WO2018212358A1 - 脳神経疾患に対するペプチドワクチン及びペプチドワクチン組成物 - Google Patents

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WO2018212358A1
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peptide vaccine
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amino acid
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戸田　正博
亮太 田村
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Definitions

  • the present invention relates to peptide vaccines and peptide vaccine compositions for cranial nerve diseases.
  • Neuroencephalopathy includes neurofibromatosis type II (NF2), brain tumor, cerebrovascular disease, autoimmune disease, ophthalmic disease and the like.
  • NF2 is an autosomal dominant hereditary disease that develops due to a genetic abnormality of the tumor suppressor merlin present in chromosome 22 long arm 22q12.
  • the diagnosis of NF2 is confirmed by using as an index the occurrence of an acoustic nerve tumor (exactly a vestibular schwannoma) on both the left and right sides.
  • schwannoma occurs in the cranial nerve, spinal nerve, and peripheral nerve, and meningioma, ependymoma, glioma, etc.
  • Vascular Endothelial Growth Factor Receptor is a kind of receptor-type tyrosine kinase, and is known to be involved in expression of action of VEGF as a ligand.
  • VEGFR-1 In addition to three types of VEGFR, VEGFR-1, VEGFR-2, and VEGFR-3, sVEGFR-1, sVEGFR-2, and sVEGFR-3 are known as soluble VEGFR (soluble VEGFR). Of these, VEGFR-1 and VEGFR-2 are known to be expressed in vascular endothelial cells and play a central role in angiogenesis.
  • Patent No. 4931154 Japanese Patent No. 3971769
  • an object of the present invention is to provide a peptide vaccine and a peptide vaccine composition that can effectively treat cranial nerve diseases.
  • a peptide vaccine for cranial nerve disease comprising a peptide that induces cytotoxic T cells (CTL) against VEGFR-1 expressing cells or a peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells.
  • CTL cytotoxic T cells
  • VEGFR-1-expressing cells a peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells.
  • the peptide vaccine according to [1], wherein the peptide that induces CTL against VEGFR-1-expressing cells is HLA-A * 24: 02-binding.
  • the peptide that induces CTL against a VEGFR-1-expressing cell has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or one or more amino acids in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 deleted, substituted or added
  • the peptide vaccine according to [1], wherein the peptide that induces CTL against VEGFR-1-expressing cells is HLA-A * 02: 01-binding.
  • the peptide that induces CTL against VEGFR-1-expressing cells is one or more in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 2 to 4 or the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 2 to 4.
  • the peptide vaccine according to [1], wherein the peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells is HLA-A * 24: 02 binding.
  • the peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells is one or more in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 5 to 10 or the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 5 to 10.
  • the peptide vaccine according to [1], wherein the peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells is HLA-A * 02: 01-binding.
  • the peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells is one or more in the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 11 to 16 or the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 11 to 16.
  • a peptide vaccine and a peptide vaccine composition that can effectively treat cranial nerve diseases can be provided.
  • FIG. 1 A) to (e) are photographs showing the results of imaging meningioma of the patient of case 1 by head contrast MRI examination in Experimental Example 2.
  • FIG. 2 it is a graph which shows the result of having measured the volume of the meningioma on each test day based on the result of the head contrast MRI test
  • FIG. 2 A) to (e) are photographs showing the results of imaging the right and left vestibular schwannomas of the patient of Case 1 by head contrast MRI examination in Experimental Example 2.
  • (A) is a graph which shows the result of having measured the volume of the right vestibular schwannoma in each examination day based on the result of the head contrast MRI examination in example 2 of an experiment.
  • (B) is a graph which shows the result of having measured the volume of the left vestibular schwannoma on each examination day based on the head contrast MRI examination result in Experimental example 2.
  • (A) to (f) are photographs showing the results of imaging the trigeminal schwannomas of the patient in case 2 by head-enhanced MRI examination in experimental example 3.
  • it is a graph which shows the result of having measured the volume of the trigeminal schwannoma in each test day based on the result of the head contrast MRI test.
  • (A) to (f) are photographs showing the results of photographing the right and left vestibular schwannomas of the patient of Case 2 by head contrast MRI examination in Experimental Example 3.
  • (A) is a graph which shows the result of having measured the volume of the right vestibular schwannoma on each examination day based on the result of the head contrast MRI examination in example 3 of an experiment.
  • (B) is a graph which shows the result of having measured the volume of the left vestibular schwannoma on each examination day based on the head contrast MRI examination result in Experimental example 3.
  • Experimental example 2 it is a graph which shows the result of having measured the blood volume in the tumor of meningioma.
  • (A) is a graph which shows the result of having measured the blood volume in the tumor of the right vestibular schwannoma in Experimental example 2.
  • FIG. (B) is a graph showing the results of measuring the intratumoral blood volume of the left vestibular schwannomas in Experimental Example 2.
  • Experimental example 3 it is a graph which shows the result of having measured the blood volume in the tumor of a trigeminal schwannoma.
  • A) is a graph which shows the result of having measured the blood volume in the tumor of the right vestibular schwannoma in Experimental example 3.
  • FIG. (B) is a graph showing the results of measuring the intratumoral blood volume of the left vestibular schwannomas in Experimental Example 3.
  • (A) And (b) is a graph which shows the result of the speech intelligibility test done to the patient of case 2 in Experimental example 3.
  • FIG. 1 is a graph which shows the result of having measured the volume of the left vestibular schwannoma in each examination day based on the result of the head contrast MRI examination in example 4 of an experiment.
  • (B) is a graph showing the result of measuring the volume of meningioma on each examination day based on the result of the head contrast MRI examination in Experimental Example 4.
  • (A) is a graph which shows the result of having measured the intratumoral blood volume of the right vestibular schwannoma in Experimental Example 4.
  • (B) is a graph showing the results of measuring the intratumoral blood volume of the left vestibular schwannomas in Experimental Example 4.
  • (A)-(d) are photographs showing the results of imaging bilateral vestibular schwannomas of the patient of case 6 by head-enhanced MRI examination in experimental example 5.
  • (A) is a graph which shows the result of having measured the volume of the right vestibular schwannoma in each examination day based on the result of the head contrast MRI examination in example 5 of an experiment.
  • (B) is a graph which shows the result of having measured the volume of the left vestibular schwannoma on each examination day based on the result of the head contrast MRI examination in Experimental example 5.
  • FIG. (A) is the graph which shows the result of having measured the blood volume in the tumor of the right vestibular schwannoma in Experimental example 6.
  • FIG. (B) is a graph showing the results of measuring the intratumoral blood volume of the left vestibular schwannomas in Experimental Example 6.
  • (A)-(d) are photographs showing the results of imaging meningiomas of the patient of case 6 by head-enhanced MRI examination in experimental example 6.
  • it is a graph which shows the result of having measured the volume of the meningioma on each test day based on the result of the head contrast MRI test
  • In Experimental example 6 it is a graph which shows the result of having measured the blood volume in the tumor of meningioma.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of quantitative RT-PCR in Experimental Example 7.
  • A is a photomicrograph showing the results of immunostaining before administration of the peptide vaccine composition in Experimental Example 7.
  • B is a photomicrograph showing the results of immunostaining after administration of the peptide vaccine composition in Experimental Example 7.
  • A is a photomicrograph showing the results of immunostaining before administration of the peptide vaccine composition in Experimental Example 7.
  • B) is a photomicrograph showing the results of immunostaining after administration of the peptide vaccine composition in Experimental Example 7. It is a fluorescence micrograph which shows the result of the immuno-staining in Experimental example 7.
  • the present invention provides a peptide vaccine against cranial nerve disease, comprising a peptide that induces CTL against VEGFR-1-expressing cells, or a peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells.
  • the cranial nerve disease includes cranial nerve diseases involved in angiogenesis, and more specifically, tumors, brain tumors, cerebrovascular diseases, autoimmunity occurring in patients with neurofibromatosis type II (NF2) Examples include diseases and ophthalmic diseases.
  • NF2 neurofibromatosis type II
  • tumors that occur in NF2 patients include schwannomas, meningiomas, ependymomas, and gliomas.
  • schwannomas include schwannomas that occur in cranial nerves, spinal nerves, and peripheral nerves, and more specifically include vestibular schwannomas and trigeminal schwannomas.
  • Meningiomas, ependymomas, and gliomas include tumors that occur in the skull and tumors that occur in the spinal cord.
  • Brain tumors include glioma, meningioma, schwannoma, pituitary adenoma, craniopharyngioma, chordoma, ependymoma, hemangioblastoma, hemangioperiosteum, metastatic brain tumor, medulloblastoma, malignant Examples include lymphoma.
  • cerebrovascular diseases include cerebrovascular malformations and hereditary telangiectasia.
  • the autoimmune disease include optic neuromyelitis and giant cell arteritis.
  • ophthalmic diseases include age-related macular degeneration and diabetic retinopathy.
  • a cranial nerve disease can be effectively treated by administering the peptide vaccine of the present embodiment to a cranial nerve disease patient.
  • Human VEGFR-1 is a cell membrane protein consisting of 1338 amino acids. Human VEGFR-1 is a vascular endothelial growth factor receptor essential for neovascular growth and is highly expressed in tumor neovascular endothelial cells of solid tumors. Human VEGFR-2 is a cell membrane protein consisting of 1356 amino acids. Human VEGFR-2 is highly expressed in neoplastic vascular endothelial cells of solid tumors and is involved in the proliferation and migration of vascular endothelial cells.
  • the peptide vaccine of this embodiment can induce CTLs against VEGFR-1 expressing cells or VEGFR-2 expressing cells.
  • CTL induced in the patient's body by administration of the peptide vaccine of this embodiment is considered to cause tumor growth suppression by specifically destroying the blood vessels of tumors that occur in cranial nerve diseases. Furthermore, since a part of CTL persists as memory T cells, it is considered that a long-term therapeutic effect is exhibited even after completion of administration of the peptide vaccine.
  • effectively treating a tumor may be, for example, suppressing an increase in tumor volume or decreasing a tumor volume.
  • peptides can be used as peptides that induce CTLs against VEGFR-1-expressing cells and peptides that induce CTLs against VEGFR-2 expressing cells. Some known peptides have been confirmed to be safe when administered to humans in clinical trials. Such peptides are easy to apply clinically because some clinical trials can be omitted.
  • the length of the peptide may be less than about 40 amino acids, less than about 20 amino acids, or less than about 15 amino acids.
  • the length of the peptide may be 8-11 amino acids, 9 amino acids, or 10 amino acids.
  • the peptide in the peptide vaccine of this embodiment, can be prepared by a known method.
  • peptides may be prepared by recombinant DNA techniques or by chemical synthesis.
  • the peptide may have various modifications as long as it has an activity to induce CTL.
  • a sugar chain, a fatty acid, a polyalkylene glycol chain, or the like may be bound to the peptide.
  • the peptide may contain D-form amino acids.
  • the side chain of the peptide may be modified such as oxidation or phosphorylation.
  • the peptide may form a salt such as trifluoroacetate, acetate or hydrochloride.
  • human leukocyte antigen is a membrane protein also called a histocompatibility antigen and plays an important role in the immune mechanism. It is known that there are many types of HLA. In order for a peptide vaccine to function effectively, it is necessary for the peptide to have binding properties to the same type of HLA as the patient's HLA type.
  • HLA-A * 24: 02, HLA-A * 02: 01, HLA-A * 02: 06, HLA-A * 02: 07, etc. are relatively frequent especially in Japanese.
  • the peptide vaccine of the present embodiment is HLA-A * 24: 02 binding (restricted) or HLA-A * 02: 01 binding, to HLA-A * 02: 06, HLA-A * 02: 07 Can be effectively functioning in many Japanese patients.
  • the peptide that induces CTL against VEGFR-1-expressing cells may be HLA-A * 24: 02-binding or HLA-A * 02: 01-binding. Alternatively, it may be HLA-A * 02: 06 binding or HLA-A * 02: 07 binding.
  • the peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells may be HLA-A * 24: 02 binding, HLA-A * 02: 01 binding, or HLA-A. * 02: 06 binding may be used, and HLA-A * 02: 07 binding may be used.
  • HLA-A * 02: 07 binding may be used.
  • HLA-A * 24 02-binding peptide that induces CTL against VEGFR-1-expressing cells
  • HLA-A * 24: 02 binding peptides that can induce CTL against VEGFR-1-expressing cells are already known.
  • An example of such a peptide is a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 may have a mutation as long as it can induce CTL against VEGFR-1-expressing cells.
  • the peptide that induces CTL against VEGFR-1-expressing cells may be, for example, a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the number of one or more is preferably one, two or three.
  • the amino acid substitution include substitution of the second amino acid from the N-terminus with phenylalanine, tyrosine, methionine or tryptophan, and substitution of the C-terminal amino acid with phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine.
  • amino acid addition include addition of 1 to 2 amino acids at the N-terminal or C-terminal.
  • HLA-A * 02 01-binding peptide that induces CTL against VEGFR-1-expressing cells
  • HLA-A * 02: 01 binding peptides that can induce CTL against VEGFR-1-expressing cells are already known.
  • Examples of such peptides include peptides consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 2 to 4.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 2 to 4 may have a mutation as long as it can induce CTLs against VEGFR-1-expressing cells.
  • the peptide that induces CTL against VEGFR-1-expressing cells is, for example, a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 2 to 4. There may be.
  • the number of one or more is preferably one, two or three.
  • amino acid substitution include substitution of the second amino acid from the N-terminus with leucine or methionine, and substitution of the C-terminal amino acid with valine or leucine.
  • amino acid addition include addition of 1 to 2 amino acids at the N-terminal or C-terminal.
  • HLA-A * 24 02-binding peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells
  • HLA-A * 24: 02 binding peptides that can induce CTL against VEGFR-2 expressing cells are already known.
  • Examples of such a peptide include a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 5 to 10.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 5 to 10 may have a mutation as long as it can induce CTLs against VEGFR-2 expressing cells.
  • a peptide that induces CTL against a VEGFR-2 expressing cell is, for example, a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 5 to 10. There may be.
  • the number of one or more is preferably one, two or three.
  • the amino acid substitution include substitution of the second amino acid from the N-terminus with phenylalanine, tyrosine, methionine or tryptophan, and substitution of the C-terminal amino acid with phenylalanine, leucine, isoleucine, tryptophan or methionine.
  • amino acid addition include addition of 1 to 2 amino acids at the N-terminal or C-terminal.
  • HLA-A * 02 01-binding peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells
  • HLA-A * 02: 01 binding peptides that can induce CTL against VEGFR-2 expressing cells are already known.
  • Examples of such a peptide include a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 11 to 16.
  • the peptide consisting of the amino acid sequence set forth in any of SEQ ID NOs: 11 to 16 may have a mutation as long as it can induce CTLs against VEGFR-2 expressing cells.
  • the peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells is, for example, a peptide consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 11 to 16. There may be.
  • the number of one or more is preferably one, two or three.
  • amino acid substitution include substitution of the second amino acid from the N-terminus with leucine or methionine, and substitution of the C-terminal amino acid with valine or leucine.
  • amino acid addition include addition of 1 to 2 amino acids at the N-terminal or C-terminal.
  • a peptide consisting of an amino acid sequence (SEQ ID NO: 16) in which the second amino acid from the N-terminus is substituted with leucine is a suitable example.
  • CTL induced by stimulation with a peptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16 recognizes the peptide before mutation (SEQ ID NO: 12) and can be damaged.
  • the present invention provides a peptide vaccine composition for cranial nerve disease comprising the peptide vaccine described above and a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the peptide vaccine described above may be directly administered to a patient, or may be administered to a patient in the form of the peptide vaccine composition of the present embodiment.
  • the inventors have clarified that cranial nerve diseases can be effectively treated by administering the peptide vaccine composition of the present embodiment to cranial nerve disease patients.
  • the peptide vaccine composition of this embodiment may contain only one or both of a peptide that induces CTL against VEGFR-1 expressing cells and a peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells. You may do it.
  • the peptide vaccine composition of the present embodiment can be mixed with a pharmaceutically acceptable carrier and formulated by a general pharmaceutical technique.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for example, it may be formulated and administered orally in the form of tablets, capsules, elixirs, microcapsules, etc., and parenterally administered in the form of injections, suppositories, external skin preparations, etc. May be.
  • the external preparation for skin include dosage forms such as ointments and patches.
  • the pharmaceutically acceptable carrier examples include adjuvants, injection solvents, excipients, and adhesives.
  • adjuvant those generally used as adjuvants for vaccine preparations can be used without particular limitation, such as sodium hydroxide, aluminum hydroxide, calcium phosphate, aluminum phosphate, alum, pepes, carboxyvinyl polymer, etc.
  • oil-based adjuvants such as sedimentary adjuvants, liquid paraffin, lanolin, incomplete Freund's adjuvant, and complete Freund's adjuvant.
  • the solvent for injection examples thereof include physiological saline, glucose, D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride and the like. Examples include, but are not limited to, isotonic solutions containing adjuvants.
  • the solvent for injection may contain an alcohol such as ethanol; a polyalcohol such as propylene glycol or polyethylene glycol; a nonionic surfactant such as polysorbate 80 (trademark) or HCO-50.
  • those used in general preparations can be used without particular limitation, and examples thereof include, but are not limited to, starch and crystalline cellulose.
  • pressure-sensitive adhesive those used for general patches can be used without particular limitation, and examples thereof include, but are not limited to, rubber-based pressure-sensitive adhesives and silicone-based pressure-sensitive adhesives.
  • the peptide vaccine composition of the present embodiment may be administered together with an active ingredient such as another anticancer agent, or may contain an active ingredient such as another anticancer agent.
  • Administration of the peptide vaccine described above or the peptide vaccine composition of this embodiment to a patient can be performed, for example, by oral administration, intradermal administration, subcutaneous administration, intravenous injection, or the like, and may be systemic administration. May be administered locally in the vicinity of the tumor.
  • the dose can be appropriately adjusted depending on the patient's age, weight, symptoms, administration method, and the like. Usually, for an adult (body weight 60 kg), for example, 0.001 mg to 1000 mg, eg 0.001 mg to An amount to administer an active ingredient (peptide) of 1000 mg, for example, 0.1 mg to 10 mg can be mentioned.
  • the number of times the peptide vaccine or peptide vaccine composition is administered to the patient may be one, but it is preferable to administer the peptide vaccine multiple times in order to efficiently induce CTL.
  • the administration interval in the case of multiple administrations may be several days to several months, for example.
  • the invention comprises administering to a patient in need of treatment an effective amount of a peptide that induces CTL against a VEGFR-1 expressing cell, or a peptide that induces CTL against a VEGFR-2 expressing cell.
  • a method for treating cranial nerve disease is provided.
  • the present invention provides a peptide that induces CTL against VEGFR-1 expressing cells or a peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells for the treatment of cranial nerve diseases.
  • the present invention provides the use of a peptide that induces CTL against a VEGFR-1 expressing cell or a peptide that induces CTL against a VEGFR-2 expressing cell for the manufacture of a therapeutic agent for cranial nerve disease.
  • examples of the peptide that induces CTL against VEGFR-1 expressing cells and the peptide that induces CTL against VEGFR-2 expressing cells include those described above.
  • the form of the composition containing a pharmaceutically acceptable carrier may be sufficient as said peptide.
  • examples of the pharmaceutically acceptable carrier include those described above.
  • Case 1 was a 30 year old male.
  • the HLA type of the patient of case 1 was HLA-A * 24: 02.
  • Bilateral vestibular schwannoma, trigeminal schwannoma, and meningioma occurred in the cranium, and innumerable schwannomas also occurred in the spinal cord and skin. He had no hearing on both sides and was bedridden.
  • a total of 4 tumor extractions and 3 ⁇ knife irradiations were performed including intracranial and spinal cord, but it was difficult to control the growth of the tumor, and the tumor was growing year by year.
  • the peptide vaccine composition prepared in the same manner as in Experimental Example 1 was administered to the patient of Case 1.
  • peptide vaccine composition was subcutaneously administered per time around the patient's bilateral axilla or inguinal lymph node. As an initial administration, it was administered once a week and four times during one month from the start of administration. Thereafter, as a boost administration, it was administered once a month four times. According to the above administration schedule, the peptide vaccine composition was administered a total of 8 times within 5 months from the start of administration.
  • FIGS. 1 (a) to 1 (e) show the results after 8 administrations of the peptide vaccine composition.
  • arrows indicate meningiomas.
  • FIG. 2 is a graph showing the result of measuring the volume of meningioma on each examination day based on the result of the head contrast MRI examination.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of measuring the intratumoral blood volume of meningioma on each examination day based on the results of cephalographic CT examination.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition.
  • FIGS. 3 (a) to 3 (e) are photographs showing the results of imaging the right and left vestibular schwannomas of the patient of Case 1 by cephalographic MRI examination. At the top of each photo, the shooting date is listed.
  • 3 (a) and (b) are the results before administration of the peptide vaccine composition
  • FIG. 3 (c) is the result at the start of administration of the peptide vaccine composition
  • FIG. 3 (d) is the peptide vaccine composition.
  • Fig. 3 (e) shows the result after 8 administrations of the peptide vaccine composition.
  • the arrows indicate vestibular schwannomas.
  • FIG. 4 (a) is a graph showing the result of measuring the volume of the right vestibular schwannoma on each examination day based on the result of the head-enhanced MRI examination
  • FIG. It is a graph which shows the result of having measured the volume of the left vestibular schwannoma on each examination day based on the contrast MRI examination result.
  • the arrows indicate the start of administration of the vaccine composition.
  • FIG. 10A is a graph showing the results of measuring the intratumoral blood volume of the right vestibular schwannoma on each examination day based on the results of the cephalogram CT examination
  • FIG. It is a graph which shows the result of having measured the intratumoral blood volume of the left vestibular schwannoma on each examination day based on the result of the cephalogram CT examination.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition.
  • Case 2 was a 22 year old female.
  • the HLA type of the patient in case 2 was HLA-A * 24: 02.
  • Bilateral vestibular schwannomas and trigeminal schwannomas occurred, and numerous schwannomas also occurred in the spinal cord and skin.
  • three tumor extraction operations and one ⁇ knife irradiation were performed, but it was difficult to control the growth of the tumor, and the tumor gradually increased.
  • the peptide vaccine composition prepared in the same manner as in Experimental Example 1 was administered to the patient of Case 2.
  • the administration schedule and image analysis were performed in the same manner as in Experimental Example 2.
  • FIGS. 5A to 5F show the effects of administration of the peptide vaccine composition on the patient's tumor.
  • 5 (a) to 5 (f) are photographs showing the results of imaging trigeminal schwannomas of NF2 patient in Case 2 by cephalographic MRI examination. At the top of each photo, the shooting date is listed.
  • 5 (a) to (c) are the results before administration of the peptide vaccine composition
  • FIG. 5 (d) is the result at the start of administration of the peptide vaccine composition
  • FIG. 5 (e) is the peptide vaccine composition.
  • Fig. 5 (f) shows the results after 8 administrations of the peptide vaccine composition.
  • the arrows indicate trigeminal schwannomas.
  • FIG. 6 is a graph showing the results of measuring the volume of the trigeminal schwannoma on each examination day based on the results of the head contrast MRI examination.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of measuring the intratumoral blood volume of trigeminal schwannomas on each examination day based on the results of cephalometric CT examination.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition.
  • FIGS. 7A to 7F are photographs showing the results of imaging the right and left vestibular schwannomas of the patient in Case 2 by cephalographic MRI examination. At the top of each photo, the shooting date is listed. 7 (a) to (c) are the results before administration of the peptide vaccine composition, FIG. 7 (d) is the result at the start of administration of the peptide vaccine composition, and FIG. 7 (e) is the peptide vaccine composition. Fig. 7 (f) shows the results after 8 administrations of the peptide vaccine composition. In FIGS. 7A to 7F, arrows indicate vestibular schwannomas.
  • FIG. 8A is a graph showing the result of measuring the volume of the right vestibular schwannoma on each examination day based on the result of the head-enhanced MRI examination
  • FIG. It is a graph which shows the result of having measured the volume of the left vestibular schwannoma on each examination day based on the contrast MRI examination result.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition.
  • the volume of the right vestibular schwannoma which had been on an increasing trend after the start of the administration of the peptide vaccine composition, decreased by about 7% compared to the start of the administration of the peptide vaccine composition.
  • Vestibular schwannoma growth was found to have stopped.
  • FIG. 12 (a) is a graph showing the results of measuring the intratumoral blood volume of the right vestibular schwannoma on each examination day based on the results of the cephalographic CT examination
  • FIG. It is a graph which shows the result of having measured the intratumoral blood volume of the left vestibular schwannoma on each examination day based on the result of the cephalogram CT examination.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition.
  • FIGS. 13A and 13B are graphs showing the results of the speech intelligibility test performed on the patient of case 2.
  • the speech intelligibility test is a test in which a subject is made to listen to a voice to measure how much the word can be understood and how much the volume is increased to make the voice easier to understand.
  • FIG. 13 (a) shows the test results before the start of administration of the peptide vaccine composition
  • FIG. 13 (b) shows the test results after four administrations of the peptide vaccine composition.
  • the result of the speech intelligibility test was 60% at 70 dB before the start of the administration of the peptide vaccine composition, but it became possible to discriminate about 70% at 70 dB after the administration of the peptide vaccine composition four times, thereby improving hearing. was recognized.
  • Case 5 was a 41 year old female.
  • the HLA type of the patient in case 5 was HLA-A * 24: 02.
  • the right auditory schwannoma was operated at age 23. He was also re-operated at the age of 26.
  • MRI showed an increase in bilateral auditory schwannomas and meningiomas on the back of the left pyramidal bone.
  • Administration of the peptide vaccine composition prepared in the same manner as in Experimental Example 1 was started.
  • the administration schedule and image analysis were performed in the same manner as in Experimental Example 2.
  • FIG. 14 (a) to (d) are the results before administration of the peptide vaccine composition
  • FIG. 14 (e) is the result after four administrations of the peptide vaccine composition
  • FIG. 14 (f) is the peptide vaccine composition. It is the result after administration of the composition 8 times.
  • FIG. 15A is a graph showing the result of measuring the volume of the left vestibular schwannoma on each examination day based on the result of the head-enhanced MRI examination
  • FIG. It is a graph which shows the result of having measured the volume of the meningioma on each test day based on the result of a contrast MRI test.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition.
  • the volume of the left vestibular schwannoma which had been increasing until then, decreased by 34%.
  • the volume of meningioma which had been increasing until then, decreased by 10%, and thereafter showed a tendency to suppress increase.
  • FIG. 16 (a) is a graph showing the results of measuring the intratumoral blood volume of the left vestibular schwannoma on each examination day based on the results of cephalographic CT examination
  • FIG. It is a graph which shows the result of having measured the blood volume in the tumor of the meningioma on each test day based on the result of a head contrast CT test.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition. As a result, it was revealed that the blood volume in the tumor showed a tendency to decrease after administration of the peptide vaccine composition.
  • the pure tone hearing test is a test for measuring the volume of sound with seven different sounds from 125 Hz to 8,000 Hz and examining the volume of the smallest sound that can be heard. As a result, after the administration of the peptide vaccine composition 8 times, a tendency to improve left hearing was observed.
  • FIGS. 17A to 17D are photographs showing the results of imaging bilateral vestibular schwannomas of the patient of case 6 by cephalographic MRI examination. At the top of each photo, the shooting date is listed.
  • FIG. 17 (a) shows the results before the administration of the peptide vaccine composition
  • Fig. 17 (b) shows the results before the start of the administration of the peptide vaccine composition
  • Fig. 17 (c) shows the peptide vaccine composition four times.
  • FIG. 17 (d) shows the result after 8 administrations of the peptide vaccine composition.
  • FIG. 18A is a graph showing a result of measuring the volume of the right vestibular schwannoma on each examination day based on the result of the head-enhanced MRI examination
  • FIG. It is a graph which shows the result of having measured the volume of the left vestibular schwannoma on each examination day based on the result of contrast MRI examination.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition.
  • the volume of the right vestibular schwannoma which had been increasing until then, decreased by 5%.
  • the volume of the left vestibular schwannoma which had been increasing until then, decreased by 13%.
  • FIG. 19 (a) is a graph showing the results of measuring the intratumoral blood volume of the right vestibular schwannoma on each examination day based on the results of cephalographic CT examination
  • FIG. It is a graph which shows the result of having measured the intratumoral blood volume of the left vestibular schwannoma on each examination day based on the result of the cephalogram CT examination.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition. As a result, it was revealed that the intratumoral blood volume of the right vestibular schwannoma tended to decrease after administration of the peptide vaccine composition.
  • FIGS. 20A to 20D are photographs showing the results of imaging meningiomas of the patient in case 6 by cephalographic MRI examination. At the top of each photo, the shooting date is listed.
  • FIG. 20 (a) and (b) are the results before administration of the peptide vaccine composition
  • FIG. 20 (c) is the result after four administrations of the peptide vaccine composition
  • FIG. 20 (d) is the peptide vaccine. It is the result after administration of the composition 8 times.
  • FIG. 21 is a graph showing the result of measuring the volume of meningioma on each examination day based on the result of the head contrast MRI examination.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition.
  • FIG. 22 is a graph showing the results of measuring the intratumoral blood volume of meningioma on each examination date based on the results of cephalographic CT examination.
  • the arrow indicates the start of administration of the vaccine composition. As a result, it was revealed that the blood volume in the tumor of meningioma showed a tendency to decrease after administration of the peptide vaccine composition.
  • HLA-A * 02: 01-binding peptide vaccine was effective for schwannoma and meningioma in HLA-A * 02: 07 patients.
  • FIG. 23 is a graph showing the results of quantitative RT-PCR. As a result, it was revealed that the expression levels of VEGF-A, VEGFR-1, and VEGFR-2 were decreased after administration of the peptide vaccine composition.
  • CD34 expression indicates the presence of vascular endothelial cells.
  • FIG. 24 (a) and 24 (b) are micrographs showing the results of immunostaining. The magnification is 40 times.
  • FIG. 24 (a) shows the results before administration of the peptide vaccine composition
  • FIG. 24 (b) shows the results after administration of the peptide vaccine composition.
  • FOXP3-positive cells are regulatory T cells.
  • FIGS. 25 (a) and (b) are micrographs showing the results of immunostaining. The magnification is 40 times.
  • FIG. 25 (a) shows the results before administration of the peptide vaccine composition
  • FIG. 25 (b) shows the results after administration of the peptide vaccine composition.
  • arrows indicate the presence of FOXP3-positive cells.
  • FIG. 26 is a fluorescence micrograph showing the results of immunostaining.
  • Pre-vaccine indicates a result before administration of the peptide vaccine composition
  • Post-vaccine indicates a result after administration of the peptide vaccine composition
  • DAPI indicates the result of staining the nucleus with 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole
  • Merge indicates the result of synthesizing the image.
  • a peptide vaccine and a peptide vaccine composition that can effectively treat cranial nerve diseases can be provided.

Abstract

Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）－１発現細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するペプチド、又はＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドからなる、脳神経疾患に対するペプチドワクチン。

Description

脳神経疾患に対するペプチドワクチン及びペプチドワクチン組成物
　本発明は、脳神経疾患に対するペプチドワクチン及びペプチドワクチン組成物に関する。本願は、２０１７年５月１９日に、日本に出願された特願２０１７－１００３６１号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　脳神経疾患には、神経線維腫症ＩＩ型（ＮＦ２）、脳腫瘍、脳血管疾患、自己免疫疾患、眼科疾患等が存在する。例えば、ＮＦ２は、第２２番染色体長腕２２ｑ１２に存在する腫瘍抑制因子ｍｅｒｌｉｎの遺伝子異常により発症する常染色体優性の遺伝性疾患である。ＮＦ２は、左右両側に聴神経腫瘍（正確には前庭神経鞘腫）が発生することを指標として診断が確定される。ＮＦ２では多数の腫瘍が発生する。具体的には、脳神経、脊髄神経、末梢神経に神経鞘腫が発生し、更に、頭蓋内や脊髄に髄膜腫、上衣腫、神経膠腫等が発生する。ＮＦ２の発症は、１０～２０歳代で多く、進行が速く、難聴、半身麻痺等をきたし、頭蓋内腫瘍の成長を制御できない場合には生命の危険性も高い。
　現在、ＮＦ２の治療は、手術による腫瘍摘出と定位放射線治療により行われている。しかしながら、ＮＦ２患者の神経鞘腫は出血性腫瘍であるため、手術では周囲神経が損傷される可能性が高く、特に多発腫瘍に対しては積極的に手術を行うことができない。また小さい腫瘍に対しては放射線治療も有効であるが、長期制御は困難なことが多く、悪性転化のリスクもある。
　ところで、Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）は、受容体型チロシンキナーゼの一種であり、リガンドであるＶＥＧＦの作用発現に関与することが知られている。
　ＶＥＧＦＲには、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２、ＶＥＧＦＲ－３の３種類に加えて、可溶性ＶＥＧＦＲ（ｓｏｌｕｂｌｅ　ＶＥＧＦＲ）として、ｓＶＥＧＦＲ－１、ｓＶＥＧＦＲ－２、ｓＶＥＧＦＲ－３が知られている。これらのうち、ＶＥＧＦＲ－１及びＶＥＧＦＲ－２は、血管内皮細胞に発現し、血管新生において中心的な役割を担っていることが知られている。
　これまでに、ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するペプチドや、ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドが開発されてきた（例えば、特許文献１、２を参照。）。
特許第４９３１１５４号 特許第３９７１７６９号
　特許文献１、２等に記載されたＶＥＧＦＲの部分ペプチドを、ペプチドワクチンとして癌の治療に応用する研究が行われている。しかしながら、例えば、ＶＥＧＦＲ－２の部分ペプチドの、再発の膵臓癌を対象とした第ＩＩＩ相臨床試験では、その有効性が確認されなかった。癌は成長速度が速く、ほとんどの場合、抗癌剤投与により免疫が抑制されているなど、ペプチドワクチンを癌治療に応用することは容易ではない。
　このような状況のもと、本発明は、脳神経疾患を効果的に治療することができるペプチドワクチン及びペプチドワクチン組成物を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
［１］ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するペプチド、又はＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドからなる、脳神経疾患に対するペプチドワクチン。
［２］ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２結合性である、［１］に記載のペプチドワクチン。
［３］ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、［２］に記載のペプチドワクチン。
［４］ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合性である、［１］に記載のペプチドワクチン。
［５］ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、配列番号２～４のいずれかに記載のアミノ酸配列、又は配列番号２～４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、［４］に記載のペプチドワクチン。
［６］ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６結合性又はＨＬＡ－Ａ＊０２：０７結合性である、［１］に記載のペプチドワクチン。
［７］ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２結合性である、［１］に記載のペプチドワクチン。
［８］ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、配列番号５～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列、又は配列番号５～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、［７］に記載のペプチドワクチン。
［９］ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合性である、［１］に記載のペプチドワクチン。
［１０］ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、配列番号１１～１６のいずれかに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１１～１６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、［９］に記載のペプチドワクチン。
［１１］ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６結合性又はＨＬＡ－Ａ＊０２：０７結合性である、［１］に記載のペプチドワクチン。
［１２］前記脳神経疾患が神経線維腫症ＩＩ型である、［１］～［１１］のいずれかに記載のペプチドワクチン。
［１３］［１］～［１２］のいずれかに記載のペプチドワクチンと、薬学的に許容される担体とを含有する、ＮＦ２患者に発生する腫瘍に対するペプチドワクチン組成物。
　本発明によれば、脳神経疾患を効果的に治療することができるペプチドワクチン及びペプチドワクチン組成物を提供することができる。
（ａ）～（ｅ）は、実験例２において、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例１の患者の髄膜腫を撮影した結果を示す写真である。 実験例２において、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における髄膜腫の体積を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｅ）は、実験例２において、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例１の患者の右側及び左側の前庭神経鞘腫を撮影した結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例２において、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における右側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例２において、頭部造影ＭＲＩ検査結果に基づいて、各検査日における左側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｆ）は、実験例３において、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例２の患者の三叉神経鞘腫を撮影した結果を示す写真である。 実験例３において、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における三叉神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｆ）は、実験例３において、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例２の患者の右側及び左側の前庭神経鞘腫を撮影した結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例３において、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における右側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例３において、頭部造影ＭＲＩ検査結果に基づいて、各検査日における左側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフである。 実験例２において、髄膜腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例２において、右側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例２において、左側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。 実験例３において、三叉神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例３において、右側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例３において、左側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）及び（ｂ）は、実験例３において、症例２の患者に行った語音明瞭度試験の結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｆ）は、実験例４において、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例５の患者の左側前庭神経鞘腫及び髄膜腫を撮影した結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例４において、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における左側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例４において、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における髄膜腫の体積を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例４において、右側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例４において、左側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｄ）は、実験例５において、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例６の患者の両側前庭神経鞘腫を撮影した結果を示す写真である。 （ａ）は、実験例５において、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における右側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例５において、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における左側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例６において、右側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、実験例６において、左側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。 （ａ）～（ｄ）は、実験例６において、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例６の患者の髄膜腫を撮影した結果を示す写真である。 実験例６において、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における髄膜腫の体積を測定した結果を示すグラフである。 実験例６において、髄膜腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。 実験例７における定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。 （ａ）は、実験例７におけるペプチドワクチン組成物の投与前の免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例７におけるペプチドワクチン組成物の投与後の免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。 （ａ）は、実験例７におけるペプチドワクチン組成物の投与前の免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。（ｂ）は、実験例７におけるペプチドワクチン組成物の投与後の免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。 実験例７における免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。
［ペプチドワクチン］
　１実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド、又はＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドからなる、脳神経疾患に対するペプチドワクチンを提供する。
　本明細書において、脳神経疾患としては、血管新生に関与する脳神経疾患が挙げられ、より具体的には、神経線維腫症ＩＩ型（ＮＦ２）患者に発生する腫瘍、脳腫瘍、脳血管疾患、自己免疫疾患、眼科疾患等が挙げられる。
　ＮＦ２患者に発生する腫瘍としては、神経鞘腫、髄膜腫、上衣腫、神経膠腫等が挙げられる。神経鞘腫としては、脳神経、脊髄神経、末梢神経に発生する神経鞘腫が挙げられ、より具体的には、前庭神経鞘腫、三叉神経鞘腫等が挙げられる。また、髄膜腫、上衣腫、神経膠腫としては、頭蓋内に生じる腫瘍や脊髄に生じる腫瘍が挙げられる。
　また、脳腫瘍としては、神経膠腫、髄膜腫、神経鞘腫、下垂体腺腫、頭蓋咽頭腫、脊索腫、上衣腫、血管芽腫、血管周皮腫、転移性脳腫瘍、髄芽腫、悪性リンパ腫等が挙げられる。また、脳血管疾患としては、脳血管奇形、遺伝性毛細血管拡張症等が挙げられる。また、自己免疫疾患としては、視神経脊髄炎、巨細胞性動脈炎等が挙げられる。また、眼科疾患としては、加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症等が挙げられる。
　例えば、神経鞘腫や髄膜腫が頭蓋内に発生した場合、患者の生命にかかわる。しかしながら、従来、このような腫瘍の有効な治療法は存在しなかった。
　これに対し、実施例において後述するように、発明者らは、脳神経疾患患者に本実施形態のペプチドワクチンを投与することにより、脳神経疾患を効果的に治療することができることを明らかにした。
　ヒトＶＥＧＦＲ－１は、１３３８アミノ酸からなる細胞膜タンパク質である。ヒトＶＥＧＦＲ－１は、新生血管の増殖に不可欠な血管内皮細胞増殖因子受容体であり、固形腫瘍の腫瘍新生血管内皮細胞で高発現している。また、ヒトＶＥＧＦＲ－２は、１３５６アミノ酸からなる細胞膜タンパクである。ヒトＶＥＧＦＲ－２は、固形腫瘍の腫瘍新生血管内皮細胞で高発現しており、血管内皮細胞の増殖と遊走に関与している。
　本実施形態のペプチドワクチンは、ＶＥＧＦＲ－１発現細胞又はＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる。本実施形態のペプチドワクチンの投与により患者の体内で誘導されたＣＴＬは、脳神経疾患において発生する腫瘍の血管を特異的に破壊して腫瘍増殖抑制をもたらすと考えられる。さらに、ＣＴＬの一部はメモリーＴ細胞となって持続するため、ペプチドワクチンの投与完了後においても長期の治療効果が奏されるものと考えられる。
　本明細書において、腫瘍を効果的に治療するとは、例えば、腫瘍体積の増大を抑制することであってもよく、腫瘍体積を減少させることであってもよい。
　ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド、ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドとしては、既知のものを用いることができる。既知のペプチドには、臨床試験によりヒトに投与した場合の安全性が確認されたものが存在する。このようなペプチドは、臨床試験を一部省略することが可能であるため臨床応用しやすい。
　本実施形態のペプチドワクチンにおいて、ペプチドの長さは、約４０アミノ酸未満であってもよく、約２０アミノ酸未満であってもよく、約１５アミノ酸未満であってもよい。例えば、ペプチドの長さは８～１１アミノ酸であってもよく、９アミノ酸であってもよく、１０アミノ酸であってもよい。
　本実施形態のペプチドワクチンにおいて、ペプチドは既知の方法により調製することができる。例えば、ペプチドは、組換えＤＮＡ技術により調製してもよいし、化学合成により調製してもよい。
　また、ペプチドは、ＣＴＬを誘導する活性を有している限り、各種の修飾を有していてもよい。具体的には、例えば、ペプチドに、糖鎖、脂肪酸、ポリアルキレングリコール鎖等が結合されていてもよい。あるいは、ペプチドにＤ体のアミノ酸が含まれていてもよい。あるいは、ペプチドの側鎖が、酸化、リン酸化等の修飾を受けていてもよい。あるいは、ペプチドが、トリフルオロ酢酸塩、酢酸塩、塩酸塩等の塩を形成していてもよい。
　ところで、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）は組織適合性抗原とも呼ばれる膜タンパク質であり、免疫機構において重要な役割を担っている。ＨＬＡには多数の型が存在することが知られている。ペプチドワクチンが効果的に機能するためには、ペプチドが患者のＨＬＡ型と同じ型のＨＬＡに結合性を有する必要がある。
　中でも、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０７等のＨＬＡ型を有するヒトは特に日本人において比較的頻度が高い。本実施形態のペプチドワクチンは、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２結合性（拘束性）又はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合性であり、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０７への結合性も予想されることから、多くの日本人患者において効果的に機能することができる。
　したがって、本実施形態のペプチドワクチンにおいて、ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドは、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２結合性であってもよいし、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合性であってもよいし、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６結合性であってもよいし、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０７結合性であってもよい。また、ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドは、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２結合性であってもよいし、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合性であってもよいし、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６結合性であってもよいし、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０７結合性であってもよい。以下、本実施形態のペプチドワクチンに用いることができるより具体的なペプチドについて説明する。
（ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するＨＬＡ－Ａ＊２４：０２結合性のペプチド）
　ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２結合性のペプチドはすでに知られている。このようなペプチドとしては、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
　ここで、配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる限り変異を有していてもよい。ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドは、例えば、配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
　ここで、１又は複数個とは、１個、２個又は３個であることが好ましい。アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンへの置換が挙げられる。また、アミノ酸の付加として、Ｎ末端又はＣ末端への１～２個のアミノ酸の付加が挙げられる。
（ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合性のペプチド）
　ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合性のペプチドはすでに知られている。このようなペプチドとしては、例えば、配列番号２～４に記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
　ここで、配列番号２～４のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる限り変異を有していてもよい。ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドは、例えば、配列番号２～４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
　ここで、１又は複数個とは、１個、２個又は３個であることが好ましい。アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のロイシン又はメチオニンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のバリン又はロイシンへの置換が挙げられる。また、アミノ酸の付加として、Ｎ末端又はＣ末端への１～２個のアミノ酸の付加が挙げられる。
（ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するＨＬＡ－Ａ＊２４：０２結合性のペプチド）
　ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２結合性のペプチドはすでに知られている。このようなペプチドとしては、例えば、配列番号５～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
　ここで、配列番号５～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる限り変異を有していてもよい。ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドは、例えば、配列番号５～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
　ここで、１又は複数個とは、１個、２個又は３個であることが好ましい。アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のフェニルアラニン、チロシン、メチオニン又はトリプトファンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、トリプトファン又はメチオニンへの置換が挙げられる。また、アミノ酸の付加として、Ｎ末端又はＣ末端への１～２個のアミノ酸の付加が挙げられる。
（ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合性のペプチド）
　ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合性のペプチドはすでに知られている。このようなペプチドとしては、例えば、配列番号１１～１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドが挙げられる。
　ここで、配列番号１１～１６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるペプチドは、ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導することができる限り変異を有していてもよい。ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドは、例えば、配列番号１１～１６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるペプチドであってもよい。
　ここで、１又は複数個とは、１個、２個又は３個であることが好ましい。アミノ酸の置換として、Ｎ末端から２番目のアミノ酸のロイシン又はメチオニンへの置換、Ｃ末端のアミノ酸のバリン又はロイシンへの置換が挙げられる。また、アミノ酸の付加として、Ｎ末端又はＣ末端への１～２個のアミノ酸の付加が挙げられる。
　例えば、配列番号１２に記載のアミノ酸配列において、Ｎ末端から２番目のアミノ酸をロイシンに置換したアミノ酸配列（配列番号１６）からなるペプチドは好適な例である。例えば、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチドによる刺激に誘導されるＣＴＬは、変異前のペプチド（配列番号１２）を認識し、傷害することができることが確認されている。
［ペプチドワクチン組成物］
　１実施形態において、本発明は、上述したペプチドワクチンと、薬学的に許容される担体とを含有する、脳神経疾患に対するペプチドワクチン組成物を提供する。
　上述したペプチドワクチンは、直接患者に投与してもよいし、本実施形態のペプチドワクチン組成物の形態で患者に投与してもよい。実施例において後述するように、発明者らは、脳神経疾患患者に本実施形態のペプチドワクチン組成物を投与することにより、脳神経疾患を効果的に治療することができることを明らかにした。
　本実施形態のペプチドワクチン組成物は、ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド、及びＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドの、一方のみを含有していてもよいし、双方を含有していてもよい。
　本実施形態のペプチドワクチン組成物は、薬学的に許容される担体と混合して、一般的な製薬手法により製剤化することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤等の形態に製剤化して経口的に投与してもよく、注射剤、坐剤、皮膚外用剤等の形態に製剤化して非経口的に投与してもよい。皮膚外用剤としては、軟膏剤、貼付剤等の剤型が挙げられる。
　薬学的に許容される担体としては、アジュバント、注射用溶剤、賦形剤、粘着剤等が挙げられる。アジュバントとしては、ワクチン製剤のアジュバントとして一般的に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化アルミニウム、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン、ペペス、カルボキシビニルポリマー等の沈降性アジュバント、流動パラフィン、ラノリン、不完全型フロイントアジュバント、完全型フロイントアジュバント等の油性アジュバント等が挙げられるがこれらに限定されない。
　注射用溶剤としては、注射剤に一般的に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、生理食塩水、ブドウ糖、Ｄ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウム等の補助薬を含む等張液等が挙げられるがこれらに限定されない。注射用溶剤は、エタノール等のアルコール；プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等のポリアルコール；ポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ－５０等の非イオン性界面活性剤等を含有していてもよい。
　賦形剤としては、一般的な製剤に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、デンプン、結晶性セルロース等が挙げられるがこれらに限定されない。
　粘着剤としては、一般的な貼付剤等に使用されるものを特に限定なく使用することができ、例えば、ゴム系粘着剤、シリコーン系粘着剤等が挙げられるがこれらに限定されない。
　本実施形態のペプチドワクチン組成物は、他の抗癌剤等の有効成分と共に投与されてもよいし、他の抗癌剤等の有効成分を含有していてもよい。
　上述したペプチドワクチン又は本実施形態のペプチドワクチン組成物の患者への投与は、例えば、経口投与、皮内投与、皮下投与、静脈注射等により行うことができ、全身投与であってもよく、目的となる腫瘍の近傍に局所投与してもよい。
　また、投与量は、患者の年齢、体重、症状、投与方法等により適宜調整することができ、通常成人（体重６０ｋｇ）においては、１回あたり、例えば０．００１ｍｇ～１０００ｍｇ、例えば０．００１ｍｇ～１０００ｍｇ、例えば０．１ｍｇ～１０ｍｇの有効成分（ペプチド）を投与する量が挙げられる。
　ペプチドワクチン又はペプチドワクチン組成物の患者への投与回数は、１回であってもよいが、効率的にＣＴＬを誘導するためには複数回投与することが好ましい。複数回投与する場合の投与間隔は、例えば数日から数か月であってもよい。
［その他の実施形態］
　１実施形態において、本発明は、ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド、又はＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドの有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、脳神経疾患の治療方法を提供する。
　１実施形態において、本発明は、脳神経疾患の治療のための、ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド、又はＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドを提供する。
　１実施形態において、本発明は、脳神経疾患の治療薬を製造するための、ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド、又はＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドの使用を提供する。
　これらの各実施形態において、ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチド、及びＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドとしては、上述したものが挙げられる。また、上記のペプチドは、薬学的に許容される担体を含む組成物の形態であってもよい。薬学的に許容される担体としては、上述したものが挙げられる。
　次に実験例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実験例に限定されるものではない。
［実験例１］
（ペプチドワクチン組成物の調製）
　配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるペプチド２ｍｇと、配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるペプチド２ｍｇと、不完全フロイントアジュバント（型式「ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ　ＩＳＡ５１」、ＳＥＰＰＩＣ社）１ｍＬとを混合してエマルジョン化し、ペプチドワクチン組成物２ｍＬを調製した。
［実験例２］
（症例１の患者へのペプチドワクチン組成物の投与）
　症例１の患者は、３０歳の男性であった。症例１の患者のＨＬＡ型はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２であった。頭蓋内に両側前庭神経鞘腫、三叉神経鞘腫及び髄膜腫を生じており、脊髄や皮膚にも無数に神経鞘腫が生じていた。両側の聴力は既に全くなく、寝たきりの状態であった。頭蓋内や脊髄を含めて、計４回の腫瘍摘出術及び３回のγナイフ照射を行ったが、腫瘍の増大を制御することは困難であり、腫瘍は年々増大していた。症例１の患者に、実験例１と同様にして調製したペプチドワクチン組成物の投与を行った。
（投与スケジュール）
　患者の両側腋窩又は鼠径リンパ節周囲に、１回あたりペプチドワクチン組成物１ｍＬを皮下投与した。初期投与として、投与開始から１ヶ月の間に、１週間に１回、４回投与した。その後、ブースト投与として、１ヶ月に１回、４回投与した。以上の投与スケジュールにより、投与開始から５か月間で、ペプチドワクチン組成物を合計８回投与した。
（画像解析）
　頭部造影ＭＲＩ検査により、ペプチドワクチン組成物の投与が患者の腫瘍に与える影響を検討した。図１（ａ）～（ｅ）は、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例１の患者の髄膜腫を撮影した結果を示す写真である。各写真の上部には撮影日が記載されている。図１（ａ）及び（ｂ）はペプチドワクチン組成物の投与前の結果であり、図１（ｃ）はペプチドワクチン組成物の投与開始時の結果であり、図１（ｄ）はペプチドワクチン組成物を４回投与後の結果であり、図１（ｅ）はペプチドワクチン組成物を８回投与後の結果である。図１（ａ）～（ｅ）中、矢印は髄膜腫を示す。
　また、図２は、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における髄膜腫の体積を測定した結果を示すグラフである。図２中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。
　その結果、ペプチドワクチン組成物を８回投与後には、それまで増大傾向であった頭蓋内の多数の腫瘍の成長が止まったことが明らかとなった。また、ペプチドワクチン組成物を８回投与後の髄膜腫の体積は、ペプチドワクチン組成物の投与開始時と比較して約１０％減少したことが明らかとなった。
　また、図９は、頭部造影ＣＴ検査の結果に基づいて、各検査日における髄膜腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。図９中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。その結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、腫瘍内血液量が減少したことが明らかとなった。
　また、図３（ａ）～（ｅ）は、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例１の患者の右側及び左側の前庭神経鞘腫を撮影した結果を示す写真である。各写真の上部には撮影日が記載されている。図３（ａ）及び（ｂ）はペプチドワクチン組成物の投与前の結果であり、図３（ｃ）はペプチドワクチン組成物の投与開始時の結果であり、図３（ｄ）はペプチドワクチン組成物を４回投与後の結果であり、図３（ｅ）はペプチドワクチン組成物を８回投与後の結果である。図３（ａ）～（ｅ）中、矢印は前庭神経鞘腫を示す。
　また、図４（ａ）は、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における右側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフであり、図４（ｂ）は、頭部造影ＭＲＩ検査結果に基づいて、各検査日における左側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフである。図４（ａ）及び（ｂ）中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。
　その結果、ペプチドワクチン組成物の投与開始後は、それまで増大傾向であった右側及び左側の前庭神経鞘腫の増大がいずれも抑制されたことが明らかとなった。また、ペプチドワクチン組成物を８回投与後の右側及び左側の前庭神経鞘腫の体積は、ペプチドワクチン組成物の投与開始時と比較していずれも約１０％減少したことが明らかとなった。
　また、図１０（ａ）は、頭部造影ＣＴ検査の結果に基づいて、各検査日における右側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフであり、図１０（ｂ）は、頭部造影ＣＴ検査の結果に基づいて、各検査日における左側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。図１０（ａ）及び（ｂ）中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。その結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、腫瘍内血液量が減少したことが明らかとなった。
［実験例３］
（症例２の患者へのペプチドワクチン組成物の投与）
　症例２の患者は、２２歳の女性であった。症例２の患者のＨＬＡ型はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２であった。聴力障害をきっかけにＮＦ２と診断された。両側前庭神経鞘腫、三叉神経鞘腫が生じており、脊髄や皮膚にも多数の神経鞘腫が生じていた。右の聴力は既に無く、左は補聴器をつけて何とか会話ができるレベルであったが、徐々に聴力が低下していた。過去に３回の腫瘍摘出術と、１回のγナイフ照射を行ったが、腫瘍の増大を制御することは困難であり、腫瘍は徐々に増大していた。
　症例２の患者に、実験例１と同様にして調製したペプチドワクチン組成物の投与を行った。投与スケジュール及び画像解析は実験例２と同様にして行った。
（画像解析）
　頭部造影ＭＲＩ検査により、ペプチドワクチン組成物の投与が患者の腫瘍に与える影響を検討した。図５（ａ）～（ｆ）は、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例２のＮＦ２患者の三叉神経鞘腫を撮影した結果を示す写真である。各写真の上部には撮影日が記載されている。図５（ａ）～（ｃ）はペプチドワクチン組成物の投与前の結果であり、図５（ｄ）はペプチドワクチン組成物の投与開始時の結果であり、図５（ｅ）はペプチドワクチン組成物を４回投与後の結果であり、図５（ｆ）はペプチドワクチン組成物を８回投与後の結果である。図５（ａ）～（ｆ）中、矢印は三叉神経鞘腫を示す。
　また、図６は、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における三叉神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフである。図６中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。
　その結果、ペプチドワクチン組成物の投与開始後は、それまで増大傾向であった三叉神経鞘腫の成長が止まったことが明らかとなった。また、ペプチドワクチン組成物を８回投与後の三叉神経鞘腫の体積は、ペプチドワクチン組成物の投与開始時と比較して約１４％減少したことが明らかとなった。
　また、図１１は、頭部造影ＣＴ検査の結果に基づいて、各検査日における三叉神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。図１１中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。その結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、腫瘍内血液量が減少したことが明らかとなった。
　また、図７（ａ）～（ｆ）は、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例２の患者の右側及び左側の前庭神経鞘腫を撮影した結果を示す写真である。各写真の上部には撮影日が記載されている。図７（ａ）～（ｃ）はペプチドワクチン組成物の投与前の結果であり、図７（ｄ）はペプチドワクチン組成物の投与開始時の結果であり、図７（ｅ）はペプチドワクチン組成物を４回投与後の結果であり、図７（ｆ）はペプチドワクチン組成物を８回投与後の結果である。図７（ａ）～（ｆ）中、矢印は前庭神経鞘腫を示す。
　また、図８（ａ）は、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における右側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフであり、図８（ｂ）は、頭部造影ＭＲＩ検査結果に基づいて、各検査日における左側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフである。図８（ａ）及び（ｂ）中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。
　その結果、ペプチドワクチン組成物の投与開始後は、それまで増大傾向であった右側の前庭神経鞘腫の体積は、ペプチドワクチン組成物の投与開始時と比較して約７％減少し、左側の前庭神経鞘腫の成長は止まったことが明らかとなった。
　また、図１２（ａ）は、頭部造影ＣＴ検査の結果に基づいて、各検査日における右側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフであり、図１２（ｂ）は、頭部造影ＣＴ検査の結果に基づいて、各検査日における左側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。図１２（ａ）及び（ｂ）中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。その結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、腫瘍内血液量が減少したことが明らかとなった。
　また、図１３（ａ）及び（ｂ）は、症例２の患者に行った語音明瞭度試験の結果を示すグラフである。語音明瞭度試験とは、被験者に音声を聞かせて、どのくらい言葉が理解できるのか、また、どのくらい音量を上げたら音声を理解しやすくなるのかを測定する試験である。図１３（ａ）はペプチドワクチン組成物の投与開始前の試験結果であり、図１３（ｂ）はペプチドワクチン組成物を４回投与後の試験結果である。
　語音明瞭度試験の結果は、ペプチドワクチン組成物の投与開始前は７０ｄＢで６０％であったが、ペプチドワクチン組成物を４回投与後には７０ｄＢで７０％程度判別できるようになり、聴力の改善が認められた。
　更に、血液中のＶＥＧＦＲ－１及びＶＥＧＦＲ－２特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の反応をＥＬＩＳＰＯＴ法により解析した結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、ＶＥＧＦＲ－１及びＶＥＧＦＲ－２に対するＣＴＬが誘導されたことが確認された。
［実験例４］
（症例５の患者へのペプチドワクチン組成物の投与）
　症例５の患者は、４１歳の女性であった。症例５の患者のＨＬＡ型はＨＬＡ－Ａ＊２４：０２であった。２３歳で両側聴神経鞘腫を発症し、ＮＦ２と診断された。右側聴神経鞘腫は２３歳時に手術した。更に２６歳時にも再手術した。右の聴力は術後低下し、左の聴力も低下傾向となった。２０１５年３月のＭＲＩで両側聴神経鞘腫、左錐体骨後面の髄膜腫は増大傾向を示した。実験例１と同様にして調製したペプチドワクチン組成物の投与を開始した。投与スケジュール及び画像解析は実験例２と同様にして行った。
（画像解析）
　頭部造影ＭＲＩ検査により、ペプチドワクチン組成物の投与が患者の腫瘍に与える影響を検討した。図１４（ａ）～（ｆ）は、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例５の患者の左側前庭神経鞘腫及び髄膜腫を撮影した結果を示す写真である。各写真の上部には撮影日が記載されている。
　図１４（ａ）～（ｄ）はペプチドワクチン組成物の投与前の結果であり、図１４（ｅ）はペプチドワクチン組成物を４回投与後の結果であり、図１４（ｆ）はペプチドワクチン組成物を８回投与後の結果である。
　また、図１５（ａ）は、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における左側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフであり、図１５（ｂ）は、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における髄膜腫の体積を測定した結果を示すグラフである。図１５（ａ）及び（ｂ）中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。
　その結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、それまで増大傾向であった左側前庭神経鞘腫の体積は３４％減少した。また、それまで増大傾向であった髄膜腫の体積は１０％減少し、その後も増大抑制傾向を示した。
　また、図１６（ａ）は、頭部造影ＣＴ検査の結果に基づいて、各検査日における左側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフであり、図１６（ｂ）は、頭部造影ＣＴ検査の結果に基づいて、各検査日における髄膜腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。図１６（ａ）及び（ｂ）中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。その結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、腫瘍内血液量が低下傾向を示したことが明らかとなった。
　また、症例５の患者に純音聴力試験を行った。純音聴力試験は、１２５Ｈｚ～８，０００Ｈｚまでの７種類の高さの異なる音に対する聴力を測定し、聞こえる最も小さな音の大きさを調べる試験である。その結果、ペプチドワクチン組成物を８回投与後に、左聴力の改善傾向が認められた。
　更に、血液中のＶＥＧＦＲ－１及びＶＥＧＦＲ－２特異的な細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の反応をＥＬＩＳＰＯＴ法により解析した結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、ＶＥＧＦＲ－１及びＶＥＧＦＲ－２に対するＣＴＬが誘導されたことが確認された。
［実験例５］
（ペプチドワクチン組成物の調製）
　配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるペプチド２ｍｇと、配列番号１６に記載のアミノ酸配列からなるペプチド２ｍｇと、不完全フロイントアジュバント（型式「ＭＯＮＴＡＮＩＤＥ　ＩＳＡ５１」、ＳＥＰＰＩＣ社）１ｍＬとを混合してエマルジョン化し、ペプチドワクチン組成物２ｍＬを調製した。
［実験例６］
（症例６の患者へのペプチドワクチン組成物の投与）
　症例６の患者は、２３歳の男性であった。症例６の患者のＨＬＡ型はＨＬＡ－Ａ＊０２：０７であった。２００８年より左耳鳴りを感じていた。また同時に皮膚にも腫瘍が生じたため切除し、ＮＦ２と診断された。２０１１年に両側前庭神経鞘腫が発見された。その後両側聴力は徐々に低下しており、軽度呂律困難も生じ始めている。また前頭蓋底に髄膜腫を認め、その後も急速に増大傾向を示していた。実験例５と同様にして調製したペプチドワクチン組成物の投与を開始した。投与スケジュール及び画像解析は実験例２と同様にして行った。
（画像解析）
　頭部造影ＭＲＩ検査により、ペプチドワクチン組成物の投与が患者の腫瘍に与える影響を検討した。図１７（ａ）～（ｄ）は、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例６の患者の両側前庭神経鞘腫を撮影した結果を示す写真である。各写真の上部には撮影日が記載されている。
　図１７（ａ）はペプチドワクチン組成物の投与前の結果であり、図１７（ｂ）はペプチドワクチン組成物の投与開始前の結果であり、図１７（ｃ）はペプチドワクチン組成物を４回投与後の結果であり、図１７（ｄ）はペプチドワクチン組成物を８回投与後の結果である。
　また、図１８（ａ）は、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における右側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフであり、図１８（ｂ）は、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における左側前庭神経鞘腫の体積を測定した結果を示すグラフである。図１８（ａ）及び（ｂ）中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。
　その結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、それまで増大傾向であった右側前庭神経鞘腫の体積は５％減少した。また、それまで増大傾向であった左側前庭神経鞘腫の体積は１３％減少した。
　また、図１９（ａ）は、頭部造影ＣＴ検査の結果に基づいて、各検査日における右側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフであり、図１９（ｂ）は、頭部造影ＣＴ検査の結果に基づいて、各検査日における左側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。図１９（ａ）及び（ｂ）中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。その結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、右側前庭神経鞘腫の腫瘍内血液量が低下傾向を示したことが明らかとなった。
　また、図２０（ａ）～（ｄ）は、頭部造影ＭＲＩ検査により、症例６の患者の髄膜腫を撮影した結果を示す写真である。各写真の上部には撮影日が記載されている。
　図２０（ａ）及び（ｂ）はペプチドワクチン組成物の投与前の結果であり、図２０（ｃ）はペプチドワクチン組成物を４回投与後の結果であり、図２０（ｄ）はペプチドワクチン組成物を８回投与後の結果である。
　また、図２１は、頭部造影ＭＲＩ検査の結果に基づいて、各検査日における髄膜腫の体積を測定した結果を示すグラフである。図２１中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。その結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、それまで急速増大傾向であった髄膜腫の体積の増大速度が軽減した。
　また、図２２は、頭部造影ＣＴ検査の結果に基づいて、各検査日における髄膜腫の腫瘍内血液量を測定した結果を示すグラフである。図２２中、矢印はワクチン組成物の投与開始時を示す。その結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、髄膜腫の腫瘍内血液量が低下傾向を示したことが明らかとなった。
　以上の結果から、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０７患者の神経鞘腫及び髄膜腫に対する、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合性のペプチドワクチンの投与の有効性が明らかとなった。
［実験例７］
（組織学的解析）
　症例１の患者の、ペプチドワクチン組成物の投与前及び投与後の腫瘍組織におけるＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２の発現量を定量的ＲＴ－ＰＣＲにより測定した。
　図２３は、定量的ＲＴ－ＰＣＲの結果を示すグラフである。その結果、ペプチドワクチン組成物の投与後に、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２の発現量が低下したことが明らかとなった。
　続いて、症例１の患者の、ペプチドワクチン組成物の投与前及び投与後の腫瘍組織の切片を免疫染色し、ＣＤ３４の発現を検討した。ＣＤ３４の発現は血管内皮細胞の存在を示す。
　図２４（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。倍率は４０倍である。図２４（ａ）はペプチドワクチン組成物の投与前の結果であり、図２４（ｂ）はペプチドワクチン組成物の投与後の結果である。その結果、ペプチドワクチン組成物の投与前には、大型の血管が多数認められたのに対し、ペプチドワクチン組成物の投与後には、大型の血管はほとんど認められないことが明らかとなった。
　続いて、症例１の患者の、ペプチドワクチン組成物の投与前及び投与後の腫瘍組織の切片を免疫染色し、ＦＯＸＰ３陽性細胞の存在を検出した。ＦＯＸＰ３陽性細胞は制御性Ｔ細胞である。
　図２５（ａ）及び（ｂ）は、免疫染色の結果を示す顕微鏡写真である。倍率は４０倍である。図２５（ａ）はペプチドワクチン組成物の投与前の結果であり、図２５（ｂ）はペプチドワクチン組成物の投与後の結果である。図２５（ａ）及び（ｂ）中、矢印はＦＯＸＰ３陽性細胞の存在を示す。その結果、ペプチドワクチン組成物の投与前には、制御性Ｔ細胞の存在が認められたのに対し、ペプチドワクチン組成物の投与後には、制御性Ｔ細胞の存在が認められないことが明らかとなった。
　続いて、症例１の患者の、ペプチドワクチン組成物の投与前及び投与後の腫瘍組織の切片を免疫染色し、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ－２、ＰＤＧＦＲ－βを三重染色した。
　図２６は、免疫染色の結果を示す蛍光顕微鏡写真である。図２６中、「Ｐｒｅ－ｖａｃｃｉｎｅ」はペプチドワクチン組成物の投与前の結果であることを示し、「Ｐｏｓｔ－ｖａｃｃｉｎｅ」はペプチドワクチン組成物の投与後の結果であることを示す。また、「ＤＡＰＩ」は４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドールで核を染色した結果であることを示し、「Ｍｅｒｇｅ」は画像を合成した結果であることを示す。
　その結果、ペプチドワクチン組成物の投与前には、周皮細胞が欠落し、ＶＥＧＦＲ－１及びＶＥＧＦＲ－２が高発現する巨大な血管が多く形成されていたのに対し、ペプチドワクチン組成物の投与後には、周皮細胞に覆われた小型の血管が多く存在することが明らかとなった。
　本発明によれば、脳神経疾患を効果的に治療することができるペプチドワクチン及びペプチドワクチン組成物を提供することができる。

Claims (13)

  1. 　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＶＥＧＦＲ）－１発現細胞に対する細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するペプチド、又はＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導するペプチドからなる、脳神経疾患に対するペプチドワクチン。
  2. 　ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２結合性である、請求項１に記載のペプチドワクチン。
  3. 　ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、配列番号１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号１に記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のペプチドワクチン。
  4. 　ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合性である、請求項１に記載のペプチドワクチン。
  5. 　ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、配列番号２～４のいずれかに記載のアミノ酸配列、又は配列番号２～４のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、請求項４に記載のペプチドワクチン。
  6. 　ＶＥＧＦＲ－１発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６結合性又はＨＬＡ－Ａ＊０２：０７結合性である、請求項１に記載のペプチドワクチン。
  7. 　ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊２４：０２結合性である、請求項１に記載のペプチドワクチン。
  8. 　ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、配列番号５～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列、又は配列番号５～１０のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、請求項７に記載のペプチドワクチン。
  9. 　ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０１結合性である、請求項１に記載のペプチドワクチン。
  10. 　ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、配列番号１１～１６のいずれかに記載のアミノ酸配列、又は配列番号１１～１６のいずれかに記載のアミノ酸配列において１又は複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる、請求項９に記載のペプチドワクチン。
  11. 　ＶＥＧＦＲ－２発現細胞に対するＣＴＬを誘導する前記ペプチドが、ＨＬＡ－Ａ＊０２：０６結合性又はＨＬＡ－Ａ＊０２：０７結合性である、請求項１に記載のペプチドワクチン。
  12. 　前記脳神経疾患が神経線維腫症ＩＩ型である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のペプチドワクチン。
  13. 　請求項１～１２のいずれか一項に記載のペプチドワクチンと、薬学的に許容される担体とを含有する、脳神経疾患に対するペプチドワクチン組成物。
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