CN111226865A - 一种树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，属于动物模型建立技术领域。本发明系统的应用单点激光法诱导构建树鼩脉络膜新生血管动物模型，可以实现树鼩CNV模型的成功诱导，且诱导出的CNV病灶从形态学、功能、血管生成相关促进、抑制因子变化趋势等方面均与人类疾病高度相似，模型诱导的时间从其他灵长类模型诱导的4周显著缩短为1周，填补了目前没有针对树鼩这一物种特定的CNV动物模型的空白，提高了建模的成功率。此外，本发明提供的观察分析方法简单，价格低廉，可以系统、动态观察分析CNV形成的过程和效率。
Description
技术领域
本发明属于动物模型建立技术领域，具体涉及一种树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法。
背景技术
脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)是由多种病因所致的脉络膜新生血管芽穿越Bruch膜受损处，并在视网膜色素上皮(Retinal pigmentepithelium,RPE)下方生长，逐渐穿过RPE向视网膜神经上皮层延伸，增殖形成纤维血管组织。CNV常发生于黄斑区，引发黄斑区出血、视网膜下的浆液性渗出，为年龄相关性黄斑变性、高度近视黄斑病变、中心性渗出性脉络膜视网膜病变等多种眼底疾病的共同特征，严重影响患者的中心视力。眼底荧光血管造影(Fundus Fluorescein Angiography，FFA)和脉络膜血管造影(Indocyanine green angiography,ICGA)主要表现为新生血管的渗漏，伴有周围的出血、渗出，晚期引起脉络膜纤维化和视网膜瘢痕形成。引起的CNV相关疾病已经成为全球主要的致盲原因之一，在西方发达国家已经成为老年人的主要致盲性眼病，在我国的患病率也在不断上升。CNV形成的具体发病机制不清，目前认为可能与以下因素有关：1)长期氧化应激损伤及炎症反应，激活巨噬细胞(macrophages,MPs)、中性粒细胞等炎细胞聚集，以及小胶质细胞的活化，通过蛋白水解作用破坏了Bruch膜；2)炎症因子的释放及促血管生成因子和抗血管生成因子的平衡失调，引起病灶局部的微环境改变，促进了CNV的发生。但目前对CNV的具体发病机制，尤其是CNV发生相关的基因调控，仍有待进一步大量研究。
国内外的主要CNV建模方法包括激光诱导、生长因子诱导等。1981年，Archer等提出CNV形成的两个主要因素包括：Bruch膜的破裂和外层视网膜细胞结构成分的改变。在此理论基础上，Archer等成功利用激光光凝造成恒河猴视网膜内层血供减少和Bruch膜破裂，诱发CNV模型。氪激光诱导CNV的作用机制是用激光选择性破坏光感受器外界、RPE细胞、Bruch膜和脉络膜毛细血管，Bruch膜破坏后引发的一系列损伤修复过程，继而形成新生血管。其病理基础与人类CNV相同，即Bruch膜-视网膜色素上皮(RPE)-脉络膜毛细血管复合体损伤导致血管生成因子与抑制因子间平衡的破坏，使内皮细胞发生增生、移行和管腔形成等一系列新生血管形成过程，与其他诱导方式相比，激光诱导所产生的病理变化与人类自然病程更为相近。
目前，CNV模型常用的实验动物有猴、兔、鼠和猪。猴CNV模型的组织学病理及眼FFA/ICGA改变与人类疾病改变非常相似，实验性猴CNV模型中，CNV一般发生于光凝后4周，持续2-52周，虽然这种模型表现与人类极其相似，但动物来源有限，费用高昂，CNV诱发时间较长，发生率低等缺陷限制了其运用。而其他动物视网膜结构与人类差异较大，CNV形成后不具备人类疾病的典型特征，并非理想的模型动物。亟需开发一种更理想的CNV实验动物模型。
树鼩作为一种新型实验动物，近年来在生物医学研究中其应用范围越来越广，在人类疾病动物模型方面，树鼩开始得到应用，包括乳腺癌、乙肝、疱疹病毒感染、登革热病毒、HIV、糖尿病和神经系统等。由于树鼩具有很好的色觉、较高的辨色准确率，对光暗度很敏感，视觉系统比鼠、兔等动物更加发达，近年来很多研究应用于人类的近视和视觉发育研究。其视网膜以视锥细胞为主，感光度变化很敏感，这与人类的黄斑区功能很类似。树鼩的独特的视网膜结构为模拟人类黄斑区CNV的疾病过程提供了良好基础。但目前为止，还没有在树鼩上建立脉络膜新生血管动物模型的研究。
发明内容
既往的激光造模方法采用激光簇的方式进行，即在同一个视网膜部位用激光进行4-5个点围成一圈的方式来破坏Bruch膜，来诱导新生血管的产生。这种方式在进行激光的时候，因为要在同一片区域进行多次光凝，误伤视网膜血管的几率比较高，引起视网膜出血甚至玻璃体积血的概率较高。同时在新生血管成功诱导出现后再FFA/ICGA检查上虽然可以看到明显渗漏，但难以判断渗漏是由哪个激光斑造成的，而且在人类的CNV相关性疾病中，CNV并非成簇出现，而是以单一位置单一CNV病灶为主，或者多个位置每个位置单一CNV为主要表现形式。为解决现有的动物模型诱发时间长、造模成功率低等问题，发明人通过大量实验探索，找到了适合的造模方法和参数，最终创新性地首次应用单个激光点氪红激光破坏Bruch膜的方法成功诱导建立树鼩脉络膜新生血管动物模型。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，包括如下步骤：
所有实验树鼩均为成年健康树鼩，年龄在2-3岁之间，体重150～200g，均在造模前，进行裂隙灯和双目间接检眼镜检查，排除眼部疾病；
腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物后，维持麻醉后维持动物体温；
激光光凝前25～30min，用复方托吡卡胺滴眼液滴眼以充分散大双眼瞳孔；接着进行双眼点表面麻醉，之后，用卡波姆眼用凝胶滴眼以预防角膜干燥，最后固定动物；
轻轻扒开实验动物上下眼睑，将一片盖玻片正中央涂上卡波姆眼用凝胶后盖在树鼩角膜中央；在距视盘1PD的距离，将眼底均等划分为围绕视盘的N个区域，每个区域包含60°范围视网膜；于每个区域中心，避开血管，等距离行氪离子激光光凝，每个区域1个激光斑，击破Bruch膜；N个激光点距离视盘的距离相等，N个激光点之间的距离也相等；N＝6～10；
分别于光凝前及光凝后3、7、14、21、28天，观察造模后FFA/ICGA的特征，当FFA/ICGA均出现CNV典型表现，即视为建模成功。
进一步，优选的是，在造模前，深度麻醉后，进行裂隙灯和双目间接检眼镜检查。
进一步，优选的是，腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物时，麻醉剂量为4.5mg/kg。
进一步，优选的是，维持麻醉后动物体温的方式为：采用加热垫维持麻醉后动物体温。
进一步，优选的是，用复方托吡卡胺滴眼液滴眼时，滴眼三次，每次1～2滴，相邻两次间隔5min。
进一步，优选的是，双眼点表面麻醉时，采用盐酸奥布卡因滴眼液，滴眼两次，每次1～2滴，两次间隔2min。
进一步，优选的是，用卡波姆眼用凝胶滴眼一次，用量1～2滴。
进一步，优选的是，激光波长为647.1nm，光凝斑直径50μm，曝光时间0.01s，能量从250mw开始，在周边视网膜上进行能量的滴定根据视网膜的反应，调节能量大小，以光凝后有气泡形成无视网膜出血，标志击破Bruch膜，记为有效点。
进一步，优选的是，如击破小血管时，有出血，该眼不用于建模。
进一步，优选的是，所述的CNV典型表现为：在造影的早期出现激光病灶处染料渗漏，随着时间延长渗漏面积不断扩大。
本发明盖盖玻片时，盖玻片可以黏附在角膜上。
本发明在盖玻片辅助下，在距视盘1PD的距离，将眼底均等划分为围绕视盘的6个区域，每个区域包含60°范围视网膜；划分为6个是要把单个激光点隔开，避免观察效果时相互影响，如果低于6个区域激光点过少，可能造成动物造模失败，后期观察到按单个激光点来计算造模成功率，70％的激光点可以成功诱导CNV。
本发明所述的染料为荧光素和/或吲哚青绿。
以往的CNV动物模型观察中主要使用FFA/ICGA和病理切片对模型的发生发展进行观察，本发明提出一种树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，能使实验树鼩在造模后7天出现典型的CNV表现，造模后的观察方法除了常规的方法以外，还应用了SD-OCT从形态上证实CNV的存在，F-VEP从功能上观察模型对模型动物的神经电生理影响，免疫组化和PCR方法检测血管生成相关因子的变化趋势，从多角度多层面确认新生血管的形成和模型与人类CNV疾病的高度相似。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明首次提供了一种系统的应用单点激光法诱导树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，可以实现树鼩CNV模型的成功诱导，且诱导出的CNV病灶从形态学、功能、血管生成相关促进、抑制因子变化趋势等方面均与人类疾病高度相似，模型诱导的时间从其他灵长类模型诱导的4周显著缩短为1周，填补了目前没有针对树鼩这一物种特定的CNV动物模型的空白，提高了建模的成功率。此外，本发明提供的观察分析方法简单，价格低廉，可以系统、动态观察分析CNV形成的过程和效率。
本发明采用单点法的优势主要在于：
(1)诱导出现的新生血管为单灶的，这与人类CNV疾病是类似的。本方法造模成功后树鼩可出现与人类疾病高度类似的CNV形态；
(2)树鼩眼底血管密布，呈放射状从视盘发出，造模位置靠近视盘，血管间的距离较近，用单点法造模，可以最大程度避免激光造成视网膜血管损伤，引起视网膜出血，造模失败，从而提高造模成功率，提高实验动物的利用率；
(3)单点激光制造的病灶区域无论是在FFA/ICGA还是OCT上都便于观察病灶的形态变化，利用图像分析软件可以对CNV病灶的高度、宽度等进行精确量化计算，如开展药物干预相关实验时，有利于对药物针对CNV的治疗效果进行精确评估。而且通过对促血管生成因子和抑制血管生成因子的观察证实树鼩CNV造模成功后与人类疾病中的血管生成相关因子变化极为类似。该方法价格低廉、使用方便，模型诱导需要的时间短，造模成功率高。
附图说明
图1为激光诱导建模前眼底照相；可见视网膜呈现橘红色反光，后极部见椭圆形视乳头，边界清，呈橘红色，从中发出数条放射状血管分布于视网膜。a.树鼩后极部眼底照相。b.树鼩中周部眼底照相，可见距离视盘越远，血管间视网膜面积越大；
图2为激光诱导建模后眼底照相；可见围绕视乳头所形成的激光斑，并有气泡产生，部分激光斑处伴有视网膜下脉络膜少量出血；
图3为正常树鼩FFA/ICGA；a：正常树鼩FFA图像；b：正常树鼩早期ICGA图像；C：正常树鼩中期ICGA图像；D：正常树鼩晚期ICGA图像；
图4为光凝后3天树鼩CNV模型FFA/ICGA显示CNV渗漏；a和b：FFA图像，a为FFA早期，b为FFA中晚期，均可见激光斑处视网膜低荧光改变；c和d：ICGA图像，a为ICGA早期，b为ICGA中晚期，均可见激光班处局部脉络膜呈团块状高背景荧光，无强荧光及荧光渗漏出现；
图5为光凝后7天树鼩CNV模型FFA/ICGA显示CNV渗漏；a：FFA出现强荧光伴荧光渗漏，b：FFA晚期边界扩大，周围组织荧光着染；c和d：ICGA可见不同位置激光斑处呈现点状强荧光；
图6为SD-OCT显示树鼩CNV形成；a-b.不同树鼩光凝后3天SD-OCT图像，可见激光斑处高反射病灶形成；c-d.不同树鼩光凝后7天SD-OCT图像；箭头所指为CNV形成区域；
图7为人类CNV病灶的SD-OCT图像；
图8为与正常组相比较，光凝后7天树鼩F-VEP潜伏期及振幅变化；a：P3潜伏期显著延长，b：N1-P1振幅显著降低；*表示经过统计学分析差异有显著性，其中*表示p＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001
图9为正常组、3天组和7天组MMP-9和PLGF mRNA相对表达量。a.MMP-9mRNA相对表达量，b：PLGF mRNA相对表达量；*表示经过统计学分析差异有显著性，其中*表示p＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001
图10为正常组及实验组病理切片；a.100倍光镜下正常组；b.100倍光镜下光凝后3天病理切片；c.100倍光镜下光凝后7天病理切片；d.100倍光镜下光凝后14天病理切片；e.100倍光镜下光凝后21天病理切片；f.100倍光镜下光凝后28天病理切片；g.200倍光镜下正常组；h.200倍光镜下光凝后3天病理切片；i.200倍光镜下光凝后7天病理切片；j.200倍光镜下光凝后14天病理切片；k.200倍光镜下光凝后21天病理切片；l.200倍光镜下光凝后28天病理切片；m.400倍光镜下正常组；n.400倍光镜下光凝后3天病理切片；o.400倍光镜下光凝后7天病理切片；p.400倍光镜下光凝后14天病理切片；q.400倍光镜下光凝后21天病理切片；r.400倍光镜下光凝后28天病理切片；
图11四种血管生成相关因子在正常组、3天、7天、14天、21天和28天的MOD值。a.VEGF-A MOD值；b.VEGF-B MOD值；c.PIGF MOD值；d.FGF-R MOD值。*表示经过统计学分析差异有显著性，其中*表示p＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1
一种树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，包括如下步骤：
所有实验树鼩均为成年健康树鼩，年龄在2-3岁之间，体重150～200g，均在造模前，进行裂隙灯和双目间接检眼镜检查，排除眼部疾病；
腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物后，维持麻醉后维持动物体温；
激光光凝前25min，用复方托吡卡胺滴眼液滴眼以充分散大双眼瞳孔；接着进行双眼点表面麻醉，之后，用卡波姆眼用凝胶滴眼以预防角膜干燥，最后固定动物；
轻轻扒开实验动物上下眼睑，将一片盖玻片正中央涂上卡波姆眼用凝胶后盖在树鼩角膜中央；在距视盘1PD的距离，将眼底均等划分为围绕视盘的6个区域，每个区域包含60°范围视网膜；于每个区域中心，避开血管，等距离行氪离子激光光凝，6个激光点距离视盘的距离相等，6个激光点之间的距离也相等，每个区域1个激光斑，击破Bruch膜；
分别于光凝前及光凝后3、7、14、21、28天，观察造模后FFA/ICGA的特征，当FFA/ICGA均出现CNV典型表现，即视为建模成功。
实施例2
一种树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，包括如下步骤：
所有实验树鼩均为成年健康树鼩，年龄在2-3岁之间，体重150～200g，均在造模前，深度麻醉后，进行裂隙灯和双目间接检眼镜检查，排除眼部疾病；
腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物后，加热垫维持麻醉后维持动物体温；其中，腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物时，麻醉剂量为4.5mg/kg；
激光光凝前25min，用复方托吡卡胺滴眼液(Tropicamide Phenylephrine EyeDrops)(商品名：美多丽，日本参天株式会社)滴眼以充分散大双眼瞳孔；接着进行双眼点表面麻醉，之后，用卡波姆眼用凝胶滴眼以预防角膜干燥，最后固定动物；
其中，用复方托吡卡胺滴眼液滴眼时，滴眼三次，每次1滴，相邻两次间隔5min；双眼点表面麻醉时，采用盐酸奥布卡因滴眼液，滴眼两次，每次1滴，两次间隔2min；用卡波姆眼用凝胶滴眼一次，用量1滴。
轻轻扒开实验动物上下眼睑，将一片盖玻片正中央涂上卡波姆眼用凝胶后盖在树鼩角膜中央；在距视盘1PD的距离，将眼底均等划分为围绕视盘的10个区域，每个区域包含60°范围视网膜；于每个区域中心，避开血管，等距离行氪离子激光光凝，10个激光点距离视盘的距离相等，10个激光点之间的距离也相等，每个区域10个激光斑，击破Bruch膜；
激光波长为647.1nm，光凝斑直径50μm，曝光时间0.01s，能量从250mw开始，在周边视网膜上进行能量的滴定根据视网膜的反应，调节能量大小，以光凝后有气泡形成无视网膜出血，标志击破Bruch膜，记为有效点。
如击破小血管时，有出血，该眼不用于建模。
分别于光凝前及光凝后3、7、14、21、28天，观察造模后FFA/ICGA的特征，当FFA/ICGA均出现CNV典型表现，即视为建模成功。
所述的CNV典型表现为：在造影的早期出现激光病灶处染料渗漏，随着时间延长渗漏面积不断扩大。
实施例3
一种树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，包括如下步骤：
所有实验树鼩均为成年健康树鼩，年龄在2-3岁之间，体重150～200g，均在造模前，深度麻醉后，进行裂隙灯和双目间接检眼镜检查，排除眼部疾病；
腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物后，加热垫维持麻醉后维持动物体温；其中，腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物时，麻醉剂量为4.5mg/kg；
激光光凝前30min，用复方托吡卡胺滴眼液滴眼以充分散大双眼瞳孔；接着进行双眼点表面麻醉，之后，用卡波姆眼用凝胶滴眼以预防角膜干燥，最后固定动物；
其中，用复方托吡卡胺滴眼液滴眼时，滴眼三次，每次2滴，相邻两次间隔5min；双眼点表面麻醉时，采用盐酸奥布卡因滴眼液，滴眼两次，每次2滴，两次间隔2min；用卡波姆眼用凝胶滴眼一次，用量2滴。
轻轻扒开实验动物上下眼睑，将一片盖玻片正中央涂上卡波姆眼用凝胶后盖在树鼩角膜中央；在距视盘1PD的距离，将眼底均等划分为围绕视盘的8个区域，每个区域包含60°范围视网膜；于每个区域中心，避开血管，等距离行氪离子激光光凝，8个激光点距离视盘的距离相等，8个激光点之间的距离也相等，每个区域1个激光斑，击破Bruch膜；
激光波长为647.1nm，光凝斑直径50μm，曝光时间0.01s，能量从250mw开始，在周边视网膜上进行能量的滴定根据视网膜的反应，调节能量大小，以光凝后有气泡形成无视网膜出血，标志击破Bruch膜，记为有效点。
如击破小血管时，有出血，该眼不用于建模。
分别于光凝前及光凝后3、7、14、21、28天，观察造模后FFA/ICGA的特征，当FFA/ICGA均出现CNV典型表现，即视为建模成功。
所述的CNV典型表现为：在造影的早期出现激光病灶处染料渗漏，随着时间延长渗漏面积不断扩大。
实施例4
一种树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，包括如下步骤：
所有实验树鼩均为成年健康树鼩，年龄在2-3岁之间，体重150～200g，均在造模前，深度麻醉后，进行裂隙灯和双目间接检眼镜检查，排除眼部疾病；
腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物后，加热垫维持麻醉后维持动物体温；其中，腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物时，麻醉剂量为4.5mg/kg；
激光光凝前28min，用复方托吡卡胺滴眼液(Tropicamide Phenylephrine EyeDrops)(商品名：美多丽，日本参天株式会社)滴眼以充分散大双眼瞳孔；接着进行双眼点表面麻醉，之后，用卡波姆眼用凝胶滴眼以预防角膜干燥，最后固定动物；
其中，用复方托吡卡胺滴眼液滴眼时，滴眼三次，每次1滴，相邻两次间隔5min；双眼点表面麻醉时，采用盐酸奥布卡因滴眼液，滴眼两次，每次2滴，两次间隔2min；用卡波姆眼用凝胶滴眼一次，用量1滴。
轻轻扒开实验动物上下眼睑，将一片盖玻片正中央涂上卡波姆眼用凝胶后盖在树鼩角膜中央；在距视盘1PD的距离，将眼底均等划分为围绕视盘的6个区域，每个区域包含60°范围视网膜；于每个区域中心，避开血管，等距离行氪离子激光光凝，6个激光点距离视盘的距离相等，6个激光点之间的距离也相等，每个区域1个激光斑，击破Bruch膜；
激光波长为647.1nm，光凝斑直径50μm，曝光时间0.01s，能量从250mw开始，在周边视网膜上进行能量的滴定根据视网膜的反应，调节能量大小，以光凝后有气泡形成无视网膜出血，标志击破Bruch膜，记为有效点。
如击破小血管时，有出血，该眼不用于建模。
分别于光凝前及光凝后3、7、14、21、28天，观察造模后FFA/ICGA的特征，当FFA/ICGA均出现CNV典型表现，即视为建模成功。
所述的CNV典型表现为：在造影的早期出现激光病灶处染料渗漏，随着时间延长渗漏面积不断扩大。
应用实例
一种树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，包括如下步骤：
所有实验树鼩均为成年健康树鼩，年龄在2-3岁之间，体重150～200g，均在造模前，深度麻醉后，进行裂隙灯和双目间接检眼镜检查，排除眼部疾病；
腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物后，加热垫维持麻醉后维持动物体温；其中，腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物时，麻醉剂量为4.5mg/kg；
激光光凝前28min，用复方托吡卡胺滴眼液滴眼以充分散大双眼瞳孔；接着进行双眼点表面麻醉，之后，用卡波姆眼用凝胶滴眼以预防角膜干燥，最后固定动物；
其中，用复方托吡卡胺滴眼液复方托吡卡胺滴眼液滴眼时，滴眼三次，每次1滴，相邻两次间隔5min；双眼点表面麻醉时，采用盐酸奥布卡因滴眼液，滴眼两次，每次2滴，两次间隔2min；用卡波姆眼用凝胶滴眼一次，用量1滴。
轻轻扒开实验动物上下眼睑，将一片盖玻片正中央涂上卡波姆眼用凝胶后盖在树鼩角膜中央；在距视盘1PD的距离，将眼底均等划分为围绕视盘的6个区域，每个区域包含60°范围视网膜；于每个区域中心，避开血管，等距离行氪离子激光光凝，6个激光点距离视盘的距离相等，6个激光点之间的距离也相等，每个区域1个激光斑，击破Bruch膜；
激光波长为647.1nm，光凝斑直径50μm，曝光时间0.01s，能量从250mw开始，在周边视网膜上进行能量的滴定根据视网膜的反应，调节能量大小，以光凝后有气泡形成无视网膜出血，标志击破Bruch膜，记为有效点。
如击破小血管时，有出血，该眼不用于建模。
分别于光凝前及光凝后3、7、14、21、28天，观察造模后FFA/ICGA的特征，当FFA/ICGA均出现CNV典型表现，即视为建模成功。
所述的CNV典型表现为：在造影的早期出现激光病灶处染料渗漏，随着时间延长渗漏面积不断扩大。
采用上述方法及技术参数，可使Bruch膜破坏成功率达100％，提高了CNV造模成功率。
本发明模型建立采用的观察分析方法，包括如下方式：
(1)光凝后立即行眼底照相。术后每天观察眼部情况。
(2)分别于光凝前及光凝后3、7、14、21、28天，观察造模后FFA/ICGA的特征，FFA/ICGA均出现CNV典型表现，即视为建模成功，测量各组FFA荧光强度及荧光渗漏面积。
(3)对各组动物行SD-OCT及F-VEP检查，观察树鼩CNV在SD-OCT中的表现，记录不同时间点F-VEP图像及各波的潜伏期和振幅数值结果。
(4)在各组实验结束时通过过量麻醉处死动物，摘除眼球，进行连续石蜡切片和常规HE染色，观察CNV形成情况及相关的病理改变，测量200倍光镜视野下，连续切片中CNV的相对高度。
(5)免疫组化观察血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)-A、VEGF-B、胎盘生长因子(placental growth factor,PLGF)及成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptor,FGF-R)等促血管生成因子于组织中的表达强弱及分布，测定各蛋白表达的阳性面积(area)，积分光密度值(integral opticaldensity,IOD)，计算平均光密度值(mean optical density,MOD)，对这些因子于正常组及各实验组中的表达差异及趋势进行分析。
(6)提取树鼩脉络膜及视网膜中的RNA，qRT-PCR观察树鼩视网膜及脉络膜中，VEGF-A、VEGF-B、促血管生成素(angiopoietin,Ang)-2、基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)-9，MMP-13、碱性成纤维生长因子(Basic fibroblast growthfactor,bFGF)、PLGF、转化生长因子(transforming growth factor,TGF)-β、色素上皮衍生因子(pigment epithelium derivedfactor,PEDF)等血管生成相关因子mRNA的变化趋势。
1.麻醉下对树鼩进行激光诱导
正常树鼩眼底视乳头呈圆形，边界清楚，色橘红，动静脉清晰，无黄斑，无上下血管弓，视网膜橘红色反光，见图1。成年(2～3岁，体重150～200g)树鼩30只(60眼)，分组如表1。
表1实验动物分组
| 分组 | 数量(只)(眼) | 观察时间(光凝后 |
| 正常对照组 | 5(10) | 不光凝 |
| 3天组 | 5(10) | 3天 |
| 7天组 | 5(10) | 7天 |
| 14天组 | 5(10) | 14天 |
| 21天组 | 5(10) | 21天 |
| 28天组 | 5(10) | 28天 |
试验时，在每个区域的中心使用氪红激光能引发Bruch膜损伤的能量进行了双眼激光光凝，可听到轻微爆破音和观察到水泡状改变，光凝后，可见距视乳头1PD位置，围绕视乳头所形成的激光斑，并有气泡产生，部分激光斑处伴有视网膜下脉络膜少量出血，见图2。
2.FFA/ICGA观察
正常树鼩FFA可观察到，视网膜动静脉同时充盈，伴有脉络膜均匀分布的强荧光，ICGA可清晰显示脉络膜血管充盈，并呈现弥漫均匀荧光，见图3。光凝后3天，FFA可见激光斑处脉络膜片状低背景荧光，ICGA可见局部脉络膜呈团块状高背景荧光，无强荧光及荧光渗漏出现，见图4。光凝后7天，ICGA可见部分激光斑处呈现点状强荧光，且FFA于动静脉期即出现强荧光伴荧光渗漏，晚期边界扩大，周围组织荧光着染，见图5。
3.OCT观察
在光凝后3天及7天，于SD-OCT中的改变，发现光凝后3天，后段OCT可见激光斑处视网膜轻度萎缩变薄，RPE连接中断，RPE与脉络膜毛细血管反光带增厚、变形，但未见轮廓清晰的CNV形成，光凝后7天，激光斑处RPE与脉络膜反射带局限不规则增厚、断裂，可见于RPE层向上隆起的梭形高反光区域，后伴影缺，见图6。从OCT上可看出，树鼩CNV模型成功建立后形成了与人类CNV病灶(见图7)高度相似的形态。
4.F-VEP观察
F-VEP可以检测到树鼩的N1、N2、N3、P1、P2和P3的波形、振幅和潜伏期。光凝后7天，观察到F-VEP中，P3潜伏期显著延长，N1-P1振幅显著降低，图8。在人类CNV相关黄斑疾病中，可以在F-VEP中检测到N1-P1的振幅明显降低和P波潜伏期明显延长。这一检测证实了本模型在CNV成功建立后可出现与人类疾病类似的表现。
5.血管生成相关因子表达变化检测
采用qRT-PCR检测了MMP-9及PLGF在光凝后3天、7天，于视网膜中的表达趋势，见MMP-9mRNA表达在光凝后3天表达显著上调，光凝后7天又显著下调，PLGF mRNA表达在光凝后3天表达显著上调，光凝后7天表达降低，但仍显著高于正常，见图9。二代测序发现，在光凝后7天，与对照组相比，脉络膜中部分miRNA发生显著差异性表达。在人类CNV疾病中可以观察到MMP-9和PLGF的高表达，这一趋势也在本模型中观察到。
6.病理切片观察及免疫组化观察
与正常组相比，光凝后3天，可见光凝处神经视网膜内核层至RPE层完全断裂，脉络膜毛细血管破损，脉络膜色素细胞由破损处侵入视网膜内，但未突破视网膜全层，未见新生血管形成。光凝后7天，神经视网膜及RPE全层于光凝处断裂，色素细胞由脉络膜侵入视网膜全层，新生血管由脉络膜发出，并由断裂处长入视网膜下及视网膜内。光凝后14天，色素细胞浸润更加明显，新生血管密度及高度均明显增加。光凝后21天-28天，与光凝后14天相比无明显差异，见图11。高倍镜下，可见由脉络膜发出的新生薄壁毛细血管管腔形成，管腔内见红细胞游离其中，新生血管长入视网膜下及视网膜内，偶见其破裂，红细胞溢出至视网膜下，见图10。综上，树鼩CNV模型中，光凝后3天即可见色素细胞由RPE-Bruch膜破裂处侵入视网膜下及视网膜内，光凝后7天即可见CNV形成，光凝后14天可见色素细胞浸润增加，CNV密度及高度增加，光凝后21-28天，CNV形成稳定，无明显变化，CNV形成过程中伴色素性MPs、淋巴细胞等炎细胞浸润。
在随机选取的5个视野中，四个新生血管生成促进因子VEGF-A、VEGF-B、PIGF及FGF-R表达变化趋势见图11。VEGF-A蛋白表达于光凝后3天达高峰，且显著高于正常(P＜0.05)，21天时表达量再次上调并显著高于正常(P＜0.05)。VEGF-B蛋白于光凝后3天与正常比较未见显著差异(P＞0.05)，7-14天表达量上升达高峰，显著高于正常(P＜0.05)。PLGF蛋白于光凝后3天与正常比较未见显著差异(P＞0.05)，光凝后7天表达量上升达高峰，且显著高于正常(P＜0.05)，28天时表达量再次上调并显著高于正常(P＜0.05)，达第二高峰。FGF-R蛋白表达于光凝后3-7天逐渐上升，均显著高于正常(P＜0.05)，光凝后21天再次上升，且显著高于正常(P＜0.05)。在人类CNV疾病中也检测到VEGF-A、VEGF-B、PIGF及FGF-R因子的显著升高。
7.造模成功率计算
以FFA/ICGA上出现典型的CNV表现作为造模成功，造模成功率计算公式如下：
成功率＝造模成功的总点数/激光总点数*100％。
根据FFA/ICGA结果，树鼩CNV形成从造模后7天开始，21天达到高峰，模型可以稳定持续2-3周，总的造模成功率可到70％。
表2.光凝后7天脉络膜中表达差异miRNA
树鼩CNV动物模型成功构建后，可以再次模型基础上开展CNV相关的病理生理机制研究和治疗干预研究，例如CNV发生发展过程中的分子生物学机制、CNV潜在的治疗药物筛选、药物有效性评价等。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (10)
1.一种树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
所有实验树鼩均为成年健康树鼩，年龄在2-3岁之间，体重150~200g，均在造模前，进行裂隙灯和双目间接检眼镜检查，排除眼部疾病；
腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物后，维持麻醉后维持动物体温；激光光凝前25~30min，用复方托吡卡胺滴眼液滴眼以充分散大双眼瞳孔；接着进行双眼点表面麻醉，之后，用卡波姆眼用凝胶滴眼以预防角膜干燥，最后固定动物；
扒开实验动物上下眼睑，将一片盖玻片正中央涂上卡波姆眼用凝胶后盖在树鼩角膜中央；在距视盘1PD的距离，将眼底均等划分为围绕视盘的N个区域，每个区域包含60°范围视网膜；于每个区域中心，避开血管，等距离行氪离子激光光凝，每个区域1个激光斑，击破Bruch膜；N个激光点距离视盘的距离相等，N个激光点之间的距离也相等；N=6~10；
分别于光凝前及光凝后3、7、14、21、28天，观察造模后FFA/ICGA的特征，当FFA/ICGA均出现CNV典型表现，即视为建模成功。
2.根据权利要求1所述的树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，其特征在于，在造模前，深度麻醉后，进行裂隙灯和双目间接检眼镜检查。
3.根据权利要求1所述的树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，其特征在于，腹腔内注射戊巴比妥钠深度麻醉动物时，麻醉剂量为4.5mg/kg。
4.根据权利要求1所述的树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，其特征在于，维持麻醉后动物体温的方式为：采用加热垫维持麻醉后动物体温。
5.根据权利要求1所述的树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，其特征在于，用复方托吡卡胺滴眼液滴眼时，滴眼三次，每次1~2滴，相邻两次间隔5min。
6.根据权利要求1所述的树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，其特征在于，双眼点表面麻醉时，采用盐酸奥布卡因滴眼液，滴眼两次，每次1~2滴，两次间隔2min。
7.根据权利要求1所述的树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，其特征在于，用卡波姆眼用凝胶滴眼一次，用量1~2滴。
8.根据权利要求1所述的树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，其特征在于，激光波长为647.1nm，光凝斑直径50μm，曝光时间0.01s，能量从250mw开始，在周边视网膜上进行能量的滴定根据视网膜的反应，调节能量大小，以光凝后有气泡形成无视网膜出血，标志击破Bruch膜，记为有效点。
9.根据权利要求8所述的树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，其特征在于，如击破小血管时，有出血，该眼不用于建模。
10.根据权利要求1所述的树鼩脉络膜新生血管动物模型的构建方法，其特征在于，所述的CNV典型表现为：在造影的早期出现激光病灶处染料渗漏，随着时间延长渗漏面积不断扩大。
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| CN111139296A (zh) * | 2020-03-10 | 2020-05-12 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 检测树鼩TGF-β基因转录水平的实时荧光定量PCR的引物及方法 |
| CN115804362A (zh) * | 2023-02-08 | 2023-03-17 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 一种IFN-α/βR-/-小鼠抗体依赖性增强感染的注射液及其制备方法 |
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| JPH0789859A (ja) * | 1990-04-05 | 1995-04-04 | Celtrix Pharmaceut Inc | ピラジン誘導体を含む薬剤学的組成物と眼の新血管新生を阻止する治療法 |
| CN102217980A (zh) * | 2010-04-16 | 2011-10-19 | 四川大学华西医院 | 一种恒河猴脉络膜血管新生模型的制备方法 |
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2020
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