CN115925881B - 一种抑制set蛋白核质穿梭的多肽及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制SET蛋白核质穿梭的多肽及其应用,属于药物领域。该多肽来源于内源性SET蛋白的部分肽段,具体公开了该多肽的基因序列为SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2,SEQ ID NO.3,以及对应的氨基酸序列为SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6和其融合多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8,SEQ ID NO.9。该多肽可以精准靶向SET出核复合物核心蛋白XPO1,在纳摩尔浓度水平上抑制由SET蛋白出核介导的乳腺癌细胞增殖和转移,因此本发明的多肽可以作为乳腺肿瘤治疗药物的候选药物,具有潜在的药物开发价值。
Description
技术领域
本发明属药物领域,具体涉及一种抑制SET蛋白核质穿梭的多肽及其在治疗乳腺肿瘤中的应用。
背景技术
SET是在肿瘤的发生、进展、转移以及耐药等多个过程中起推动作用的重要因素,可以通过与p53、p21、Erk、Akt、ALDH2、β-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、Cytc、cyclinB-CDK1以及cyclinE-CDK2在内的多种肿瘤相关分子发生相互作用,通过一系列复杂的癌基因网络来介导肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、肿瘤干细胞样特性发生等多种过程。其过表达与急性骨髓性白血病(AML)、T细胞急性淋巴细胞白血病、头颈鳞状细胞癌、乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肝癌、结肠癌、绒毛膜癌、威氏瘤、腺泡状软组织肉瘤以及前列腺癌等多种癌症相关,目前已有多种处于临床前阶段的用于恶性肿瘤治疗的SET拮抗剂,包括FTY720、OP449、EMQA和TD-x系列。由此可见,靶向SET对多种恶性血液瘤和实体瘤的治疗具有重要意义,针对该靶点设计的药物存在巨大的临床应用价值。
SET的亚细胞定位直接影响到SET的生物学功能。SET最初被报道为主要的核蛋白。进一步的研究表明,SET分布在质膜,细胞质(主要是内质网)和细胞核中。在稳态条件下,SET蛋白的一部分(主要位于细胞核中)以明显随机的方式转移到细胞质中。在细胞扩散和分裂中也可以看到SET逃逸出细胞核。已经鉴定168KRSSQTQNKASRKR181为SET蛋白的核定位信号,其中179RKR181发挥重要作用。除核定位信号外,SETβ的亚细胞定位还受磷酸化及其酸性尾部的调控。SET可以被酪蛋白激酶II和PI3激酶c磷酸化,从而调节SET二聚化、定位和功能改变。SET的亚细胞分布不当会导致各种病理的发生,包括癌症、白血病、阿尔茨海默病和神经退行性疾病(Adachietal.1994;Qin等人2019;Saito等人2004;Zhangetal.2018)。更好地理解SET的核浆转运机制将有助于开发针对这些病理的有效治疗方法。SET定位及功能的关系在阿尔兹海默症中研究较多,研究表明,在阿尔兹海默症患者脑内SET蛋白的水平明显提高,作为一种核蛋白,SET从细胞核转移至细胞质,并被发现SET与PP2A和磷酸化的tau蛋白共定位,进一步可以导致微管退化以及神经退行等病理症状。
酸性结构的蛋白质定位在细胞核并具有不同的功能,SET酸性结构域可充当转录激活结构域或与染色质相关;同时SET是核小体组装蛋白家族成员。在氨基酸结构上,SET已经被鉴定含有两个可能的核定位信号,这些功能和结构特点或许可以解释SET蛋白被认为是一个核蛋白,如果滞留在细胞质可能影响细胞功能,进一步导致或恶化疾病进程的原因。因此抑制SET蛋白从细胞核转移至细胞质具有重大的临床和科研应用价值。
发明内容
发明目的
本发明的创新点和目的在于提供一种具有潜在医学和药学价值的抑制原癌蛋白SET出核的多肽,达到抗肿瘤增殖和转移的目的。
技术方案
一种多肽,其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。
多肽在制备SET蛋白出核抑制剂中的应用
所述的多肽在制备治疗艾尔兹海默症、肿瘤药物中的应用。
所述的应用,其特征在于所述的肿瘤为急性骨髓性白血病、头颈鳞状细胞癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、结肠癌、绒毛膜癌、威氏瘤、腺泡状软组织肉瘤以及前列腺癌的应用,其特征在于所述的乳腺癌为转移型乳腺癌。
所述的应用,其特征在于:所述乳腺癌为转移性强且SET蛋白表达量高的乳腺癌,包括HER2受体阳性乳腺癌、雌激素受体阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌。
具体来说:
一种抑制原癌蛋白SET出核的多肽,其特征在于其氨基酸序列为X-IDEVQN,IDEVQN-Y,X-IDEVQN-Y,其中X为AIEH,Y为EIDR。
一种抑制原癌蛋白SET出核的多肽,其特征在于:其氨基酸序列为TS1:SEQ IDNO.4,TS2:SEQ ID NO.5,TS3:SEQ ID NO.6。
进一步选择:
一种抑制SET蛋白出核的多肽与穿膜肽形成融合多肽,其特征在于:其氨基酸序列为OPTS1:SEQ ID NO.7,OPTS2:SEQ ID NO.8,OPTS3:SEQ ID NO.9。
其中所述穿膜肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.10。
所述的抑制SET出核的多肽的制备在治疗肿瘤增殖和转移药物中的应用。
所述肿瘤为转移性强且SET蛋白表达量高的乳腺肿瘤包括HER2受体阳性乳腺癌、雌激素受体阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌。
基因序列为
TS1:GCGATTGAACACATTGATGAAGTACAAAAT;
TS2:ATTGATGAAGTACAAAATGAAATAGACAGACTT;
TS3:GCGATTGAACACATTGATGAAGTACAAAATGAAATAGACAGACTT;
多肽序列为:
TS1:AIEHIDEVQN,如图4所示,31-40截短氨基酸序列。
TS2:IDEVQNEIDRL如图4所示,35-45截短氨基酸序列。
TS3:AIEHIDEVQNEIDRL,如图4所示,31-45截短氨基酸序列。
SET蛋白通过出核复合体核心蛋白XPO1从细胞核转位到细胞质,上述片段与SET中的相互作用域氨基酸序列相似,可以与SET蛋白竞争结合XPO1,进而实现减少SET蛋白的出核,同时SET蛋白与肿瘤增殖或转移密切相关,因而上述多肽实现抗肿瘤增殖或转移的目的。
穿膜肽序列为RQIKIWFQNRRMKWKKC;
OPTS1:RQIKIWFQNRRMKWKKCAIEHIDEVQN;
OPTS2:RQIKIWFQNRRMKWKKCIDEVQNEIDRL;
OPTS3:RQIKIWFQNRRMKWKKCAIEHIDEVQNEIDRL。
由于TS1-TS3进入细胞内能力弱,故设计加入连接穿膜肽,使其增加进入细胞的能力。
有益效果
目前关于SET蛋白亚细胞定位及定位改变对功能的影响的研究还相对较少,绝大部分研究都是在神经退行性疾病中进行。研究发现,在阿尔兹海默症患者的神经细胞中SET蛋白高表达并积聚在细胞质中抑制PP2A活性使Tau蛋白过度磷酸化,以此促进疾病进一步发生和发展。由此我们得到启示:在肿瘤细胞中SET蛋白亚细胞定位的改变对肿瘤细胞的增殖和转移是否有影响。
本发明首次发现SET蛋白通过出核复合体核心蛋白XPO1从细胞核转位到细胞质,这一亚细胞定位改变可以帮助肿瘤细胞在面对营养匮乏、冷热刺激等多种应激情况时更好的存活。同时,细胞质定位的SET蛋白会抑制PP2A活性从而激活肿瘤细胞内ERK、AKT等关于增殖和转移的信号通路。肿瘤细胞中SET蛋白从细胞核转位至细胞质促进肿瘤进展这一发现提示我们:抑制SET蛋白的出核可能是抗肿瘤的一种有效手段。基于XPO1蛋白是SET出核复合物的关键蛋白,我们试图通过抑制SET与XPO1的相互作用来实现抑制SET蛋白出核这一目的。目前现有的XPO1特异性抑制剂来普霉素虽然可以抑制SET蛋白的出核,然而该抑制剂也会引起其他蛋白包括抑癌蛋白的核积聚对正常细胞会有较大的毒性。考虑到安全性,来普霉素直接作为SET蛋白高表达肿瘤的治疗药物在临床上并不可行。
故本发明根据SET蛋白与XPO1蛋白的分子对接结果(见图3A和3B)和SET蛋白的蛋白结构进一步优化后设计了与SET蛋白竞争性结合在XPO1蛋白的SET蛋白截短体TS1、TS2和TS3(图4),从而抑制SET蛋白出核,达到抑制肿瘤增殖和转移的效果(图5)。但上述多肽的治疗效果不好,原因在于只能部分进入细胞内发挥作用。
为此发明人进一步研究,通过化学方法合成了OPTS1、OPTS2和OPTS3多肽,该多肽为穿膜肽和截短体(TS1、TS2、T23)的融合多肽,其通过穿膜肽的作用,使融合蛋白更容易进入细胞内,通过与细胞内的XPO1蛋白相互作用,竞争性抑制SET蛋白出核,进而抵抗肿瘤细胞增殖和转移。
乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下,发生增殖失控的现象。目前,乳腺癌已超越肺癌,成为全球最为常见的癌症,也成为了困扰众多女性健康的罪魁祸首之一。与其他类型的癌症一样,早期诊断可以使乳腺癌总死亡率降低20%,同时,乳腺并不是维持人体生命活动的重要器官,随着内分泌疗法的出现及外科手术技术的进步,可以通过多种方法如手术切除、化疗、放疗或联合治疗等方式获得成功,得益于此,乳腺癌患者的生存率有很大的提升。然而,接近30%的患者最后会发展成转移性疾病,癌细胞之间的连接松散,极易脱落,脱落游离后,癌细胞可随血液或者淋巴液迁移到全身后定向地根植于身体器官或组织,因此,乳腺肿瘤复发和转移是患者生存率降低的主要原因。众多研究发现,在多种乳腺癌细胞系中都明显可见SET蛋白的过表达,这使其成为乳腺癌治疗富有潜力的重要靶点。本发明采用乳腺癌为转移性强且SET蛋白表达量高的乳腺癌,包括HER2受体阳性乳腺癌、雌激素受体阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌作为研究对象,具体为HER2受体阳性乳腺癌MCF-10CA1a、雌激素受体阳性乳腺癌MCF-7和三阴性乳腺癌MDA-MB-231。由于TS1、TS2和TS3进入细胞能力弱,故采用融合多肽OPTS1、OPTS2和OPT23做进一步研究考察其抑制肿瘤增殖和转移的效果。实验结果见附图6所示,对于HER2受体阳性乳腺癌MCF-10CA1a而言,融合多肽FITC-OPTS3加入2h时其在细胞内的位置,可以发现多肽可以到达细胞核,并且主要定位于细胞核。实验结果见附图7,可以看出在MCF-10CA1a、MCF-7和MDA-MB-231三种乳腺癌细胞系中多肽OPTS3均可以有效抑制SET蛋白的核输出。MTT实验表明OPTS1、OPTS2、OPTS3上述三种细胞株IC50为达微摩尔级别。细胞划痕实验法检测多肽抑制不同肿瘤细胞迁移的结果显示,OPTS1、OPTS2、OPTS3均具有良好抑制肿瘤细胞迁移作用。
具体来说:本发明以OPTS3为例进行细胞增殖实验、细胞迁移实验和抑制细胞内SET蛋白出核实验,发现OPTS3具有抑制SET蛋白出核和抑制肿瘤增殖和转移的功能。
附图说明
图1 co-IP检测SET蛋白与XPO1蛋白的相互作用;可以发现SET蛋白与核输出蛋白XPO1存在相互作用。
图2 Westernblot检测XPO1特异性抑制剂对SET亚细胞定位的改变;结果表明抑制XPO1功能会限制SET蛋白出核。
图3预测SET蛋白与XPO1蛋白的结合位点,A为分子对接模拟图,B为对应氨基酸序列结合示意图。
图4多肽的结构图示。
图5 Westernblot检测细胞内表达PCDNA3.1-TS1、PCDNA3.1-TS2、PCDNA3.1-TS3质粒时SET亚细胞定位的改变;结果表明上述三个质粒均可以抑制SET蛋白核输出。
图6多肽在细胞内定位验证。。
图7多肽作用于肿瘤细胞对SET蛋白亚细胞定位的影响,其中A为乳腺癌MCF-10CA1a、B为乳腺癌MCF-7、C为乳腺癌MDA-MB-231;可以看出在三种乳腺癌细胞中多肽OPTS3均可以有效抑制SET蛋白的核输出。
图8多肽作用于肿瘤细胞的划痕实验结果,其中A为在OPTS1、OPTS2、OPTS3作用下MCF-10CA1a细胞的划痕创伤愈合结果、B为在OPTS1、OPTS2、OPTS3作用下MCF-7细胞的划痕创伤愈合结果、C为在OPTS1、OPTS2、OPTS3作用下MDA-MB-231细胞的划痕创伤愈合结果;结果表明多肽对于肿瘤细胞的划痕创伤愈合结果有明显抑制作用。
具体实施方式
本发明涉及的多肽由金斯瑞合成。
实施例1 SET蛋白与核输出蛋白XPO1相互作用验证。
重组质粒构建:基于plkO.1载体构建SET与Flag标签融合表达的重组质粒。选用EcoRI和AgeⅠ两种限制性内切酶对载体进行双酶切,以HEK-293T细胞cDNA为模板,采用PCR扩增出目的片段SET并在引物设计时带有Flag标签序列,采用同源重组的方法将载体和目的片段连接,随后挑选测序正确的单克隆细菌提取质粒用于转染。
待HEK-293T细胞汇合度达到70%-80%,使用Lipo2000瞬转Flag-SET融合表达质粒,转染48h后收集细胞,用预冷的PBS清洗细胞,弃尽PBS。用含蛋白酶和磷酸酶混合物的全细胞裂解缓冲液(20mMTris–HClpH7.5,150mMNaCl,1%TritonX-100,10mMNaF,2mMEDTA,1%NP-40,0.25%脱氧胆酸钠)裂解细胞(4℃,30min)。13000×g离心15min,收集上清,加入Flag抗体以及相同种属来源的对照IgG抗体。用预先中和好的ProteinA琼脂糖磁珠收集免疫沉淀,洗涤3次,在1×SDS上样缓冲液(50mMTris-HClpH6.8,0.1%溴酚蓝,5%甘油,2%SDS,0.1mM二硫代糖醇)中煮沸,进行westernblotting分析。
根据待测蛋白分子量大小配制浓度为10%的分离胶,将胶板取出安装到垂直电泳槽,在两块板中间加满电泳缓冲液,然后将尺梳拔出。保证相同量的免疫沉淀物进行加样,在合适泳道加入5μL蛋白Marker。加入电泳缓冲液没过电泳槽电极,进行恒压电泳。先使用80V恒压在浓缩胶中电泳30min,接着调整电压至100V,直到蛋白marker跑出清晰的条带,溴酚蓝跑至接近泳道底端,约60min。在4℃预冷转膜液,电泳结束后将合适大小的PVDF膜浸泡在无水甲醇中进行活化,接着将滤纸片浸泡在转膜液中,按照滤纸-PVDF膜-蛋白胶-滤纸的顺序由下而上依次铺好,每一层都要保证中间没有气泡,将湿转转膜仪装好,恒流250mA进行转膜。转膜时间根据蛋白大小不同而调整。将PVDF膜取出并剪去多余的膜,并在膜的一侧做上标记。封闭液使用1×TBST溶液配制5%脱脂奶粉,将膜放到抗体孵育盒中,加入封闭液室温摇床振摇1小时。一抗用一抗稀释液按适宜比例稀释,4℃摇床孵育过夜。将一抗溶液倒掉,1×TBST溶液清洗膜3次,每次10min。二抗用1×TBST按比例稀释,室温摇床振摇1小时。弃去二抗,并用1×TBST溶液洗3次,每次10min,在膜上均匀滴加新鲜配置的ECL发光液,用凝胶成像仪对PVDF膜进行成像,拍照分析。
实验结果见图1,免疫共沉淀实验结果显示,
细胞内SET蛋白与XPO1蛋白存在相互作用,推测SET蛋白可能通过出核复合物核心蛋白XPO1实现核输出。
实施例2检测干扰XPO1功能对SET蛋白细胞内分布的影响。
通过使用XPO1特异性抑制剂来普霉素B(LeptomycinB,LMB),分离核质蛋白后WesternBlot验证SET亚细胞定位的改变。
将MCF-10CA1a细胞以1×106接种于10cm细胞培养皿中,当细胞汇合度达60%时去除培养基,加入新的含有LMB的完全培养基预处理培养24h,收集培养基加入20μM多聚甲醛(Formaldehyde,FA)作为SET出核诱导剂,将含有FA培养基继续培养细胞20min,去除培养基,用预冷的PBS洗涤两次,吸尽PBS,用细胞刮将细胞刮下收集至离心管。
核质蛋白分离:用低渗缓冲液(20mMTris-HClpH7.4,10mMNaCl,3mMMgCl2)重悬细胞。在冰上孵育15分钟,然后加入终浓度为0.5%的NP-40。700×g离心10min,取上清为细胞质组分。用低渗缓冲液洗涤不溶物,离心弃去上清,然后用NP-40裂解缓冲液(50mMTris-HClpH7.4,150mMNaCl,1%NP-40)裂解1小时。13000×g离心10min,取上清液作为细胞核组分。采用BCA分析试剂盒(Beyotime)定量测定细胞核和细胞质蛋白浓度。在所有缓冲液中添加蛋白酶和磷酸酶混合物、1mMPMSF和0.5mM二硫苏糖醇。定量后用上样缓冲液煮沸十分钟,进行WesternBlot,具体方法如实例1中所述。
实验结果见附图2,来普霉素B(LeptomycinB),简称LMB,是一种有效的抗真菌抗生素,最初是从链霉菌中发现的。LeptomycinB是一种出核转运(nuclearexport)抑制剂,能够抑制带有出核转运序列(NES)的蛋白和RNA的出核转运,常用于研究细胞核-胞浆转运。LeptomycinB可以使穿梭于胞浆和核的蛋白如IRAK-1、NLRC5在核内聚集,另外,LeptomycinB特异地结合XPO1,从而抑制XPO1和带有的出核转运序列(NES)蛋白结合。多聚甲醛(Formaldehyde,FA)是诱导SET出核因子。图2中我们可以看出无论是在细胞正常状态下还是SET出核诱导因子FA存在的条件下,使用LMB干扰XPO1功能时都会导致SET蛋白细胞质分布减少。结合实施例1结果我们推测SET蛋白通过与出核复合物核心蛋白XPO1作用实现核输出。
实施例3根据蛋白对接以及软件预测结果。
构建pcDNA3.1-TS1、pcDNA3.1-TS2、pcDNA3.1-TS3的质粒,检测优化后的截短体竞争性结合XPO1对于SET蛋白亚细胞分布的影响。
引物设计:人工合成
TS1-FP:CACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCATGGCGATTGAACACATTG
TS1-RP:GCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTTAATTTTGTACTTCATC
TS2-FP:CACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCATGATTGATGAAGTACAAAATG
TS2-RP:CGAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTTAAAGTCTGTCTATTTC
TS3-FP:AGTCCAGTGTGGTGGAATTCATGGCGATTGAACACATTGATG
TS3-RP:GCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTTAAAGTCTGTCTATTTC
质粒构建:基于pcDNA3.1载体构建TS1、TS2、TS3质粒。选用EcoRI和EcoRⅤ两种限制性内切酶对载体进行双酶切,以HEK-293T细胞cDNA为模板,PCR扩增出目的片段,采用同源重组的方法将载体和目的片段连接,随后挑选测序正确的单克隆细菌提取质粒用于转染,转染方法见例1。蛋白提取、WestenBlot方法见实施例2。
实验结果:见图3A和3B,SET蛋白与XPO1蛋白的分子对接结果,显示SET蛋白与XPO1具有相互作用。
见图4,与SET蛋白竞争性结合在XPO1蛋白的SET蛋白截短体TS1、TS2和TS3的氨基酸序列与SET蛋白相互作用结合域序列相似,可以作为SET结合XPO1的拮抗剂。
见图5,在HEK293T中表达pcDNA3.1-TS1、pcDNA3.1-TS2、pcDNA3.1-TS3的质粒可以减少SET蛋白的细胞质分布,提高其细胞核分布,这说明设计的截短体抑制SET输出有明显效果。
实施例4 OPTS3多肽在细胞内定位验证。
前一天将培养好的肿瘤细胞MCF-10CA1a,用胰酶消化收集,用完全培养基重悬细胞计数,将细胞浓度调整为2×106个/mL,将细胞悬液接种到12孔板中,每孔100μL,并于37℃,5%CO2培养箱中培养过夜。将多肽用完全培养基稀释到预定浓度200nM加入12孔板中,在37℃,5%CO2培养箱中培养。多肽末端修饰了FITC,故可以在荧光显微镜下观察绿色荧光,同时加入DAPI用于指示细胞核。
实验结果:以OPTS3多肽为例进行细胞内定位,结果见图6所示,图6中为OPTS3多肽加入2h时其在细胞内的位置,可以发现OPTS3多肽可以到达细胞核,并且主要定位于细胞核。说明OPTS3可以穿过细胞膜进入细胞核内。
实施例5 OPTS3多肽对多种肿瘤细胞SET蛋白亚细胞定位的改变。
前一天将培养好的肿瘤细胞MCF-10CA1a、MCF-7和MDA-MB-231用胰酶消化收集,用完全培养基重悬细胞计数,将细胞悬液以1×106接种到6cm细胞培养皿中,并于37℃,5%CO2培养箱中培养过夜。将多肽用完全培养基稀释到预定浓度(200nM)加入皿中,在37℃,5%CO2培养箱中培养12h。按照例2中方法提取核质蛋白,WB验证。
实验结果见附图7,可以看出在MCF-10CA1a、MCF-7和MDA-MB-231三种乳腺癌细胞系中随着加入多肽OPTS3浓度的增加,在细胞质中SET蛋白表达量降低,而细胞核中SET蛋白含量增加,说明OPTS3可以有效抑制SET蛋白的核输出,其中HSP70作为细胞质内参,LaminB1作为细胞核内参。
实施例6采用MTT法检测多肽对乳腺肿瘤细胞增殖活性的抑制作用。
乳腺肿瘤细胞为HER2+乳腺癌细胞MCF-10CA1a,ER+乳腺癌细胞MCF-7,三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231。
将肿瘤细胞在37℃、5%CO2的培养箱中培养至密度90%以上时用胰蛋白酶消化收集,用培养液重悬细胞并在显微镜下计数,将细胞浓度调整为3.0×104个/mL,将细胞悬液接种到96孔板中,每孔100μL,并于37℃,5%CO2培养箱中培养过夜。将多肽与阳性药紫杉醇Taxol用培养液稀释到各个预定浓度。待细胞完全贴壁后,将各个稀释液分别加入96孔板中,每孔100μL。以加入多肽作为给药组,Taxol作为阳性对照组,以不加任何药物的培养液作为空白对照组,在37℃,5%CO2培养箱孵育48小时。向96孔板中每孔加入20μL5mg/mL的MTT,继续培养4小时。吸去培养基,每孔加入100μLDMSO溶解。用酶标仪在570nm下检测,参比波长为630nm处测定吸光值,并计算生长抑制率(proliferationinhibition,PI),公式如下:PI=(1-Ntest/Ncontrol)×100%
其中Ntest为测试组的OD值,Ncontrol为阴性对照组的OD值。
数据统计:
试验独立重复5次,试验得到的结果计算mean±SD,并进行统计t-test检验,P<0.05为显著性差异,P<0.01为极显著性差异。实验结果见表1。
表1 OPTS1、OPTS2、OPTS3对不同种肿瘤的IC50值
实施例7细胞划痕实验检测多肽抑制多种肿瘤细胞的迁移能力
(1)6孔板中加入2mLDMEM培养基,以1×106个/孔细胞数将肿瘤细胞接种于6孔板中,37℃5%CO2培养。
(2)次日当细胞长至80%汇合度时,去除原培养基,加入DMEM不完全培养基和多肽,多肽的终浓度分别为200nM。用200ul枪头在6孔板底部平行划线,每组3个重复孔。分别在0h、24h和48h在荧光显微镜下观察划痕愈合程度。
其中Ntest为测试组的划痕愈合程度、Ncontrol为空白对照组的划痕愈合程度。
数据统计:
试验独立重复3次,试验得到的结果计算mean±SD,并进行统计t-test检验,P<0.05为显著性差异,P<0.01为极显著性差异。实验结果见表2和附图8。
表2细胞划痕实验法检测OPTS1、OPTS2、OPTS3抑制不同肿瘤细胞迁移的结果
Claims (6)
1.一种抑制原癌蛋白SET出核的多肽,其特征在于,其氨基酸序列为X-IDEVQN、IDEVQN-Y或X-IDEVQN-Y,其中X为AIEH,Y为EIDR。
2.根据权利要求1所述的多肽,其特征在于,其氨基酸序列为SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9。
3.根据权利要求1或2所述的多肽在制备SET蛋白出核抑制剂中的应用。
4.根据权利要求1或2所述的多肽在制备治疗肿瘤药物中的应用,其中所述的肿瘤为急性骨髓性白血病、乳腺癌、肺癌、结肠癌或前列腺癌。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述的乳腺癌为转移型乳腺癌。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述乳腺癌为转移性强且SET蛋白表达量高的乳腺癌,包括HER2受体阳性乳腺癌、雌激素受体阳性乳腺癌和三阴性乳腺癌。
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