示的COG肽对BV2小胶质细胞中LPS诱导的一氧化氮产生的剂量响应曲线。B.标示的COG肽抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞生长的剂量响应曲线。C.标示的COG肽抑制U87MG成胶质细胞瘤细胞生长的剂量响应曲线。

图7.构建ApoE肽二聚体文库的方法的图解。PTD=蛋白转导域；ApoE=apoE-模拟域；“X”和“Y”代表不同的连接模块。

图8.双马来酰亚胺偶联。A。双马来酰亚胺偶联反应中涉及的化学转化。在化学合成中掺入的半胱氨酸残基通过双马来酰亚胺化合物如双马来酰亚胺乙烷(BMOE)或双马来酰亚胺己烷(BMH)被偶联在一起。B。BMOE和BMH的化学结构。

图9.“点击化学”(Click Chemistry)反应中涉及的化学转化。铜催化的3+2缩合通过形成稳定的1,4-二取代三唑而造成偶联。A.炔丙基甘氨酸肽与叠氮高丙氨酸肽的异源偶联产生异二聚肽。B.同二聚肽可通过用N,N-二炔丙胺偶联两个含叠氮高丙氨酸的单体肽来合成。

图10.COG445在乳腺癌细胞系和成胶质细胞瘤细胞系中抑制EGF诱导的Akt活化。A.在EGF存在下暴露于标示浓度的COG445肽U87的成胶质细胞瘤细胞的Western印迹分析。用针对活化的EGF受体(P-EGFR)、总EGF受体、活化的PDK1(P-PDK1)、以及总PDK1的抗体探查印迹。B.对U87细胞中在递增浓度的COG445存在下的由EGF诱导的Akt活化的Western印迹和密度测定分析。

图11.COG45对Akt活化的影响是藉由PP2A来介导的。A.对在有或无冈田酸存在下用标示浓度的COG45和EGF处理的MDA-MB-231细胞的Western印迹分析。用针对活化Akt(P-Akt)和总Akt的抗体探查印迹。B.对MDA-MB-231细胞中在有和无冈田酸处理的情况下，在递增浓度的COG45的存在下EGF诱导的Akt活化的密度测定分析。磷酸化Akt对总Akt的比例相对单独EGF的对照的比例进行标准化。C.小图B中所示数据的非线性回归分析。

图12.A.MDA-MB-231细胞用EGF和递增浓度的COG445处理后，从该细胞免疫沉淀的总PP2A活性。B.U87细胞在有或无冈田酸的条件下用标示浓度的COG445处理后，对U87细胞中的总c-myc蛋白水平的Western印迹和密度测定分析。C.MDA-MB-231细胞暴露于EGF和两种不同浓度的COG445后，从该细胞免疫沉淀PP2A的催化亚单位。探查印迹中的I₂PP2A(SET)和PP2A催化亚单位。

图13.A.MDA-MB-231细胞在有或无冈田酸的条件下用EGF和标示浓度的COG445处理后，对该细胞中磷酸化m-TOR水平的Western印迹和密度测定分析。B.MDA-MB-231细胞在有或无冈田酸的条件下用EGF和标示浓度的COG445处理后，对该细胞中磷酸化GSK-3β水平的Western印迹和密度测定分析。

图14.A.用MTT还原来度量的COG445对U87(空心圆)和MDA-MB-231(实心圆)细胞的增殖的剂量响应曲线。B.用细胞计数度量的COG445对MDA-MB-231细胞的增殖的剂量响应曲线。

图15.SET拮抗作用抑制c-Myc在S62的磷酸化。将Raji细胞用COG449或溶媒对照处理20小时后裂解。裂解物用Western印迹法使用抗-磷酸-S62抗体和总c-Myc抗体进行分析。*表示p<0.05。

图16.SET在CLL中过表达。A.测得的16名CLL患者和6份正常B细胞样品的SET/β-肌动蛋白比，显示B-CLL细胞中SET表达相对正常B细胞显著增加。显示了代表性的Western印迹。B.从相同的患者和志愿者样品分离了mRNA，并通过qPCR定量SET mRNA。

图17.SET在B细胞淋巴瘤系中过表达。A.从Raji和Ramos细胞以及正常B细胞分离mRNA，并通过qPCR定量SET mRNA。B.显示来自于小图A相同的细胞的SET和GAPDH的Western印迹，表明在B细胞淋巴瘤系中相对于正常B细胞SET的表达显著增加(N004和N007)。

图18.对SET的沉默可抑制Raji细胞的生长。利用慢病毒转导导入了针对对照或SET的shRNA，72小时后通过MTT监控Raji细胞的生长。Western印迹显示相对于加载β-肌动蛋白的对照SET被减少了大约一半。

图19.SET可能可预测CLL疾病的进展。相对于通过免疫印迹测定的CLL细胞SET水平评估了从诊断到首先需要治疗的时间(“治疗前时间”)。将具有高水平的患者与具有较低水平的患者(通过接受者操作特征来确定)进行比较，前者具有统计学上显著更短的治疗前时间(n=226;p<0.002)。

图20.提议的Mcl-1稳定性调控机制。A.c-myc调控位点与159-164位的Mcl-1序列的序列同源性，显示S/T-X-S-S-S/T-P(SEQ ID NO:89)基序的保守。B.提议的Mcl-1调控复合物的图示(转引自R.Sears提供的附图)。

图21.可能调控Mcl-1稳定性的Mcl-1相关蛋白的免疫共沉淀。与Mcl-1免疫共沉淀的蛋白(SET(A),PP2A(B),Pin-1(C),和轴蛋白1(D))的免疫印迹。I指示输入上样对照的泳道，IP指示免疫沉淀泳道。

图22SET拮抗作用降低细胞Mcl-1浓度。将原代人CLL细胞铺入平板并与标示浓度的COG449一起温育24小时。裂解细胞，进行PAGE并免疫印迹以定量Mcl-1与β-肌动蛋白比(*标示p<0.01)。

图23.COG449处理抑制体内c-myc依赖性伯基特淋巴瘤Ramos细胞系生长。用溶媒或COG449肽处理的SCID小鼠中注射10⁷个来自伯基特淋巴瘤Ramos细胞系的细胞19天后的肿瘤生长。

图24.A.接受COG449(空心方块)或乳酸林格氏溶液对照(实心方块)处理的SCID小鼠中Ramos细胞肿瘤异种移植物的肿瘤体积的作图，处理在第11天当肿瘤达到150-200mm³的可触及大小时启动。B.植入后第19天收集的经处理和未经处理的Ramos肿瘤的最终肿瘤质量。***=p<0.001，T检验。

图25.SET和CIP2A在人原代三阴性乳腺癌(TNBC)中过表达。通过qRT-PCR确定的13份TNBC患者样品中SET(小图A)和CIP2A(小图B)对于正常组织(N)的相对表达。

图26.SET在人乳腺癌细胞系中过表达。通过Western印迹显示的TNBC细胞系中SET蛋白与肌动蛋白的表达。

图27.COG449降低eIF4E的磷酸化。U87MG成胶质细胞瘤细胞用COG449(1μM)或溶媒对照处理20小时，然后用磷酸-特异性抗体和总eIF4E抗体通过Western印迹测定eIF4E的磷酸化。COG449处理降低了磷酸-eIF4E蛋白对总eIF4E蛋白的比例(n=3)。*表示与溶媒对照相比p<0.01。

图28.COG449在乳腺癌细胞中的细胞毒效应。如标示地使细胞系在无血清培养基和COG449中生长24小时。通过细胞计数来测量细胞增殖。细胞数以相对于对照的、未处理的细胞的相对数表示。

图29.COG449与索拉非尼或吉非替尼对三阴性乳腺癌(TNBC)细胞系生长的组合处理。如标示，使MDA-231细胞在亚致死剂量的COG449、索拉非尼或吉非替尼存在下生长。48小时后，使用MTT测定法定量活细胞。***表示p<0.001。

图30.COG449处理在异种移植物中抑制三阴性乳腺癌(TNBC)肿瘤生长。将4x10⁶个MDA-MB-231细胞与基质胶一起注射到免疫缺损小鼠的第4乳腺中，并从第10天开始每天用10mg/kg COG449皮下注射处理(小图A)，或者从注射后的第27天起(小图B)通过尾静脉静脉注射1mg/kg来处理小鼠3周。通过游标卡尺测量来测定肿瘤体积。

发明详述

本发明人先前发现ApoE合成肽可用于治疗多种癌症。见2009年7月1日提交的WO2010/002982，将其全部内容通过提述并入本文。这里，本发明人在其先前的工作的基础上进行了扩展，令人惊奇地发现合成ApoE肽的二聚体与其单体的对应物相比展现出增加的生物学活性。本发明人发现有特定的一批ApoE肽，它们在活性测定中强度特别高，已经被氧化而形成肽二聚体。进一步的实验显示，通过不可逆的连接而形成的ApoE肽二聚体比可逆连接的二聚体还要更强。因此，本发明提供源自ApoE的受体结合区的新的肽二聚体。在一个实施方案中，所述肽二聚体包含第一ApoE肽和第二ApoE肽，其中所述第一和第二ApoE肽通过连接模块共价连接。

ApoE肽，又称COG肽，是来源于天然ApoE全蛋白的肽。本发明的肽二聚体包含至少两个ApoE肽或ApoE模拟域。所述ApoE肽或模拟域可源自ApoE全蛋白的LDL受体结合区，即全长ApoE蛋白的氨基酸130-150。在某些实施方案中，本发明的ApoE肽或模拟域可来源于ApoE的至少氨基酸133-140。在本发明的一个实施方案中，所述ApoE肽源自ApoE的氨基酸130-149。在又一个实施方案中，ApoE肽源自ApoE的氨基酸133-149。在又一个实施方案中，ApoE肽源自ApoE的氨基酸138-149。如本文中使用的，短语“源自”“衍生自”或“来源于”指含有对来自ApoE蛋白的特定氨基酸序列的至少80%的同一性的肽，或者具有来自ApoE蛋白的受体结合区的至少5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,或20个相邻氨基酸残基(例如氨基酸第130-150)的肽。举例而言，具有对应于氨基酸133-149中发生一个、两个或三个点突变或氨基酸修饰的序列的肽可认为是源自ApoE蛋白的氨基酸133-149的。ApoE肽或模拟域可以是含有来自天然ApoE蛋白的氨基酸133-149的5个或更多、10个或更多残基，或15个或更多残基的肽的衍生物，包括具有非天然氨基酸替代(如氨基异丁酸和乙基赖氨酸)，和其他可提高所述肽的α螺旋含量的修饰的衍生物。

在本发明的一个实施方案中，所述肽二聚体的第一和/或第二ApoE肽具有序列LRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ ID NO:3(COG133))。COG133单体先前被证明对于治疗或减低脑缺血或脑炎症有用。参见美国专利申请公开号2003/0077641Al，该申请于2002年9月23日提交，将其全文并入本文。在另一个实施方案中，所述第一和/或第二ApoE肽是COG133的类似物或衍生物。例如，所述第一和/或第二ApoE肽具有选自下组的序列：AS(Aib)LRKL(Aib)KRLL(SEQ ID NO:5(COG1410)),LRVRLAS(Aib)LKRLRK(硝基-Arg)LL(SEQ ID NO:4(COG248)),和LRVRLAS(Aib)LRKLR(K-Ac)RLL(SEQ ID NO:35(COG345))。可以将其他ApoE类似物或衍生物掺入本发明的ApoE肽二聚体。例如，先前有很多种ApoE 130-150肽的类似物已经被制作出来，并且在基于细胞的测定中测试了它们阻遏炎症细胞因子和自由基的释放的活性，还在受体结合测定中测试了它们的活性。Lynch et al.(2003)J.Biol.Chem.,Vol.278(4):48529-33和于2002年9月23日提交的美国专利申请公开流水号2003/0077641Al，于2007年4月17日公告的美国专利No.7,205,280；以及于1999年3月1日提交的美国专利申请流水号09/260,430，本文通过提述并入上述各文献的全部内容。特别地，WO2006/029028(本文通过提述并入其全部内容)中描述的改进的ApoE模拟物是本发明的肽二聚体的合适的第一和/或第二ApoE肽或模拟域。例如，ApoE肽或模拟域可以包括，但不限于：

其中(NMe)-L为N-甲基化的亮氨酸，Aib为氨基异丁酸，(orn)为鸟氨酸，(narg)为硝基精氨酸，(NLe)为正亮氨酸，(harg)为高精氨酸，(dmarg)为二甲基精氨酸，(aclys)为乙酰赖氨酸，(azlys)为氮赖氨酸，Ac为乙酰化氨基末端。还考虑到其他源自ApoE蛋白的受体结合区的ApoE肽或模拟域。例如，如下的ApoE肽或模拟域是本发明的肽二聚体的合适的第一和/或第二ApoE肽或模拟域：所述ApoE肽或模拟域包含与ApoE蛋白的氨基酸133-149对应的序列，并保留(即不替代)选自下组中的一个或多个关键残基：S139,R142,K143,L144,K146,R147和L149，但在其他位置上有一个或多个氨基酸替代。

在本发明的特定实施方案中，所述肽二聚体的第一和第二ApoE肽是相同的。例如，在一个实施方案中，肽二聚体包含第一ApoE肽和第二ApoE肽，其中所述第一和第二肽具有序列SEQ ID NO:3(COG133)。在其他实施方案中，肽二聚体的第一和第二ApoE肽是不同的。举例而言，肽二聚体可包含第一ApoE肽和第二ApoE肽，其中所述第一ApoE肽具有序列SEQID NO:3(COG133)，第二ApoE肽具有序列SEQ ID NO:5(COG1410)。本发明涵盖了包含本文所描述的不同ApoE肽的所有排列的肽二聚体。

在本发明的另一个实施方案中，肽二聚体的第一和/或第二ApoE肽与蛋白转导域(PTD)缀合。PTD是可增强运载物的胞内输送的小型碱性肽。可以与ApoE肽缀合的PTD的一些非限制性实例包括源自触角足,SynBl,SynB3,SynB5,TAT,和聚精氨酸的肽。例如，可以与第一和/或第二ApoE肽缀合的示例性PTD序列包括：

RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO：8)

YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO：9)

GRKKRRQRRRPPQ(SEQ ID NO：36)

RRMKWKK(SEQ ID NO：37)

RGGRLSYSRRRFSTSTGR(SEQ ID NO：38)

RRLSYSRRRF(SEQ ID NO：39)

RGGRLAYLRRRWAVLGR(SEQ ID NO：40)

RRRRRRRR(SEQ ID NO：41)

WKK

在特定的实施方案中，所述第一和/或第二ApoE肽与具有序列RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:8);YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:9),或WKK的PTD缀合。在一个实施方案中，所述第一ApoE肽通过一个或多个第一连接残基与第一PTD缀合。这样，本发明的肽二聚体可包含与第一PTD缀合的第一ApoE肽和不与PTD缀合的第二ApoE肽。在这样的实施方案中，肽二聚体包含两个ApoE肽或模拟域，和一个PTD。在另一个实施方案中，所述第一ApoE肽通过一个或多个第一连接残基与第一PTD缀合，而所述第二ApoE肽通过一个或多个第二连接残基与第二PTD缀合。在这样的实施方案中，肽二聚体包含包含两个ApoE肽或模拟域，和两个PTD。因此，本发明的肽二聚体可包含两个ApoE肽域以及0个、一个或两个PTD。见实施例3和图7。

二聚体的ApoE肽和PTD可以是本发明中描述的ApoE肽和PTD的任何组合。在特定的实施方案中，PTD选自源自触角足或TAT的肽(例如SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:9,或WKK序列)，而ApoE肽选自COG 133(SEQ ID NO:3),COG248(SEQ ID NO:4),COG1410(SEQ ID NO:5),或COG345(SEQ ID NO:35)，如实施例3的表II和IV所述。在一个特定的实施方案中，ApoE肽是COG133(SEQ ID NO:3)，且PTD具有序列SEQ ID NO:8。在另一个实施方案中，ApoE肽是COG133(SEQ ID NO:3)且PTD具有序列WKK。在另一个实施方案中，肽二聚体包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽和所述第二肽通过双马来酰亚胺-乙烷共价连接，且所述第一和第二肽具有序列SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:90。例如，在一个具体的实施方案中，肽二聚体包含第一肽和第二肽，其中所述第一和第二肽具有序列SEQ ID NO:1，且其中所述第一肽和所述第二肽通过SEQ ID NO:1的第17位处的半胱氨酸残基之间的双马来酰亚胺-乙烷接头共价连接(例如，所述肽二聚体是COG449，见表I)。在另一个具体的实施方案中，肽二聚体包含第一肽和第二肽，其中所述第一和第二肽具有序列SEQ ID NO:15，且所述第一肽和所述第二肽通过每个肽的氨基末端处(例如，SEQ ID NO:15的第1位)的半胱氨酸残基之间的双马来酰亚胺-乙烷接头共价连接(例如，所述肽二聚体是COG492，见表I)。在另一个具体的实施方案中，肽二聚体包含第一肽和第二肽，其中所述第一和第二肽具有序列SEQID NO:90，且其中所述第一肽和所述第二肽通过SEQ ID NO:90的第4位处的半胱氨酸残基之间的双马来酰亚胺-乙烷接头共价连接(例如，所述肽二聚体是COG493，见表I)。

所述第一和/或第二ApoE肽可任选地通过一个或多个连接残基与PTD缀合。如本文中使用的，所谓连接残基是指至少一个氨基酸或修饰的氨基酸，其能够发生反应而交联ApoE肽单体形成稳定的二聚体。在一些实施方案中，连接残基适于使用马来酰亚胺基团(如图8中描述的那些)来交联，或者通过形成稳定的1,4-二取代的三唑(如图9描述的)来交联。示例性的连接残基包括半胱氨酸、叠氮高丙氨酸和炔丙基甘氨酸。其他合适的连接基团可以由本领域技术人员来确定。

本发明的肽二聚体包含第一ApoE肽和第二ApoE肽，其中所述第一和第二ApoE肽通过连接模块共价连接。如本文中使用的，所谓“连接模块”可以是这样的化合物或分子，其交联肽二聚体，使得各肽链被至少四个原子分隔开。可以选择连接基团来形成肽单体之间的接头的不同长度。例如，可以选择连接模块使得各肽链相隔至少6个原子，至少8个原子，至少10个原子，或者至少12个原子。连接模块可以是天然ApoE序列中找不到的异源氨基酸，如多余的半胱氨酸残基或修饰的氨基酸，如叠氮高丙氨酸或炔丙基甘氨酸。在一些实施方案中，连接模块可以包括通过与肽链中的氨基酸所起的交联反应而产生的分子或化合物。例如，在特定的实施方案中，连接模块选自二硫桥、双马来酰亚胺、1,4-二取代三唑、和N,N-二炔丙胺。所述双马来酰亚胺可包括但不限于双马来酰亚胺-乙烷或双马来酰亚胺-己烷。在一些实施方案中，所述连接模块不是肽键。

在肽二聚体包含不与PTD缀合的ApoE肽的实施方案中，两个ApoE肽可以这样连接，使得第一ApoE肽的羧基末端与第二ApoE肽的氨基末端连接(例如直接连接)。或者，两个ApoE肽可以这样连接，使得两个ApoE肽彼此处于相反方向。例如，第一ApoE肽的羧基末端可以与第二ApoE肽的羧基末端连接，或者第一ApoE肽的氨基末端可以与第二ApoE肽的氨基末端连接。这样的连接可以通过在第一和第二ApoE肽的合适的末端添加一个或多个能够进行交联反应的氨基酸残基(例如半胱氨酸、叠氮高丙氨酸、或炔丙基甘氨酸残基)来实现。举例而言，添加到第一和第二ApoE肽二者的氨基末端的半胱氨酸残基将产生这样的二聚体，其中第一和第二ApoE肽的氨基末端相互连接(见例如实施例2中的COG492)。

在肽二聚体包含至少一个与PTD缀合的ApoE肽的实施方案中，可以通过将ApoE-PTD缀合物中的至少一个连接残基与另一个未缀合的ApoE肽的羧基或氨基末端处的氨基酸交联来形成二聚体。如果两个ApoE肽都与PTD缀合，则优选地通过将每个ApoE-PTD缀合物中的至少一个连接残基交联，使得两条肽链通过内部氨基酸残基连接在一起来形成二聚体。

可以将ApoE肽或模拟域掺入多聚体中，使得一个ApoE多聚体包含三个或更多个ApoE肽或模拟域。所述多聚体中的一个或多个ApoE肽可以如本文中所述的那样与PTD缀合。在一个实施方案中，本发明提供一种ApoE三聚体，包含第一ApoE肽、第二ApoE肽，和第三ApoE肽，其中所述第一、第二和第三ApoE肽通过连接模块共价连接。考虑到本发明范围内的其他ApoE多聚体。

本发明的肽可以通过如本领域已知的标准技术来产生。本发明的肽可以附接于多种标记模块，如放射性标记物、重原子标记物和荧光标记物，用于检测和示踪。

荧光标记物包括但不限于萤光素(luciferin)、荧光素(fluorescein)、曙红、Alexa Fluor、Oregon Green、Rhodamine Green、四甲基罗丹明、Rhodamine Red、TexasRed、香豆素和NBD荧光团，QSY 7、dabcyl和dabsyl生色团，BODIPY、Cy5等等。

本领域技术人员能够容易地对本文中公开的肽进行修饰以提高与这些肽相关的功能活性。例如，可以将本发明的肽二聚体化学修饰或缀合到其他分子，以提高溶解性、血清稳定性等参数，同时保持功能活性。尤其是，可将二聚体的第一和/或第二ApoE肽的N末端乙酰化和/或将其C末端酰胺化，或者可以将二聚体进一步与增加血清稳定性的分子缀合、复合(complex)或融合(fuse)，这样的分子包括但不限于白蛋白、免疫球蛋白及其片段、转铁蛋白、脂蛋白、脂质体、α-2-巨球蛋白和α-1-糖蛋白，PEG和右旋糖酐。这样的分子在美国专利6,762,169中有详细描述，通过提述并入其全部内容。

本发明的肽二聚体的ApoE肽还可以包括本文中所述的肽的保守变体。如本文中使用的，所谓保守变体是指氨基酸序列中不会对肽的生物学功能产生不利影响的改变。对于替代、插入或缺失来说，如果被改变的序列阻止或阻断与该肽相关的生物学功能，则称替代、插入或缺失对肽产生不利影响。例如，可以改变肽的总电荷、结构或输水/亲水性质而不对生物学活性产生不利影响。因此，可以改变氨基酸序列，例如改变使得肽更加疏水或者亲水，而不对该肽的生物学活性产生不利影响。一般而言，所述肽的保守替代变体、类似物和衍生物与公开的序列，SEQ ID NO:3,4,5,和35，将具有至少约55%,至少约65%,至少约75%,至少约80%,至少约85%,至少约90%,至少约95%,或至少约96%至99%的氨基酸序列同一性。相对于这些序列的同一性或同源性在此定义为：将序列比对好，并且视需要引入缺口(gap)，以实现最大百分比的同一性，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分的情况下，候选序列中与已知肽相同的氨基酸残基的百分比。N端、C端或内部的延伸，缺失，或者对序列的插入不应视为影响同源性。

因此，本发明的肽二聚体的第一和/或第二ApoE肽包括：具有SEQ ID NO:3，4，5和35中公开的氨基酸序列的分子，其具有治疗肽的至少约3,4,5,6,10,15或更多个氨基酸残基的连续序列的片段；此类肽的氨基酸序列变体，其中氨基酸残基已经插入到公开的序列的N端或C端或序列之内；以及公开的序列或它们的如上定义的片段的氨基酸序列变体，它们已经被另一个残基替代。考虑的变体还包括：通过例如同源同组、定点诱变或者PCR诱变等而含有预定的突变的变体，以及其他动物物种的相应肽，包括但不限于家兔、大鼠、猪、牛、绵羊、马和非人灵长类物种，以及其中所述肽已经通过取代、化学、酶学或其他合适的方式用天然氨基酸之外的模块(例如可检测的模块，如酶或放射性同位素)共价修饰。

交联肽以形成肽二聚体的方法是本领域技术人员已知的，可包括但不限于通过马来酰亚胺基团偶联，和使用“点击化学”偶联(参见实施例3和附图8-9)。本领域技术人员无需过多劳动即可确定其他用于共价连接本文公开的ApoE肽以形成肽二聚体的方法

本发明的二聚体的ApoE肽可以是游离形式或者盐的形式，当盐可药用时。这些包括钠、钾、锂、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰等的无机盐。也可以制成所述肽的各种有机盐，包括但不限于与乙酸、丙酸、丙酮酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、水杨酸等成的盐。

在一个实施方案中，本发明的肽二聚体与可药用的担载体组合使用。由此，本发明还提供适合施用于受试者的药物组合物。这样的组合物包含与可药用的担载体组合的有效量的本发明的ApoE肽二聚体。所述担载体可以是液体，使得组合物适合于胃肠外施用，或者可以是固体，即配制用于口服施用的片剂或药丸。此外，担载体可以是可雾化的液体或固体的形式，使得组合物适于吸入。当胃肠外施用时，组合物应当是无热原的，并且处于合适的胃肠外担载体中。作为替代，活性剂可以使用已知方法包埋在脂质体中来配制。可以使用本领域中已知的技术来进行用于鼻内施用的本发明的肽二聚体的制备。本发明的肽二聚体还可以配制为用于表面施用，例如以乳膏或凝胶的形式。表面施用对于治疗皮肤癌或炎症性皮肤状况特别有用。在其他实施方案中，ApoE肽二聚体可以配制为用于直肠施用，例如以栓剂的形式。在一些实施方案中，ApoE肽二聚体的直肠施用对于结直肠癌、炎性肠病或克罗恩氏病的治疗可能是优选的。

本发明的肽二聚体的药物制备物还可任选地包含可药用的稀释剂或赋形剂。

本发明的ApoE肽二聚体可以包含进一步的修饰或者加以配制，以便特异性地靶向特定组织，例如发炎的组织或者癌性肿瘤。例如，可以将ApoE肽二聚体与可定位到肿瘤细胞的其他肽缀合，这样的其他肽例如有美国专利6,380,161、美国专利申请公开号2003/0232013、WO 2009/155556和WO2009/143023中公开的那些肽。并且/或者，可以将ApoE肽二聚体包埋到脂质体中。脂质体可包含寻靶配体以便将脂质体定位到特定的组织或肿瘤部位。

本发明的ApoE肽二聚体的有效量是这样的量，与没有该肽的情况下相比，其可减少与癌症相关的至少一种症状或病态，例如肿瘤大小、肿瘤生长、癌细胞的扩散、癌细胞的数目、以及生存。ApoE肽二聚体的有效量还可以是这样的量，与没有该化合物的情况下相比，其可减少小胶质细胞活化(即减少小胶质细胞产生神经毒性和神经调节性化合物的量)。有效量(以及施用方式)，将基于个体来确定，并且将以所使用的肽二聚体的具体组成为基础，同时考虑受试者(身材、年龄、一般健康状况)、所治疗的具体状况(例如癌症、神经变性病症、炎症状况)、要治疗的症状的严重程度、所追求的结果、所使用的具体的担载体或药物配方、施用路径、以及本领域技术人员容易想到的其他因素。本领域普通技术人员可使用本领域已知的技术来确定有效量。本文中描述的肽二聚体的治疗有效量可以使用体外测试、动物模型、或本领域已知的其他剂量-响应研究来加以确定。

本发明的ApoE肽二聚体可以急性施用(即在发病时，或者在导致特定状况得到确诊的事件之后不久)，或者可以预防性施用(例如，在计划好的手术之前，或者在出现特定状况的征象或症状之前)，或者可以在特定疾病或状况的过程中施用，以减轻或缓解原本会发生的症状发展。施用的时机和时间间隔根据受试者的症状而改变，施用间隔可以为数小时到数天，时程可以以小时计，以天计，以周计或者更长，可以由本领域技术人员来确定。

典型的每日给药方案可以是从0.01μg/kg体重每日，从大约1mg/kg体重每日,从大约10mg/kg体重每日,从大约100mg/kg体重每日,从大约1,000mg/kg体重每日。根据要施用的具体ApoE肽二聚体的不同，剂量可以为约1mg/kg到约500mg/kg体重每日之间，优选约25mg/kg到约400mg/kg体重每日之间,或更优选约50mg/kg到约250mg/kg体重每日之间。

本发明提供通过施用有效量的至少一种如本文所述的ApoE肽二聚体来在有需要的受试者中治疗癌症的方法。在特定的实施方案中，所述至少一种ApoE肽二聚体包含选自下组的序列：SEQ ID NO:1,3,4,5,6,7,10,11,12,13,14,15,35,90，其有效片段和变体。ApoE肽二聚体可减少一种或多种与癌症相关的症状，包括但不限于肿瘤形成、肿瘤生长、癌性细胞数目、癌性细胞对健康组织的扩散、以及生存减少。可以用本发明的肽二聚体和方法来治疗的癌症包括，但不限于各种形式的白血病(CLL、CML、ALL、AML)，乳腺癌，卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结直肠癌、肺癌、胰腺癌、脑癌(例如胶质细胞瘤)、皮肤癌(黑素瘤和非黑素瘤)、头颈癌、膀胱癌、子宫内膜癌、肾细胞癌、甲状腺癌、胃癌、食道癌、胆囊癌、肝癌、淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤)、以及肉瘤。在一个实施方案中，所述ApoE肽二聚体能减少在多种癌症中异常活化的信号传导途径(例如Akt途径)的活化(见实施例5)。ApoE肽还可活化PP2A(实施例2、5和10)。PP2A据报道可负调节内皮细胞活动性，而内皮细胞活动性是癌症中的血管新生和肿瘤转移所必需的(Gabel et al,1999,Otolaryngol Head Neck Surg.121:463-468;Young,MR.,1997,Adv Exp Med Biol.407:3 11-318)。冈田酸对PP2A的抑制通过破坏细胞骨架网络而增加细胞活动性，从而增强肿瘤细胞的侵袭性质。因此，本发明的肽二聚体可通过活化PP2A而降低肿瘤细胞转移和癌症相关的血管新生。在本发明的一个实施方案中，ApoE肽的施用增加受试者体内癌细胞中的PP2A活性。在另一个实施方案中，ApoE肽的施用降低受试者体内癌细胞中的Akt激酶活性。在又一个实施方案中，ApoE肽的施用诱导受试者体内癌细胞中的细胞毒性。

本发明还提供一种用于治疗白血病的方法，包括以一定的量施用至少一种ApoE肽二聚体，所述量与没有该肽二聚体的情况下相比可减少该疾病的症状。在一个实施方案中，所述白血病是慢性髓性白血病(CML)。SET(即I₂PP2A)是一种内源PP2A负调节物，它在CML中过表达并抑制PP2A，从而保持致癌的BCR/ABL激酶途径的活化(Neviani et al.(2005)Cancer Cell.8:355-368)。因此，施用本发明的ApoE肽二聚体可活化PP2A，然后PP2A可自由地对细胞扩增和生存的调节物进行去磷酸化并遏制BCR/ABL激酶的致癌活性，从而减少白血病生成。在一个实施方案中，所述白血病是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在优选的实施方案中，ApoE肽二聚体的施用减少受试者体内的CD5+B细胞数。在另一个实施方案中，所述白血病是急性淋巴细胞性白血病(ALL)。

本发明还涵盖通过对受试者施用有效量的至少一种ApoE肽二聚体来治疗受试者中的乳腺癌的方法。在一个实施方案中，所述乳腺癌以Her2表达为特征。在另一个实施方案中，所述乳腺癌以雌激素受体的表达为特征。在另一个实施方案中，所述乳腺癌以孕酮受体的表达为特征。本发明的ApoE肽二聚体可以用来治疗乳腺癌的三种主要亚型中的任一种：腔内肿瘤(ER+/HER2-)、Her2扩增肿瘤(HER2+)、或者三阴性乳腺癌(TNBC,ER-/PR-/HER2-)。在特定的实施方案中，要用本发明的ApoE肽二聚体治疗的乳腺癌是三阴性乳腺癌，其特征是缺少雌激素受体、孕酮受体、以及HER2受体的表达。ApoE肽二聚体的施用优选在它们的施用之后减少肿瘤生长。

本发明的ApoE肽二聚体可单独用来治疗癌症或者与其他常用于治疗癌症的治疗剂组合使用，这样的治疗剂例如化疗剂(苯丁酸氮芥、环磷酰胺)，皮质类固醇(强的松，强的松龙)、氟达拉滨、喷司他丁、克拉屈滨、伊马替尼(Gleevec)、达沙替尼(Sprycel)、激素治疗(他莫昔芬、芳香酶抑制剂)、索拉非尼、吉非替尼、和放射。在一些实施方案中，ApoE肽二聚体与索拉非尼或吉非替尼联用来治疗癌症。如本文中使用的，“与……联用”是指施用ApoE肽二聚体和其他治疗剂使得它们的作用在时间上重叠。因此，ApoE肽二聚体可以与其他治疗剂同时使用或者在施用所述治疗剂之前或之后施用。

本发明提供一种用于预测或评价用于在患者中治疗癌症的治疗性介入的功效的方法。在一个实施方案中，所述方法包括测量来自患者的生物样品中SET蛋白的表达水平，并比较测得的水平与对照样品中SET蛋白的表达水平，其中测得的SET蛋白的表达水平指示所述治疗性介入的治疗功效。在特定的实施方案中，所述治疗性介入是本发明的ApoE肽或肽二聚体。本发明人已经发现ApoE模拟肽和肽二聚体结合SET(即I₂PP2A)并解除其对内源PP2A的抑制，从而增加细胞中PP2A的活性。不限于任何具体理论，认为这种由ApoE肽或肽二聚体诱导的PP2A活性增加触发凋亡，导致癌细胞的细胞毒性。因此，过表达SET蛋白的癌细胞对ApoE肽诱导的细胞毒性特别敏感。由此，本发明包括一种预测ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗癌症的治疗功效的方法，该方法是通过测量来自患者的生物样品中SET蛋白的表达水平，并将测得的水平与对照样品中SET蛋白的表达水平比较来进行的，其中测得的SET蛋白的表达水平指示ApoE肽或肽二聚体的治疗功效。

在一个实施方案中，测得的相对于对照样品为至少2倍的SET表达水平指示ApoE肽或肽二聚体在所述患者中治疗癌症的治疗功效。在一些实施方案中，测得的相对于对照样品为至少4倍、至少5倍、至少8倍、至少10倍、至少12倍、至少15倍、或至少20倍的SET表达水平指示ApoE肽或肽二聚体在所述患者中治疗癌症的治疗功效。在一个实施方案中，所述方法可预测ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗乳腺癌的治疗功效。在另一个实施方案中，所述方法可预测ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗三阴性乳腺癌(雌激素受体阴性、孕酮受体阴性，以及HER2受体阴性)的治疗功效。在另一个实施方案中，所述方法可预测ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗B细胞淋巴瘤(例如非何杰金氏淋巴瘤)的治疗功效。在又一个实施方案中，所述方法可预测ApoE肽或肽二聚体在患者中治疗白血病(例如CML或CLL)的治疗功效。

SET表达可以通过评估SET蛋白或SET转录物的水平来测定。SET表达可以通过本领域已知的方法来测量，这样的方法包括但不限于Northern印迹、PCR、RT-PCR、Western印迹、免疫测定(例如ELISA或多重测定(multiplexedassays))、2D凝胶电泳、和杂交。在一个实施方案中，测量SET蛋白表达。

在特定实施方案中，所述用于预测ApoE肽疗法在患者中治疗癌症的功效的方法还包括在评估了患者的生物样品中的SET表达后，对该患者施用至少一种ApoE肽或肽二聚体。本文中描述的任何ApoE肽或其二聚体都适用于该方法。例如，在一些实施方案中，对患者施用具有选自SEQ ID NO:1、3、4、5、6、7、10、11、12、13、14、15、35、90及其有效片段和变体的序列的ApoE肽或其二聚体。在另一个实施方案中，本发明还包括根据所述患者的生物样品中的SET蛋白的表达水平来调整ApoE肽或肽二聚体的具体类型或者ApoE肽或肽二聚体的剂量。可以在一段特定的时间内或者整个治疗期内多次测量患者中的SET表达水平。

所述生物样品可以使任何包含癌性细胞的组织样品。例如，所述生物样品可以包括，但不限于来自实体瘤(例如乳腺癌、淋巴瘤、肉瘤等)的活检，或者从血液分离的外周血单个核细胞(PBMC)。在一个实施方案中，所述生物样品是CD19+/CD5+白血病细胞。对照样品可以使任何含有正常或肺癌细胞的组织样品，例如从正常的年龄匹配的患者分离的PBMC，或者从要治疗的患者或从正常的、年龄匹配的对照患者获得的非癌性组织(例如乳腺、淋巴、皮肤等等)。

本发明还涵盖用于预测或评估ApoE肽或肽二聚体用于在患者中治疗癌症的治疗功效的试剂盒。在一个实施方案中，所述试剂盒包含用于测量生物样品中SET蛋白表达的试剂，以及关于测量SET蛋白表达以预测或评估ApoE肽或肽二聚体用于在患者中治疗癌症的治疗功效的说明。在一些实施方案中，用于测量SET表达的试剂可包括SET特异性抗体、ELISA试剂、以及用于扩增和检测SET mRNA的引物和探针。在其他实施方案中，所述试剂盒还可包括一个或多个标准化对照。例如，标准化对照可以是外源添加的、天然不存在于样品中的RNA或蛋白，或者其可为已知在特定的生物样品或细胞中组成性表达的蛋白质或RNA，例如β-肌动蛋白。在这样的实施方案中，所述试剂盒可进一步提供用于检测和定量所述标准化对照的试剂(抗体、引物、探针等)。在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包括一套参照值，可用来与测得的SET表达水平比较。

本发明提供一种用于在有需要的受试者中降低胶质细胞活化或小胶质细胞活化的方法，该方法是通过对所述受试者施用至少一种本发明的ApoE肽二聚体来实施的。在一个实施方案中，所述小胶质细胞活化与中枢神经(CNS)炎症、创伤性脑损伤、脑缺血或脑水肿相关。因此，本发明和组合物可用于预防、遏制或降低作为急性或慢性CNS疾病的一部分发生的CNS中胶质细胞的活化。本发明方法和肽二聚体的效果可以在细胞或组织水平评估(例如通过组织学或形态测量手段)，或者通过评价受试者的神经学状态来评估。胶质细胞活化的遏制或降低可通过多种方法来评估，这对本领域技术人员而言是显而易见的；一种这样的方法是测量已知由活化的胶质细胞产生的化合物的产生或存在，并将这样的测量值与相同化合物在对照情况下的水平相比较。或者，本发明的方法和肽二聚体遏制、降低或防止小胶质细胞活化的效果可以通过比较经过处理的受试者和对照受试者中CNS疾病的体征和/或症状来加以评估，其中这样的体征和/或症状与小胶质细胞的活化相关或者继发于小胶质细胞的活化。

本发明的方法和肽二聚体可用于预防、治疗或缓解与急性CNS损伤相关的神经学体征和症状。如本文中使用的，所谓急性CNS损伤包括但不限于卒中(由血栓形成、栓塞或血管收缩造成的)、闭合性头部外伤、全脑缺血(例如由于任何原因，包括心肌梗塞、心律不齐、出血性休克、以及冠状动脉旁路搭桥术后的脑损伤，造成的系统性低血压而导致的缺血)、局灶性缺血、以及颅内出血。中枢神经系统的出血性损伤可以是局灶性或全局性状况的结果。全局性缺血在流向全脑的血流停止一段时间(例如在心脏停搏过程中)时发生。局灶性缺血在脑的一部分的正常血流被剥夺(例如在血栓栓塞性脑血管堵塞、创伤性脑损伤、水肿和脑肿瘤中)时发生。由于脑缺血导致的CNS损伤大多发生在缺血状况之后数小时甚至数天内，并继发于受损组织的细胞毒性产物的释放。

本发明的方法和肽二聚体还可用于预防、治疗或缓解与影响中枢神经系统(包括CNS)的炎症状况相关的神经学体征和症状，包括但不限于多发性硬化、血管炎、急性播散性脑脊髓炎和格-巴二氏综合征。在此方面，本发明的ApoE肽二聚体可以单独使用或者与其他已知的抗炎药或细胞因子联用以配制成用于治疗CNS炎症状况的药物组合物。

在另一个实施方案中，本发明提供在有需要的受试者中减少神经元细胞死亡的方法，包括对受试者使用有效量的至少一种本文中描述的ApoE肽二聚体。在一些实施方案中，神经元细胞死亡与谷氨酸兴奋性中毒(glutamate excitotoxicity)相关。先前发现COG133单体肽显著抑制与N-甲基-D天冬氨酸暴露相关的神经元细胞死亡和钙内流(见例如美国专利公开号2003/0077641Al，兹通过提述并入其全部内容)。因此，本发明的肽二聚体为改良的用于治疗与NMDA受体过刺激介导的谷氨酸兴奋性中毒相关的疾病的治疗组合物提供了基础。例如，人们已经将谷氨酸兴奋性中毒与下述状况关联起来：山黧豆中毒(neurolathyrism),肌萎缩侧索硬化(ALS)(Doble(1999)Pharmacol.Ther.,Vol.81:163-221),精神分裂症(Nguimfack(2002)Encephale,Vol.28:147-153)、亨廷顿舞蹈症、帕金森氏病(Nguimfack,2002;Mytilineou et al.(1997)J.Neurochem.,Vol.68:33-39;Klopmanand Sedykh(2002)BMC Pharmacol.,Vol.2:8;Le and Lipton(2001)Drugs Aging,Vol.18:717-724),双相型障碍(Farber et al.(2002)Mol.Psychiatry,Vol.7:726-733),人和动物中的实验性自身免疫脑炎(EAE)中的多发性硬化(Paul and Bolton(2002)J.Pharmacol.Exp.Ther.,Vol.302:50-57)、抑郁症、卒中(Le and Lipton,2001)、癫痫和遗传性神经代谢疾病d-2-羟基戊二酸尿病(Kolker et al.(2002)Eur.J.Neurosci.,Vol.16:21-28)，以及阿尔茨海默病(Bi et al.(2002)Neuroscience,Vol.1 12:827-840;Bi etal.(2002)J.Neurol.Sci.,Vol.200:1 1-18)和创伤性脑损伤(Rao et al.(2001)BrainRes.,Vol.911:96-100;Regner et al.(2001)J.Neurotrauma,Vol.18:783-792;Xu andLuo(2001)Chin.J.Traumatol.,Vol.4:135-138)。

因此，本发明包括公开的肽二聚体在用于治疗任何上述疾病或病症的方法和药物制剂中的应用，以及在含有其他可用于治疗所述各种病症的已知化合物的联合治疗组合物中的应用。例如，在一些实施方案中，本发明的肽二聚体可以用于在有需要的受试者中治疗山黧豆中毒、肌萎缩侧索硬化(ALS)、亨廷顿氏病、帕金森氏病、或精神分裂症。

利鲁唑(Riluzole)(力如太Rhone-Poulenc)是一种具有谷氨酸拮抗性质的物质，用于肌萎缩侧索硬化中的神经保护治疗，已经在临床试验中测试用于治疗亨廷顿氏病和帕金森氏病(Schiefer et al.(2002)Mov.Disord.,Vol.17:748-757;Doble,1999)。Schiefer及其同事最近证实利鲁唑在亨廷顿氏病的转基因小鼠模型中延长生存时间并改变核包涵体的形成。因此，考虑到本发明的肽二聚体可能的NMDA拮抗作用，这些肽二聚体可以单独地或者与其他谷氨酸拮抗剂如利鲁唑联合用于治疗ALS、亨廷顿氏病和帕金森氏病的药物制剂中。

L-司来吉兰(L-Deprenyl)是单胺氧化酶(MAO)-B的抑制剂，其可延迟帕金森氏病失能的出现和体征和症状的进展，并且被预测可针对谷氨酸受体活化的下游事件发挥保护作用(Mytilineou et al,1997)。MAO-B抑制剂，多巴胺受体拮抗剂，如左旋多巴，以及NMDA受体拮抗剂都已经显示具有抗帕金森作用，而且还已经显示多种药物的组合能够协同地提高这些药物的抗帕金森作用(Klopman and Sedykh,2002)。因此，考虑到本发明的肽二聚体的可能的NMDA拮抗作用，这些肽可以单独地或者与其他NMDA拮抗剂、MAO-B抑制剂如L-司来吉兰，多巴胺受体激动剂如左旋多巴联合用于治疗帕金森氏病的药物制剂中。

已发现谷氨酸兴奋性中毒导致的自由基产生与精神分裂症的发病机制有牵连(Nguimfack,2002)。因此，研究者们已经开始考察用ALS、帕金森氏病和亨廷顿氏病等其他神经疾病的治疗中使用的抗氧化物质来治疗精神分裂症。考虑到本发明的肽二聚体很可能具有NMDA受体拮抗性质并且能够用来抑制由谷氨酸兴奋性中毒导致的自由基产生，这些肽可以单独地或者与其他抗氧化物质联合用于治疗精神分裂症的药物制剂中。

本发明还包括用于在有需要的受试者中治疗、预防或缓解多发性硬化的症状的方法，所述方法是通过对所述受试者施用有效量的至少一种本发明的ApoE肽二聚体来进行的。从对免疫治疗的应答，以及实验性自身免疫脑炎(EAE)的动物模型的存在可以确定多发性硬化(MS)是一种免疫介导的疾病。参见例如Mix et al.(2004)J.NeuroimmunoL,Vol.151(1-2):158-70,Anderson,et al.(2004),Ann.Neurol,Vol.55(5):654-9,和Ni et al.(2004)Mult.Scler.,Vol.10(2):158-64。目前用于反复性和弛张性MS的治疗药干扰素(IFN)β-1b，IFN-β-1a和乙酸格拉默(克帕松Teva)具有应对MS的免疫学病理生理的作用机制(Dhib-Jalbut(2002)Neurology,Vol.58:S3-S9)。例如，干扰素结合细胞表面特异性受体，引发信号传导途径的级联，最终导致分泌抗病毒、抗增殖、和免疫调节性基因产物的分泌。乙酸格拉默，一种合成分子，抑制髓磷脂碱性蛋白反应性T细胞的活化并诱导产生以抗炎作用为特征的T细胞库。一些目前上市的治疗药，包括IV免疫球蛋白(Baxter)，甲氨蝶呤((American Cyanamid),和硫唑嘌呤(GlaxoSmithKline)，已经作为与已获批准的治疗联用的复发性-弛张性多发性硬化治疗药接受了评估(Calabresi(2002)Neurology,Vol.58:S10-S22)。考虑到NMDA受体拮抗剂美金刚(Merz)已经被证明可防止血脑屏障的破坏和恢复血脑屏障以及减少与EAE致病机制相关的体内症状(Paul and Bolton,2002),本发明的肽二聚体可以单独地或者与其他NMDA受体拮抗剂联合，或者作为干扰素或乙酸格拉默的附加用于治疗人体中的MS。

本发明涵盖通过对受试者施用至少一种如本文所述的ApoE肽二聚体来在有需要的受试者中治疗、预防或缓解类风湿性关节炎、银屑病关节炎、强直性脊柱炎或多关节型幼年类风湿性关节炎的症状的方法。现有的关节炎治疗手段包括与肿瘤坏死因子结合的肽和蛋白质。依那西普(Amgen)是一种二聚体融合蛋白，由人75kd肿瘤坏死因子受体的胞外配体结合部分及与之连接的人IgG1 Fc部分构成。阿达木单抗(Abbott)是一种重组人IgG1单克隆抗体。肿瘤坏死因子结合蛋白已经在延缓类风湿性关节炎和其他风湿性疾病的症状的进展和减轻其症状方面显示了优秀的结果。因此，本发明的肽二聚体可以单独地或者与其他药物联合用于治疗类风湿性疾病，包括例如类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、多关节幼年型类风湿性关节炎、和银屑病关节炎。

本发明的方法和ApoE肽二聚体还可用来治疗、预防或缓解与慢性神经疾病(包括但不限于阿尔茨海默病(AD)和HIV相关脑病)相关的神经体征和症状。本发明人发现ApoE肽二聚体特别强地遏制小胶质细胞活化，为本发明的肽二聚体提供了在任何涉及小胶质细胞活化的神经疾病的治疗中发挥作用的机会。例如，小胶质细胞在AD中表达活化标志物，暗示AD中的关键的炎症事件牵涉小胶质细胞。这样的活化的小胶质细胞在淀粉样斑块附近积聚(Griffin et al.(1995)J.Neuropath.Exp.Neurol.,Vol.54:276)。小胶质细胞也在癫痫中活化(Sheng et al.(1994)J.Neurochem,Vol.63:1872)。

已经证明淀粉样蛋白β肽的摄取和致病作用被NMDA受体拮抗剂所阻断(Bi etal.,2002)。其他研究提示抗炎症药物可延迟AD的发病或进展(Breitner et al.(1995)Neurobiol.Aging,Vol.16:523;Rogers et al.(1993)Neurology,Vol.43:1609)。因此，本发明的肽二聚体可单独地或者与其他NMDA受体拮抗剂或其他已知的用于治疗AD的药物，尤其是抗炎药物联合在人体AD的治疗组合物或方法中使用。

本发明包括通过对受试者施用有效量的本发明的ApoE肽二聚体来在有需要的受试者中治疗、预防或缓解细菌性脓毒病的方法。已经证明，在体内脓毒症动物模型中，单体型ApoE受体结合肽可提供针对外周中(periphery)LPS诱导的细胞因子产生的保护。参见美国专利公开号2003/0077641 Al，兹通过提述并入其全部内容。因此，本发明的肽二聚体可以单独地或者与其他已知的抗炎性细胞因子和抗体联合用于治疗脓毒症的组合物和方法中。

已知炎症过程介导动脉粥样硬化过程的一个方面，参见例如Hansson(1994)BasicRes.Cardiol.,Vol.89:41;Berliner et al.(1995)Circulation,Vol.91:2488;Watanabeet al.(1997)Int.J.Cardiol.,Vol.54:551。已知血管壁上的巨噬细胞局部地分泌ApoE(虽然个体中由巨噬细胞分泌的量与由肝脏产生的ApoE的量相比是微不足道的)。在经典的动脉粥样硬化模型中，ApoE发挥从血流中去除胆固醇并将它输送到巨噬细胞或肝脏的功能。但是已经清楚，血管壁处的巨噬细胞分泌的ApoE减少动脉粥样硬化斑块的形成，而不依赖于任何脂质代谢效应。例如，ApoE缺陷小鼠被普遍承认是高胆固醇血症和动脉粥样硬化疾病的模型。对这样的小鼠提供分泌ApoE的巨噬细胞可急剧降低动脉粥样硬化斑块的形成。Linton et al.(1995)Science,Vol.267:1034。反过来，将野生型小鼠的巨噬细胞替换为ApoE缺陷的巨噬细胞可加速动脉粥样硬化性改变，尽管该动物的肝脏仍然产生ApoE。Fazioet al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.,Vol.94:4647。

在动脉粥样硬化中，有假说称ApoE通过某种受体介导的事件下调血管壁附近的巨噬细胞活化。这样的巨噬细胞活化下调阻断或干扰与动脉粥样硬化斑块形成相关的事件级联，从而减少或减慢动脉粥样硬化病灶的形成。已知与动脉粥样硬化相关的事件级联包括平滑肌细胞和内皮细胞增殖，以及泡沫细胞形成。有证据证明ApoE下调所有这些过程。因此ApoE影响体内的动脉粥样硬化的存在和进展，而不依赖于其对脂质的效果。动脉粥样硬化的进展可以通过测量动脉粥样硬化斑块的量或大小、或者被动脉粥样硬化病灶阻塞的血管的百分比，或这样的斑块的生长速率来加以评估。

动脉粥样硬化是指动脉内膜的增厚和动脉粥样硬化斑块中脂质的累积。本发明提供通过施用一种或多种本发明的肽二聚体来在有需要的受试者中治疗动脉粥样硬化或减少动脉粥样硬化斑块的形成的方法。可以用本方面来治疗的状况包括冠状动脉、对CNS供血的动脉如颈动脉、外周循环或内脏血液循环动脉的动脉粥样硬化；以及肾动脉疾病。施用，例如胃肠外施用可以是部位特异性的，或者可以施用到全身血流中。在一些实施方案中，肽二聚体可以与额外的抗动脉粥样硬化药(包括HMG-CoA还原酶抑制剂，又称他汀类)联用。适用于本发明的方法的他汀类包括，例如，洛伐他汀(MEVMerck)、辛伐他汀(Merck)、普伐他汀(BristolMyers Squibb)、罗苏伐他汀(AstraZeneca)、氟伐他汀(Novartis)和阿托伐他汀(Warner-Lambert)。

本发明还提供了通过施用有效量的至少一种本发明的ApoE肽二聚体来在有需要的受试者中治疗、预防或缓解炎性肠病(IBD)、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎的症状的方法。在本发明的方法的实施中，治疗肽和/或其衍生物可以单独使用或者与其他活性成分联用。如果期望，可用一种或多种通常用于治疗炎性肠病的药剂来作为本发明的方法和组合物中的治疗肽的替代或者附加。这样的药剂包括生物药(例如inflixamab,adelimumab,和CDP-870)，小分子免疫调节物(例如VX 702、SCIO 469、doramapimod、RO 30201 195、SCIO323、DPC 333、pranalcasan、霉酚酸酯、和merimepodib),非甾类亲免疫因子依赖性免疫抑制剂(例如环孢霉素A,他克莫司,吡美莫司,和ISAtx247),5-氨基水杨酸(例如美沙拉秦、柳氮磺吡啶、巴柳氮二钠、和奥柳氮钠),DMARD(例如甲氨蝶呤和硫唑嘌呤)以及阿洛司琼。

受益于本发明的组合物和方法的合适的受试者包括雄性和雌性哺乳动物受试者，包括人，非人灵长类，和非灵长类哺乳动物。受试者包括兽类(veterinary)(伴侣动物)受试者，以及家畜和外来物种(exotic species)。

下面的实施例用于例示本发明，不应解释为对本发明构成限制。

实施例

实施例1.二硫化物二聚体的形成增强ApoE肽的细胞毒活性

我们先前已经显示，通过对apoE模拟性COG133肽(LRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ IDNO:3))添加蛋白转导域(PTD)，如触角足(触角足)肽，可增强其抗炎症活性。通过化学合成制备了一系列COG133与PTD缀合的融合肽。值得注意的是，我们发现在BV2细胞中，在用LPS刺激之后，具有序列RQIKIWFQNRRMKWKCLRVRLASHLRKLRKRLL(SEQ ID NO:1)的COG112可有效地遏制NO,TNFα和IL-6的产生，IC50分别为21nM,58nM,和12nM(图1)。这些结果展示了COG112的一个显著的安全窗，其中有效的抑制发生在12-58nM的浓度，而LD50高于其超过120倍，为7μM。

在测试多种化合物针对CLL细胞的细胞毒性的过程中，我们发现COG112具有220nM的ED50。这些数据是使用批号313的COG112肽产生的。当批号313COG112肽的库存耗尽后，我们开始使用新合成的COG112(批号411)，发现ED50降低到1.2μM。虽然这一批比仍然比缺少触角足PTD的apoE模拟COG133更强，但比批号313的活性低。

为了确定这两批COG112之间任何可能的结构差异，我们利用正检测模式下的带电喷雾离子化的液相色谱/质谱(LC/MS)技术测定了来自这两个不同批次的COG112。对于来自批号313的COG112，观察到了一个质荷比(M/Z)为1126.3的主峰，以及M/Z=1800.9、1286.6、和1001.5的峰(图2A中的红色箭头)。据分析，M/Z 1800.9的峰来自一个带5个正电荷的二聚体化肽的质量+5质子形式(表示为[M+5H]⁵⁺/5)，1286.6的峰来自[M+7H]⁷⁺/7种类。实际上，该二聚体预期有M/Z=1801.3、1501.2、1286.9、1126.2、1001.1、901.1的峰，而单体肽预期有M/Z=1501.6、1126.4、901.3、751.3、和644.1的峰。

为了确证这一发现，我们用二巯苏糖醇处理来自批次313的COG112以将二硫化物还原成游离巯基，制备了还原型的COG112，并重复了LC/MS分析(图2B)。在该还原型的肽中，观察到M/Z=1501.0、1126.4.901.3、751.3和644.2的峰，与单体肽预期的峰很好地吻合。通过在氧化性条件下搅拌单体并纯化二聚体(又称为COG445，以区分COG112的二聚体形式和单体形式)来强迫形成二硫化物，确认了二聚体是COG112的活性形式。通过LC/MS分析COG445给出了M/Z=1800.5、1501.3、1286.6、1126.1、1001.0、和901.2的MS峰(图2C)，其中1800.5、1286.6和1001.0处的峰是该肽的二聚体形式所独有的，从而确认了该化合物的二硫桥。

确认了COG445的二聚体结构之后，我们接下来评估了该肽在BV2细胞测定中的NO释放并对其进行了CLL细胞毒性细胞测定。在BV2测定中，我们确认了NO释放的IC50为20nM，CLL细胞的细胞毒性的ED50为110nM。对于COG445，重要的是先前的ED50值(例如220nM)是利用单体的分子量4502而不是二聚体的真实分子量9004来报道的。基于COG445的真实分子量进行校正后，CLL细胞毒性的ED50值被降低到110nM。

实施例2不可还原的COG112二聚体肽活化PP2A并且对癌细胞具有细胞毒性

在发现COG112作为二硫化物连接的二聚体发挥活性之后，我们探寻了稳定化COG112的二聚体状态的方法。我们首先在稀溶液中用5倍摩尔过量的双马来酰亚胺乙烷(BMOE)处理还原型COG112肽。通过加入醚沉淀出肽，过滤收集肽，洗涤去除未反应的BMOE，然后在真空下干燥。将BMOE连接的肽溶解在缓冲液中并与1.5-2.0倍摩尔过量的新鲜还原的COG112混合。通过HPLC检测交联情况直到反应完成，产生的肽-BMOE-接头-肽二聚体用醚沉淀，收集、洗涤、并通过反相HPLC纯化到98%的纯度。通过MS确认该肽的身份(称之为COG449)，并对其进行BV2NO释放测定法测定。如图3所示，我们观察到使用COG449从BV2小胶质细胞释放一氧化氮的IC50为9.4nM，相比于COG445(二硫化物连接的COG112二聚体)活性提高大约2倍。

为了进一步评估COG449的效果，我们测量了稳定的二聚体化COG449化合物在32D:p210^BCR/Abl慢性髓性白血病细胞中活化PP2A的能力。用COG445或COG449处理后，由于PP2A的活化，导致磷酸的释放相对于未处理的对照细胞增加(图4A)。然而，COG449处理增加该速率(rate)的程度比COG445更高，这提示有可能会发现COG449及其他稳定的二聚体肽具有更高的CLL细胞杀灭强度。COG449还显示比FTH720(一种先前证明可活化PP2A的物质(Nevianiet al.(2007)J Clin Invest,Vol.1 17:2408-2421))更强的PP2A活化。32D:p210^BCR/Abl慢性髓性白血病细胞不用化合物处理、用1μM COG449处理，或者用5μM FTH720处理。我们观察到，用COG449单独处理后，与未处理的对照相比，PP2A的相对比活性(磷酸释放/分钟/单位蛋白)稳健地增加约45%，并且与FTY720相比有大约20%的活化(图4B)。

根据在含血清的培养基中PP2A的活化以及在BV2测定中对NO的强力抑制，我们测定了COG445和COG449针对源自患者的CLL细胞和正常B细胞的细胞毒性(图5)。从CLL患者收集血液，使用RosetteSep(^TM)人B细胞富集鸡尾酒根据制造商的说明分离CD5+/CD19+CLL细胞，并用COG化合物进行处理。将化合物施加于B-CLL细胞(96孔板中，2.5x10⁵个细胞/孔)，然后处理细胞72小时。处理期之后，利用MTS测定法(Pharmacia)评估活细胞以确定可有效杀死50%的输入CLL细胞的COG化合物的浓度(EC50)。和PP2A活化以及NO释放的数值一样，COG449相比于COG445显示了更高的效力，如下面的表I所列。COG445和COG449处理来自志愿者的正常B细胞的细胞毒性的EC50值要高出将近200倍(高于10μM)。

为了更充分地了解COG肽的PTD域和apoE域在抗CLL细胞毒活性中所起的作用，我们利用具有HIV-TAT PTD的其他化合物(COG226)以及具有改变的apoE序列的肽(COG1410和COG248)，如表I中所示。值得注意的是触角足(ANTP)或TAT PTD分别将COG 1410的效力从5.7μM增加到1.0μM和1.4μM。此外有趣的是，与ANTP连接的COG1410(COG 120)与COG112单体相比作为单体的效力更高，COG 120和COG 112的EC50值分别为1.0μM和1.4μM。该结果提示，构建含有改变的apoE域以及ANTP或TAT PTD域的二聚体肽可能进一步提高肽的效力。这些数据表明，apoE模拟化合物针对新鲜分离的人B-CLL细胞显示强效和选择性的细胞毒活性，并具有宽的安全范围。

我们还评估了这些不同的肽抑制BV2小胶质细胞在LPS刺激下诱导的一氧化氮产生的功效(作为抗炎活性的量度)，以及在大鼠中耐受的最大剂量(表I和图6A)。对于LPS测定，EC50是导致LPS刺激后BV2细胞的一氧化氮释放的50%抑制的化合物浓度。对于小鼠毒性，MTD是能够通过静脉注射给药而不导致24小时后死亡的最大化合物剂量。ApoE肽二聚体，特别地，在抗炎测定中显示出显著的效力(图6A)。将ApoE域与蛋白转导域偶联进一步增强了二聚体的效力。

接下来，我们考察了一种ApoE肽二聚体与其单体形式对MDA-MB-231乳腺癌细胞系的增殖的效力。MDA-MB-231细胞用不同浓度的COG435(单体；SEQ ID NO:90)或COG493(BMOE连接的COG 435二聚体)肽处理48小时。肽处理之后，利用MTT测定法定量细胞。结果如图6B所示，表明ApoE模拟肽的二聚体形式对乳腺癌细胞的细胞毒性显著高于单体形式。

为了确定ApoE肽二聚体是否对其他类型的癌症具有细胞毒性，我们评价了三种不同的ApoE BMOE连接的肽二聚体(COG449,COG492,COG493;见表I)对U87MG成胶质细胞瘤细胞的生长特征的影响。使用多种浓度的COG449,COG492,COG493或索拉非尼来处理U87MG成胶质细胞瘤细胞，并使用MTT来定量活细胞。使用索拉非尼作为阳性对照，因为它已被报道对成胶质细胞瘤细胞有细胞毒性(Yang et al.(2010)Mol Cancer Ther.,Vol.9(4):953-962)。图6C所示的剂量响应曲线显示每一种二聚体肽对U87MG细胞都有细胞毒性。

这一系列实验证明ApoE肽对三种不同类型的癌细胞具有细胞毒性。有趣的是，这些ApoE肽的二聚体形式诱导癌细胞的细胞毒作用的效力大大强于单体形式。

实施例3.ApoE肽二聚体文库的创建

根据实施例1和2中显示的ApoE肽二聚体诱导癌细胞细胞毒性和活化PPA的效力更强的结果，合成了28种不同的单体ApoE肽，它们可以用两种不同的偶联化学偶联，形成一个有64种独特化合物的二聚体文库。本实施例的目标是建立一个化学稳定的肽二聚体的文库，其中的肽二聚体被设计用来探索apoE模拟肽与针对CLL细胞的细胞毒性之间的结构活性关系。我们最初使用COG肽进行的筛选限于一种二聚体肽，COG112，其具有序列Ac-RQIKIWFQNRRMKWKKCLRVRLASHLRKLRKRLL-酰胺(SEQ ID NO:1)，含有一个通过第17位的半胱氨酸形成的二硫桥。该肽的N端有一个源自触角足的PTD域，C端部分有一个apoE模拟域，因此二聚体肽含有两个PTD域和两个apoE模拟域。虽然这种COG112二聚体显示了优越的效力，但无法确定PTD域是否是改善的效力必需的，也无法确定由两个肽组成的二聚体对于细胞毒性测定中的高效力而言是否是足够的。单体COG112的ED为1.4±0.7μM而缺少PTD的COG133的效力只有它的三分之一，ED50为4.4±1.5(表I)，根据该观察结果，似乎PTD确实可增加细胞毒性效力。基于这些结果，我们制作二聚体肽的策略倚赖于将含有PTD和apoE模拟域的肽进行组合混合(combinatorial mixing)。图7显示了这种策略，二聚体文库中的所有肽都含有两个apoE模拟域。创建了一系列具有活性基团的单体肽，所述活性基团能够被化学偶联以形成稳定的二聚体肽，并将它们组合以形成含有0个、1个、或2个PTD域的二聚体肽。为了完成化学偶联，我们已经确认并验证了两种独特的实施偶联反应的途径，即双马来酰亚胺偶联和点击化学偶联。

第一种用于创建apoE模拟二聚体肽的方法利用马来酰亚胺基团与半胱氨酸的巯基之间的反应。创建了在肽单体中具有一个半胱氨酸残基的单体肽，并利用双马来酰亚胺接头将它们偶联形成二聚体以创建稳定的二聚体(图8)。双马来酰亚胺-乙烷(BMOE)和双马来酰亚胺丙烷(BMH)都被用于创建二聚体，它们容许在二聚体肽的两条肽链之间存在12或16个原子的桥。使用两种不同长度的桥连基团容许我们确定桥连基团的长度对于抗CLL活性的影响。为了创建双马来酰亚胺连接文库，合成了12种独特的单体，如表II所示。我们已经为apoE模拟域选择了4种独特的序列(COG133,COG1410,COG248,和COG345)。COG1410,COG248,和COG345先前已被证明在NO释放测定出显示出相对于COG133更好的抗炎活性。使用了一种触角足(触角足)PTD(RQIKIWFQNRRMKWKK(SEQ ID NO:8))和一种HIV TAT PTD(YGRKKRRQRRR(SEQ ID NO:9))作为文库肽中的PTD域。

合成了表II中所列的肽之后，使用BMOE或BMH将这些肽偶联起来以形成二聚体，如表III中所列的。在表III中，X指示哪些单体肽被偶联到一起，从而创建了一个包含40个独特成员的集中文库(focused library)。初始的文库并不是严格的组合性的，因为只有匹配的apoE序列被偶联起来，结果生成含有2个COG133、2个COG1410、2个COG248、或2个COG345apoE域的二聚体肽。最终的含有两个PTD域和两个apoE域的化合物在该表中的蓝色区域中突出显示，含有一个PTD域和两个apoE域的化合物在该表中的黄色区域中突出显示，而缺少PTD域但含有两个apoE域的化合物出现在该表中的绿色区域中。

第二种偶联肽的方法利用“点击”化学来偶联单体。这种偶联方法倚赖于铜催化的叠氮化物与一级炔的3+2Huisgen环加成反应来形成稳定的1,4-二取代三唑，如图9所示。活性叠氮与一级炔基团是在合成过程中分别利用市售的L-叠氮高丙氨酸和L-炔丙基甘氨酸掺入到肽中的。合成了含有L-叠氮高丙氨酸或L-炔丙基甘氨酸的肽单体后，可以使用两种方法来生成二聚肽。第一种方法是使用标准反应条件将一个含有叠氮高丙氨酸的单体与一个含有炔丙基甘氨酸的单体简单偶联(图9A)。该反应产生在肽链之间具有短的6原子桥的二聚体。第二种方法使用通过N,N-二炔丙胺偶联在一起的两个含有叠氮高丙氨酸的单体(图9B)来在肽链之间形成13原子桥。为了完成“点击”化学文库的构建，合成了16种独特的单体肽，如表IV所示。

在合成了如表IV中所列的肽之后，使用表V中所示的组合计划，利用直接点击偶联(图9A)或者通过N,N-二炔丙胺偶联将这些肽偶联起来形成二聚体。在表V中，X指示哪些单体肽被偶联到一起，而代号Xa或Xb则分别指示直接点击偶联或通过N,N-二炔丙胺点击偶联，以生成二聚肽。该方法生成含有24种独特成员的集中文库。含有两个PTD域和两个apoE域的最终化合物在表中的蓝色区域突出显示，含有一个PTD域和两个apoE域的化合物在表中的黄色区域突出显示，而缺少PTD域但含有两个apoE域的化合物可见于表中的绿色区域。对于含有两个apoE域但缺少PTD域的二聚体(表的绿色区域)，apoE模拟域之间的接头有两种长度。通过直接点击偶联而实现的异二聚化(B1对C1，B2对C2，等等)导致肽链间较短的6原子桥，而利用N,N-二炔丙胺的同二聚化则导致肽链间较长的136原子桥。

方法

双马来酰亚胺偶联.利用双马来酰亚胺化合物偶联含有半胱氨酸的肽是作为两步过程来进行的，其中首先在稀溶液中用3-5倍摩尔过量的BMOE或BMH与经还原的单体肽反应。通过加入醚沉淀出肽，过滤收集肽，洗涤去除未反应的BMOE/BMH，然后在真空下干燥。将BMOE/BMH连接的肽单体肽溶解在缓冲液中，并与1.5-2.0倍摩尔过量的第二单体肽混合。通过HPLC监控偶联直到反应完成。产生的肽用醚沉淀，收集、洗涤、并通过反相HPLC纯化到纯度>90%，并通过LC/MS分析以确定产物的分子质量。弃去任何不符合预期质量的肽，并重复进行偶联。

点击偶联.含有叠氮高丙氨酸和炔丙基甘氨酸的肽的偶联使用前人描述的程序来进行((Chan et al.(2004)Org Lett,Vol.6(17):2853-2855)。简单地说，将等摩尔量的每种单体肽与碘化铜和抗坏血酸或三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺(TBTA)混合到一起。首先使用抗坏血酸来进行偶联((Rostovtsev et al.(2002)Angew Chem Int EdEngl,Vol.41(14):2596-2599)，但如果抗坏血酸偶联的产率不佳或者发现对肽骨架造成破坏，则使用TBTA。偶联后，将肽用醚沉淀，收集、并通过反相HPLC纯化到纯度>90%。通过LC/MS分析以确定产物的分子质量。弃去任何不符合预期质量的肽，并重复进行偶联。

实施例4.ApoE肽二聚体的评估

该实施例陈述了旨在评价来自实施例3中描述的文库的肽二聚体的效力的实验。使用了一种两步筛选级联。先前已经显示，当将CLL细胞与一氧化氮合酶(NOS)抑制剂共同培养从而降低一氧化氮(NO)的浓度时，发生高度的细胞毒作用和白血病细胞凋亡(Thomaset al.(2008)Free Radic Biol Med,Vol.45:18-31)。该现象的发生是由于CLL细胞的抗凋亡状态的维持需要低到中等水平的NO(Zhao et al.(1998)Blood，Vol.92(3):1031-1043;Levesque et al.(2008)Leuk Res，Vol.32(7):1061-70;Kolb et al.(2003)CardiovascHaematol Disord，Vol.3(4):261-86)。在细胞中，NO是由人体中的三种NOS同种型从L-氨基酸产生的，这三种同种型由不同的基因编码。NOS 1(“神经元NOS”)和NOS3(内皮NOS)通常产生低水平的NO并且是组成性表达的，而诱导型NOS(NOS2)是由细胞因子和微生物因子通过NFKB的活化而诱导的。像BV2细胞一样，人细胞应答于数种刺激因素，包括IFN-α、IFN-γ、IL-1、TNFα、IL-6、和LPS，而表达NOS并产生NO(Weinberg(1998)Molecular Med，Vol.4:577-591)。在人CLL细胞中，已经有报道称高水平的NOS mRNA和蛋白组成性表达，并且这些细胞具有高NOS酶活性(Zhao et al.(1998)Blood，Vol.92(3):1031-1043)。基于这些数据以及对使用人CLL细胞的限制，首先在用脂多糖刺激的BV2小胶质细胞中筛选抑制NO产生的化合物。使用这种测定法进行初筛是因为BV2细胞生长迅速并且容易响应于LPS处理而表达诱导型NO合酶(NOS)，从而产生可测量的量的NO。因此，第一步筛选测定涉及按照8点剂量滴定曲线处理BV2细胞，然后用LPS刺激，并测量肽二聚体抑制NO产生的能力。

测定了BV2细胞中针对NO产生的IC50之后，对于在NO抑制测定中具有最高效力的二十种肽二聚体筛选针对来自CLL患者的纯化的CD19+/CD5+白血病细胞的细胞毒活性。获得来自CLL患者的全血，并如下文的方法一节所述利用RosetteSep^TM人B细胞富集鸡尾酒分离CD19+/CD5+CLL细胞。与来自培养的同质的BV2细胞不同，从一名患者身上难以获得足够的细胞以便用来自一名患者的细胞筛选多种肽二聚体。此外，由于CLL的性质多种多样，有很多已有记录的染色体异常以及表型，有必要用来自多个患者的CLL细胞来筛选一种肽二聚体。因此，为了保证在这个筛选步骤中药物基因组学效应最小化，测定了每种肽二聚体针对来自不少于6名随机选择的患者的CLL细胞的细胞毒性的EC50值，并且对来自每个患者的ED50曲线求平均。在这个筛选步骤完成之后，对于来自该CLL细胞细胞毒性测定的10种最强效的肽二聚体，确定了每一种的安全窗口，方法是从正常的、年龄相符的志愿者分离CD19+B细胞，并测定正常B细胞的细胞毒性的ED50。与使用CLL细胞进行的分析相似，用来自不少于4名志愿者的B细胞样品确定ED50。每种肽二聚体的安全窗口如下计算：用针对CLL细胞的细胞毒性的ED50值除以针对正常B细胞的细胞毒性的ED50值。选择安全窗口最大的5种肽二聚体用于药动学概况分析。

肽二聚体的药动学概况分析

雄性C57B1/6小鼠(20-24g，Charles River，Raleigh，NC)以5mL/kg的量在颈背处皮下注射一种肽二聚体。在期望的时间点前10分钟将小鼠麻醉，并在期望的时间点通过心脏穿刺采取血液。每个时间点使用来自至少4只小鼠的血液，在第5、10、15、30、45、60、90、120、180和240分钟时采样用于最初的分析。处理样品并完成药动学分析。所述时间点的选择是基于先前使用COG1410皮下注射的经验，该经验显示剂量依赖的T_max为20-30分钟，清除的半寿期为60-90分钟。若未达到半寿期，则重复进行试验，使用一个在观察到的T_max之前的时间点、一个处于观察到的T_max的时间点，以及延伸足够长的多个时间点，以基于先前观察到的血浆清除进行外推而确定半寿期。还进行了肽二聚体的三个浓度的分析，以确定是否对药动学参数存在剂量依赖效应。

使用非区室模型分析来估计药动学参数(Gibaldi and Perrier、1982)，包括血浆-浓度时间曲线从0时间到无穷时间的曲线下面积(AUC，0-∞)，峰值血浆浓度(C_max)、系统性清除(CL，它是基于剂量和AUC，0-∞的比来计算的)、稳态时分布体积(V_SS)，终点半寿期(t1/2)，其是使用最后三个浓度-时间数据中的最小值计算的，以及在体内的平均驻留时间(MRT)。使用Win-Nonlin professional version 3.1(Pharsight Corporation、Cary、NC、USA)进行数据分析。

对Eμ-TCL1转基因小鼠的肽二聚体处理

药动学概况分析之后，在CLL转基因小鼠模型中测试选择的肽二聚体。从至9月龄的转基因Eμ-TCL小鼠通过眼眶后取血抽取血液，用于对总白细胞数和白血病细胞负荷的初步分析。将显示白血病征象的动物随机分配到治疗组中。治疗启动时，抽血测定基线CD5+/CD19+CLL细胞计数，对各组动物(n=20)皮下注射溶媒对照(乳酸林格氏溶液)或一种选定的肽二聚体，注射的剂量和给药频度时间表由药动学概况数据确定，总治疗时间为35天。

每周通过眼眶后取血从每只小鼠收集血液。用该血液来测定总血白细胞和淋巴细胞计数以及CD19+/CD5+细胞计数以确定白血病负荷。35天的治疗之后，将小鼠安乐死，并通过细胞计数、脾重量、以及骨髓、脾、肝和淋巴结的组织学分析来测量治疗后白血病负荷。对于所有在35天之前死亡的小鼠以可比较的方式加以分析。

方法

BV2细胞生长、LPS刺激和NO定量.将低传代数的BV2小胶质细胞培养物维持在10%HI(热灭活的)FBS DMEM培养基(添加有MEM NEAA(非必需氨基酸)、丙酮酸钠以及青-链霉素)中，并连续培养至需要时。为了测定针对NO产生的IC50值，将肽加入1% HI FBS DMEM培养基(添加有MEM NEAA和丙酮酸钠)中的BV2培养物中，使得肽的最终测定浓度范围为从1.0μM依次2倍稀释到7.8nM，然后立即添加LPS(100ng/mL终浓度)，如前人所述(Laskowitz etal.(2001)Exp Neurol，Vol.167(1):74-85)。温育18±1小时后，移出条件化培养基以利用Griess量色测定法(Promega)分析亚硝酸盐(释放出的一氧化氮的稳定氧化产物)。对于剩余的细胞使用MTT测定法(Promega)测定存活力，并利用MTT测定中细胞的百分比存活力将每个浓度的亚硝酸盐测定值标准化。基于仅LPS(无添加肽)的培养物表现100%应答、而无LPS(无添加肽)的培养物表现0%应答的假设来计算NO抑制的IC50值。典型地，在我们的测定法中，没有对LPS暴露导致BV2细胞所得到的水平低于检测限。类似地，在没有LPS的条件下添加任一种肽直至25μM都未产生可检测的NO水平。

CLL细胞分离.根据制造商的说明使用RosetteSep^TM人B细胞富集鸡尾酒分离来自志愿者的正常B细胞和来自患者的B-CLL细胞。该方法利用专有的抗体鸡尾酒来耗竭全血中的T细胞、单核细胞和NK细胞，该抗体鸡尾酒将人全血中不想要的细胞与多个红细胞(RBC)交联形成免疫花环(immunorosette)。这导致不想要的(成花环的)细胞的密度增加，使得它们在浮力密度介质(如)上离心时与游离RBC一起沉淀下来。这样使得高度富集的B细胞或B-CLL细胞留在Ficoll和血浆之间的界面上。该鸡尾酒中的抗体包括抗CD14、抗CD2和抗CD16抗体，分别用于去除T细胞、单核细胞和NK细胞。然后通过流式细胞术测定这些B细胞和B-CLL制备物的纯度。制备物中典型地CD3+T细胞平均少于2%，CD14+单核细胞少于0.5%。在B-CLL细胞分离的场合，我们使用这种方法一般获得含有少于1.5%正常CD19+/CD5-B细胞的制备物。

CLL细胞培养/细胞毒性测定法.对于细胞毒性测定法，在24孔组织培养板中将3x10⁶个/孔的CLL细胞在1.5mL Hybridoma SFM^TM(Gibco，Long Island，NY)中培养，如Levesque等人所述(2001，2003)。所有的培养物在37℃、含5%CO2的空气中培养。将肽二聚体施加到B-CLL细胞(96孔板中0.25x106个细胞/孔)，72小时后，利用MTS测定法(Pharmacia)评估活细胞以确定可有效杀死50%的输入CLL细胞的肽二聚体浓度(ED50)(Levesque etal.,2003)。

实施例5.ApoE肽二聚体抑制癌细胞中的Akt信号传导

Akt信号传导在癌症中经常失调，从而促进细胞存活和增殖。基于ApoE的肽在多种与增加的Akt信号传导相关的神经疾病中已显示抗炎症效果。考虑到ApoE肽对其他炎症疾病的效果，我们考察了一种ApoE肽二聚体对乳腺癌和脑癌细胞中Akt信号传导的效果。如实施例1所述制备了一种COG112(SEQ ID NO:1)的二硫化物二聚体(COG445)。将贴壁乳腺癌细胞MDA-MB-231(MB231)或成胶质细胞瘤细胞U87-MG(U87)血清饥饿过夜，然后暴露于COG4452小时，再用表皮生长因子刺激5分钟。Western印迹分析显示高达1μM浓度的COG445没有改变EGFR活化(根据U87(图10A)和MB231(数据未显示)细胞系中EGFR酪氨酸1045磷酸化确定)。EGFR活化导致由PDK1活化介导的PI3K/Akt信号传导途径的活化。COG445处理没有改变U87细胞系(图10A)和MB231细胞系(数据未显示)中由丝氨酸241磷酸化水平度量的PDK1活化。然而，在MB231和U87细胞中，COG445暴露确实导致Akt活化的剂量依赖性降低(图10B)。在这两种细胞系中Akt丝氨酸473磷酸化在100nM的COG445的条件下被降低，而在1μMCOG445的条件下达到统计学显著。

COG445对Akt磷酸化的抑制似乎发生在EGFR/PI3K信号传导的下游，因为EGFR和PDK1磷酸化没有被改变(图10A)。一种内源Akt负调节物是蛋白磷酸酶2A(PP2A)。为了研究PP2A对于COG445介导的Akt抑制的潜在作用，在PP2A抑制剂——冈田酸(OA)的存在下使MB231和U87细胞暴露于COG445 2小时，然后用EGF刺激细胞。对MB231细胞的Western印迹分析显示COG445在OA存在下没有抑制Akt磷酸化(图11A)。用和不用OA处理的MB231细胞的Akt磷酸化的差异，以相对于COG445浓度的占EGF对照的百分比计，示于图11B。在≥100nM的COG445浓度Akt磷酸化存在显著差异，表明COG445对Akt的抑制作用是对OA敏感的。非线性回归分析进一步显示COG445以冈田酸敏感的机理抑制Akt活化，这与蛋白磷酸酶介导的作用机理一致(图11C)。

为了进一步表征COG445对PP2A活性的影响，如上所述处理MB231细胞，并测量被免疫沉淀的PP2A的磷酸酶活性。与未经处理的血清饥饿细胞相比，EGF刺激导致总PP2A活性的显著降低(图12A)。在≥100nM的浓度用COG445处理的细胞显示了PP2A活性的显著(P<0.01)增加。然而PP2A活性的水平未回复到未经刺激的对照水平。为了进一步探查应答于COG445的PP2A活化的程度，通过Western印迹分析测定了总c-myc蛋白水平。C-myc是PP2A的底物，一旦被去磷酸化则通过遍在蛋白化和蛋白酶体降解而被代谢掉。在U87(图12B)和MB231(数据未显示)细胞系中，在暴露于COG445 2小时后c-mys水平以剂量依赖的方式降低，在1000nM达到统计学显著。此外，在OA的存在下，c-myc水平应答于COG445没有改变，表明PP2A可能介导由COG445诱导的c-myc水平的降低。

为了考察COG445对PP2A活性的作用机理，将重组人PP2A催化亚单位与COG445一起温育，并测量活性。直到10μM的浓度COG445都没有对磷酸酶活性的速率(rate)有任何影响(数据未显示)。这些数据表明COG445是在生化水平上影响PP2A活性的。为了进一步探查PP2A蛋白复合物的变化，对MB231细胞进行了免疫共沉淀实验。在EGF刺激的细胞中，PP2A的内源强抑制物I₂PP2A(又称SET)与PP2A强力缔合，与低的PP2A活性对应，而在未刺激的细胞中该缔合显著降低(图12C)。用0.1或1μM COG445预处理这些细胞同样强烈减少了I₂PP2A对PP2A的催化亚单位的缔合(数据未显示)。

Akt通过磷酸化蛋白底物如mTOR和GSK-3β来施加其增殖信号。为了考察MB231细胞中COG445对下游Akt信号传导的作用，通过western印迹分析测量了mTOR活化和GSK-3β抑制。COG445导致mTOR和GSK-3β磷酸化在EGF刺激时的活化发生剂量依赖性的降低(图13A和B)。Akt底物的磷酸化在≥100nM的COG445浓度下显著减少，与Akt活化水平相对应。在冈田酸存在下mTOR和GSK-3β的磷酸化的降低不复存在，这进一步证明了PP2A介导COG445对Akt信号传导的作用。

由于COG445抑制了Akt活化和下游信号传导，我们考察了COG445对细胞增殖的作用。使贴壁的MB231细胞和U87细胞在COG445存在下生长~24小时，然后用MTT还原来测量细胞增殖。对于受测的两种癌细胞系COG445都导致了增殖的剂量依赖性降低(图14A)。此外，如细胞计数确定的，COG445抑制了MB231细胞增殖(图14B)。大约6x 104个细胞在含有递增浓度的COG445的生长培养基(RPMI+10%FBS)中铺平板24小时。将MB231细胞与0.1μM COG445温育导致细胞增殖稍微降低，这与MTT测定数据一致。然而在≥1μM COG445的浓度下，似乎有细胞损失。这可以部分地用增殖降低来解释，但也有可能是在COG445存在下细胞降解的速率增加了。但是，施用1-1000nM COG44524小时后没有与之响应的凋亡的迹象(数据未显示)

本实施例中描述的这些实验的结果提示基于ApoE的肽可能通过活化肿瘤抑制物PP2A而在癌症化疗中产生有益效果。

实施例6.ApoE肽二聚体在伯基特淋巴瘤细胞系中减少c-myc磷酸化

已经发现多种形式的癌症中牵涉c-myc的异常表达。已有报道称c-myc的丝氨酸62的磷酸化稳定化c-myc蛋白，而PP2A对该丝氨酸残基的去磷酸化将c-myc引向遍在蛋白介导的降解(参见例如Sears et al.(2004)Cell Cycle,Vol.3:1133-1137)。由于ApoE肽二聚体在癌细胞系中增加PP2A活性并促进c-myc降解(见实施例2和5)，我们进一步考察了一种稳定化的ApoE肽二聚体在c-myc依赖型人伯基特淋巴瘤Raji细胞系中对c-myc磷酸化的影响。我们用COG449，COG112的BMOE连接的二聚体(见实施例2)，或者用溶媒对照处理Raji细胞20小时，并通过Western印迹用针对P-S62的抗体与总c-myc抗体探查提取物，结果显示S62处的磷酸化显著降低(图15)。

这些结果与实施例2和5中描述的实验获得的结果一致，提示ApoE肽二聚体能够在癌细胞中调节c-myc蛋白水平，可能是通过拮抗SET并解除PP2A的抑制来实现的。因此，ApoE肽二聚体可能代表了一种新的癌症治疗途径，尤其是在过表达SET的癌症中。

实施例7.SET在CLL和B细胞淋巴瘤细胞中过表达

在寻求研究PP2A在慢性淋巴细胞性白血病(CLL)中的失调的过程中，我们选择内源生理性抑制蛋白PP2A作为着眼点。最近，Neviani等人(Cancer Cell,Vol.8:355-68,2005)报道了在来源于患者的慢性髓细胞性白血病(CML)细胞中SET癌蛋白(又称PP2A抑制物-2，I₂PP2A)过表达，而且随着患者发生急变(blast crisis)SET浓度升高。该参考文献还显示PP2A活性在急变过程中减少，导致细胞在BCR/Abl刺激Akt磷酸化后调节Akt信号传导途径的能力降低。考虑到CML和CLL中Akt信号传导失调的一致性，我们尝试确定SET是否在新鲜的源自患者的CLL细胞中也过表达。我们使用来自16名患者的原代B-CLL样品和来自志愿者的正常B细胞制备了细胞裂解物，将每种裂解物40μg加载到SDS PAGE上，转移到硝酸纤维素，并进行免疫印迹。在LiCor Odyssey荧光扫描仪上将使用抗SET抗体检测到的条带定量并使用β-肌动蛋白作为上样对照标准化。我们发现SET在CLL患者样品中相对于来自志愿者的正常B细胞显著过表达(p<0.05)(图16A)。通过利用定量PCR(qPCR)测定患者CLL细胞中的SET mRNA的表达水平支持了这一结果。该分析的结果显示相对于正常B细胞统计学上显著更高(p<0.05)的SET mRNA水平(图16B)。该SET过表达与患者的apoE基因型或者细胞遗传学异常无关。查阅关于CLL中SET过表达的文献显示SET在多种癌症中都是重要的因子：它在CML中过表达(Neviani et al.(2005)Cancer Cell,Vol.8:355-68)和弥散型大B细胞淋巴瘤(Nenasheva et al.(2004)Mol Biol(Mosk),Vol.38:265-75)中过表达。此外在CLL细胞的微阵列研究中有人指出了在未突变的IgVH细胞中SET的上调(Rosenwald et al.(2001)JExp Med,Vol.194:1639-47)。

为了扩展这项工作，我们还评价了伯基特淋巴瘤(一种B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL))的Raji和Ramos细胞系中SET的过表达；与CLL细胞不同，这些细胞是在增殖过程中的，能够加以遗传操作。我们用ATCC推荐的条件养这些细胞。从3个不同的培养物利用标准规程进行细胞裂解用于Western印迹和mRNA分离。从分离的mRNA合成了cDNA之后，进行qPCR来分析SET mRNA和18S引物，并将Raji和Ramos细胞中的SET表达的倍数变化对正常B细胞cDNA表达水平(标准化为1)标准化。SET表达水平在Raji细胞中高于正常B细胞10.5±0.7倍，而在Ramos细胞中为8.2±0.4倍(p<0.001)(图17A)。Western印迹也显示了在Raji和Ramos细胞中SET蛋白的水平相对于正常B细胞提取物升高(图17B)。总的来看，这些结果显示在B-CLL细胞和淋巴瘤细胞中SET的过表达可降低PP2A活性并抑制PP2A对多种信号传导途径例如Akt-NFκB途径、c-Myc癌基因、以及抗凋亡Mcl-1蛋白的调节能力，从而容许这些细胞中形成促生长、抗凋亡的癌性状态。因此，SET过表达可能对于这些细胞中癌性抗凋亡状态的维持具有关键作用，提示SET拮抗作用可能是治疗B细胞恶性肿瘤的一种创新性方法。

为了分析在癌性B细胞中降低SET活性的效果，我们利用慢病毒导入shRNA构建体来沉默Raji细胞系中的SET产生。当我们用SET特异性shRNA构建体转导细胞时，相对于非编码的对照shRNA构建体，利用MTT测定法测得的生长速率显著降低(图18)。在Western印迹中，相对于β-肌动蛋白上样对照蛋白，SET特异性shRNA构建体产生了细胞SET水平的大约50%的降低。

为了确定SET水平是否指示更快的CLL疾病进展，我们使用Western印迹来定量来自我们贮藏的435名患者中的226名的细胞提取物中的SET水平。我们创建了接受者操作曲线来确定高与非高SET水平的截止值。对于这两个组各自的第一次治疗前时间(time tofirst treatment)的分析显示了显著的差异——相对于具有较低SET水平的患者，具有最高SET水平的组显示了减少的第一次治疗前时间(图19)。这个初步结果支持了我们关于高CLL SET水平使得CLL更有攻击性的假说。

总的来说，我们的数据显示SET在CLL和NHL中相对正常B细胞过表达，并且通过降低SET在细胞中的水平拮抗其功能可抑制生长。此外，我们的结果表明来源于CLL细胞或活检NHL组织的SET的过表达的测量结果可能作为有用的生物标志用来预测哪些患者可能更早需要治疗，以及哪些患者可能受益于抗SET治疗，例如本文中描述的ApoE肽二聚体。

实施例8.ApoE肽二聚体降低抗凋亡性Mcl-1蛋白的细胞浓度

髓细胞白血病-1(MCl-1)蛋白是调节凋亡的Bcl-2家族的一个成员。该家族的成员包括抗凋亡型成员Bcl-2、Bcl-XL和Mcl-l，而促凋亡型成员包括BAD、BID、和BAX(Bugginsand Pepper(2010)Leuk Res,Vol.34:837-842)。抗凋亡型Bcl-2家族成员与促凋亡型家族成员缔合，抑制可释放细胞色素C的线粒体外膜通透化，并启动内在凋亡途径。已经证明CLL细胞过表达Bcl-2和Mcl-1(Buggins and Pepper(2010)Leuk Res,Vol.34:837-842)，而且高水平的Bcl-2和Mcl-1与患者对氟达拉滨治疗的应答不良相关(Kitada et al.(1998)Blood,Vol.91:3379-8947)。MCl-1过表达被证明缘于B细胞受体(BCR)结合(engagement)，BCR刺激可促进新生性B细胞克隆的选择(Stevenson and Caligaris-Cappio(2004)Blood,Vol.103:4389-9548)。

最近，Peppers等人测量了来自185名CLL患者的Mcl-l,Bcl-2,和BAX水平，发现具有高Mcl-1水平和低BAX水平，从而具有高的Mcl-1/BAX比的患者的第一次治疗前时间显著短于、总体存活率显著低于Mcl-1水平及Mcl-1与BAX的比例较低的患者(Pepper et al.(2008)Blood,Vol.112:3807-3817)。除了CLL之外，还有报道称在B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)患者中有Mcl-1过表达，且表达水平与肿瘤分级相关，在高等级的淋巴瘤中发现更高的表达水平(Cho-Vega et al.(2004)Hum Pathol,Vol.35:1095-1100)。总而言之，这些数据被用来提示Mcl-1是与B细胞恶性肿瘤相关的最具重要意义的抗凋亡蛋白(Gandhi etal.(2008)Blood,Vol.1 12:3538-4051)。

考虑到我们关于c-myc去稳定化的结果(见实施例5和6)，我们开始我们对Mcl-1蛋白的评估，分析c-myc的T58和S62位点附近的调节遍在蛋白化和蛋白酶体降解过程的序列，并将该序列与Mcl-1序列比较。我们观察到c-myc与在Mcl-1中的159和163位有S/T残基(对应于c-myc的T58和S62残基，如图20A中的红色箭头所示)的Mcl-1基序有独特的同源性此外，在Mcl-1的第163位有一个脯氨酸残基，对应于c-myc的脯氨酸-63(在图20A中用紫色人字箭头表示)。根据c-mys的调节区域和Mcl-1的序列之间的这种序列重叠，我们提出假说称对于Mcl-1的降解存在相似的调节机制。该机制可能依赖T163的磷酸化，然后是GSK3β介导的S159磷酸化，然后是P164处的Pin1介导的脯氨酸异构化。在脯氨酸异构化之后，T163被PP2A去磷酸化，然后pS159-Mcl-1蛋白被遍在蛋白化并由蛋白酶体降解(图20B)。此外，我们提出该调节复合物以同c-myc相同的方式使用轴蛋白作为骨架蛋白(图20B)。

为了检验这个假说，我们从人CLL细胞免疫沉淀Mcl-1，并检查Pin1、PP2A、轴蛋白和SET的免疫共沉淀(图21)。根据报道，Pin1、轴蛋白和PP2A都会与c-myc免疫共沉淀(Arnold et al.(2009)EMBO J,Vol.28:500-512)，而且我们也观察到这些蛋白中的每一种均与Mcl-1免疫共沉淀。还应当指出的是，我们在Mcl-1免疫沉淀的蛋白中观察到了SET(图21)。先前有人报道GSK3β与Mcl-1免疫共沉淀(Ding et al.(2007)Cancer Res,Vol.67:4564-4571)。根据Ding等人的报道和我们的观察结果，我们证明了图20中提出的调节复合物中的所有6种蛋白都与Mcl-1免疫共沉淀了。这些数据还提示对该复合物中的SET的拮抗作用可增加PP2A活性，容许GSK3β的去磷酸化(GSK3β的去磷酸化已被显示与Mcl-1稳定性反相关)，导致S159的磷酸化、P164异构化，和pT163去磷酸化。T163去磷酸化后，Mcl-1的遍在蛋白化和蛋白酶体降解将降低细胞中的Mcl-1水平，为激活凋亡提供条件。

我们接下来寻求确定SET拮抗作用是否会去稳定化Mcl-1。如下所述来评估SET拮抗剂处理对Mcl-1的去稳定化：用ApoE肽二聚体COG449(一种BMOE连接的COG112二聚体，见实施例2)处理原代人CLL细胞24小时，并评价细胞中Mcl-1的水平。我们观察到相对于作为上样对照的β-肌动蛋白，Mcl-1浓度发生了显著的剂量依赖性降低(图22)。该效应表明用COG449处理可诱导CLL细胞凋亡，而且我们观察到膜联蛋白-V染色的剂量依赖性增加，E50大约为110nM(数据未显示)。这些结果与实施例2中观察到的COG449及其他ApoE模拟肽对原代人CLL细胞的细胞毒效应一致。

实施例9.ApoE肽二聚体在体外和体内抑制肿瘤细胞的生长

为了评估ApoE肽二聚体COG449(见实施例2)在体内对癌细胞的效果，我们分析了COG449处理对B细胞非何杰金氏淋巴瘤伯基特淋巴瘤的Ramos细胞系的效果。Ramos细胞是过表达c-myc并在全身形成肿瘤的B细胞。在确定了COG449在培养物中以125nM的EC50抑制生长之后，将107个Ramos细胞皮下注射到雌性SCID小鼠的左胁(Schliemann et al.(2009)Blood,Vol.1 13:2275-2283)。每天通过触诊和卡尺测量监测肿瘤生长，直到肿瘤达到大约150mm³。在第11天，将小鼠分配到两个组中，使得各组之间的初始肿瘤大小大约相等。

由对处理方案不知情的技师进行肿瘤测量和COG449或溶媒对照处理(5mg/kg，皮下注射到右肩区域)。在第19天，肿瘤体积达到了预定的终止实验的大小，对动物拍照(图23)并安乐死。解剖肿瘤、称重、并切片用于病理学检查。

测量得到的肿瘤体积和最终肿瘤重量在图24中作图。使用单因素方差分析(oneway ANOVA)进行统计分析，表明肿瘤生长被COG449显著抑制，而且最终的肿瘤质量在用COG449处理的动物中显著较低(p<0.001)。对来自肿瘤的一部分的解离的细胞通过流式细胞术进行分析。该分析显示这些肿瘤细胞确实是B细胞。重要的是，该异种移植模型中肿瘤生长的显著降低显示COG449具有对于体内癌症治疗而言可接受的药理学性质。

实施例10.SET和CIP2A在三阴性乳腺癌中过表达

乳腺癌，影响妇女的最常见的癌症，是一种异质的疾病，由数种分子亚型构成(Tang et al.(2009)Diagn Mol Pathol,Vol.18(3):125-132)。基于激素受体雌激素(ER)和/或孕酮(PR)的表达模式，以及HER2受体状态，已经定义了三种主要的亚类：腔内肿瘤(ER+/HER2-)、HER2扩增肿瘤(HER2+)、以及三阴性乳腺癌(TNBC,ER-/PR-/HER2-)。基于生物学差异鉴定乳腺癌的亚类为开发靶向性治疗剂创造了条件(Di Cosimo and Baselga(2010)Nat Rev Clin Oncol,Vol.7(3):139-147)。例如，激素治疗在激素-受体阳性乳腺癌的治疗中是有效的，而HER2靶向治疗在HER2阳性肿瘤的治疗中是有用的。TNBC缺少激素受体和HER2的表达，因此对这样的靶向性治疗不敏感。TNBC以及与其分子上相关的基底型(basal-type)乳腺癌占所有侵袭性乳腺癌病例的15-20%，以其临床行为具有攻击性、化疗后复发率高，以及患者生存率差为特征(Di Cosimo and Baselga,2010;Ray and Polite(2010)Cancer J,Vol.16(1):17-22)。而且，对非洲裔美国女性罹患TNBC/基底样BC的比例异常之高，发生率高达39%(Carey et al.(2006)JAMA,Vol.295(21):2492-2502)。

对于患有这种可怕疾病的女性而言最有希望的治疗方法是使用特异性针对该疾病中活化的致癌途径、从而通常具有较低毒性的的分子靶向性药物。因此，为了开发出对这种攻击性的肿瘤类型有效的新的靶向性治疗，对于TNBC发病相关的独特的分子改变的了解是必不可少的。然而，关于与TNBC发病相关的遗传改变实际知之甚少。新近的工作描述了TNBC中多种受体酪氨酸激酶信号传导途径的异常活化，这些途径，包括EGF,HGF,FAK,FGF,VEGF和IGF-1途径等，能够上调包括Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT在内的激酶级联(Di Cosimoand Baselga,2010;Turner et al.(2009)Oncogene,Vol.29(14):2013-2023;Kurebayashi(2009)Breast Cancer，Vol.16(4):275-280)。此外，凋亡途径(包括p53,Bcl2,和Mcl-1)中的缺陷在TNBC中也是普遍存在的。

已经鉴定了数种天然存在的PP2A抑制物，包括SET(又称I₂PP2A)和细胞PP2A抑制物(CIP2A)。最近有人描述CIP2A是多种癌症类型中的重要的PP2A抑制物(Khanna et al.(2009)Cancer Inst,Vol.101(11):793-805)。它在39%的乳腺癌中过表达，并且这与临床攻击性相关(Come et al.(2009)Clin Cancer Res,Vol.15(16):5092-5100)。CIP2A过表达与Ras和c-Myc合作以促成细胞转化，而它的遏制则可抑制肿瘤生长(Sablina et al.(2008)Cancer Metastasis Rev,Vol.27(2):137-146)。已经证明CIP2A与c-Myc和PP2A相互作用并展现c-Myc稳定化活性(Junttila et al.(2007)Cell,Vol.130(1):51-62)。CIP2A似乎选择性地抑制靶向c-Myc的PP2A(Westermarck and Hahn(2008)Trends Mol Med,Vol.14(4):152-160)。磷酸化蛋白SET据报道具有普遍的PP2A抑制活性(Li et al.(1995)Biochemistry,Vol.34(6):1988-1996)。SET最初作为急性髓性白血病中的一种融合蛋白被鉴定，在多种癌症类型中上调(Westermarck and Hahn,2008)。

为了确定这些内源PP2A抑制物是否也在三阴性乳腺癌中表达，我们通过qRT-PCR评估了来自TNBC肿瘤的13份cDNA样品中的SET和CIP2A表达，发现在7/13例中有SET过表达，12/13例中有CIP2A过表达(图25A和B)。我们还考察了人三阴性乳腺癌细胞系中相对于肌动蛋白对照的SET蛋白水平，发现SET在数种乳腺癌细胞系中过表达(图26)。

ApoE模拟肽结合SET并活化PP2A(见实施例5)。我们先前发现衍生自氨基酸133-149的肽(称为COG133)通过NF-κB途径的活化降低抑制炎症和细胞因子及一氧化氮的产生(Singh et al.(2008)J Biol Chem,Vol.283(24):16752-16761)。为了研究该效应背后的机理，用生物素标记COG133并用来亲和纯化蛋白结合性配偶体。有趣的是，主要的结合配偶体是SET癌蛋白。SET是一种强PP2A抑制物(Li et al.(1996)Journal of BiologicalChemistry,Vol.271(19):1 1059-1 1062)，它被鉴定为apoE模拟肽的结合配偶体提示这些肽可能结合SET并阻止后者结合并抑制PP2A。还发现COG449，COG133的具有更好的功效和生物利用度的二聚体衍生物(见实施例2)，也可结合SET(数据未显示)。

综合起来，这些研究突出了PP2A抑制在乳腺癌中的关键作用，并且支持了利用拮抗PP2A抑制物的治疗重活化PP2A肿瘤阻遏物的创新性手段。

实施例11.借助ApoE肽二聚体的SET拮抗作用降低癌症相关性PP2A靶物的磷酸化

为了确定利用COG449，一种BMOE连接的COG112二聚体(见实施例2)进行的SET拮抗作用是否降低乳腺癌中牵涉的一种已知PP2A靶物的磷酸化，我们评估了eIF4E的状态。

先前我们证明，利用相关的COG肽拮抗SET降低了Akt的磷酸化(见实施例5)以及NFκB的活性(Singh et al,2008)。为了分析PP2A活化对mTOR途径的影响，我们分析了eIF4E的磷酸化状态，发现通过COG449处理拮抗SET导致eIF4E磷酸化的减少(图27)。综合起来，这些数据提示通过用ApoE肽二聚体靶定单一蛋白——SET，可导致三阴性乳腺癌的致瘤性生长所需要的增殖及抗凋亡状态的维持所牵涉的信号途径下调。

实施例12ApoE肽二聚体COG449在体外和体内抑制乳腺癌肿瘤细胞的生长.

在证明了BMOE连接的COG112肽二聚体COG449(见实施例2)对PP2A的活化，以及COG449对数种PP2A靶物的抑制效果之后，我们探究该肽是否具有任何抗肿瘤活性。为了确定COG449是否对人乳腺癌的治疗有效，我们用COG449处理了数种乳腺癌细胞系，发现COG449对所有细胞系，包括数种三阴性乳腺癌(TNBC)系(MDA-231,MDA-468和HCC38)均具有细胞毒性(图28)。

为了开始评估与COG449的联合治疗的潜力，我们分析了用亚致死剂量的COG449与低于其ED50剂量的浓度的多重激酶抑制剂索拉非尼(Sorafenib)或EGRF抑制剂吉非替尼(Gefitib)处理MDA-231细胞的效果。COG449与索拉非尼或吉非替尼的组合产生了稳健的细胞毒效果，大于任一种化合物单独使用的效果(图29)。我们还利用异种移植实验评估了COG449在体内的效果。为了确定COG449是否可能对异种移植物中的TNBC肿瘤有效，将MDA-231细胞注射到免疫受损的NOD/SCIDγ-链缺失(NSG)小鼠的第四乳腺中。一旦后肿瘤变得可触及(大约第10天时)，通过每周两次皮下注射10mg/kg的COG449来处理肿瘤。异种移植后第28天开始每天瘤内注射COG449，持续进行直到处死为止(图30A)。为了使用更具有临床相关性的治疗范式，每周三次用1mg/kg COG449通过静脉注射处理MDA-231异种移植小鼠(图30B)。在这两项研究的任一项中都没有观察到小鼠中的细胞毒作用。这些异种移植模型中肿瘤生长的有效抑制表明COG449具有适合癌症治疗的药理学性质。此外，我们以10-15mg/kg的剂量通过静脉内输注施用COG449，没有观察到任何不良效应。当COG449的剂量增加到20mg/kg时我们观察到前爪的轻微水肿以及嗜睡，这是与COG449施用相关的最先的不良事件。综合起来，这些数据提示在肿瘤遏制剂量与引发毒性作用的剂量之间存在宽的安全窗口。

应当理解，公开的发明不限于所描述的具体方法学、规程和试剂，因为这些是可以改变的。还应当理解本文中使用的术语仅为了描述特定的实施方案的目的，不意在限定本发明的范围，本发明的范围仅由随附的权利要求来限定。

除非另有定义，本文中使用的所有科技术语的含义与本文公开的发明所属技术领域的技术人员公知的意义相同。虽然与本文中描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料都可以用来实施或检验本发明，本文中描述了示例性的方法、装置和材料。本文明确地通过提述并入本文中引用的所有专利、专利申请及其他出版物以及通过引用它们而援引的材料的全部内容。

本领域技术人员会意识到，或者能够仅通过常规实验确定与本文中描述的本发明的特定实施方案等同的许多方案。下面的权利要求意在涵盖这些等同方案。

Claims (8)

1.一种肽二聚体，其选自以下组成的组中：

2.权利要求1的肽二聚体，其中所述双马来酰亚胺是双马来酰亚胺-乙烷或双马来酰亚胺-己烷。

3.一种药物组合物，包含有效量的权利要求1或2的肽二聚体以及可药用的载体。

4.一种肽二聚体在制造用于在有需要的受试者中治疗白血病的药物中的用途，其中所述肽二聚体选自以下组成的组中：

5.权利要求4的用途，其中所述白血病是慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、急性髓性白血病、或急性淋巴细胞性白血病。

6.权利要求4的用途，其中所述药物配制为用于与第二癌症治疗一起施用。

7.权利要求6的用途，其中所述第二癌症治疗是索拉非尼或吉非替尼。

8.权利要求4的用途，其中所述双马来酰亚胺是双马来酰亚胺-乙烷或双马来酰亚胺-己烷。