CN102217980A - 一种恒河猴脉络膜血管新生模型的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种恒河猴脉络膜血管新生模型的制备方法，本发明还提供了该方法制备的动物模型，以及VEGF抑制剂在制备具有抑制脉络膜新生血管产生作用的药物中的用途。本发明通过激光致脉络膜血管新生建立恒河猴模型，将VEGF抑制剂用于恒河猴激光致脉络膜新生血管，试验结果表明VEGF抑制剂具有抑制脉络膜新生血管产生的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种恒河猴脉络膜血管新生模型的制备方法。
背景技术
脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)，是指产生于视网膜下脉络膜上的不正常血管，并由于其结构缺陷能渗漏血浆和血液，导致瘢痕组织的生成，从而破坏视网膜功能，尤其是位于黄斑区的新生血管，破坏了中心视力，是导致患者失明的主要原因之一。血管内皮细胞生长因子(vascularendothelial growth factor，VEGF)是刺激形成新生血管的主要因子之一，在视网膜和脉络膜新生血管发生中起着核心而关键的作用。尽管临床上已经开展了激光治疗、手术治疗、放射治疗及药物治疗等多种治疗新生血管的治疗技术，但效果并不理想。近年来，抗新生血管药物的研究非常活跃，理论上任何灭活VEGF或降低VEGF作用的药物都具有抑制新生血管形成的作用。(夏庆杰，等，KH902抑制猴激光致脉络膜新生血管，中华现代眼耳鼻喉科杂志，2006年第3卷第5期)李筱荣，等，VEGF抑制剂在眼内新生血管疾病中的应用，眼外伤职业眼病杂志，2007年29卷8期，眼内新生血管形成是老年黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞、新生血管性青光眼等疾病共有的病理改变。其相伴的渗出、出血、增生等一系列病理改变可严重破坏眼的结构和功能，导致患者不同程度的视力障碍。研究证实血管内皮生长因子(VEGF)在新生血管形成过程中起关键性刺激作用。宋清雪，等，VEGF抑制剂在眼部新生血管性疾病中的应用进展，《广东医学》，2009年30卷3期，对血管内皮生长因子(VEGF)和新生血管、VEGF抑制剂在眼部新生血管性疾病中的治疗进展及安全性进行了综述。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种恒河猴脉络膜血管新生模型的制备方法，本发明的另一技术方案是提供了VEGF抑制剂的新用途。
本发明提供了一种恒河猴脉络膜血管新生模型的制备方法，它包括如下步骤：将恒河猴麻醉，滴眼散瞳，以240mW，50mS进行激光眼底照射Bruch膜和覆盖其上的视网膜色素上皮，击穿Bruch膜，烧出至少6-9个直径50um损伤点，即成恒河猴脉络膜血管新生模型。
其中，采用VISULAS 532S固体激光器进行激光眼底照射。采用3％戊巴比妥麻醉恒河猴。
本发明还提供了所述的方法制备的恒河猴脉络膜血管新生模型。
本发明还提供了VEGF抑制剂在制备抑制脉络膜新生血管的药物中的用途。
其中，所述的VEGF抑制剂的给药方法为玻璃体给药，给药剂量为640ug/40ul。
本发明通过激光致脉络膜血管新生建立恒河猴模型，将VEGF抑制剂用于恒河猴激光致脉络膜新生血管，试验结果表明VEGF抑制剂具有抑制脉络膜新生血管的作用。
附图说明
图1模型组给药后10min恒河猴眼底造影图片
图2VEGF抑制剂对恒河猴激光致脉络膜血管新生治疗作用：治疗组给药后10min恒河猴眼底造影图片(给药方式为造模当天，以后一周一次)
图3VEGF抑制剂对恒河猴激光致脉络膜血管新生治疗作用：治疗组给药后10min恒河猴眼底造影图片(给药方式为造模当天，及第14天，以后两周一次)
具体实施方式
试验例1 本发明VEGF抑制剂具有抑制脉络膜新生血管产生的作用的试验
1、试验材料
1.1受试物
生理状况下血管生成促进因子和血管生成抑制因子之间维持平衡，新生血管的形成归因于此平衡的破坏，其中VEGF是重要的始动因素。VEGF通过结合血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)高特异性酪氨酸激酶受体，包括fms样酪氨酸激酶受体(Flt1)和胎肝激酶1受体(Flk1)/激酶插入结构域受体(KDR)，使磷脂酶C等蛋白磷酸化，形成甘油二酯(DAG)，活化蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，从而诱导VEC生长，增加血管通透性。VEGF亦可诱导纤溶酶原激活物(plaminogen activator，PA)以及基质金属蛋白酶(matrix metallopr0teinase，MMPs)，共同促进局部的细胞基质降解，为VEC迁移提供条件，故VEGF在新生血管的形成中发挥重要作用。Avastin是全长的VEGF单克隆抗体，分子量约149kDa，与VEGF有两个结合位点，能结合和阻断所有VEGF的异构体。其抗新生血管的主要机制为阻止VEGF与内皮细胞表面的VEGFR1和VEGFR2受体结合，使内源化VEGF的生物活性失效，抑制内皮细胞有丝分裂，减少血管通透性，从而阻断新生血管的形成。
1.2阴性对照药物
PBS：0.1M磷酸缓冲液，0.15M氯化钠(NaOH调至pH7.2)。
1.3试验动物
恒河猴6只，雌雄各半。购于平安动物饲养中心，均单独饲养于(80*90*100)cm猴笼中，每日饲喂2次，辅以蔬菜、水果，自动饮水器饮水，室内平均温度(21.1±13.6)℃，相对湿度87.5±12.6，用同于实验前均有3周的适应时间。
2试验方法
2.1分组与剂量设计
将激光致脉络膜血管新生的动物分为3个试验组，对照组，VEGF抑制剂同一剂量两种给药方式2个给药组。安慰剂对照组按造模当天，及第14天，以后两周一次的给药方式，而VEGF抑制剂给药组分别按造模当天，以后一周一次以及造模当天，及第14天，以后两周一次的给药方式。
分组及剂量设计详见表1。
表1 分组及剂量设计情况表
2.2试验方法
以激光致脉络膜血管新生建立恒河猴模型，3％戊巴比妥静脉注射麻醉后，美多丽(日本参天制药株式会社)滴眼散瞳，VISULAS 532S固体激光器以240mW，50mS进行激光眼底照射Bruch膜和覆盖其上的视网膜色素上皮，击穿Bruch膜，烧出至少6-9个直径约50um损伤点。造模结束后，将模型猴按体重及雌雄搭配分为3组，即安慰剂对照组、VEGF抑制剂给药组，每组2只。
造模结束后第1天，阳性对照组猴开始给予盐酸美沙酮溶液，脱毒舒低、中、高剂量组分别按照剂量设计经口给予脱毒舒溶液，每天1次，连续7天，溶剂对照组给予1％CMC-Na溶液。
安慰剂对照组造模当天，及第14天，以后两周一次玻璃体注射VEGF抑制剂，VEGF抑制剂给药组分别于造模当天，以后一周一次以及造模当天，及第14天，以后两周一次玻璃体注射VEGF抑制剂。
给药期及恢复期，每天上午给药前观察1次动物一般状态，记录动物一般状况。
造模后20天做1次荧光素血管造影术，计算造影后10分钟左右时荧光素渗漏产生强荧光斑的的数目和范围，以评估脉络膜血管新生的病变情形，并进行统计学处理；同时对病变程度进行分级。
3、试验结果
3.1一般情况
动物在给药期及恢复期间自主活动正常、精神状况良好、皮肤被毛清洁，均未观察到明显异常反应。
3.2VEGF抑制剂对激光致脉络膜血管新生恒河猴治疗期间眼球荧光斑数目的影响
恒河猴经激光造模、玻璃体内注射药物及眼底荧光造影显示：给药组较造模给安慰剂组荧光渗漏激光损伤斑数目显著性减少，且在激光损伤斑部荧光渗漏也较给安慰剂组明显减少，差异具有显著性。结果详见表2。具体见图1-图3。
表2 恒河猴激光造模及给药后激光损伤斑部渗漏荧光斑数目
注：*与对照组比较，其差异有统计学意义(p＜0.05)
3.3结论
在本实验室条件下，恒河猴经激光造模、玻璃体内注射药物及眼底荧光造影显示：给予640ug/眼VEGF抑制剂组较造模给安慰剂组在激光损伤斑部荧光渗漏明显减少，差异具有显著性P＜0.05。该测定结果表明，VEGF抑制剂具有抑制脉络膜新生血管产生的作用。
4、主要参考文献
4.1Yoshitsugu Saishin，Yumiko Saishin，et al.VEGF-TRAPR1R2 SuppressesChoroidal Neovascularization and VEGF-Induced Breakdown of theBlood-Retinal Barrier.J Cellular Phys.195：241-248(2003)
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4.3Schwartz SD，Blumenkranz M，Rosenfeld PJ，Miller JW，Haller J，Fish G，Lobes L，Singerman L，Green WL，Reimann J.2001.Safety of rhuFab V2，ananti-VEGF antibody fragment，as a single intravitreal injection in subjects withneovascular age-related macular degeneration.Invest Ophthalmol Vis Sci(Suppl)42：S522.
4.4Derevjanik NL，Vinores SA，Xiao W-H，Mori K，Turon T，Hudish T，Dong S，Campochiaro PA.2002.Quantitative assessment of the integrity of theblood-retinal barrier in mice.Invest Ophthalmol.Vis Sci 43：2462-2467.
Claims (6)
1.一种恒河猴脉络膜血管新生模型的制备方法，它包括如下步骤：将恒河猴麻醉，滴眼散瞳，以240mW，50mS进行激光眼底照射Bruch膜和覆盖其上的视网膜色素上皮，击穿Bruch膜，烧出6-9个直径50um损伤点，即成恒河猴脉络膜血管新生模型。
2.根据权利要求1所述的恒河猴脉络膜血管新生模型的制备方法，其特征在于：采用VISULAS 532S固体激光器进行激光眼底照射。
3.根据权利要求1所述的用恒河猴脉络膜血管新生模型的制备方法，其特征在于：采用3％戊巴比妥麻醉恒河猴。
4.权利要求1-3任意一项所述的方法制备的恒河猴脉络膜血管新生模型。
5.VEGF抑制剂在制备抑制脉络膜新生血管的药物中的用途。
6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的VEGF抑制剂的给药方法为玻璃体给药，给药剂量为640ug/40ul。
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