CN111433222A - 用于免疫疗法的t细胞受体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了T细胞受体(TCR)和TCR可变区，它们能够选择性地结合SLC45A2。所述TCR可以用在不同的疗法中，诸如自体细胞移植，以治疗癌症，诸如皮肤黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、粘膜黑素瘤或转移性黑素瘤。还提供了用于扩增靶向SLC45A2的T细胞的群体的方法。

Description

用于免疫疗法的T细胞受体
本申请要求于2017年10月12日提交的美国临时申请系列号62/571,447的优先权权益，其整个内容特此通过引用并入。
序列表的并入
被包含在于2018年10月12日创建的44.7KB(如在Microsoft Windows中测量的)的名为“UTFCP1314WO.txt”的文件中的序列表通过电子呈递随同提交，并且通过引用并入本文。
背景
1.技术领域
本发明总体上涉及免疫学和医学领域。更具体地，它涉及T细胞受体(TCR)。在某些实施方案中，所述TCR可以用于治疗癌症。
2.背景技术
基于T细胞的治疗已经显示出作为用于治疗许多癌症的方法的显著前景；遗憾的是，该方案也已经受到针对常见癌症的免疫原性抗原靶标的缺乏和对非癌组织的潜在毒性的阻碍。这些基于T细胞的治疗可以包括过继性细胞转移(ACT)和疫苗接种方案。ACT通常涉及将大量的自体活化的肿瘤特异性T细胞输注到患者中，例如以治疗癌症。ACT已经在黑素瘤患者中引起治疗性临床应答(Yee,2002；Dudley,2002；Yee,2014)。一般而言，为了产生有效的抗肿瘤T细胞应答，通常需要以下三个步骤：使抗原特异性T细胞致敏并活化，使活化的T细胞迁移至肿瘤部位，以及通过抗原特异性T细胞来识别并杀死肿瘤。靶抗原的选择对于有效的抗原特异性T细胞的诱导是重要的。
虽然已经鉴定了黑素瘤和少数其它实体瘤恶性肿瘤的数种肿瘤相关抗原，但是对于胰腺癌、卵巢癌、胃癌、肺癌、宫颈癌、乳腺癌和头颈癌的免疫原性靶标很少。鉴定和验证这些常见的和难以治疗的恶性肿瘤的新表位和靶抗原是有必要的。
发明内容
在某些实施方案中，本公开内容提供了一种经工程改造的T细胞受体(TCR)，其包含α链CDR3和/或β链CDR3，所述α链CDR3与SEQ ID NO:5、15、25、35或45的氨基酸序列具有至少90％、诸如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，所述β链CDR3与SEQ ID NO:10、20、30、40或50的氨基酸序列具有至少90％、诸如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。在特定方面，所述TCR具有SEQ ID NO:5和10、15和20、25和30、35和40或45和50的CDR3氨基酸序列。在特定方面，所述TCR具有SEQID NO:3-5和8-10、13-15和18-20、23-25和28-30、33-35和38-40或43-45和48-50的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。在某些方面，所述经工程改造的TCR结合HLA-A2、HLA-A*0201、HLA-A24和/或HLA-A*2402。
在某些方面，所述TCR包含与SEQ ID NO:2、12、22、32或42的氨基酸序列具有至少90％、诸如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:7、17、27、37或47的氨基酸序列具有至少90％、诸如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的β链可变区。在特定方面，所述TCR包含SEQ ID NO:2、12、22、32或42的α链和/或SEQ ID NO:7、17、27、37或47的β链。在某些方面，所述TCR可以分别包含SEQ ID NO:2和7、12和17、22和27、32和37或42和47的α链和β链。在特定方面，所述TCR可以具有在α链和/或β链的可变区的序列中的变异，同时保持CDR区域的序列恒定。
在某些方面，所述TCR包含与SEQ ID NO:1、11、21、31或41的核苷酸序列具有至少90％、诸如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的α链和/或与SEQ ID NO:6、16、26、36或46的核苷酸序列具有至少90％、诸如91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的β链。在具体方面，所述TCR包含含有SEQ IDNO:1、11、21、31或41的核苷酸序列的α链和/或含有SEQ ID NO:6、16、26、36或46的核苷酸序列的β链。
在某些方面，所述TCR进一步定义为可溶性TCR，其中所述可溶性TCR不包含跨膜结构域。
在某些方面，所述TCR进一步包含可检测标记。在某些方面，所述TCR共价地结合治疗剂。在具体方面，所述治疗剂是免疫毒素或化学治疗剂。
本文进一步提供了多价TCR复合物，其包含多个所述实施方案的TCR。在某些方面，所述多价TCR包含2、3、4或更多个彼此结合的TCR。在特定方面，所述多价TCR存在于脂质双层中、脂质体中或连接至纳米颗粒。在某些方面，所述TCR经由接头分子彼此结合。
在另一个实施方案中，提供了一种编码所述实施方案的TCR的多肽。本文还提供了编码所述实施方案的多肽的多核苷酸。
其它实施方案提供了编码所述实施方案的TCR的表达载体。在某些方面，编码TCR的序列是在启动子的控制下。在特定方面，所述表达载体是病毒载体。在一个具体方面，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在某些方面，所述载体进一步编码接头结构域。在某些方面，所述接头结构域位于α链和β链之间。在某些方面，所述接头结构域包含一个或多个切割位点。在某些方面，所述一个或多个切割位点是弗林蛋白酶切割位点和/或P2A切割位点。在某些方面，所述弗林蛋白酶切割位点是RAKR。在其它方面，所述弗林蛋白酶切割位点是ATNFSLLKQAGDVEENPG(SEQ ID NO:51)。在某些方面，所述一个或多个切割位点被间隔物隔开。在具体方面，所述间隔物是SGSG或GSG。
在另一个实施方案中，提供了一种宿主细胞，其被工程改造成表达所述实施方案的TCR。在某些方面，所述细胞是T细胞、NK细胞、恒定型NK细胞、NKT细胞、间质干细胞(MSC)或诱导的多能干(iPS)细胞。在某些方面，所述宿主细胞是免疫细胞。在特定方面，所述宿主细胞分离自脐带。在某些方面，所述T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞或γδT细胞。在特定方面，所述T细胞是调节性T细胞(Treg)。在某些方面，所述细胞是自体的。在特定方面，所述细胞是同种异体的。
另一个实施方案提供了一种工程改造所述实施方案的宿主细胞的方法，所述方法包括使所述免疫细胞与所述实施方案的TCR或所述实施方案的表达载体接触。在某些方面，所述免疫细胞是T细胞或外周血淋巴细胞。在某些方面，将接触进一步定义为转染或转导。在某些方面，转染包括将编码所述实施方案的TCR的RNA电穿孔进免疫细胞中。
在另外方面，所述方法还包括，在转导所述免疫细胞之前，从编码所述实施方案的TCR的表达载体产生病毒上清液。
在某些方面，所述免疫细胞是经刺激的淋巴细胞。在某些方面，所述经刺激的淋巴细胞是人淋巴细胞。在某些方面，刺激包括使免疫细胞与OKT3和/或IL-2接触或在OKT3和/或IL-2中孵育免疫细胞。
在某些方面，所述方法还包括将免疫细胞分选以分离TCR工程改造的T细胞。在某些方面，所述方法还包括通过系列稀释执行T细胞克隆。在某些方面，所述方法还包括通过快速扩增方案来扩增T细胞克隆。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括将有效量的所述实施方案的TCR工程改造的细胞施用给所述受试者。在某些方面，所述受试者被鉴定为具有HLA-A*0201等位基因或HLA-A*2402等位基因。在某些方面，所述受试者是人。
在某些方面，所述TCR工程改造的细胞是T细胞或外周血淋巴细胞。在具体方面，所述T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞或Treg。
在某些方面，所述癌症是黑素瘤。在特定方面，所述黑素瘤是皮肤黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、粘膜黑素瘤或转移性黑素瘤。在某些方面，所述TCR工程改造的细胞是自体的或同种异体的。
在另外方面，所述方法还包括在施用SLC45A2-特异性的T细胞之前对受试者的淋巴细胞耗竭。在某些方面，淋巴细胞耗竭包括施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。
在某些方面，所述方法还包括施用第二种抗癌疗法。在某些方面，所述疗法是化学疗法、免疫疗法、外科手术、放射疗法或生物疗法。在某些方面，静脉内地、腹膜内地、气管内地、肿瘤内地、肌肉内地、内窥镜地、病灶内地、经皮地、皮下地、局部地或通过直接注射或灌注施用所述TCR工程改造的细胞和/或所述至少第二种治疗剂。在某些方面，所述受试者被确定为具有过表达SLC45A2的癌细胞。
在某些实施方案中，本公开内容提供了选择性地结合SLC45A2的TCR。在某些实施方案中，本文提供的TCR序列的α和β部分可以包含在嵌合抗原受体(CAR)中，所述嵌合抗原受体可以用在过继性T细胞疗法中。在某些实施方案中，所述TCR的α和β部分可以在DNA中编码，所述DNA可以用于例如治疗黑素瘤。可替代地，所述TCR的α和β可变区可以包含在蛋白(诸如TCR或增溶蛋白)中，并用在抗癌疗法诸如过继免疫疗法中。在某些优选的实施方案中，所述TCR、CAR或可溶性肽选择性地结合SLC45A2的特定表位，诸如SLC45A2382-390或SLC45A2393-402免疫原性表位。预见到，所述TCR可以导致对非癌细胞的毒性的下降，且可以对于黑素瘤(例如，皮肤黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、粘膜黑素瘤)的治疗是特别有用的。在某些实施方案中，可以将克隆的T细胞受体包含在嵌合T细胞受体(CAR)中并用在过继性T细胞转移或免疫疗法中。
在某些方面，本公开内容提供了可溶性TCR，其可以直接用于治疗HLA-A2阳性的癌症患者。通过将SLC45A2 TCR连接至CD3-特异性的Fab片段，可以产生可溶性的双特异性的T细胞接合分子。T细胞接合TCR可以通过呈递相应的肽/MHC复合物而结合肿瘤细胞表面，然后Fab片段交联在经历抗原的CD8+T细胞的表面上的TCR，从而引起细胞活化和靶细胞的消除。因此，这种可溶性的双特异性的TCR构建体可以直接用于治疗癌症患者。
最后，可溶性TCR可以用作探针，其用于肿瘤细胞中的肽/MHC的诊断评价，或者用于将治疗分子引导至肿瘤部位。该可溶性TCR分子也可以用示踪剂(诸如荧光探针或放射性探针)进行标记，然后用于肿瘤细胞中的肽/MHC的呈递的诊断评价。此外，该可溶性TCR分子可以与治疗分子(诸如毒素)连接，从而将这些治疗分子引导至肿瘤部位以治疗癌症患者。
在某些方面，可以静脉内地、腹膜内地、气管内地、肿瘤内地、肌肉内地、内窥镜地、病灶内地、经皮地、皮下地、局部地或通过直接注射或灌注施用SLC45A2-特异性的T细胞，其任选地与第二种治疗剂组合。
本公开内容的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含本公开内容的肽或如上所述的肽和赋形剂。可以将药物制剂配制成用于胃肠外施用、静脉内注射、肌肉内注射、吸入或皮下注射。在某些实施方案中，所述肽被包含在脂质体、含有脂质的纳米颗粒或基于脂质的载体中。
本公开内容的另一个方面涉及特定T细胞受体可变区(例如，SEQ ID NO:51-70)。
本文中使用的术语“嵌合抗原受体(CAR)”可以表示例如人工T细胞受体、嵌合T细胞受体或嵌合免疫受体，且包括将人工特异性移植到特定免疫效应细胞上的经工程改造的受体。可以采用CAR将单克隆抗体的特异性赋予在T细胞上，从而允许产生大量特异性T细胞，例如，用于用在过继性细胞疗法中。在具体实施方案中，CAR指导细胞针对例如肿瘤相关抗原的特异性。在某些实施方案中，CAR包含细胞内活化结构域、跨膜结构域和包含肿瘤相关抗原结合区域的细胞外结构域。在特定方面，CAR包含来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)与CD3-ζ跨膜结构域和胞内结构域融合的融合物。其它CAR设计的特异性可以来源于受体(例如肽)的配体或来源于模式识别受体，诸如Dectin。在某些情况下，可以修饰抗原识别结构域的间隔以降低活化诱导的细胞死亡。在某些情况下，CAR包含用于其它共刺激性信号传导的结构域，诸如CD3ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10和/或OX40。在某些情况下，分子可以与CAR共表达，所述分子包括共刺激分子、用于成像(例如用于正电子发射断层摄影术)的报道基因、在添加前药之后有条件地消融T细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体。
就特定组分而言，本文中使用的“基本上没有”在本文中用于表示，特定组分均不被故意地配制在组合物中和/或仅作为污染物或以痕量存在。因此，由组合物的任何非预期污染产生的特定组分的总量远低于0.05％，优选地低于0.01％。最优选的是其中用标准分析方法不可检测到特定组分的量的组合物。
HLA-A2表示人白细胞抗原血清型A2并且也被称作HLA-A*02。许多HLA-A*02等位基因的基因产物的几种血清型是众所周知的，包括HLA-A*0201、*0202、*0203、*0206、*0207和*0211基因产物。
HLA-A24表示人白细胞抗原血清型A24并且也被称作HLA-A*24。许多HLA-A*24等位基因的基因产物的几种血清型是众所周知的，包括HLA-A*2402和*2403基因产物。
当在权利要求书和/或说明书中使用时，术语“抑制”、“减少”或“预防”或这些术语的任何变体包括任何可测量的降低或完全抑制以达到期望的结果。
当在本说明书和/或权利要求书中使用该术语时，术语“有效的”意指足以实现期望的、预期的或想要的结果。
在权利要求书和/或说明书中，术语“一个”或”一种”当与术语“包含”结合使用时可以表示“一个/种”，但它也与“一个/种或多个/种”、“至少一个/种”以及“一个/种或多于一个/种”的含义一致。
预见到，可以相对于本发明的任何方法或组合物实现在本说明书中讨论的任何实施方案，反之亦然。此外，本发明的组合物可以用于实现本发明的方法。
术语“约”、“基本上”和“大约”通常是指所述值加或减5％。
在权利要求书中使用的术语“或”用于表示“和/或”，除非明确表明仅仅表示替代方案或替代方案是相互排斥的，尽管本公开内容支持仅表示替代方案和“和/或”的定义。
在本说明书和权利要求书中使用的词语“包含”(和包含的任意形式，诸如“包括”和“含有”)、“具有”(和具有的任意形式，诸如“有”和“带有”)、“包括”(和包括的任意形式，诸如“包含”和“含有”)或“含有”(和含有的任意形式，诸如“包含”和“包含有”)是包含性的或开放式的，并且不排除其它未列举的元素或方法步骤。
从下面的详细描述会明白本发明的其它目的、特征和优点。但是，应当理解，详细说明和具体实施例虽然指示了本发明的优选实施方案，但是仅通过示例的方式给出，因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步证实本发明的某些方面。通过参考这些附图中的一个或多个，并结合本文中呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本发明。
图1:描绘包含TCRβ链、肽接头和TCRα链的逆转录病毒构建体的示意图。
图2A-B:TCR-转染的T细胞对靶细胞的特异性裂解。通过使用Mel526(HLA A2+)和Mel888(HLA A2-)细胞的铬释放测定，TCR克隆#Vb3的细胞毒活性。为了测试亲代T细胞的细胞毒性活性，进行了标准的铬释放测定，并在TCR-转染的T细胞和亲代T细胞克隆之间进行了对比。图2A,TCR-转染的T细胞可以裂解HLA-A24匹配的靶标Mel888，但不能裂解HLA-A24不匹配的靶标Mel526，两者均表达SLC45A2。图2B,亲代T细胞的细胞毒性活性显示出相似的裂解。
图3A-B:使用TCR逆转录病毒的TCR的稳定表达。TCR克隆Vb3和亲代克隆的SLC45A2四聚体和CD8染色。图3A,用包括TCR基因的逆转录病毒转导活化的自体PBMC。8天以后，将T细胞用SLC45A2-PE缀合的四聚体染色。将SLC45A2四聚体阳性的T细胞分选并进行REP。图3B,从自体PMBC产生亲代T细胞克隆。
图4A-B:TCR-转染的T细胞对靶细胞的特异性裂解。通过使用Mel526(HLA A2+)和Mel888(HLA A2-)细胞的铬释放测定测试TCR克隆#24的细胞毒性活性。为了测试亲代T细胞的细胞毒性活性，进行了标准的铬释放测定并在TCR-转染的T细胞和亲代T细胞克隆之间进行了对比。图4A,TCR-转染的T细胞可以裂解HLAA24匹配的靶标Mel888，但不能裂解HLA-A24不匹配的靶标Mel526，两者均表达SLC45A2。图4B,亲代T细胞的细胞毒性活性显示出相似的裂解。
图5A-B:使用TCR逆转录病毒的TCR的稳定表达。TCR克隆#24和亲代克隆的SLC45A2四聚体和CD8染色。图5A,用包括TCR基因的逆转录病毒转导活化的自体PBMC。8天以后，将T细胞用SLC45A2-PE缀合的四聚体染色。将SLC45A2四聚体阳性的T细胞分选并进行REP。图5B,从自体PMBC产生了亲代T细胞克隆。
图6A-B:TCR-转染的T细胞对靶细胞的特异性裂解。通过使用Mel526(HLA A2+)和Mel888(HLA A2-)细胞的铬释放测定测试TCR克隆#39的细胞毒性活性。为了测试亲代T细胞的细胞毒性活性，进行了标准的铬释放测定并在TCR-转染的T细胞和亲代T细胞克隆之间进行了对比。图6A,TCR-转染的T细胞可以裂解HLA-A24匹配的靶标Mel888，但不能裂解HLA-A24不匹配的靶标Mel526，两者均表达SLC45A2。图6B,亲代T细胞的细胞毒性活性显示出相似的裂解。
图7A-B:使用TCR逆转录病毒的TCR的稳定表达。TCR克隆#39和亲代克隆的SLC45A2四聚体和CD8染色。图7A,用包括TCR基因的逆转录病毒转导了活化的自体PBMC。8天以后，将T细胞用SLC45A2-PE缀合的四聚体染色。将SLC45A2四聚体阳性的T细胞分选并进行REP。图7B,从自体PMBC产生了亲代T细胞克隆。
图8:TCR工程改造的T细胞的四聚体染色检测。将来自SLC45A2CTL(#39克隆)的TCR克隆进逆转录病毒表达载体pMSGV1，并从PBMC的感染产生重组逆转录病毒。感染以后，出现CD8+和CD4+T细胞的四聚体+群体。将CD8+四聚体+和CD4+四聚体+群体分选并用快速扩增方案(REP)扩增，此后测试它们的纯度。
图9:TCR工程改造的T细胞的肽结合滴定测定。将T2细胞用不同浓度的SLC45A2肽(从10pg/mL至10μg/mL)脉冲处理并用51Cr标记。将CD8+或CD4+TCR工程改造的T细胞用作效应细胞并与T2细胞共培养(E:T＝20:1)。共培养4小时以后检测51Cr释放。
图10:CD8+TCR工程改造的T细胞的内源性地呈递的表位识别。CD8+TCR工程改造的T细胞能够杀死Mel526(HLA-A2+,SLC45A2+)和Mel888-A2(HLA-A2强迫的表达,SLC45A2+)肿瘤细胞系，但不能杀死A375(HLA-A2+,SLC45A2-)或Mel624(HLA-A2+,SLC45A2+)肿瘤细胞系(图10)。但是，T细胞能够杀死用SLC45A2肽脉冲处理过的A375细胞。
图11:CD4+TCR工程改造的T细胞的内源性地呈递的表位识别。尽管CD4+TCR工程改造的T细胞在REP以后没有明显产生四聚体+群体，但是它们仍然在长期共培养(20h)以后杀死了肿瘤细胞。
图12A-E:TCR工程改造的T细胞当遇到靶细胞时特异性地应答。进行了内部细胞因子染色(ICS)测定以检测当TCR工程改造的T细胞遇到靶细胞时它们的特异性应答。将Mel526(天然地呈递SLC45A2的内源性表位)、A375(SLC45A2阴性的)、用SLC45A2肽脉冲处理过的T2和用M26肽脉冲处理过的T2(阴性对照)与TCR工程改造的T细胞(CD8+或CD4+,E:T＝10:1)共培养。过夜孵育以后，用ICS检测TNF-α(图12A)、CD107a(图12B)、IFN-γ(图12C)、CD137(图12D)和IL-2(图12E)表达水平。
图13A-13J:包括克隆#24(图13A-B)、克隆#39(图13C-D)、克隆#76(图13E-F)、克隆Vβ3(图13G-H)和克隆Vβ22(图13I-J)的每个TCR克隆的α和β链的序列。有下划线：信号肽；突出显示：可变区；有下划线：CDR1，CDR2，CDR3；黑色：恒定区。
示例性实施方案的描述
I.经工程改造的抗原受体
在不同的方面，本文提供了特异性地结合本公开内容的SLC45A2或SLC45A2肽的T细胞受体(TCR)(例如，SEQ ID NO:1-50)。TCR的抗原结合区域可以作为包含抗原结合区的细胞外结构域包含在嵌合抗原受体(CAR)中。可以将TCR转染进细胞(例如，自体或同种异体细胞)中，所述细胞可以用在过继性细胞转移疗法中。在某些实施方案中，将CAR人源化以降低免疫原性(hCAR)。
在某些实施方案中，可以遗传工程改造本公开内容的宿主细胞，诸如T细胞(例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞、γδT细胞和Treg)、NK细胞、恒定型NK细胞、NKT细胞、间质干细胞(MSC)、诱导的多能干(iPS)细胞，以表达抗原受体诸如经工程改造的TCR和/或嵌合抗原受体(CAR)。例如，修饰自体细胞或同种异体细胞(例如，分离自脐带)以表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。在特定实施方案中，所述抗原受体对SLC45A2(诸如肽SLC45A2382-390或SLC45A2393-402肽)具有抗原特异性。在某些实施方案中，所述经工程改造的TCR具有α链CDR3和/或β链CDR3，所述α链CDR3与SEQ ID NO:5、15、25、35或45具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性，所述β链CDR3与SEQ ID NO:10、20、30、40或50具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性。在某些实施方案中，所述TCR具有α链和/或β链，所述α链与SEQ ID NO:1、2、11、12、21、22、31、32、41或42具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性，所述β链与SEQ ID NO:6、7、16、17、26、27、36、37、46或47具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％序列同一性。合适的修饰方法是本领域已知的。参见，例如，Sambrook和Ausubel,出处同上。例如，使用在Heemskerk等人.Hum Gene Ther.19:496-510(2008)和Johnson等人.Blood 114:535-46(2009)中描述的转导技术，可以将T细胞转导以表达对癌症抗原具有抗原特异性的T细胞受体(TCR)。
编码全长TCRα和β(或γ和δ)链的RNA的电穿孔可以用作替代方案，以克服因逆转录病毒转导的TCR链和内源性TCR链的配对而引起的自身反应性长期问题。即使这种替代配对发生在瞬时转染策略中，可能产生的自身反应性T细胞通常也会在一段时间后失去这种自身反应性，因为引入的TCRα和β链仅仅瞬时表达。当引入的TCRα和β链表达减少时，仅剩下正常的自体T细胞。当通过稳定的逆转录病毒转导引入全长TCR链时，情况并非如此，其不会丢失引入的TCR链，从而在患者中引起恒定存在的自身反应性。
示例性的抗原受体(包括CAR和重组TCR)以及用于工程改造受体并将所述受体引入细胞中的方法，包括例如在以下文献中描述的那些：国际专利申请公开号WO200014257,WO2013126726,WO2012/129514,WO2014031687,WO2013/166321,WO2013/071154,WO2013/123061，美国专利申请公开号US2002131960,US2013287748,US20130149337,美国专利号:6,451,995,7,446,190,8,252,592,8,339,645,8,398,282,7,446,179,6,410,319,7,070,995,7,265,209,7,354,762,7,446,191,8,324,353,和8,479,118，和欧洲专利申请号EP2537416，和/或Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75描述的那些。在某些方面，所述遗传工程改造的抗原受体包括在美国专利号7,446,190中描述的CAR和在国际专利申请公开号WO/2014055668Al中描述的那些。
A.T细胞受体(TCR)
在某些实施方案中，所述遗传工程改造的抗原受体包括重组T细胞受体(TCR)和/或从天然存在的T细胞克隆的TCR。“T细胞受体”或“TCR”表示这样的分子：其含有可变α和β链(分别也被称作TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(分别也被称作TCRy和TCRδ)，且其能够特异性地结合与MHC受体结合的抗原肽。在某些实施方案中，所述TCR呈αβ形式。在某些实施方案中，所述经工程改造的TCR具有SEQ ID NO:5、15、25、35或45的α链CDR3和/或SEQ ID NO:10、20、30、40或50的β链CDR3。在某些实施方案中，所述TCR分别具有SEQ ID NO:1、2、11、12、21、22、31、32、41或42的α链和SEQ ID NO:6、7、16、17、26、27、36、37、46或47的β链。
一般来说，以αβ和γδ形式存在的TCR通常在结构上相似，但表达它们的T细胞可能具有不同的解剖学位置或功能。TCR可以出现在细胞表面上或呈可溶形式。通常，TCR出现在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上，在那里它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。在某些实施方案中，TCR也可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短细胞质尾巴(参见，例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health andDisease,第3版,Current Biology Publications,第433页,1997)。例如，在某些方面，TCR的每条链可以具有一个N-端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、一个跨膜区和一个在C-末端端部处的短细胞质尾巴。在某些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的恒定蛋白结合。除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖其功能性TCR片段。该术语还涵盖完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。
因而，就本文的目的而言，对TCR的提及包括任何TCR或功能片段，例如与在MHC分子中结合的特定抗原肽(即MHC-肽复合物)结合的TCR的抗原结合部分。TCR的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”可互换使用，表示这样的分子：其含有TCR的结构性结构域的一部分，但结合完全TCR所结合的抗原(例如MHC-肽复合物)。在某些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域，诸如TCR的可变α链和可变β链，其足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点，例如通常其中每条链含有三个互补性决定区。
在某些实施方案中，TCR链的可变结构域结合以形成环，或类似于免疫球蛋白的互补性决定区(CDR)，其通过形成TCR分子的结合位点来赋予抗原识别和决定肽特异性并决定肽特异性。一般来说，与免疫球蛋白类似，CDR被框架区(FR)隔开(参见，例如，Jores等人,PNAS U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；也参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在某些实施方案中，CDR3是负责识别经加工的抗原的主要CDR，尽管α链的CDR1也已被证实与抗原肽的N端部分相互作用，而β链的CDR1与肽的C端部分相互作用。认为CDR2识别MHC分子。在某些实施方案中，β-链的可变区可以含有另一个高变异性(HV4)区域。
在某些实施方案中，所述TCR链含有恒定结构域。例如，与免疫球蛋白类似，TCR链(例如，α-链、β-链)的细胞外部分可以含有两个免疫球蛋白结构域、一个在N端的可变结构域(例如，Va或Vp；通常是基于Kabat编号的氨基酸1-116，Kabat等人,“Sequences ofProteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,第5版)、以及一个与细胞膜相邻的恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Ca，通常是基于Kabat的氨基酸117-259；β-链恒定结构域或Cp，通常是基于Kabat的氨基酸117-295)。例如，在某些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个近膜端恒定结构域和两个含有CDR的远膜端可变结构域。TCR结构域的恒定结构域含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，在两条链之间形成连接。在某些实施方案中，TCR可以具有在α链和β链的每一个中的额外半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
在某些实施方案中，所述TCR链可以含有一个跨膜结构域。在某些实施方案中，所述跨膜结构域是带正电荷的。在某些情况下，所述TCR链含有一个细胞质尾巴。在某些情况下，所述结构允许TCR与其它分子(如CD3)结合。例如，含有具有跨膜区的恒定结构域的TCR可以将蛋白锚定在细胞膜中并与CD3信号传导器(apparatus)或复合物的恒定亚基结合。
一般来说，CD3是可以具有三条不同链(γ、δ和ε)(在哺乳动物中)和ζ链的多蛋白复合物。例如，在哺乳动物中，所述复合物可以含有一个CD3γ链、一个CD3δ链、两个CD3ε链以及CD3ζ链的同源二聚体。CD3γ、CD3δ和CD3ε链是含有单个免疫球蛋白结构域的免疫球蛋白超家族的高度相关的细胞表面蛋白。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的跨膜区带负电荷，这是允许这些链与带正电荷的T细胞受体链结合的特征。CD3γ、CD3δ和CD3ε链的胞内尾巴各自含有单个保守基序(称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM)，而每个CD3ζ链具有三个保守基序。通常，ITAM参与TCR复合物的信号传导能力。这些辅助分子具有带负电荷的跨膜区，并在将信号从TCR传送到细胞中发挥作用。CD3链和ζ链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。
在某些实施方案中，所述TCR可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异源二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在某些实施方案中，所述TCR是含有例如通过一个或更多个二硫键连接的两条独立链(α和β链或γ和δ链)的异源二聚体。在某些实施方案中，鉴定针对靶抗原(例如癌症抗原)的TCR并将其引入细胞中。在某些实施方案中，编码TCR的核酸可从多种来源获得，例如通过公众可得到的TCR DNA序列的聚合酶链式反应(PCR)扩增。在某些实施方案中，TCR获自生物来源，例如获自细胞，例如获自T细胞(例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其它公众可获得的来源。在某些实施方案中，T细胞可获自体内分离的细胞。在某些实施方案中，可以从患者分离高亲和力T细胞克隆，并分离TCR。在某些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在某些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如人白细胞抗原系统或HLA)工程改造的转基因小鼠中产生了针对靶抗原的TCR克隆。参见例如肿瘤抗原(参见，例如，Parkhurst等人(2009)Clin Cancer Res.15:169-180和Cohen等人(2005)J Immunol.175:5799-5808)。在某些实施方案中，噬菌体展示用于分离针对靶抗原的TCR(参见，例如，Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390-1395和Li(2005)NatBiotechnol.23:349-354)。在某些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可根据TCR序列的知识合成地产生。
B.嵌合T细胞受体
在某些实施方案中，所述经工程改造的抗原受体包括嵌合抗原受体(CAR)，包括活化性或刺激性CAR、共刺激性CAR(参见WO2014/055668)和/或抑制性CAR(iCAR,参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)。CAR通常包括在一些方面通过接头和/或跨膜结构域与一个或更多个细胞内信号传导组分连接的细胞外抗原(或配体)结合结构域。这样的分子通常模拟或接近通过天然抗原受体的信号、通过与共刺激受体组合的这样的受体的信号和/或仅通过共刺激受体的信号。在某些实施方案中，所述CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，诸如从单克隆抗体(mAb)的可变重(VH)链和可变轻(VL)链衍生出的单链抗体片段(scFv)。
CAR的抗原结合结构域的排列可以是多聚体，诸如双体(diabody)或多聚体。通过将轻链和重链的可变部分交叉配对成所谓的双体，可以形成多聚体。在某些实施方案中，可以缩短或排除CAR的铰链部分(即，产生仅包含抗原结合结构域、跨膜区和细胞内信号传导结构域的CAR)。多种铰链可以与本发明一起使用，例如，如在表1中所示。在某些实施方案中，铰链区可以具有被保持的第一半胱氨酸或通过脯氨酸或丝氨酸置换而突变的第一半胱氨酸，或被截短直至第一半胱氨酸。可以从用作抗原结合区的scFv删除Fc部分，以产生根据本发明的CAR。在某些实施方案中，抗原结合区可以仅编码Fc结构域之一，例如来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。一种还可以包括人免疫球蛋白的铰链、CH2和CH3区域，其已被修饰以改善二聚化和寡聚化。在某些实施方案中，铰链部分可以包含8-14个氨基酸的肽(例如，12个氨基酸的肽)、CD8α的部分或IgG4 Fc，或者由8-14个氨基酸的肽(例如，12个氨基酸的肽)、CD8α的部分或IgG4 Fc组成。在某些实施方案中，使用促进寡聚化的结构域诸如CD8α，可以从细胞表面悬挂抗原结合结构域。在某些实施方案中，使用被单克隆抗体(mAb)克隆2D3(例如，在Singh等人,2008中描述的mAb克隆2D3)识别的结构域，可以从细胞表面悬挂抗原结合结构域。
CAR的胞内结构域或细胞内信号传导结构域通常可以引起或促进包含CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的激活。例如，胞内结构域可以促进T细胞的效应子功能，例如，细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。在初始、记忆或记忆型T细胞中的效应子功能可以包括抗原依赖性增殖。术语“细胞内信号传导结构域”或“胞内结构域”表示CAR的可以转导效应子功能信号和/或指导细胞执行专门功能的部分。尽管通常整个细胞内信号传导结构域都可以包含在CAR中，但在某些情况下，可以包含胞内结构域的截短部分。通常，胞内结构域包括截短的胞内结构域，其中截短的胞内结构域保留在细胞中转导效应子功能信号的能力。
在某些实施方案中，胞内结构域包含T细胞受体的ζ链或其任何同源物(例如，η、δ、γ或ε)、MB1链、B29、Fc RIII、Fc RI、和信号传导分子的组合诸如CD3ζ和CD28、CD27、4-1BB、DAP-10、OX40以及它们的组合，以及其它相似的分子和片段。可以使用活化蛋白家族的其它成员的细胞内信号传导部分，诸如FcγRIII和FcεRI。这些可选的跨膜和细胞内结构域的例子可以参见：例如，Gross等人(1992)，Stancovski等人(1993)，Moritz等人(1994)，Hwu等人(1995)，Weijtens等人(1996)和Hekele等人(1996)，将它们全部内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，胞内结构域可以包含人CD3ζ细胞内结构域。
抗原特异性的细胞外结构域和细胞内信号传导结构域优选地通过跨膜结构域连接。在CAR中可以包含的跨膜结构域包括，例如，人IgG4 Fc铰链和Fc区、人CD4跨膜结构域、人CD28跨膜结构域、跨膜人CD3ζ结构域或半胱氨酸突变的人CD3ζ结构域、或来自人跨膜信号传导蛋白的跨膜结构域，例如，CD16和CD8和促红细胞生成素受体。跨膜结构域的例子提供在例如表1中。
在某些实施方案中，所述胞内结构域包含编码共刺激受体的序列，所述共刺激受体例如，经修饰的CD28细胞内信号传导结构域或CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10或4-1BB(CD137)共刺激受体。在某些实施方案中，由CD3ζ引发的主要信号、由人共刺激受体提供的另外信号可以被包括在CAR中以更有效地激活转化的T细胞，这可以帮助改善过继免疫疗法的体内持久性和治疗成功。如表1所示，胞内结构域或细胞内受体信号传导结构域可以包含单独的或与FcγRIII共刺激信号传导结构域(例如，CD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2、4-1BB)组合的CD3的ζ链。在某些实施方案中，所述胞内结构域包含TCRζ链、CD28、CD27、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12和CD40中的一个或多个的部分或全部。在某些实施方案中，胞内结构域可以包含1、2、3、4或更多个胞质结构域。例如，在某些CAR中已经观察到，融合在一起的至少两个或三个信号传导结构域可以产生累加或协同效应。
在某些方面，可以产生分离的核酸片段和表达盒，其包括编码CAR的DNA序列。可以使用多种载体。在某些优选的实施方案中，载体可以允许将编码CAR的DNA递送至免疫细胞诸如T细胞。CAR表达可以是在受调节的真核启动子(例如MNDU3启动子、CMV启动子、EF1α启动子或泛素启动子)的控制下。并且，如果没有其它原因，载体可以包含选择标记，以促进其体外操作。在某些实施方案中，可以从体外从DNA模板转录的mRNA表达CAR。
嵌合抗原受体分子是重组的，并且通过经由存在于它们的细胞质尾巴中的免疫受体激活基序(ITAM)结合抗原并转导激活信号的能力而区分。利用抗原结合部分(例如，从单链抗体(scFv)产生)的受体构建体会提供成为“通用”的额外优点，因为它们可以以不依赖HLA的方式结合靶细胞表面上的天然抗原。例如，scFv构建体可以与编码CD3复合物的ζ链(ζ)、Fc受体γ链和sky酪氨酸激酶的细胞内部分的序列融合(Eshhar等人,1993；Fitzer-Attas等人,1998)。已经在几种鼠和人抗原-scFv:ζ系统中记录了重定向的T细胞效应子机制，包括通过CTL的肿瘤识别和溶解(Eshhar等人,1997；Altenschmidt等人,1997；Brocker等人,1998)。
在某些实施方案中，TCR作为抗原结合结构域(例如，作为scFv区)包含在CAR中，并且CAR进一步包含铰链区、跨膜区和胞内结构域。例如，TCR(例如，SEQ ID NO:51-70)可以与铰链区、跨膜区和胞内结构域一起包括在CAR中，所述铰链区、跨膜区和胞内结构域如下表1所述。
表1.在抗-SLC45A2靶向CAR中可以包含的区域
Figure BDA0002506020640000181
Figure BDA0002506020640000191
Figure DA00025060206435545
Figure BDA0002506020640000192
Figure BDA0002506020640000201
ζ-zeta；Δ-突变体；注意＝4-1BB也被称作CD137；“+”表示不同区域的融合体。
II.可溶性TCR
在某些实施方案中，本公开内容提供了可溶性TCR，诸如本文提供的SLC45A2 TCR。可溶性TCR不仅出于研究特定TCR-pMHC相互作用的目的是有用的，而且潜在地可用作检测感染或检测自身免疫病标志物的诊断工具。可溶性TCR还可应用于染色，例如用于针对在MHC背景下呈递的特定肽抗原的存在而对细胞染色。类似地，可溶性TCR可用于将治疗剂(例如细胞毒性化合物或免疫刺激化合物)递送至呈递特定抗原的细胞。可溶性TCR还可用于抑制T细胞，例如，与自身免疫肽抗原反应的那些。
在本申请的上下文中，“溶解度”被定义为在1mg/ml的浓度在磷酸盐缓冲盐水(PBS)(KCL 2.7mM,KH2PO4 1.5mM,NaCl 137mM和Na2PO4 8mM,pH 7.1-7.5.LifeTechnologies,Gibco BRL)中TCR被纯化为单分散异源二聚体且在25℃温育1小时之后超过90％的所述TCR保持为单分散异源二聚体的能力。
在某些方面，本公开内容提供了一种可溶性的T细胞受体(sTCR)，其包含：(i)TCRα链的全部或部分(例如，SEQ ID NO:1、2、11、12、21、22、31、32、41或42)，除了其跨膜结构域之外，和(ii)TCRβ链的全部或部分(例如，SEQ ID NO:6、7、16、17、26、27、36、37、46或47)，除了其跨膜结构域之外，其中(i)和(ii)各自包含TCR链的功能可变结构域和至少一部分的恒定结构域，并且通过在天然TCR中不存在的恒定结构域残基之间的二硫键连接。
在某些方面，所述可溶性TCR包含借助于一对C-端二聚化肽(诸如亮氨酸拉链)而分别二聚到TCRβ或δ链细胞外结构域的TCRα或γ链细胞外结构域(国际专利公开号WO 99/60120；美国专利号7,666,604)。
本公开内容的可溶性TCR(其优选是人的)可以以基本上纯的形式或作为经纯化或经分离的制剂提供。例如，其可以以基本上不含其它蛋白的形式提供。
本公开内容的多种可溶性TCR可以以多价复合物提供。因此，在一个方面，本公开内容提供了多价T细胞受体(TCR)复合物，其包含多个如本文中所述的可溶性T细胞受体。所述多个可溶性TCR的每一个优选是相同的。
在其最简单的形式中，根据本发明的多价TCR复合物包含优选通过接头分子彼此结合(例如共价地或以其它方式连接)的两个或三个或四个或更多个T细胞受体分子的多聚体。合适的接头分子包括、但不限于多价附接分子，诸如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中和亲和素和extravidin，它们各自具有四个针对生物素的结合位点。因而，生物素化的TCR分子可以形成到具有多个TCR结合位点的T细胞受体的多聚体中。多聚体中TCR分子的数目将取决于与用于制造多聚体的接头分子的量相关的TCR的量，还取决于是否存在任何其它生物素化的分子。优选的多聚体是二聚体、三聚体或四聚体TCR复合物。
用于本发明方法中的合适的结构包括膜结构诸如脂质体，以及固体结构，其优选为颗粒，诸如珠子，例如胶乳珠子。可以在外部包被有T细胞受体分子的其它结构也是合适的。优选地，所述结构包被有T细胞受体多聚体而不是包被有单独T细胞受体分子。
在脂质体的情况下，T细胞受体分子或其多聚体可以与膜附接或以其它方式与膜结合。用于此的技术是本领域技术人员众所周知的。
可以在本发明的多价TCR复合物中包括标记或另外的部分(例如毒性或治疗性部分)。例如，标记或另外的部分可以被包含在混合分子多聚体中。这样的多聚体分子的一个例子是四聚体，其含有三个TCR分子和一个过氧化物酶分子。这可以如下实现：以约3:1的摩尔比混合TCR和酶以产生四聚体复合物，并从任何不含有正确分子比例的复合物中分离所期望的复合物。这些经混合的分子可以含有任何分子的组合，前提条件是，空间位阻不会损害或不会显著地损害分子的期望功能。由于不太可能发生空间位阻，链霉抗生物素蛋白分子上的结合位点的定位适合用于混合四聚体。
可替换地或额外地，本公开内容的TCR(或其多价复合物)可以与治疗剂结合(例如与其共价地或以其它方式连接)，所述治疗剂可以是例如可用于细胞杀死中的毒性部分，或者免疫刺激剂(诸如白介素或细胞因子)。与非多聚体的T细胞受体异源二聚体相比，本发明的多价TCR复合物可以具有增强的对TCR配体的结合能力。因此，根据本发明的多价TCR复合物特别有益于在体外或在体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，并且还可用作用于生产具有此类用途的另外多价TCR复合物的中间体。因此，TCR或多价TCR复合物可以提供在用于体内应用的药学上可接受的制剂中。
本公开内容还提供了用于将治疗剂递送至靶细胞的方法，所述方法包括在使TCR或多价TCR复合物与靶细胞附接的条件下使潜在的靶细胞与根据本公开内容的TCR或多价TCR复合物接触，所述TCR或多价TCR复合物对TCR配体具有特异性并且具有与之结合的治疗剂。
具体地，可溶性TCR或多价TCR复合物可以用于将治疗剂递送至呈递特定抗原的细胞的位置。这在许多情况下将是有用的，特别是针对肿瘤。可以递送治疗剂，以使其在局部但不仅在其结合的细胞上发挥其作用。因此，一种特定策略设想了与对肿瘤抗原特异的T细胞受体或多价TCR复合物连接的抗肿瘤分子。
许多治疗剂可用于该用途，例如放射性化合物、酶(例如，穿孔蛋白)或化学治疗剂(例如，顺铂)。为了改善在期望位置中的有限毒性效应，可以将毒素提供在与链霉抗生物素蛋白连接的脂质体内部，使得化合物缓慢地释放。这可以减少在体内转运期间的损伤作用，并帮助限制毒素效应直到TCR与相关抗原呈递细胞结合之后。
其它合适的治疗剂包括：
●小分子细胞毒性剂，即具有小于700道尔顿的分子量、具有杀死哺乳动物细胞的能力的化合物。这样的化合物还可以含有能够具有细胞毒性效应的毒性金属。此外，应当理解，这些小分子细胞毒性剂也包括前药，即在生理条件下衰变或转变以释放细胞毒性剂的化合物。这样的药剂的例子包括顺铂、美坦辛衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡奇霉素、多西他赛、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、卟吩姆钠光敏素II(sorfimer sodiumphotofrin II)、替莫唑胺、托泊替康、三甲曲沙葡萄糖醛酸盐、耳他汀E长春新碱和多柔比星；
●肽细胞毒素，即具有杀死哺乳动物细胞的能力的蛋白或其片段。例子包括蓖麻蛋白、白喉毒素、假单胞菌属细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；
●放射性核素，即元素的不稳定同位素，其随着α或β颗粒或γ射线中的一种或更多种的同时发射而衰变。例子包括碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213；
●前药，例如抗体导向的酶前药；以及
●免疫刺激剂，即刺激免疫应答的部分。例子包括：细胞因子，例如IL-2；趋化因子，例如IL-8；血小板因子4；黑素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，例如抗CD3抗体或其片段；补体激活剂；异种蛋白结构域；同种异体蛋白结构域；病毒/细菌蛋白结构域以及病毒/细菌肽。
本公开内容的可溶性TCR可以用于通过结合特异性TCR配体并从而抑制T细胞活化来调节T细胞活化。涉及T细胞介导的炎症和/或组织损伤的自身免疫病(例如I型糖尿病)将适用该方案。对于该用途，需要了解由相关pMHC呈递的特定肽表位。
还设想了本公开内容的可溶性TCR和/或多价TCR复合物在制备用于治疗癌症或自身免疫病的组合物中的用途。
还提供了治疗癌症或自身免疫病的方法，其包括向有此需要的患者施用有效量的本发明的可溶性TCR和/或多价TCR复合物。
如在抗癌和自身免疫治疗中常见的，本公开内容的sTCR可以与其它药剂组合使用，用于治疗癌症和自身免疫病以及在类似患者组中发现的其它相关病症。
III.过继性细胞转移疗法
本文提供了用于在个体中治疗癌症或延迟癌症进展的方法，其包括向所述个体施加有效量的抗原特异性细胞(例如，自体或同种异体T细胞(例如，调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、NK细胞、恒定型NK细胞、NKT细胞、间质干细胞(MSC)或诱导的多能干(iPS)细胞)疗法，诸如SLC45A2-特异性的细胞疗法。本文还提供了使用遗传工程改造的TCR-转导的T细胞(例如，表达包含SEQ ID NO:51-70之一的TCR)的过继性T细胞疗法。在其它实施方案中，提供了用于治疗癌症(例如，黑素瘤)的方法，其包括用经纯化的肿瘤抗原或免疫优势的肿瘤抗原特异性肽免疫受试者。在某些实施方案中，将过继性细胞转移疗法与第二疗法(诸如化学疗法、放射疗法、外科手术或第二免疫疗法)组合地提供给受试者(例如，人患者)。
本公开内容的实施方案涉及获得TCR工程改造的细胞并将其作为免疫疗法施用给受试者以靶向癌细胞。具体地，TCR工程改造的细胞(例如，自体或同种异体T细胞(例如，调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、NK细胞、恒定型NK细胞、NKT细胞、间质干细胞(MSC)或诱导的多能干(iPS)细胞)是抗原特异性的细胞(例如，SLC45A2-特异性的细胞)。在过去的二十年中已经描述了数种用于功能性抗肿瘤效应细胞的衍生、活化和扩增的基本方案。这些包括：自体细胞，诸如肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)；使用自体DC、淋巴细胞、人工抗原呈递细胞(APC)或包被有T细胞配体和活化抗体的珠子离体活化的T细胞，或通过捕获靶细胞膜分离的细胞；天然地表达抗宿主肿瘤T细胞受体(TCR)的同种异体细胞；以及在遗传上重新程序化或“重定向”以表达肿瘤反应性TCR或嵌合TCR分子(其展现出抗体样肿瘤识别能力，被称作“T-体”)的非肿瘤特异性自体或同种异体细胞。这些方案已经产生了许多用于T细胞制备和免疫接种的方案，其可用于本文所述的方法中。
A.T细胞制备和施用
在某些实施方案中，T细胞是自体的。但是，所述细胞可以是同种异体的。在某些实施方案中，T细胞是从患者分离的，因此所述细胞是自体的。如果T细胞是同种异体的，则可以从数个供体汇集T细胞。以足以控制、降低或消除所治疗的疾病的症状和征象的量将细胞施用给目标受试者。
在某些实施方案中，T细胞来源于血液、骨髓、淋巴、脐带或淋巴样器官。在某些方面，细胞是人细胞。细胞通常是原代细胞，例如从受试者直接分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在某些实施方案中，细胞包括T细胞或其它细胞类型的一个或更多个亚群，例如全部T细胞群、CD4+细胞、CD8+细胞、及其亚群，诸如由以下限定的那些：功能、活化状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标志物或细胞因子分泌特征、和/或分化程度。与待治疗的受试者相关，细胞可以是同种异体的和/或自体的。在某些方面，例如对于现成技术，细胞是多能的和/或全能的，例如干细胞，例如诱导的多能干细胞(iPSC)。在某些实施方案中，如本文中所述的，所述方法包括从受试者分离细胞，制备、处理、培养和/或工程改造它们，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一患者中。
在T细胞的亚型和亚群(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)中是初始T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型，例如干细胞记忆T(TSCM)细胞、中枢记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞或终末分化效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助性T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜层相关的恒定型T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助性T细胞诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助性T细胞、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在某些实施方案中，一个或更多个T细胞群富集或耗尽对特定标志物(例如表面标志物)呈阳性的细胞，或对特定标志物呈阴性的细胞。在某些情况下，这样的标志物是在某些T细胞(例如非记忆细胞)群体上不存在或以相对低的水平表达、但是在某些其它T细胞(例如记忆细胞)群体上存在或以相对较高的水平表达的那些。
在某些实施方案中，通过在非T细胞(诸如B细胞、单核细胞或其它白血细胞)上表达的标志物(诸如CD14)的阴性选择，使T细胞从PBMC样品分离。在某些方面，将CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助性T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过在一个或更多个初始T细胞、记忆T细胞和/或效应T细胞亚群上表达或表达至相对较高程度的标志物的阳性或阴性选择，这样的CD4+和CD8+群体可以进一步分类成亚群。
在某些实施方案中，CD8+T细胞进一步富集或耗尽初始细胞、中枢记忆细胞、效应记忆细胞和/或中枢记忆干细胞，例如通过基于与相应亚群相关的表面抗原的阳性或阴性选择。在某些实施方案中，进行中枢记忆T(TCM)细胞的富集以提高效力，例如以改善在施用之后的长期存活、扩增和/或移植物植入，这在某些方面在这样的亚群中是特别稳健的。参见Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在某些实施方案中，T细胞是自体T细胞。在该方法中，从患者获得肿瘤样品并获得单细胞悬液。以任何合适的方式，例如机械地(使用例如gentleMACSTM解离器(MiltenyiBiotec,Auburn,Calif.)解离肿瘤)或酶促地(例如胶原酶或DNA酶)，可以获得单细胞悬液。将肿瘤酶消化物的单细胞悬液在白介素-2(IL-2)中培养。培养细胞直至汇合(例如，约2×106个淋巴细胞)，例如，约5天至约21天，优选约10天至约14天。例如，可以将细胞培养从5天、5.5天或5.8天至21天、21.5天或21.8天，诸如从10天、10.5天或10.8天至14天、14.5天或14.8天。
可以将培养的T细胞合并和快速扩增。快速扩增会提供抗原特异性T细胞的数目在约10天至约14天的时间内至少约50倍(例如，50-、60-、70-、80-、90-或100-倍或更大)的增加。更优选地，快速扩增会提供在约10天至约14天的时间内至少约200倍(例如，200-、300-、400-、500-、600-、700-、800-、900-倍或更大)的增加。
可以通过本领域中已知的许多方法中的任一种来完成扩增。例如，在有饲养淋巴细胞和白介素-2(IL-2)或白介素-15(IL-15)(其中IL-2为优选)存在下使用非特异性T细胞受体刺激，可以快速扩增T细胞。非特异性T细胞受体刺激可以包括约30ng/ml的OKT3(一种小鼠单克隆抗-CD3抗体，可从
Figure BDA0002506020640000271
Raritan,N.J.获得)。可替换地，在有T细胞生长因子(例如诸如300IU/ml IL-2或IL-15，其中IL-2为优选)存在下，通过用一种或更多种癌症抗原(包括其抗原性部分，例如表位或细胞)(其可以任选地从载体表达，诸如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽)在体外刺激外周血单核细胞(PBMC)，可以快速扩增T细胞。通过用脉冲至表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激，快速扩增在体外诱导的T细胞。可替换地，可以例如用经辐射的自体淋巴细胞或者用经辐射的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激T细胞。
可以修饰自体T细胞以表达促进自体T细胞的生长和活化的T细胞生长因子。合适的T细胞生长因子包括例如白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12。合适的修饰方法是本领域中已知的。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.2001；和Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons,NY,1994。在特定方面，经修饰的自体T细胞以高水平表达T细胞生长因子。T细胞生长因子编码序列，例如IL-12的编码序列，在本领域中是容易获得的，启动子也是如此，其与T细胞生长因子编码序列的可操作连接会促进高水平表达。
在某些实施方案中，与自体T细胞同时或在自体T细胞之后将促进自体T细胞生长和活化的T细胞生长因子施用给受试者。T细胞生长因子可以是促进自体T细胞的生长和活化的任何合适的生长因子。合适的T细胞生长因子的例子包括白介素(IL)-2、IL-7、IL-15和IL-12，它们可以单独地或以不同组合使用，诸如IL-2和IL-7，IL-2和IL-15，IL-7和IL-15，IL-2、IL-7和IL-15，IL-12和IL-7，IL-12和IL-15，或IL-12和IL2。IL-12是优选的T细胞生长因子。
可以静脉内地、肌肉内地、皮下地、透皮地、腹膜内地、鞘内地、胃肠外地、鞘内地、腔内的、心室内地、动脉内地、或经由脑脊液、或通过任何可植入的或半可植入的永久性或可降解装置施用T细胞。基于待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和进程、个体的临床状况、个体的临床史和对治疗的应答以及主治医师的判断，可以确定T细胞疗法的合适剂量。
对于离散的、实体的、可及的肿瘤，特别考虑肿瘤内注射或注射到肿瘤脉管系统中。局部、区域或全身施用也可以是合适的。对于>4cm的肿瘤，要施用的体积将为约4-10ml(特别是10ml)，而对于＜4cm的肿瘤，将使用约1-3ml的体积(特别是3ml)。作为单剂量递送的多次注射包含约0.1至约0.5ml体积。
在某些实施方案中，可以将编码CAR的裸露DNA或合适载体引入受试者的T细胞(例如，得自患有癌症或其它疾病的人患者的T细胞)。使用裸露DNA通过电穿孔稳定转染T细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利号6,410,319。裸露DNA通常表示以适当的表达方向包含在质粒表达载体中的编码本发明的嵌合受体的DNA。在某些实施方案中，裸露DNA的使用可以减少产生T细胞(其表达通过本发明的方法产生的CAR)所需的时间。
可替换地，可以使用病毒载体(例如逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)将嵌合构建体引入T细胞。通常，用于转染来自受试者的T细胞的、编码CAR的载体通常应在受试者的T细胞中不复制。已知大量基于病毒的载体，其中维持在细胞中的病毒的拷贝数足够低以维持细胞的生存力。示例性载体包括pFB-neo载体
Figure BDA0002506020640000281
以及基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。
一旦确定转染或转导的T细胞能够以所需的调节和所需的水平表达CAR作为表面膜蛋白，就可以确定嵌合受体在宿主细胞中是否具有功能以提供所需的信号诱导。随后，可以将转导的T细胞重新引入或施用给受试者以激活受试者中的抗肿瘤应答。为了促进施用，可以将转导的T细胞与合适的载体或稀释剂一起制成药物组合物或制成适于体内施用的植入物，所述载体或稀释剂优选地是药学上可接受的。在本领域中已经描述了制备这样的组合物或植入物的方法(参见，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mack,编(1980))。在适当的情况下，可以以用于它们的相应施用途径的常规方式将表达CAR的转导T细胞配制成半固体或液体形式的制剂，例如胶囊、溶液、注射剂、吸入剂或气雾剂。可以利用本领域已知的手段来防止或最小化组合物在到达目标组织或器官之前的释放和吸收，或者确保组合物的定时释放。通常，优选采用不影响表达嵌合受体的细胞的药学上可接受的形式。因此，理想地，可以将转导的T细胞制成药物组合物，其含有平衡盐溶液诸如汉克斯(Hanks)平衡盐溶液或生理盐水。
B.抗原呈递细胞
通过其对特定MHC分子的表达来区分抗原呈递细胞，其包括巨噬细胞、B淋巴细胞和树突细胞。APC内化抗原并与在其外细胞膜上的MHC分子一起重新表达该抗原的一部分。主要组织相容性复合物(MHC)是具有多个基因座的大遗传复合物。MHC基因座编码两大类MHC膜分子，称为I类和II类MHC。T辅助性淋巴细胞通常识别与MHC II类分子结合的抗原，而T细胞毒性淋巴细胞识别与MHC I类分子结合的抗原。在人类中，MHC被称为HLA复合物，并且在小鼠中被称为H-2复合物。
在某些情况下，人工抗原呈递细胞(aAPC)可用于制备基于CAR的治疗组合物和细胞治疗产品。对于关于抗原呈递系统的制备和使用的一般指导，参见，例如，美国专利号6,225,042、6,355,479、6,362,001和6,790,662；美国专利申请公开号2009/0017000和2009/0004142；和国际公开号WO2007/103009。
aAPC可以用于扩增表达CAR的T细胞。在遇到肿瘤抗原时，由抗原呈递细胞传递给T细胞的信号可以影响T细胞编程及其随后的治疗效果。这已经刺激了开发人工抗原呈递细胞的努力，所述人工抗原呈递细胞允许最佳地控制提供给T细胞的信号(Turtle等人,2010)。除感兴趣的抗体或抗原外，aAPC系统还可以包含至少一种外源性辅助分子。可以采用任何合适数目和组合的辅助分子。辅助分子可以选自诸如共刺激分子和粘附分子这样的辅助分子。示例性共刺激分子包括CD70和B7.1(也称为B7或CD80)，它们可以结合T细胞表面上的CD28和/或CTLA-4分子，从而影响例如T细胞扩增、Th1分化、短期T细胞存活和细胞因子分泌，诸如白介素(IL)-2分泌(参见Kim等人,2004)。粘附分子可以包括：碳水化合物结合糖蛋白，例如选择蛋白；跨膜结合糖蛋白，例如整联蛋白；钙依赖性蛋白，例如钙粘着蛋白；以及单次跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白，例如胞间粘附分子(ICAM)，其促进例如细胞与细胞或细胞与基质的接触。示例性的粘附分子包括LFA-3和ICAM，诸如ICAM-1。在例如美国专利号6,225,042、6,355,479和6,362,001中举例说明了可用于选择、克隆、制备和表达示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的技术、方法和试剂。
C.核酸
在一个方面，本公开内容提供了编码分离的TCR、CAR或可溶性肽的核酸，所述TCR、CAR或可溶性肽选择性地结合SLC45A2(例如，在SLC45A2382-390或SLC45A2393-402免疫原性表位)且与本文中公开的TCR可变区(例如，SEQ ID NO:1-50)具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性，或者与SEQ ID NO:1-50相比，所述肽可以具有1、2、3或4个点突变(例如，置换突变)。如上所述，所述肽可以具有例如8-35个氨基酸的长度，或由此衍生出的任何范围。在某些实施方案中，所述肿瘤抗原特异性肽对应于肿瘤抗原蛋白诸如SLC45A2的部分。术语“核酸”意图包括DNA和RNA，且可以是双链的或单链的。
本公开内容的一些实施方案提供了可特异性地结合HLA-A*0201的重组生产的肿瘤抗原特异性肽(例如，SLC45A2肽)。因此，可以将编码肿瘤抗原特异性肽的核酸可操作地连接至表达载体，并且使用分子生物学领域中公知的方法在合适的表达系统中产生所述肽。可以将编码本文中公开的肿瘤抗原特异性肽的核酸掺入到确保所述肽的良好表达的任何表达载体中。可能的表达载体包括、但不限于粘粒、质粒或经修饰的病毒(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，只要所述载体适合于宿主细胞的转化。
“适合于宿主细胞的转化”的重组表达载体意指，该表达载体含有本发明的核酸分子和可操作地连接到所述核酸分子的基于要用于表达的宿主细胞而选择的调节序列。术语“操作性连接”或“可操作地连接”互换使用，并且意指所述核酸以允许所述核酸表达的方式连接至调节序列。
因此，本发明提供了一种重组表达载体，其包含编码肿瘤抗原特异性肽的核酸以及用于转录和翻译所插入的蛋白序列的必需调节序列。合适的调节序列可以源自多种来源，包括细菌、真菌或病毒基因(例如，参见在Goeddel(1990)中描述的调节序列)。
合适调节序列的选择通常取决于所选择的宿主细胞，并且可以由本领域普通技术人员容易地实现。这样的调节序列的例子包括：转录启动子和增强子或RNA聚合酶结合序列，核糖体结合序列，其包括翻译起始信号。此外，根据所选择的宿主细胞和所使用的载体，其它序列(例如复制起点、其它DNA限制位点、增强子和赋予转录诱导能力的序列)也可掺入到表达载体中。还应当理解，必需调节序列可以由天然蛋白和/或它的侧接区域提供。
重组表达载体还可以含有选择性标记基因，其有利于选择用本文中公开的重组肿瘤抗原特异性肽(例如，SLC45A2肽)转化或转染的宿主细胞。选择性标记基因的例子是编码例如以下的基因：赋予针对某些药物的抗性的蛋白，如G418和潮霉素；β-半乳糖苷酶；氯霉素乙酰转移酶；或萤火虫荧光素酶。通过选择性标记蛋白诸如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶或萤火虫荧光素酶的浓度改变，监测选择性标记基因的转录。如果选择性标记基因编码赋予抗生素抗性(例如新霉素抗性)的蛋白，则可用G418选择转化体细胞。已经掺入选择性标记基因的细胞将存活，而其它细胞将死亡。这使得可能使重组表达载体的表达可视化和进行测定，并且具体地确定突变对表达和表型的影响。应当理解，可以将选择标记引入到与目标核酸分开的载体上。
可以将重组表达载体引入宿主细胞中以产生转化体宿主细胞。术语“转化体宿主细胞”意图包括已经用本发明的重组表达载体转化或转染的原核和真核细胞。术语“用……转化”、“用……转染”、“转化”和“转染”意图包括通过本领域已知的许多可能技术之一将核酸(例如载体)引入细胞中。合适的宿主细胞包括多种原核和真核宿主细胞。例如，可以在细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))、昆虫细胞(使用杆状病毒)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达本发明的蛋白。
还可以使用标准技术化学合成本发明的核酸分子。化学合成多聚脱氧核苷酸的多种方法是已知的，包括固相合成，其与肽合成类似，已经在商购可得的DNA合成仪中完全自动化(参见例如，美国专利号4,598,049；4,458,066；4,401,796；和4,373,071)。
II.药物制剂
在选择的实施方案中，预期可以将表达如本文公开的TCR的细胞、含有TCR的可变区的蛋白、或编码本发明的TCR的可变区的DNA包含在疫苗组合物中，并施用给受试者以诱导所述受试者中针对表达SLC45A2的癌症(例如黑素瘤)的治疗性免疫应答。在受试者中用于药物用途的治疗组合物可以包含本文公开的TCR组合物，例如可溶性TCR(任选地连接至成像剂)和药学上可接受的载体。
短语“药物”、“药学上可接受的”、或“药理学上可接受的”表示，当适当地施用给动物例如人时，不会产生不利的、变应性或其它不良反应的分子实体和组合物。本文中使用的“药学上可接受的载体”包括任意的和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如，抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、矫味剂、染料、这样的类似材料及其组合，如本领域普通技术人员所公知的(参见，例如，Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,第21版,Pharmaceutical Press,2011,通过引用并入本文)。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑其在本发明的疫苗组合物中的应用。
本文中使用的“保护性免疫应答”表示哺乳动物宿主的免疫系统对癌症的应答。保护性免疫应答可以为癌症的治疗提供治疗效果，例如减小肿瘤大小、增加生存期等。
医学领域的普通技术人员会明白，通过物理和生理学因素诸如体重、病症的严重程度、所治疗的疾病的类型、既往或同时的治疗干预、患者的特发症以及施用途径，可以确定施用给动物或人患者的治疗组合物的实际剂量。在任何情况下，负责施用的从业人员将确定组合物中的活性成分的浓度和用于个体受试者的合适剂量。
可以静脉内地、真皮内地、动脉内地、腹膜内地、病灶内地、颅内地、关节内地、前列腺内地、胸膜内地、气管内地、鼻内地、玻璃体内地、阴道内地、直肠内地、局部地(topically)、肿瘤内地、肌肉内地、腹膜内地、皮下地、结膜下地、囊泡内地、粘膜地、心包内地、脐内地、眼内地、口服地、外用局部地(topically)、局部地(locally)和通过吸入、注射、输注、连续输注、灌洗和局部灌注来施用本文中公开的治疗组合物。如本领域普通技术人员已知的，通过导管，在乳剂中，在脂质组合物中，通过弹道微粒递送，或通过其它方法或前述方法的任何组合，也可以将治疗组合物施用给受试者(参见，例如，Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy,第21版，Lippincott Williams和Wilkins,2005,通过引用并入本文)。
尽管本领域普通技术人员已知的任何合适的载体可以用在本发明的药物组合物中，但是载体的类型将随施用模式而变化。对于胃肠外施用，诸如皮下注射，载体优选地包含水、盐水、醇、脂肪、蜡或缓冲液。对于口服施用，可以采用上述载体或固体载体中的任一种，诸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁。可生物降解的微球(例如聚乳酸半乳糖)也可用作本发明的药物组合物的载体。合适的可生物降解的微球公开在例如美国专利4,897,268和5,075,109中。
在某些实施方案中，通过微结构化的透皮或弹道微粒递送，可以施用疫苗组合物。作为疫苗制剂的载体的微结构是疫苗应用的理想构型，并且在本领域中广为人知(Gerstel和Place 1976(美国专利3,964,482)；Ganderton和McAinsh 1974(美国专利3,814,097)；美国专利5,797,898,5,770,219和5,783,208和美国专利申请2005/0065463)。配制用于弹道微粒递送的这样的疫苗组合物可以包含被固定在支持基底表面上的分离的本文公开的SLC45A2肽。在这些实施方案中，支持基底可以包括、但不限于微胶囊、微粒、微球、纳米囊、纳米颗粒、纳米球或它们的组合。
本文中公开的充当TCR(诸如可溶性TCR)的支持基底的微结构或弹道微粒可以由可生物降解的材料和不可生物降解的材料构成，并且这样的支持基底可以由合成的聚合物、二氧化硅、脂质、碳水化合物、蛋白质、凝集素、离子试剂、交联剂和本领域可获得的其它微结构组分构成。用于将本发明的肽固定化到由这样的材料组成的支持基底上的方案和试剂是在商业上和在本领域中可广泛获得的。
在其它实施方案中，疫苗组合物包含本文公开的固定化的或封装的TCR或可溶性TCR和支持基底。在这些实施方案中，支持基底可以包括，但不限于，脂质微球、脂质纳米颗粒、醇质体(ethosome)、脂质体、类脂囊泡(niosome)、磷脂、鞘脂体(sphingosome)、表面活性剂、转移体(transferosome)、乳剂或它们的组合。脂质体以及其它脂质纳米载体和微米载体制剂的形成和使用通常是本领域普通技术人员已知的，并且脂质体、微粒、纳米囊等的应用已被广泛用于治疗剂的递送(例如，美国专利5,741,516，特别地通过引用整体并入本文中)。已经综述了众多作为潜在药物载体的脂质体和脂质体样制剂的方法，包括肽的包封(美国专利5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587，它们各自特别地通过引用整体并入本文)。
除了本文描述的递送方法之外，还考虑了许多用于施用所公开的疫苗组合物的替代技术。作为非限制性实施例，可以如下施用疫苗组合物：通过超声促渗(即，超声)，其已在美国专利5,656,016中使用和描述，用于提高药物渗透进和通过循环系统的速率和功效；骨内注射(美国专利5,779,708)；或反馈控制递送(美国专利5,697,899)，并且在该段落中的每篇专利特别地通过引用整体并入本文中。
多种佐剂中的任一种可以用在本发明的疫苗中以非特异性地增强免疫应答。大多数佐剂含有旨在保护抗原免于快速分解代谢的物质，诸如氢氧化铝或矿物油，以及免疫应答的非特异性刺激物，诸如脂质A、百日咳博德特菌(Bortadella pertussis)或结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。合适的佐剂是商购可得的，例如，作为弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(Difco Laboratories,Detroit,Mich.)和Merck佐剂65(Merck andCompany,Inc.,Rahway,N.J.)。其它合适的佐剂包括明矾、可生物降解的微球、单磷酰脂质A和quil A。
可以将可溶性TCR配制成中性或盐形式的组合物。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且其与无机酸(例如盐酸或磷酸)或有机酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。与游离羧基形成的盐还可以衍生自无机碱(例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁)和异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因等有机碱。
在任何情况下，所述组合物可以包含各种抗氧化剂以阻止一种或多种组分的氧化。另外，通过防腐剂例如各种抗细菌剂和抗真菌剂可以预防微生物的作用，所述防腐剂包括，但不限于，对羟基苯甲酸酯(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或它们的组合。
如下制备无菌可注射溶液：将所需量的活性肽与所需的上述各种其它成分一起掺入适当的溶剂中，然后过滤除菌。通常，如下制备分散体：将各种灭菌的活性成分掺入含有基本分散介质和/或其它成分的无菌媒介物中。就用于制备无菌可注射溶液、混悬液或乳剂的无菌粉末而言，优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术，该技术产生活性成分加来自先前无菌过滤的其液体介质的任何额外期望成分的粉末。如果必要的话，应当适当地缓冲液体介质，并在与足够的盐水或葡萄糖一起注射之前首先使液体稀释剂等渗。还考虑了用于直接注射的高浓缩组合物的制备，其中设想以DMSO用作溶剂导致极快的渗透，从而将高浓度的活性剂递送至小区域。
所述组合物在制备和贮存条件下必须是稳定的，并且保存以防微生物(诸如细菌和真菌)的污染作用。应当理解，应当将内毒素污染最小限度地保持在安全水平，例如小于0.5ng/mg蛋白。
在特定实施方案中，通过延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝、明胶或它们的组合)在组合物中的应用，可以实现可注射组合物的延长吸收。
A.联合疗法
在某些实施方案中，本发明实施方案的组合物和方法涉及与至少一种额外疗法组合的抗原特异性细胞(例如，自体或同种异体T细胞(例如，调节性T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞或γ-δT细胞)、NK细胞、恒定型NK细胞、NKT细胞、间质干细胞(MSC)或诱导的多能干(iPS)细胞)群体。所述额外疗法可以是辐射疗法、外科手术(例如，病灶切除术和乳房切除术)、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、免疫疗法、骨髓移植、纳米疗法、单克隆抗体疗法或前述的组合。所述额外疗法可以是辅助疗法或新辅助疗法的形式。
在某些实施方案中，所述额外疗法是小分子酶抑制剂或抗转移性剂的施用。在某些实施方案中，所述额外疗法是副作用限制剂(例如，意图降低治疗的副作用的发生和/或严重程度的药剂，例如抗恶心剂等)的施用。在某些实施方案中，所述额外疗法是辐射疗法。在某些实施方案中，所述额外疗法是外科手术。在某些实施方案中，所述额外疗法是辐射疗法和外科手术的组合。在某些实施方案中，所述额外疗法是γ辐照。在某些实施方案中，所述额外疗法是化学疗法，例如，达卡巴嗪或替莫唑胺。所述额外疗法可以是本领域已知的化学治疗剂中的一种或多种。
可以在相对于另外癌症疗法(诸如免疫检验点疗法)之前、期间、之后或以不同组合施用T细胞疗法。所述施用可以是以从同时至数分钟至数天至数周的时间间隔进行。在其中将T细胞疗法与另外治疗剂分开提供给患者的实施方案中，通常将确保在每次递送的时间之间不会度过相当长的一段时间，使得两种化合物仍然能够对患者发挥有利的组合效应。在这样的情况下，考虑在彼此相隔约12小时至24小时或72小时内，并且更特别地，在彼此相隔约6至12小时内，可以给患者提供抗体疗法和抗癌疗法。在一些情况下，可能合乎需要的是，显著地延长治疗的时间段，其中在各施用之间间隔数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。
可以采用多种组合。对于以下实施例，抗原特异性T细胞疗法、肽或TCR是“A”，并且抗癌疗法是“B”：
Figure BDA0002506020640000371
考虑到药剂的毒性(如果有的话)，本发明实施方案的任何化合物或疗法向患者的施用将遵循用于施用这样的化合物的一般方案。因此，在某些实施方案中，存在监测可归因于联合疗法的毒性的步骤。
1.化学疗法
根据本发明实施方案可以使用多种化学治疗剂。术语“化学疗法”表示使用药物来治疗癌症。“化学治疗剂”用于意指在癌症治疗中施用的化合物或组合物。这些药剂或药物通过其在细胞内的活性模式(例如，其是否影响细胞周期以及在何阶段影响细胞周期)进行分类。可替换地，基于它的直接交联DNA、嵌入到DNA中或通过影响核酸合成来诱导染色体和有丝分裂畸变的能力来表征药剂。
化学治疗剂的例子包括：烷化剂诸如塞替派和环磷酰胺；磺酸烷基酯诸如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶类诸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺，包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；番荔枝内酯(acetogenin)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物托泊替康)；苔藓抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括它的合成类似物阿多来新、卡泽来新和比泽来新)；念珠藻环肽(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；杜卡霉素(包括合成类似物KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇；水鬼蕉碱(pancratistatin)；sarcodictyin；海绵抑素；氮芥类，诸如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧化氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和乌拉莫司汀；硝基脲类，诸如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀和雷莫司汀；抗生素类，诸如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，尤其是卡奇霉素γlI和卡奇霉素ωI1)；达内霉素，包括达内霉素A；二膦酸盐类，诸如氯膦酸盐；埃斯波霉素；以及新制癌菌素生色团和有关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素、氨茴霉素(authrarnycin)、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉代-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素类诸如丝裂霉素C、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药，诸如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素类，诸如卡普睾酮、屈他雄酮丙酸盐、环硫雄醇、美雄烷和睾内酪；抗肾上腺类，诸如米托坦和曲洛司坦；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美坦辛类，诸如美坦辛和安丝菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK多糖复合物；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；替奴佐酸；三亚胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯类(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇行菌素)；乌拉坦(urethan)；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；加西托星(gacytosine)；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；紫杉烷类，例如，紫杉醇和多西他赛；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；铂配位络合物，诸如顺铂、奥沙利铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺肖林；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达；伊班膦酸盐；伊立替康(例如，CPT-11)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维A酸类，诸如视黄酸；卡培他滨；卡铂、丙卡巴肼、普卡霉素、吉西他滨、诺维本、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、反铂，和上述任一种的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
2.放射疗法
造成DNA损伤并已广泛使用的其它因素包括通常被称为γ射线、X射线的那些和/或放射性同位素向肿瘤细胞的定向递送。还考虑了其它形式的DNA损伤因素，例如微波、质子束照射(美国专利5,760,395和4,870,287)和UV照射。最可能的是，所有这些因素对DNA、DNA前体、DNA的复制和修复以及染色体的组装和维持造成宽范围的损害。X射线的剂量范围为从以50-200伦琴的日剂量持续长时间段(3至4周)至2000-6000伦琴的单次剂量。放射性同位素的剂量范围宽泛地变化，并且取决于同位素的半衰期、发射的辐射的强度和类型以及肿瘤细胞的摄取。
3.免疫疗法
熟练的技术人员会理解，另外的免疫疗法可以与实施方案的方法组合或结合使用。在癌症治疗的情形下，免疫治疗剂通常依赖于使用免疫效应细胞和分子以靶向并破坏癌细胞。利妥昔单抗
Figure BDA0002506020640000391
是这样的一个实例。免疫效应物可以是例如对肿瘤细胞表面上的一些标志物特异性的抗体。所述抗体单独地可以充当治疗的效应物，或者它可以募集其它细胞以实际影响细胞杀死。抗体还可以与药物或毒素(化学治疗剂、放射性核素、蓖麻蛋白A链、霍乱毒素、百日咳毒素等)缀合并且充当靶向剂。可替换地，效应物可以是直接地或间接地与肿瘤细胞靶标相互作用的携带表面分子的淋巴细胞。多种效应细胞包括细胞毒性T细胞和NK细胞。
已经出现抗体-药物缀合物作为癌症治疗剂开发的突破性方案。癌症是世界上死亡的主要原因之一。抗体-药物缀合物(ADC)包含与杀死细胞的药物共价连接的单克隆抗体(MAb)。该方案将MAb针对其抗原靶标的高特异性与高效细胞毒性药物组合，从而产生将货物(药物)递送至具有丰富水平抗原的肿瘤细胞的“武装”MAb。药物的靶向递送还使其在正常组织中的暴露最小化，从而导致降低的毒性和提高的治疗指数。FDA对两种ADC药物的批准(2011年
Figure BDA0002506020640000401
(本妥昔单抗(Brentuximab)vedotin)和2013年
Figure BDA0002506020640000402
(曲妥珠单抗美坦新或T-DM1))验证了该方案。目前存在超过30种ADC药物候选物处于癌症治疗的临床试验的各个阶段(Leal等人,2014)。随着抗体工程和接头-货物优化变得越来越成熟，新ADC的发现和开发越来越依赖于适合于该方案的新靶标的鉴定和验证以及靶向MAb的产生。ADC靶标的两个标准是在肿瘤细胞中上调的/高水平的表达和稳健内化。
在免疫疗法的一个方面，肿瘤细胞必须带有一些适合靶向的标志物，即，所述标志物不存在于大多数其它细胞上。存在许多肿瘤标志物，并且这些肿瘤标志物中的任一种可能适合用于在本发明实施方案的上下文中的靶向。常见的肿瘤标志物包括CD20、癌胚抗原、酪氨酸酶(p97)、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸基路易斯抗原、MucA、MucB、PLAP、层粘连蛋白受体、erb B和p155。免疫疗法的一个替代方面是将抗癌作用与免疫刺激作用组合。还存在免疫刺激分子，包括：细胞因子，诸如IL-2、IL-4、IL-12、GM-CSF、γ-IFN，趋化因子，诸如MIP-1、MCP-1、IL-8，和生长因子，诸如FLT3配体。
目前在研究或在使用中的免疫疗法的例子是免疫佐剂，例如，牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、二硝基氯苯和芳族化合物(美国专利5,801,005和5,739,169；Hui和Hashimoto,1998；Christodoulides等人,1998)；细胞因子疗法，例如，干扰素α、β和γ、IL-1、GM-CSF和TNF(Bukowski等人,1998；Davidson等人,1998；Hellstrand等人,1998)；基因疗法，例如，TNF、IL-1、IL-2和p53(Qin等人,1998；Austin-Ward和Villaseca,1998；美国专利5,830,880和5,846,945)；和单克隆抗体，例如，抗-CD20、抗-神经节苷脂GM2和抗-p185(Hollander,2012；Hanibuchi等人,1998；美国专利5,824,311)。考虑一种或更多种抗癌疗法可以与本文所述的抗体疗法一起使用。
在某些实施方案中，所述免疫疗法可以是免疫检验点抑制剂。免疫检验点调高信号(例如共刺激分子)或调低信号。可通过免疫检验点阻断而靶向的抑制性免疫检验点包括：腺苷A2A受体(A2AR)、B7-H3(也被称作CD276)、B和T淋巴细胞衰减剂(BTLA)、细胞毒性T-淋巴细胞相关的蛋白4(CTLA-4、也被称作CD152)、吲哚胺2,3-双加氧酶(IDO)、杀伤细胞免疫球蛋白(KIR)、淋巴细胞活化基因-3(LAG3)、程序性死亡1(PD-1)、T-细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)和T细胞激活的V结构域Ig抑制剂(VISTA)。具体地，免疫检验点抑制剂靶向PD-1轴和/或CTLA-4。
免疫检验点抑制剂可以是药物，例如小分子、重组形式的配体或受体，或者特别是抗体，例如人抗体(例如，国际专利公开WO2015016718；Pardoll,Nat Rev Cancer,12(4):252-64,2012；二者通过引用并入本文)。可以使用免疫检验点蛋白或其类似物的已知抑制剂，特别是可以使用嵌合的、人源化的或人形式的抗体。如技术人员将知晓的，替代和/或等同名称可以用于在本公开内容中提及的某些抗体。在本公开内容的上下文中，这样的替代和/或等同名称是可互换的。例如已知的是，帕姆单抗(lambrolizumab)也以替代和等同名称MK-3475和帕博丽珠单抗(pembrolizumab)为人所知。
在某些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是抑制PD-1与其配体结合配偶体结合的分子。在一个具体的方面，所述PD-1配体结合配偶体是PDL1和/或PDL2。在另一个实施方案中，PDL1结合拮抗剂是抑制PDL1与其结合配偶体结合的分子。在一个具体的方面，PDL1结合配偶体是PD-1和/或B7-1。在另一个实施方案中，PDL2结合拮抗剂是抑制PDL2与其结合配偶体结合的分子。在一个具体的方面，PDL2结合配偶体是PD-1。拮抗剂可以是抗体、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。示例性抗体描述于美国专利号US8735553、US8354509和US8008449中，它们都通过引用并入本文。用于用在本文提供的方法中的其它PD-1轴拮抗剂是本领域已知的，例如描述于美国专利申请号US20140294898、US2014022021和US20110008369中，它们都通过引用并入本文。
在某些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是抗-PD-1抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)。在某些实施方案中，所述抗-PD-1抗体选自纳武单抗(nivolumab)、帕博丽珠单抗(pembrolizumab)和CT-011。在某些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是免疫粘附素(例如，含有与恒定区(例如，免疫球蛋白序列的Fc区)融合的PDL1或PDL2的细胞外或PD-1结合部分的免疫粘附素)。在某些实施方案中，所述PD-1结合拮抗剂是AMP-224。纳武单抗(也被称作MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558和
Figure BDA0002506020640000421
)是在WO2006/121168中描述的抗-PD-1抗体。帕博丽珠单抗(也被称作MK-3475、Merck 3475、帕姆单抗、
Figure BDA0002506020640000422
和SCH-900475)是在WO2009/114335中描述的抗-PD-1抗体。CT-011(也被称作hBAT或hBAT-1)是在WO2009/101611中描述的抗-PD-1抗体。AMP-224(也被称作B7-DCIg)是在WO2010/027827和WO2011/066342中描述的PDL2-Fc融合可溶性受体。
可以在本文提供的方法中被靶向的另一种免疫检验点是细胞毒性T-淋巴细胞-相关的蛋白4(CTLA-4)，也被称作CD152。人CTLA-4的完整cDNA序列具有Genbank登录号L15006。CTLA-4存在于T细胞表面上并且当与抗原呈递细胞表面上的CD80或CD86结合时充当“关闭”开关。CTLA4是免疫球蛋白超家族的一个成员，其在辅助性T细胞的表面上表达并向T细胞传递抑制信号。CTLA4与T细胞共刺激蛋白CD28类似，并且这两种分子结合抗原呈递细胞上的CD80和CD86(也分别称为B7-1和B7-2)。CTLA4向T细胞传递抑制信号，而CD28传递刺激信号。细胞内CTLA4也存在于调节性T细胞中并且可能对其功能是重要的。通过T细胞受体和CD28的T细胞活化会导致增加的CTLA-4(B7分子的抑制性受体)表达。
在某些实施方案中，所述免疫检验点抑制剂是抗-CTLA-4抗体(例如，人抗体、人源化抗体或嵌合抗体)、其抗原结合片段、免疫粘附素、融合蛋白或寡肽。
使用本领域众所周知的方法，可以产生适用于本发明方法的抗-人-CTLA-4抗体(或由此衍生出的VH和/或VL结构域)。可替换地，可以使用本领域公认的抗-CTLA-4抗体。例如，在以下文献中公开的抗-CTLA-4抗体可以用在本文公开的方法中：US 8,119,129,WO01/14424,WO 98/42752；WO 00/37504(CP675,206，也被称作曲美木单抗；以前的替西木单抗)，美国专利号6,207,156；Hurwitz等人(1998)Proc Natl Acad Sci USA 95(17):10067-10071；Camacho等人(2004)J Clin Oncology22(145):摘要号2505(抗体CP-675206)；和Mokyr等人(1998)Cancer Res58:5301-5304。每篇上述公开物的教导特此通过引用并入。也可以使用与这些本领域公知的抗体中的任一种竞争结合CTLA-4的抗体。例如，在国际专利申请号WO2001014424、WO2000037504和美国专利号8,017,114(都通过引用并入本文)中描述了人源化的CTLA-4抗体。
一种示例性的抗-CTLA-4抗体是伊匹木单抗(也被称作10D1、MDX-010、MDX-101和
Figure BDA0002506020640000431
)或抗原结合片段及其变体(参见，例如，WO01/14424)。在其它实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的重链和轻链CDR或VR。因此，在一个实施方案中，所述抗体包含伊匹木单抗的VH区域的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及伊匹木单抗的VL区域的CDR1、CDR2和CDR3结构域。在另一个实施方案中，所述抗体与上述抗体竞争结合CTLA-4上的相同表位和/或结合至CTLA-4上的相同表位。在另一个实施方案中，所述抗体与上述抗体具有至少约90％可变区氨基酸序列同一性(例如，与伊匹木单抗具有至少约90％、95％或99％的可变区同一性)。
用于调节CTLA-4的其它分子包括例如在美国专利号US5844905,US5885796和国际专利申请号WO1995001994和WO1998042752(都通过引用并入本文)中描述的CTLA-4配体和受体，以及例如在美国专利号US8329867(通过引用并入本文)中描述的免疫粘附素。
4.外科手术
大约60％的患有癌症的人将经历某种类型的外科手术，包括预防性、诊断性或分期、治愈性和姑息性外科手术。治愈性外科手术包括其中将全部或一部分癌性组织物理去除、切除和/或破坏的切除术，并且可以与其它疗法(例如本发明实施方案的治疗、化学疗法、放射疗法、激素疗法、基因疗法、免疫疗法和/或替代疗法)结合使用。肿瘤切除术表示至少一部分肿瘤的物理去除。除肿瘤切除术之外，通过外科手术的治疗包括激光外科手术、冷冻外科手术、电外科手术和用显微镜控制的外科手术(Mohs氏外科手术)。
在切除一部分或全部癌性细胞、组织或肿瘤之后，可以在体内形成腔。通过灌注、直接注射或向该区域局部施用另外的抗癌疗法，可以实现治疗。可以重复这样的治疗，例如每1、2、3、4、5、6或7天，或者每1、2、3、4和5周，或者每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月。这些治疗也可以具有不同剂量。
5.其它药剂
考虑可以将其它药剂与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的治疗效果。这些其它药剂包括影响细胞表面受体和GAP连接的增量调节的药剂、细胞生长抑制剂和分化剂、细胞粘附抑制剂、增加过度增殖细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性的药剂或其它生物药剂。通过提高GAP连接数目实现的细胞间信号传导的增加，会增加对相邻过度增殖细胞群体的抗过度增殖作用。在其它实施方案中，细胞生长抑制剂或分化剂可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗的抗过度增殖效力。考虑细胞粘附抑制剂以提高本发明实施方案的效力。细胞粘附抑制剂的例子是粘着斑激酶(FAK)抑制剂和洛伐他汀。进一步考虑增加过度增殖细胞对细胞凋亡的敏感性的其它试剂(例如抗体c225)可以与本发明实施方案的某些方面组合使用以提高治疗效力。
III.实施例
包括以下实施例来证实本发明的优选实施方案。本领域技术人员应该理解，在以下的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明的实践中良好地起作用的技术，因而可以视为构成其实践的优选模式。但是，本领域技术人员考虑到本公开内容以后应该理解，可以在所公开的具体实施方案中做出许多改变且仍然获得类似或相似的结果，而不背离本发明的精神和范围。
实施例1
人SLC45A2 T细胞受体(TCR)克隆
方法
T细胞克隆的生成
通过将细胞暴露于特定SLC45A2肽来生成TCR克隆。与正常组织相比，可以在黑素瘤中选择性地表达SLC45A2。SLC45A2肽SLC45A2382-390和SLC45A2393-402分别是可以选择性地结合HLA-A*0201(HLA-A2)和HLA-A*2402(HLA-A24)的免疫原性表位，且使用这些肽扩增的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可以有效地杀死多种黑素瘤细胞，包括多种皮肤黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、粘膜黑素瘤和转移性黑素瘤。SLC45A2肽可以表现出抗原特异性的和HLA-A*0201或HLA A*2402限制性的SLC45A2-特异性CD8 T细胞应答。
将全长VCX3ARNA转染至成熟的树突细胞(DC)。在有IL-21存在下，将RNA转染的DC与自体发生的初始T细胞以DC:T＝1:10的比例共培养。在一周之后，使用RNA转染的DC再次刺激T细胞。在两轮刺激之后，对CD8+和四聚体+双阳性T细胞群体进行分选并用快速扩增方案(REP)扩增。用有限稀释法产生T细胞克隆。通过肿瘤细胞杀死测定来筛选高活性CTL克隆。
T细胞受体(TCR)克隆和逆转录病毒表达载体构建
根据试剂盒的手册，使用5’-RACE方法克隆TCR(包括α链和β链)。使用IMGT/V-QUEST注释工具鉴定TCR V-α和TCR V-β使用。此外，也用使用TCR VβRepertoire试剂盒的流量检测来鉴定TCR V-β使用。用使用一组与不同TCR V-α的5’端退火的特异性引物的PCR来鉴定TCR V-α使用。对于TCR表达逆转录病毒载体构建，根据TCR V-α或β使用来设计正向引物。根据TCRα或β恒定区的序列来设计反向引物。产生含有被P2A接头肽隔开的α-和β-TCR链的表达盒，并将全长PCR产物克隆到逆转录病毒载体pMSGV1中。用测序验证经克隆的DNA序列。
逆转录病毒生成和感染人外周血淋巴细胞(PBL)
将含有TCR的pMSGV1载体和包膜载体RD114共转染至包装细胞系GP2-293。在转染6-8小时之后，更新培养基。在24小时之后收获上清液，并将其添加至已用20mg/mLRetroNectin包被的6孔板，随后在32℃离心(2000×g)2小时。然后除去上清液，并将用50ng/ml OKT3和300U/ml IL-2活化2天的PBL添加至装载有逆转录病毒的板，随后在32℃离心(1000×g)10分钟。然后将细胞在32℃孵育过夜，并在第二天重复该程序(总共两次转导)。此后，使细胞在37℃在5％CO2培养箱中扩增，并根据需要分开(split)。
TCR工程改造的T细胞克隆生成
在感染之后，对CD8+和四聚体+T细胞群体分选，并用有限稀释法产生T细胞克隆。通过肿瘤细胞杀死测定来筛选高活性CTL克隆。用REP进一步扩增高肿瘤杀死活性T细胞克隆。
IFN-γ释放测定
用ELISA方法检测T细胞的IFN-γ释放。在含有0.2ml培养基的96孔板中将T细胞与靶细胞一起以10:1比例在37℃孵育。在共培养过夜之后，收获上清液并根据试剂盒手册使用ELISA检测IFN-γ浓度。
细胞内细胞因子染色(ICS)测定
在有布雷菲德菌素A(BFA)存在下将T细胞与靶细胞一起以10:1比例在37℃孵育过夜。在共培养之后，将T细胞收获并洗涤。首先将细胞用流动抗体抗表面标志物染色。此后，将细胞洗涤并用固定缓冲液固定，并且随后使用透化溶液渗透化处理。然后将渗透化处理的细胞用细胞内细胞因子流动抗体染色。最后，使用FACS分析细胞中的细胞因子产生水平。
肽-MHC四聚体染色
通过用SLC45A2382-390肽/MHC复合物(对于HLA A*0201)或SLC45A2393-402肽/MHC复合物(对于HLA A*2402)的四聚体染色，证实SLC45A2-特异性的CD8 T细胞。将CD8 T细胞与PE-缀合的四聚体一起孵育20分钟，洗涤，并然后用APC-缀合的CD8抗体在室温染色15分钟。洗涤以后，通过流式细胞术(LSRFortessa X-20分析仪)分析细胞。分别含有SLSC45A2382-390SLC45A2393-402的HLA-A*A0201和HLA-A*A2402的四聚体购自Fred Hutchinson CancerResearch Center。
51铬释放测定
使用标准的51Cr释放测定来测量TCR工程改造的T细胞或CTL克隆的裂解HLA-A2肿瘤靶标的杀死能力。将肿瘤细胞或正常细胞在37℃用200μCi的51Cr标记2小时，并在洗涤3次以后，将经标记的靶标以2000个靶标/孔一式三份涂板。将经标记的靶细胞洗涤，并随后与效应细胞以不同比例在0.2ml完全培养基中在37℃孵育4小时。将收获的上清液使用自动γ计数器计数。通过将经标记的靶细胞在锥虫蓝裂解缓冲液或培养基中在37℃孵育4小时，测定最大和自发的51Cr释放。将每个数据点确定为一式四孔的平均值。如下计算特异性裂解％：杀死％＝((特异性释放-自发释放)/(总释放-自发释放))×100。
结果:确定了几个SLC45A2 CD8 T细胞克隆的TCR序列。这些TCR克隆(包括β3、β22、#24、#39和#76)的CDR3序列显示在表2中。将T细胞用这些TCR克隆中的每一种转染，并使用Mel526(HLA A2+)和Mel888(HLA A2-)细胞通过铬释放测定来评估细胞毒性活性，并与亲代T细胞克隆的活性对比。对于所有克隆，观察到TCR-转染的T细胞裂解HLA-A24匹配的靶标Mel888，但不能裂解HLA-A24不匹配的靶标Mel526(图2A-B,图4A-B和图6A-B)。亲代T细胞表现出类似的细胞毒性。
也对所有的TCR克隆和亲代细胞执行SLC45A2四聚体和CD8染色。用包括TCR基因的逆转录病毒转导了活化的自体PBMC。8天以后，将T细胞用SLC45A2-PE缀合的四聚体染色。将SLC45A2四聚体阳性的T细胞分选并进行REP(图3A-B,5A-B和7A-B)。
表2:SLC45A2 TCR基因信息。
Figure BDA0002506020640000481
Figure BDA0002506020640000482
实施例2
人SLC45A2 T细胞受体(TCR)克隆#39的功能性
TCR工程改造的T细胞的四聚体染色检测。将来自SLC45A2 CTL(#39克隆)的TCR克隆进逆转录病毒表达载体pMSGV1中，并生成重组逆转录病毒用于感染PBMC。感染以后，CD8+和CD4+T细胞出现四聚体+群体。将CD8+四聚体+和CD4+四聚体+群体分选并用快速扩增方案(REP)扩增。扩增以后，CD8+四聚体+群体的纯度达到96％(图8)。但是，CD4+T细胞的四聚体+群体在REP以后丧失(图8)。
TCR工程改造的T细胞的肽结合滴定测定。将T2细胞用不同浓度的SLC45A2肽(从10pg/mL至10μg/mL)脉冲处理，并用51Cr标记。将CD8+或CD4+TCR工程改造的T细胞用作效应细胞并与T2细胞共培养。在共培养4小时以后检测51Cr释放。CD8+TCR工程改造的T细胞表现出高亲和力，但是CD4+TCR工程改造的T细胞却没有(图9)。
CD8+TCR工程改造的T细胞的内源性地呈递的表位识别。CD8+TCR工程改造的T细胞能够杀死Mel526(HLA-A2+,SLC45A2+)和Mel888-A2(HLA-A2强迫的表达,SLC45A2+)肿瘤细胞系，但不能杀死A375(HLA-A2+,SLC45A2-)或Mel624(HLA-A2+,SLC45A2+)肿瘤细胞系(图10)。但是，T细胞能够杀死用SLC45A2肽脉冲处理过的A375细胞，表明Mel526和Mel888-A2天然地呈递内源性表位且TCR工程改造的T细胞可以识别它。Mel624可能在细胞表面上呈递低水平的表位，尽管它表达SLC45A2。
CD4+TCR工程改造的T细胞的内源性地呈递的表位识别。尽管CD4+TCR工程改造的T细胞在REP以后没有明显产生四聚体+群体，但是它们仍然在长期共培养(20h)以后杀死了肿瘤细胞(图11)。因而，它们可以识别低水平的内源性呈递的表位。
TCR工程改造的T细胞当遇到靶细胞时特异性地应答。进行了内部细胞因子染色(ICS)测定以检测当它们遇到靶细胞时TCR工程改造的T细胞的特异性应答。将Mel526(天然地呈递SLC45A2的内源性表位)、A375(SLC45A2阴性的)、用SLC45A2肽脉冲处理过的T2和用M26肽脉冲处理过的T2(阴性对照)与TCR工程改造的T细胞(CD8+或CD4+,E:T＝10:1)共培养。过夜孵育以后，用ICS检测TNF-α(图12A)、CD107a(图12B)、IFN-γ(图12C)、CD137(图12D)和IL-2(图12E)表达水平。与A375和用M26肽脉冲处理过的T2相比，CD8+和CD4+TCR工程改造的T细胞在与Mel526和用SLC45A2肽脉冲处理过的T2共培养时都表达显著更高水平的TNF-α、CD107a、IFN-γ、CD137和IL-2，表明TCR工程改造的T细胞是有功能的并在它们遇到靶细胞时表现出特异性应答。
***
根据本公开内容，无需过多实验可以实现和执行在本文中公开并要求保护的所有方法。虽然已经以优选实施方案的方式描述了本发明的组合物和方法，但是本领域技术人员显而易见，在不偏离本发明的概念、精神和范围的情况下，可以对本文中所述方法以及本文所述方法的步骤或步骤顺序作出改变。更具体地，显而易见，可以用在化学上和生理学上均相关的某些药剂替代本文所述的药剂，并实现相同或类似的结果。本领域技术人员显而易见的所有这样的类似的替代和修改均被认为落入由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。
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<120> 用于免疫疗法的T细胞受体
<130> UTFC.P1314WO
<150> 62571447
<151> 2017-10-12
<160> 51
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 828
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #24 alpha链
<400> 1
atggagaaga atcctttggc agccccatta ctaatcctct ggtttcatct tgactgcgtg 60
agcagcatac tgaacgtgga acaaagtcct cagtcactgc atgttcagga gggagacagc 120
accaatttca cctgcagctt cccttccagc aatttttatg ccttacactg gtacagatgg 180
gaaactgcaa aaagccccga ggccttgttt gtaatgactt taaatgggga tgaaaagaag 240
aaaggacgaa taagtgccac tcttaatacc aaggagggtt acagctattt gtacatcaaa 300
ggatcccagc ctgaagactc agccacatac ctctgtgcct ttttgtcgaa taacaatgcc 360
agactcatgt ttggagatgg aactcagctg gtggtgaagc ccaatatcca gaaccctgac 420
cctgccgtgt accagctgag agactctaaa tccagtgaca agtctgtctg cctattcacc 480
gattttgatt ctcaaacaaa tgtgtcacaa agtaaggatt ctgatgtgta tatcacagac 540
aaaactgtgc tagacatgag gtctatggac ttcaagagca acagtgctgt ggcctggagc 600
aacaaatctg actttgcatg tgcaaacgcc ttcaacaaca gcattattcc agaagacacc 660
ttcttcccca gcccagaaag ttcctgtgat gtcaagctgg tcgagaaaag ctttgaaaca 720
gatacgaacc taaactttca aaacctgtca gtgattgggt tccgaatcct cctcctgaaa 780
gtggccgggt ttaatctgct catgacgctg cggctgtggt ccagctaa 828
<210> 2
<211> 275
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #24 alpha链
<400> 2
Met Glu Lys Asn Pro Leu Ala Ala Pro Leu Leu Ile Leu Trp Phe His
1 5 10 15
Leu Asp Cys Val Ser Ser Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser
20 25 30
Leu His Val Gln Glu Gly Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro
35 40 45
Ser Ser Asn Phe Tyr Ala Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys
50 55 60
Ser Pro Glu Ala Leu Phe Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys
65 70 75 80
Lys Gly Arg Ile Ser Ala Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr
85 90 95
Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys
100 105 110
Ala Phe Leu Ser Asn Asn Asn Ala Arg Leu Met Phe Gly Asp Gly Thr
115 120 125
Gln Leu Val Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr
130 135 140
Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr
145 150 155 160
Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val
165 170 175
Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys
180 185 190
Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala
195 200 205
Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser
210 215 220
Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr
225 230 235 240
Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile
245 250 255
Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu
260 265 270
Trp Ser Ser
275
<210> 3
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #24 alpha链CDR1
<400> 3
Ser Ser Asn Phe Tyr Ala
1 5
<210> 4
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #24 alpha链CDR2
<400> 4
Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu
1 5
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #24 alpha链CDR3
<400> 5
Ala Phe Leu Ser Asn Asn Asn Ala Arg Leu Met
1 5 10
<210> 6
<211> 963
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #24 beta链
<400> 6
atgcttagtc ctgacctgcc tgactctgcc tggaacacca ggctcctctg ccatgtcatg 60
ctttgtctcc tgggagcagg ttcagtggct gctggagtca tccagtcccc aagacatctg 120
atcaaagaaa agagggaaac agccactctg aaatgctatc ctatccctag acacgacact 180
gtctactggt accagcaggg tccaggtcag gacccccagt tcctcatttc gttttatgaa 240
aagatgcaga gcgataaagg aagcatccct gatcgattct cagctcaaca gttcagtgac 300
tatcattctg aactgaacat gagctccttg gagctggggg actcagccct gtacttctgt 360
gccagcagct tatggggcag ccataattca cccctccact ttgggaacgg gaccaggctc 420
actgtgacag aggacctgaa caaggtgttc ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca 480
gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc acactggtgt gcctggccac aggcttcttc 540
cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc 600
acggacccgc agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc 660
agccgcctga gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa 720
gtccagttct acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc 780
acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt agagcagact gtggctttac ctcggtgtcc 840
taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc ctctatgaga tcctgctagg gaaggccacc 900
ctgtatgctg tgctggtcag cgcccttgtg ttgatggcca tggtcaagag aaaggatttc 960
taa 963
<210> 7
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #24 beta链
<400> 7
Met Leu Ser Pro Asp Leu Pro Asp Ser Ala Trp Asn Thr Arg Leu Leu
1 5 10 15
Cys His Val Met Leu Cys Leu Leu Gly Ala Gly Ser Val Ala Ala Gly
20 25 30
Val Ile Gln Ser Pro Arg His Leu Ile Lys Glu Lys Arg Glu Thr Ala
35 40 45
Thr Leu Lys Cys Tyr Pro Ile Pro Arg His Asp Thr Val Tyr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Asp Pro Gln Phe Leu Ile Ser Phe Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Met Gln Ser Asp Lys Gly Ser Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Gln
85 90 95
Gln Phe Ser Asp Tyr His Ser Glu Leu Asn Met Ser Ser Leu Glu Leu
100 105 110
Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Leu Trp Gly Ser His
115 120 125
Asn Ser Pro Leu His Phe Gly Asn Gly Thr Arg Leu Thr Val Thr Glu
130 135 140
Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
145 150 155 160
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
165 170 175
Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
180 185 190
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
195 200 205
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
210 215 220
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
245 250 255
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
260 265 270
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
275 280 285
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
290 295 300
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305 310 315 320
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #24 beta链CDR1
<400> 8
Pro Arg His Asp Thr
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #24 beta链CDR2
<400> 9
Phe Tyr Glu Lys Met Gln
1 5
<210> 10
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #24 beta链CDR3
<400> 10
Cys Ala Ser Ser Leu Trp Gly Ser His Asn Ser Pro Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 819
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #39 Alpha链
<400> 11
atggaaactc tcctgggagt gtctttggtg attctatggc ttcaactggc tagggtgaac 60
agtcaacagg gagaagagga tcctcaggcc ttgagcatcc aggagggtga aaatgccacc 120
atgaactgca gttacaaaac tagtataaac aatttacagt ggtatagaca aaattcaggt 180
agaggccttg tccacctaat tttaatacgt tcaaatgaaa gagagaaaca cagtggaaga 240
ttaagagtca cgcttgacac ttccaagaaa agcagttcct tgttgatcac ggcttcccgg 300
gcagcagaca ctgcttctta cttctgtgct acggacgata atgcaggcaa catgctcacc 360
tttggagggg gaacaaggtt aatggtcaaa ccccatatcc agaaccctga ccctgccgtg 420
taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 480
tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 540
ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 600
gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 660
agcccagaaa gttcctgtga tgtcaagctg gtcgagaaaa gctttgaaac agatacgaac 720
ctaaactttc aaaacctgtc agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg 780
tttaatctgc tcatgacgct gcggctgtgg tccagctaa 819
<210> 12
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #39 Alpha链
<400> 12
Met Glu Thr Leu Leu Gly Val Ser Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu
1 5 10 15
Ala Arg Val Asn Ser Gln Gln Gly Glu Glu Asp Pro Gln Ala Leu Ser
20 25 30
Ile Gln Glu Gly Glu Asn Ala Thr Met Asn Cys Ser Tyr Lys Thr Ser
35 40 45
Ile Asn Asn Leu Gln Trp Tyr Arg Gln Asn Ser Gly Arg Gly Leu Val
50 55 60
His Leu Ile Leu Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu Lys His Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Arg Val Thr Leu Asp Thr Ser Lys Lys Ser Ser Ser Leu Leu Ile
85 90 95
Thr Ala Ser Arg Ala Ala Asp Thr Ala Ser Tyr Phe Cys Ala Thr Asp
100 105 110
Asp Asn Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Met
115 120 125
Val Lys Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg
130 135 140
Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr
165 170 175
Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser
180 185 190
Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe
195 200 205
Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser
210 215 220
Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn
225 230 235 240
Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu
245 250 255
Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #39 Alpha链CDR1
<400> 13
Thr Ser Ile Asn Asn
1 5
<210> 14
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #39 Alpha链CDR2
<400> 14
Ile Arg Ser Asn Glu Arg Glu
1 5
<210> 15
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #39 Alpha链CDR3
<400> 15
Ala Thr Asp Asp Asn Ala Gly Asn Met Leu Thr
1 5 10
<210> 16
<211> 924
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #39 Beta链
<400> 16
atgggaatca ggctcctctg tcgtgtggcc ttttgtttcc tggctgtagg cctcgtagat 60
gtgaaagtaa cccagagctc gagatatcta gtcaaaagga cgggagagaa agtttttctg 120
gaatgtgtcc aggatatgga ccatgaaaat atgttctggt atcgacaaga cccaggtctg 180
gggctacggc tgatctattt ctcatatgat gttaaaatga aagaaaaagg agatattcct 240
gaggggtaca gtgtctctag agagaagaag gagcgcttct ccctgattct ggagtccgcc 300
agcaccaacc agacatctat gtacctctgt gccagcagtt ttaccccaga tacgcagtat 360
tttggcccag gcacccggct gacagtgctc gaggacctga aaaacgtgtt cccacccgag 420
gtcgctgtgt ttgagccatc agaagcagag atctcccaca cccaaaaggc cacactggtg 480
tgcctggcca caggcttcta ccccgaccac gtggagctga gctggtgggt gaatgggaag 540
gaggtgcaca gtggggtcag cacagacccg cagcccctca aggagcagcc cgccctcaat 600
gactccagat actgcctgag cagccgcctg agggtctcgg ccaccttctg gcagaacccc 660
cgcaaccact tccgctgtca agtccagttc tacgggctct cggagaatga cgagtggacc 720
caggataggg ccaaacctgt cacccagatc gtcagcgccg aggcctgggg tagagcagac 780
tgtggcttca cctccgagtc ttaccagcaa ggggtcctgt ctgccaccat cctctatgag 840
atcttgctag ggaaggccac cttgtatgcc gtgctggtca gtgccctcgt gctgatggcc 900
atggtcaaga gaaaggattt ctaa 924
<210> 17
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #39 Beta链
<400> 17
Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val
1 5 10 15
Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys
20 25 30
Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His
35 40 45
Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Phe Thr Pro Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr
115 120 125
Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe
130 135 140
Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val
145 150 155 160
Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp
165 170 175
Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro
180 185 190
Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser
195 200 205
Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe
210 215 220
Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr
225 230 235 240
Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp
245 250 255
Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val
260 265 270
Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu
275 280 285
Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg
290 295 300
Lys Asp Phe
305
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #39 Beta链CDR1
<400> 18
Met Asp His Glu Asn
1 5
<210> 19
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #39 Beta链CDR2
<400> 19
Ser Tyr Asp Val Lys Met
1 5
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #39 Beta链CDR3
<400> 20
Ala Ser Ser Phe Thr Pro Asp Thr Gln Tyr
1 5 10
<210> 21
<211> 816
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #76 alpha链
<400> 21
atggagaccc tcttgggcct gcttatcctt tggctgcagc tgcaatgggt gagcagcaaa 60
caggaggtga cgcagattcc tgcagctctg agtgtcccag aaggagaaaa cttggttctc 120
aactgcagtt tcactgatag cgctatttac aacctccagt ggtttaggca ggaccctggg 180
aaaggtctca catctctgtt gcttattcag tcaagtcaga gagagcaaac aagtggaaga 240
cttaatgcct cgctggataa atcatcagga cgtagtactt tatacattgc agcttctcag 300
cctggtgact cagccaccta cctctgtgct gataatcaaa ctggggcaaa caacctcttc 360
tttgggactg gaacgagact caccgttatt ccctatatcc agaaccctga ccctgccgtg 420
taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 480
tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 540
ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 600
gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 660
agcccagaaa gttcctgtga tgtcaagctg gtcgagaaaa gctttgaaac agatacgaac 720
ctaaactttc aaaacctgtc agtgattggg ttccgaatcc tcctcctgaa agtggccggg 780
tttaatctgc tcatgacgct gcggctgtgg tccagc 816
<210> 22
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #76 alpha链
<400> 22
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val
20 25 30
Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala
35 40 45
Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr
50 55 60
Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile
85 90 95
Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Asp Asn
100 105 110
Gln Thr Gly Ala Asn Asn Leu Phe Phe Gly Thr Gly Thr Arg Leu Thr
115 120 125
Val Ile Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg
130 135 140
Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr
165 170 175
Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser
180 185 190
Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe
195 200 205
Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser
210 215 220
Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn
225 230 235 240
Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu
245 250 255
Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 23
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #76 alpha链CDR1
<400> 23
Asp Ser Ala Ile Tyr Asn
1 5
<210> 24
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #76 alpha链CDR2
<400> 24
Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu
1 5
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #76 alpha链CDR3
<400> 25
Ala Asp Asn Gln Thr Gly Ala Asn Asn Leu Phe
1 5 10
<210> 26
<211> 963
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #76 beta链
<400> 26
atgcttagtc ctgacctgcc tgactctgcc tggaacacca ggctcctctg ccatgtcatg 60
ctttgtctcc tgggagcagg ttcagtggct gctggagtca tccagtcccc aagacatctg 120
atcaaagaaa agagggaaac agccactctg aaatgctatc ctatccctag acacgacact 180
gtctactggt accagcaggg tccaggtcag gacccccagt tcctcatttc gttttatgaa 240
aagatgcaga gcgataaagg aagcatccct gatcgattct cagctcaaca gttcagtgac 300
tatcattctg aactgaacat gagctccttg gagctggggg actcagccct gtacttctgt 360
gccagcagcg agggggggta tggaaactat ggctacacct tcggttcggg gaccaggtta 420
accgttgtag aggacctgaa caaggtgttc ccacccgagg tcgctgtgtt tgagccatca 480
gaagcagaga tctcccacac ccaaaaggcc acactggtgt gcctggccac aggcttcttc 540
cccgaccacg tggagctgag ctggtgggtg aatgggaagg aggtgcacag tggggtcagc 600
acggacccgc agcccctcaa ggagcagccc gccctcaatg actccagata ctgcctgagc 660
agccgcctga gggtctcggc caccttctgg cagaaccccc gcaaccactt ccgctgtcaa 720
gtccagttct acgggctctc ggagaatgac gagtggaccc aggatagggc caaacccgtc 780
acccagatcg tcagcgccga ggcctggggt agagcagact gtggctttac ctcggtgtcc 840
taccagcaag gggtcctgtc tgccaccatc ctctatgaga tcctgctagg gaaggccacc 900
ctgtatgctg tgctggtcag cgcccttgtg ttgatggcca tggtcaagag aaaggatttc 960
taa 963
<210> 27
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #76 beta链
<400> 27
Met Leu Ser Pro Asp Leu Pro Asp Ser Ala Trp Asn Thr Arg Leu Leu
1 5 10 15
Cys His Val Met Leu Cys Leu Leu Gly Ala Gly Ser Val Ala Ala Gly
20 25 30
Val Ile Gln Ser Pro Arg His Leu Ile Lys Glu Lys Arg Glu Thr Ala
35 40 45
Thr Leu Lys Cys Tyr Pro Ile Pro Arg His Asp Thr Val Tyr Trp Tyr
50 55 60
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Asp Pro Gln Phe Leu Ile Ser Phe Tyr Glu
65 70 75 80
Lys Met Gln Ser Asp Lys Gly Ser Ile Pro Asp Arg Phe Ser Ala Gln
85 90 95
Gln Phe Ser Asp Tyr His Ser Glu Leu Asn Met Ser Ser Leu Glu Leu
100 105 110
Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Glu Gly Gly Tyr Gly
115 120 125
Asn Tyr Gly Tyr Thr Phe Gly Ser Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu
130 135 140
Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
145 150 155 160
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
165 170 175
Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
180 185 190
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
195 200 205
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
210 215 220
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
225 230 235 240
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
245 250 255
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
260 265 270
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
275 280 285
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
290 295 300
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305 310 315 320
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #76 beta链CDR1
<400> 28
Pro Arg His Asp Thr
1 5
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #76 beta链CDR2
<400> 29
Phe Tyr Glu Lys Met Gln
1 5
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 #76 beta链CDR3
<400> 30
Ala Ser Ser Glu Gly Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Tyr Thr
1 5 10
<210> 31
<211> 837
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta3 Alpha链
<400> 31
atgtcacttt ctagcctgct gaaggtggtc acagcttcac tgtggctagg acctggcatt 60
gcccagaaga taactcaaac ccaaccagga atgttcgtgc aggaaaagga ggctgtgact 120
ctggactgca catatgacac cagtgatcca agttatggtc tattctggta caagcagccc 180
agcagtgggg aaatgatttt tcttatttat caggggtctt atgaccagca aaatgcaaca 240
gaaggtcgct actcattgaa tttccagaag gcaagaaaat ccgccaacct tgtcatctcc 300
gcttcacaac tgggggactc agcaatgtac ttctgtgcaa tgagagaggg ctggggcttt 360
ggaaatgaga aattaacctt tgggactgga acaagactca ccatcatacc caatatccag 420
aaccctgacc ctgccgtgta ccagctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc 480
ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat 540
atcacagaca aaactgtgct agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg 600
gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca 660
gaagacacct tcttccccag cccagaaagt tcctgtgatg tcaagctggt cgagaaaagc 720
tttgaaacag atacgaacct aaactttcaa aacctgtcag tgattgggtt ccgaatcctc 780
ctcctgaaag tggccgggtt taatctgctc atgacgctgc ggctgtggtc cagctaa 837
<210> 32
<211> 278
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta3 Alpha链CDR1
<400> 32
Met Ser Leu Ser Ser Leu Leu Lys Val Val Thr Ala Ser Leu Trp Leu
1 5 10 15
Gly Pro Gly Ile Ala Gln Lys Ile Thr Gln Thr Gln Pro Gly Met Phe
20 25 30
Val Gln Glu Lys Glu Ala Val Thr Leu Asp Cys Thr Tyr Asp Thr Ser
35 40 45
Asp Pro Ser Tyr Gly Leu Phe Trp Tyr Lys Gln Pro Ser Ser Gly Glu
50 55 60
Met Ile Phe Leu Ile Tyr Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn Ala Thr
65 70 75 80
Glu Gly Arg Tyr Ser Leu Asn Phe Gln Lys Ala Arg Lys Ser Ala Asn
85 90 95
Leu Val Ile Ser Ala Ser Gln Leu Gly Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys
100 105 110
Ala Met Arg Glu Gly Trp Gly Phe Gly Asn Glu Lys Leu Thr Phe Gly
115 120 125
Thr Gly Thr Arg Leu Thr Ile Ile Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro
130 135 140
Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys
145 150 155 160
Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met
180 185 190
Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe
195 200 205
Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe
210 215 220
Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser
225 230 235 240
Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly
245 250 255
Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr
260 265 270
Leu Arg Leu Trp Ser Ser
275
<210> 33
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta3 Alpha链CDR1
<400> 33
Thr Ser Asp Pro Ser Tyr Gly
1 5
<210> 34
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta3 Alpha链CDR2
<400> 34
Gln Gly Ser Tyr Asp Gln Gln Asn
1 5
<210> 35
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta3 Alpha链CDR3
<400> 35
Ala Met Arg Glu Gly Trp Gly Phe Gly Asn Glu Lys Leu Thr
1 5 10
<210> 36
<211> 936
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta3 Beta链
<400> 36
atgggaatca ggctcctctg tcgtgtggcc ttttgtttcc tggctgtagg cctcgtagat 60
gtgaaagtaa cccagagctc gagatatcta gtcaaaagga cgggagagaa agtttttctg 120
gaatgtgtcc aggatatgga ccatgaaaat atgttctggt atcgacaaga cccaggtctg 180
gggctacggc tgatctattt ctcatatgat gttaaaatga aagaaaaagg agatattcct 240
gaggggtaca gtgtctctag agagaagaag gagcgcttct ccctgattct ggagtccgcc 300
agcaccaacc agacatctat gtacctctgt gccagcagag agaagcgggg ggaagacaca 360
gatacgcagt attttggccc aggcacccgg ctgacagtgc tcgaggacct gaaaaacgtg 420
ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 480
gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 540
gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 600
cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 660
tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 720
gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 780
ggtagagcag actgtggctt cacctccgag tcttaccagc aaggggtcct gtctgccacc 840
atcctctatg agatcttgct agggaaggcc accttgtatg ccgtgctggt cagtgccctc 900
gtgctgatgg ccatggtcaa gagaaaggat tcctaa 936
<210> 37
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta3 Beta链
<400> 37
Met Gly Ile Arg Leu Leu Cys Arg Val Ala Phe Cys Phe Leu Ala Val
1 5 10 15
Gly Leu Val Asp Val Lys Val Thr Gln Ser Ser Arg Tyr Leu Val Lys
20 25 30
Arg Thr Gly Glu Lys Val Phe Leu Glu Cys Val Gln Asp Met Asp His
35 40 45
Glu Asn Met Phe Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Phe Ser Tyr Asp Val Lys Met Lys Glu Lys Gly Asp Ile Pro
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Arg Phe Ser Leu Ile
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Ser Thr Asn Gln Thr Ser Met Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Arg Glu Lys Arg Gly Glu Asp Thr Asp Thr Gln Tyr Phe Gly Pro Gly
115 120 125
Thr Arg Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu
130 135 140
Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys
145 150 155 160
Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu
165 170 175
Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr
180 185 190
Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr
195 200 205
Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro
210 215 220
Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn
225 230 235 240
Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser
245 250 255
Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr
260 265 270
Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly
275 280 285
Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala
290 295 300
Met Val Lys Arg Lys Asp Ser
305 310
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta3 Beta链 CDR1
<400> 38
Met Asp His Glu Asn
1 5
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta3 Beta链CDR2
<400> 39
Ser Tyr Asp Val Lys Met
1 5
<210> 40
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta3 Beta链 CDR3
<400> 40
Ala Ser Arg Glu Lys Arg Gly Glu Asp Thr Asp Thr Gln Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 834
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta22 alpha链
<400> 41
atggagaaga atcctttggc agccccatta ctaatcctct ggtttcatct tgactgcgtg 60
agcagcatac tgaacgtgga acaaagtcct cagtcactgc atgttcagga gggagacagc 120
accaatttca cctgcagctt cccttccagc aatttttatg ccttacactg gtacagatgg 180
gaaactgcaa aaagccccga ggccttgttt gtaatgactt taaatgggga tgaaaagaag 240
aaaggacgaa taagtgccac tcttaatacc aaggagggtt acagctattt gtacatcaaa 300
ggatcccagc ctgaagactc agccacatac ctctgtgcct tcgactcgta ctataatgca 360
ggcaacatgc tcacctttgg agggggaaca aggttaatgg tcaaacccca tatccagaac 420
cctgaccctg ccgtgtacca gctgagagac tctaaatcca gtgacaagtc tgtctgccta 480
ttcaccgatt ttgattctca aacaaatgtg tcacaaagta aggattctga tgtgtatatc 540
acagacaaaa ctgtgctaga catgaggtct atggacttca agagcaacag tgctgtggcc 600
tggagcaaca aatctgactt tgcatgtgca aacgccttca acaacagcat tattccagaa 660
gacaccttct tccccagccc agaaagttcc tgtgatgtca agctggtcga gaaaagcttt 720
gaaacagata cgaacctaaa ctttcaaaac ctgtcagtga ttgggttccg aatcctcctc 780
ctgaaagtgg ccgggtttaa tctgctcatg acgctgcggc tgtggtccag ctaa 834
<210> 42
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta22 alpha链
<400> 42
Met Glu Lys Asn Pro Leu Ala Ala Pro Leu Leu Ile Leu Trp Phe His
1 5 10 15
Leu Asp Cys Val Ser Ser Ile Leu Asn Val Glu Gln Ser Pro Gln Ser
20 25 30
Leu His Val Gln Glu Gly Asp Ser Thr Asn Phe Thr Cys Ser Phe Pro
35 40 45
Ser Ser Asn Phe Tyr Ala Leu His Trp Tyr Arg Trp Glu Thr Ala Lys
50 55 60
Ser Pro Glu Ala Leu Phe Val Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu Lys Lys
65 70 75 80
Lys Gly Arg Ile Ser Ala Thr Leu Asn Thr Lys Glu Gly Tyr Ser Tyr
85 90 95
Leu Tyr Ile Lys Gly Ser Gln Pro Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys
100 105 110
Ala Phe Asp Ser Tyr Tyr Asn Ala Gly Asn Met Leu Thr Phe Gly Gly
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Met Val Lys Pro His Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala
130 135 140
Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu
145 150 155 160
Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp
180 185 190
Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala
195 200 205
Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe
210 215 220
Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe
225 230 235 240
Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe
245 250 255
Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu
260 265 270
Arg Leu Trp Ser Ser
275
<210> 43
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta22 alpha链CDR1
<400> 43
Ser Ser Asn Phe Tyr Ala
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta22 alpha链CDR2
<400> 44
Met Thr Leu Asn Gly Asp Glu
1 5
<210> 45
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta22 alpha链CDR3
<400> 45
Ala Phe Asp Ser Tyr Tyr Asn Ala Gly Asn Met Leu Thr
1 5 10
<210> 46
<211> 939
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta22 beta链
<400> 46
atggatacct ggctcgtatg ctgggcaatt tttagtctct tgaaagcagg actcacagaa 60
cctgaagtca cccagactcc cagccatcag gtcacacaga tgggacagga agtgatcttg 120
cgctgtgtcc ccatctctaa tcacttatac ttctattggt acagacaaat cttggggcag 180
aaagtcgagt ttctggtttc cttttataat aatgaaatct cagagaagtc tgaaatattc 240
gatgatcaat tctcagttga aaggcctgat ggatcaaatt tcactctgaa gatccggtcc 300
acaaagctgg aggactcagc catgtacttc tgtgccagca gcgcagacac cgggacactg 360
aacactgaag ctttctttgg acaaggcacc agactcacag ttgtagagga cctgaacaag 420
gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 480
aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttcttccccg accacgtgga gctgagctgg 540
tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacgg acccgcagcc cctcaaggag 600
cagcccgccc tcaatgactc cagatactgc ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 660
ttctggcaga acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 720
aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 780
tggggtagag cagactgtgg ctttacctcg gtgtcctacc agcaaggggt cctgtctgcc 840
accatcctct atgagatcct gctagggaag gccaccctgt atgctgtgct ggtcagcgcc 900
cttgtgttga tggccatggt caagagaaag gatttctaa 939
<210> 47
<211> 312
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta22 beta链
<400> 47
Met Asp Thr Trp Leu Val Cys Trp Ala Ile Phe Ser Leu Leu Lys Ala
1 5 10 15
Gly Leu Thr Glu Pro Glu Val Thr Gln Thr Pro Ser His Gln Val Thr
20 25 30
Gln Met Gly Gln Glu Val Ile Leu Arg Cys Val Pro Ile Ser Asn His
35 40 45
Leu Tyr Phe Tyr Trp Tyr Arg Gln Ile Leu Gly Gln Lys Val Glu Phe
50 55 60
Leu Val Ser Phe Tyr Asn Asn Glu Ile Ser Glu Lys Ser Glu Ile Phe
65 70 75 80
Asp Asp Gln Phe Ser Val Glu Arg Pro Asp Gly Ser Asn Phe Thr Leu
85 90 95
Lys Ile Arg Ser Thr Lys Leu Glu Asp Ser Ala Met Tyr Phe Cys Ala
100 105 110
Ser Ser Ala Asp Thr Gly Thr Leu Asn Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Arg Leu Thr Val Val Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro
130 135 140
Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln
145 150 155 160
Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val
165 170 175
Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser
180 185 190
Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg
195 200 205
Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn
210 215 220
Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu
225 230 235 240
Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val
245 250 255
Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Val Ser
260 265 270
Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu
275 280 285
Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met
290 295 300
Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Phe
305 310
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta22 beta链CDR1
<400> 48
Ser Asn His Leu Tyr
1 5
<210> 49
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta22 beta链CDR2
<400> 49
Phe Tyr Asn Asn Glu Ile
1 5
<210> 50
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCR克隆 Vbeta22 beta链CDR3
<400> 50
Ala Ser Ser Ala Asp Thr Gly Thr Leu Asn Thr Glu Ala Phe
1 5 10
<210> 51
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 弗林蛋白酶切割位点
<400> 51
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly

Claims (67)

1.一种经工程改造的T细胞受体(TCR)，其包含具有SEQ ID NO:5、15、25、35或45的氨基酸序列的α链CDR3和/或具有SEQ ID NO:10、20、30、40或50的氨基酸序列的β链CDR3。
2.根据权利要求1所述的TCR，其中所述经工程改造的TCR结合HLA-A2。
3.根据权利要求2所述的TCR，其中所述经工程改造的TCR结合HLA-A*0201。
4.根据权利要求1所述的TCR，其中所述经工程改造的TCR结合HLA-A24。
5.根据权利要求4所述的TCR，其中所述经工程改造的TCR结合HLA-A*2402。
6.根据权利要求6所述的TCR，其中所述TCR包含与SEQ ID NO:2、12、22、32或42的氨基酸序列具有至少90％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:7、17、27、37或47的氨基酸序列具有至少90％同一性的β链可变区。
7.根据权利要求6所述的TCR，其中所述TCR包含与SEQ ID NO:2、12、22、32或42的氨基酸序列具有至少95％同一性的α链可变区和/或与SEQ ID NO:7、17、27、37或47的氨基酸序列具有至少95％同一性的β链可变区。
8.根据权利要求6所述的TCR，其中所述TCR包含与SEQ ID NO:2、12、22、32或42的氨基酸序列具有至少99％同一性的α链和/或与SEQ ID NO:7、17、27、37或47的氨基酸序列具有至少99％同一性的β链。
9.根据权利要求1所述的TCR，其中所述TCR包含SEQ ID NO:2、12、22、32或42的α链和/或SEQ ID NO:7、17、27、37或47的β链。
10.根据权利要求6所述的TCR，其中所述TCR包含与SEQ ID NO:1、11、21、31或41的核苷酸序列具有至少95％同一性的α链和/或与SEQ ID NO:6、16、26、36或46的核苷酸序列具有至少95％同一性的β链。
11.根据权利要求6所述的TCR，其中所述TCR包含含有SEQ ID NO:1、11、21、31或41的核苷酸序列的α链和/或含有SEQ ID NO:6、16、26、36或46的核苷酸序列的β链。
12.根据权利要求1所述的TCR，其中所述TCR进一步定义为可溶性TCR，其中所述可溶性TCR不包含跨膜结构域。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的TCR，其进一步包含可检测标记。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的TCR，其中所述TCR共价地结合治疗剂。
15.根据权利要求14所述的TCR，其中所述治疗剂是免疫毒素或化学治疗剂。
16.一种多价TCR复合物，其包含多个根据权利要求1-12中任一项所述的TCR。
17.根据权利要求16所述的复合物，其中所述多价TCR包含2、3、4或更多个彼此结合的TCR。
18.根据权利要求17所述的复合物，其中所述多价TCR存在于脂质双层中、脂质体中，或连接至纳米颗粒。
19.根据权利要求17所述的复合物，其中所述TCR经由接头分子彼此结合。
20.一种多肽，其编码权利要求1-19中任一项所述的TCR。
21.一种多核苷酸，其编码权利要求20所述的多肽。
22.一种表达载体，其编码权利要求1-19中任一项所述的TCR。
23.根据权利要求22所述的表达载体，其中所述编码TCR的序列是在启动子的控制下。
24.根据权利要求22所述的表达载体，其中所述表达载体是病毒载体。
25.根据权利要求24所述的表达载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
26.根据权利要求22所述的表达载体，其中所述载体进一步编码接头结构域。
27.根据权利要求26所述的表达载体，其中所述接头结构域位于α链和β链之间。
28.根据权利要求26所述的表达载体，其中所述接头结构域包含一个或多个切割位点。
29.根据权利要求28所述的表达载体，其中所述一个或多个切割位点是弗林蛋白酶切割位点和/或P2A切割位点。
30.根据权利要求29所述的表达载体，其中所述弗林蛋白酶切割位点是RAKR。
31.根据权利要求29所述的表达载体，其中所述弗林蛋白酶切割位点是ATNFSLLKQAGDVEENPG(SEQ ID NO:51)。
32.根据权利要求26所述的表达载体，其中所述一个或多个切割位点被间隔物隔开。
33.根据权利要求32所述的表达载体，其中所述间隔物是SGSG或GSG。
34.一种宿主细胞，其被工程改造成表达权利要求1-12中任一项所述的TCR。
35.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述细胞是T细胞、NK细胞、恒定型NK细胞、NKT细胞、间质干细胞(MSC)或诱导的多能干(iPS)细胞。
36.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是免疫细胞。
37.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞分离自脐带。
38.根据权利要求35所述的宿主细胞，其中所述T细胞是CD8+ T细胞、CD4+T细胞或γδT细胞。
39.根据权利要求35所述的宿主细胞，其中所述T细胞是调节性T细胞(Treg)。
40.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述细胞是自体的。
41.根据权利要求34所述的宿主细胞，其中所述细胞是同种异体的。
42.一种用于工程改造权利要求34所述的宿主细胞的方法，其包括使所述免疫细胞与权利要求1-12中任一项所述的TCR或权利要求22-33中任一项所述的表达载体接触。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞或外周血淋巴细胞。
44.根据权利要求42所述的方法，其中将接触进一步定义为转染或转导。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中转染包括将编码权利要求1-12中任一项的TCR的RNA电穿孔进免疫细胞中。
46.根据权利要求44中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在转导所述免疫细胞之前从权利要求22所述的表达载体产生病毒上清液。
47.根据权利要求42-46中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是经刺激的淋巴细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述经刺激的淋巴细胞是人淋巴细胞。
49.根据权利要求47所述的方法，其中刺激包括使免疫细胞与OKT3和/或IL-2接触或在OKT3和/或IL-2中孵育免疫细胞。
50.根据权利要求42-49中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将免疫细胞分选以分离TCR工程改造的T细胞。
51.根据权利要求50所述的方法，所述方法进一步包括通过连续稀释执行T细胞克隆。
52.根据权利要求51所述的方法，所述方法进一步包括通过快速扩增方案来扩增T细胞克隆。
53.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括给受试者施用有效量的权利要求34-40中任一项所述的TCR工程改造的细胞。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述受试者被鉴定为具有HLA-A*0201等位基因。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述受试者被鉴定为具有HLA-A*2402等位基因。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述TCR工程改造的细胞是T细胞或外周血淋巴细胞。
57.根据权利要求53所述的方法，其中所述T细胞是CD8+T细胞、CD4+T细胞或Treg。
58.根据权利要求53所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述黑素瘤是皮肤黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、粘膜黑素瘤或转移性黑素瘤。
60.根据权利要求53所述的方法，其中所述受试者是人。
61.根据权利要求53所述的方法，其中所述TCR工程改造的细胞是自体的或同种异体的。
62.根据权利要求53所述的方法，所述方法进一步包括在施用SLC45A2-特异性的T细胞之前对受试者的淋巴细胞耗竭。
63.根据权利要求62所述的方法，其中淋巴细胞耗竭包括施用环磷酰胺和/或氟达拉滨。
64.根据权利要求53-63中任一项所述的方法，所述方法进一步包括施用第二种抗癌疗法。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述疗法是化学疗法、免疫疗法、外科手术、放射疗法或生物疗法。
66.根据权利要求53-64中任一项所述的方法，其中静脉内地、腹膜内地、气管内地、肿瘤内地、肌肉内地、内窥镜地、病灶内地、经皮地、皮下地、局部地或通过直接注射或灌注来施用所述TCR工程改造的细胞和/或至少第二种治疗剂。
67.根据权利要求53-66中任一项所述的方法，其中所述受试者被确定具有过表达SLC45A2的癌细胞。
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