CN109880802A - 一种基于cd19和cd70的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于CD19和CD70的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用，所述双重嵌合抗原受体包括嵌合抗原受体CD19和嵌合抗原受体CD70。所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和CD3ζ信号传导结构域以及可诱导自杀融合结构域串联而成。本发明的嵌合抗原受体能特异性的识别肿瘤表面抗原CD19和CD70，相比于使用其他单一嵌合抗原受体T细胞，联合使用两种抗原靶向CAR‑T细胞使得治疗效果更好，不易发生CD19逃逸，更容易缓解疾病。

Description

一种基于CD19和CD70的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细 胞及其应用

技术领域

本发明涉及肿瘤的细胞免疫治疗领域，尤其涉及一种基于CD19和CD70的 双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用，具体为以肿瘤特异靶点 CD19和CD70为基础的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞技术的构建方法及其在 抗肿瘤治疗中的应用。

背景技术

随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法 (Chimericantigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为目前最有发展前 景的肿瘤免疫疗法之一。一般，嵌合抗原受体CAR由一个肿瘤相关抗原结合 区、胞外铰链区、跨膜区域以及胞内信号转导区组成。通常，CAR包含抗体的 单链片段可变(Single chain fragmentvariable，scFv)区或对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)具有特异性的结合结构域，其通过铰链和跨膜区与T 细胞信号传导分子的胞质结构域偶联。最常见的淋巴细胞活化部分包括与T细 胞效应物功能触发(例如CD3ζ)部分串联的T细胞共刺激结构域。CAR介导 的过继性免疫疗法允许CAR-移植的T细胞以非HLA限制性方式直接识别靶肿 瘤细胞上的TAA。

大多数患有B细胞恶性肿瘤(包括B细胞急性淋巴细胞性白血病(B cell acutelymphocytic leukemia,leukemia,B-ALL)和慢性淋巴细胞性白血病(chroniclymphocytic leukemia,CLL)的患者将由于其疾病而死亡。治疗这些患者的一种 方法是通过CAR的表达，对T细胞进行遗传修饰以靶向在肿瘤细胞上表达的抗 原。CAR是经设计以人白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)非依赖性方 式识别细胞表面抗原的抗原受体。尝试使用表达CAR的遗传修饰细胞来治疗这 些类型的患者已经取得了有前景的成功。

CD19分子是治疗B淋巴细胞系肿瘤潜在的靶点，也是CAR研究中的热 点，CD19的表达局限于正常和恶性B细胞，是广泛接受的用来安全测试的 CAR靶标。靶向CD19分子的嵌合抗原受体基因修饰的T细胞(CD19 CAR-T) 在治疗多发性、难治性的急性B淋巴细胞白血病上取得巨大成功，而在难治 性、复发性慢性B淋巴细胞白血病和B淋巴细胞系淋巴瘤的治疗中疗效明显较 差。

CN 104788573 A公开了了一种嵌合抗原受体hCD19scFv-CD8α-CD28-CD3ζ 及其用途，该第二代嵌合抗原受体由抗人CD19单克隆抗体HI19a轻链和重链 可变区(hCD19scFv)、人CD8α铰链区、人CD28跨膜区和胞内区、以及人 CD3ζ胞内区结构串联构成，该专利中的CD19在进行一次CAR-T细胞回输 后，CD19的表达量会降低，容易逃过免疫机制，而且第二代CART的免疫因子 风暴大，有安全性的隐虑。

此外，根据本中心以第四代CD19嵌合抗原受体治疗淋巴瘤的实际统计， 在9位病人当中，其中有4位肿瘤组织免疫组化染色CD19强阳性的病人，在接 受CD19嵌合抗原受体治疗后都达到完全缓解，另外5位CD19弱表达的病人， 只有1位在治疗后达到缓解，其余2位只有部分缓解，1位维持疾病的稳定，1 位疾病有进展，此结果反应了单以CD19嵌和抗原受体治疗的困境。

因此，针对CD19阴性复发，以及CD19低表达的B细胞肿瘤，联合另一 种潜在的嵌合抗原受体能够解决CD19存在的易突变和表达量低的问题显得尤 为重要。除CD19外，CD70亦是治疗恶性B细胞肿瘤的潜力靶点，根据文献报 导，有60％以上的非霍金期淋巴瘤皆有表达，本中心对17位B细胞淋巴瘤患者 的肿瘤进行免疫组化染色也检测到76％的阳性率，目前以CD70抗体治疗B细 胞肿瘤已进入临床实验阶段，所有不良反应皆在可控制的范围，且观察到20％ 的反应率，表示CD70此靶点确实可应用于B细胞淋巴肿瘤的治疗当中。虽然CD70 CART可能用到淋巴瘤治疗，但是还没有联合CD19加上CD70 CART的 治疗方案，因为CD19 CART本身就可能有非常大的副作用，联合使用不确定 性更高。

因此，找到一种强特异性、高靶向性，能够有效提高CART治疗效果的嵌 合抗原受体就显得尤为重要。

发明内容

针对目前CAR-T技术治疗肿瘤中单一靶向的长期效果不十分理想，以及肿 瘤微环境影响CAR-T技术治疗效果的情况，本发明提供一种基于CD19和CD70 的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用，本发明首次联合针对 CD19和CD70双重肿瘤靶点，具有强特异性、高靶向性的特点，能够有效的提 高且延长CART治疗的效果，针对表面抗原CD19和CD70阳性的白血病或B 细胞淋巴瘤有着更好的治疗效果，有效地避免单靶点的脱靶逃逸。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种基于CD19和CD70的双重嵌合抗原受体基因修饰 的免疫细胞，所述双重嵌合抗原受体包括嵌合抗原受体CD19和嵌合抗原受体 CD70。

本发明中，通过将抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原CD19和CD70，再通过 慢病毒载体对T细胞进行修饰，从而使得肿瘤表面抗原CD19和CD70能够特异的 结合在本申请的嵌合抗原受体上，CAR-T细胞能够同时消灭CD19和CD70的肿瘤 细胞，有效避免肿瘤细胞抗原表达降低而发生逃逸，同时增强CAR-T细胞的长 期免疫效果。

本发明中，所述双重嵌合抗原受体可以是单独的CD19嵌合抗原受体和单 独的CD70嵌合抗原受体进行联合使用时，也可以是将CD19嵌合抗原受体与 CD70嵌合抗原受体进行联合表达为双重嵌合抗原受体，即抗原结合结构域为 能够结合肿瘤表面抗原CD19和CD70，这两种情况都可以实现两种嵌合抗原受 体的联合治疗。

根据本发明，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺 激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域和可诱导自杀融合结构域串联而成。

优选地，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原CD19的单链抗体和针 对肿瘤表面抗原CD70的单链抗体。

根据本发明，所述基因修饰改造的T细胞嵌合受体(CAR)以及针对CD19 和CD70抗原结合结构域的单链抗体(scFv)为例叙述如下。

在一个具体的实施例中，所述针对肿瘤表面抗原CD19的单链抗体的氨基 酸序列具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：

(I)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(II)与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有≥90％，优选≥95％，更优选 ≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列；

(III)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个 或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

所述氨基酸序列具有针对肿瘤表面抗原CD19的单链抗体的活性；

针对肿瘤表面抗原CD19的单链抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO.1)如下： DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSR LHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT GSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVS WIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQT DDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS.

根据本发明，所述其具有90％以上同源性的氨基酸序列或经修饰、取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列可以由其它单链抗体或人源化 CD19单链抗体替代，其氨基酸突变体，仍然具有CD19单链抗体的的功能。

在一个具体的实施例中，所述针对肿瘤表面抗原CD70的单链抗体的氨基 酸序列具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：

(I)具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(II)与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有≥90％，优选≥95％，更优选 ≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列；

(III)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个 或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

所述氨基酸序列具有针对肿瘤表面抗原CD70的单链抗体的活性；

针对肿瘤表面抗原CD70单链抗体的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)如下：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLE WMGWINTYTGEPTYADAFKGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCA RDYGDYGMDYWGQGTTVTVSSGSTSGSGKPGSSEGSTKGDIVMTQSPDSLA VSLGERATINCRASKSVSTSGYSFMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDR FSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQHSREVPWTFGQGTKVEIK.

根据本发明，所述其具有90％以上同源性的氨基酸序列或经修饰、取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列可以由其它单链抗体或人源化 CD70单链抗体替代，其氨基酸突变体，仍然具有CD70单链抗体的的功能。

根据本发明，所述嵌合抗原受体通过慢病毒载体对T细胞进行基因改造， CD19和CD70双重CAR-T细胞与肿瘤表面抗原CD19和CD70结合，杀肿瘤效果更 强。

根据本发明，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构 域，在一些具体实施方案中，可以通过氨基酸替换来选择或修饰跨膜结构域。

根据本发明，所述共刺激信号传导区为CD28信号传导结构域、CD27信号 传导结构域或CD137信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合，所述 CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域和CD137信号传导结构域的排 列，本领域技术人员可以根据需要进行调整，CD28信号传导结构域和、CD27 信号传导结构域和CD137信号传导结构域不同的排列不会对所述嵌合抗原受体 产生影响，本申请采用CD28-CD27的顺序组合。

根据本发明，所述第四代CAR带有可诱导自杀融合结构域为包含胱天蛋白 酶9结构域，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述SEQ ID NO.3所示的氨 基酸序列如下：

GSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHY TGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTIS PDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRG NADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMV EVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYG TDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDE SPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFF KTSAS.

根据本发明，所述可诱导自杀融合结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结 构域相串联，所述2A序列会使所述可诱导自杀融合结构域表达的蛋白与所述 嵌合抗原受体蛋白断裂开，从而使得所述嵌合抗原受体能够发挥作用，而通过 注入激活剂，从而使得可诱导自杀融合结构域激活，从而导致表达嵌合抗原受 体的T细胞死亡而失去作用。

根据本发明，所述嵌合抗原受体还包括信号肽，所述信号肽为能够指导嵌 合抗原受体跨膜转移的信号肽，本领域技术人员可以根据需要选择本领域常规 的信号肽，所述信号肽为Secretory信号肽，所述Secretory信号肽为GMCSFR 基因的信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示如下： MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP.

优选的，所述Secretory信号肽为CD8a基因的信号肽，所述Secretory信号 肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示如下：MALPVTALLLPLALLLHAARP.

本发明的嵌合抗原受体还可以包括铰链区，所述铰链区本领域技术人员可 以根据实际情况进行选择，在此不做特殊限定，铰链区的存在不会对本发明的 嵌合抗原受体的性能产生影响。

根据本发明，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构 域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和可诱导自杀融合结 构域串联而成。

作为优选技术方案，所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、CD19抗原结 合结构域和/或CD70抗原结合结构域，CD8α和/或CD28跨膜结构域，CD28细 胞外信号传导结构域、CD28细胞内信号传导结构域、CD27细胞内信号传导结 构域，CD3ζ细胞内信号传导结构域、2A序列和FBKP.Casp9结构域串联而成， 具体排列如下：

Secretory-CD19 scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9；

Secretory-CD70 scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9。

在一个具体的实施例中，所述嵌合抗原受体Secretory-CD19 scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或与 其具有90％以上同源性的氨基酸序列，所述SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列如 下：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPQVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASG YTFTNYGMNWVRQAPGQGLEWMGWINTYTGEPTYADAFKGRVTMTTDTS TSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYGDYGMDYWGQGTTVTVSSGSTSGSG KPGSSEGSTKGDIVMTQSPDSLAVSLGERATINCRASKSVSTSGYSFMHWYQ QKPGQPPKLLIYLASNLESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQH SREVPWTFGQGTKVEIKAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLF PGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRR PGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSQRRKYRSNKGESPVEPA EPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSPGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPA YQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNEL QKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR TSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYT GMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRG NADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFM VEVKGDLTAKKMVLALLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAV YGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSP EDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPK SGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRK KLFFKTSAS；

在一个具体的实施例中，所述嵌合抗原受体Secretory-CD19 scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示或与 其具有95％以上同源性的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.5所示的核酸序列如 下：

ATGCTGCTGCTGGTCACAAGCCTGCTGCTGTGCGAGCTGCCCCACCCC GCCTTTCTGCTGATCCCCGACATCCAGATGACCCAGACCACCAGCAGCCTG AGCGCCAGCCTGGGCGACAGAGTGACCATCAGCTGCCGGGCCAGCCAGG ACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAACCCGACGGCACCGTG AAGCTGCTGATCTACCACACCAGCCGGCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAG ATTTTCTGGCAGCGGATCTGGCACCGACTACAGCCTGACCATCTCCAACCT GGAACAGGAAGATATCGCTACCTACTTCTGTCAGCAGGGCAACACCCTGC CCTACACCTTCGGCGGAGGCACCAAGCTGGAAATCACCGGCAGCACCAGC GGCTCCGGCAAGCCTGGATCTGGCGAGGGCAGCACCAAGGGCGAAGTGA AGCTGCAGGAAAGCGGCCCTGGCCTGGTCGCCCCTAGCCAGAGCCTGTCC GTGACCTGTACCGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCCGACTACGGCGTGTCCTGG ATCAGACAGCCCCCCAGAAAGGGCCTGGAATGGCTGGGCGTGATCTGGGG CAGCGAGACAACCTACTACAACAGCGCCCTGAAGTCCCGGCTGACCATCA TCAAGGACAACAGCAAGAGCCAGGTGTTCCTGAAGATGAACAGCCTGCA GACCGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCG GCAGCTACGCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTCTCT TCTGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGA AGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGT CCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGG GGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCT GGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATG ACTCCCCGCCGCCCTGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCA CCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGCTAGCGGAGGTGGAGGTTCTGG AGGTGGTGGAAGTCAAAGAAGGAAGTACCGCAGCAACAAAGGAGAATCT CCCGTCGAGCCAGCCGAGCCCTGTCATTATTCATGCCCAAGGGAGGAGGA GGGAAGTACAATCCCAATTCAAGAAGACTACAGGAAGCCCGAACCTGCAT GCAGTCCAGGTGGAGGCGGTTCTGGAGGCGGTGGCTCCCGGGTGAAATTC TCACGGTCTGCAGACGCACCCGCTTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTCTA TAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGA GACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCC TCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCT ACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGA TGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCC TTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCACTAGTGGCTCCGGAGCCACGAAC TTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCAT GGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCA AGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGA AAGAAAGTGGACTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCT AGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATG AGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGT GCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGAT GTGGAGCTTCTAAAACTGGAAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGCGGCGGCA GCGGCGCCATGGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTG GCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAAT GTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACAT CGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGAGGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGC TGGCGCGGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTC TCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGGCACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGG GACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGG CCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCCCCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTT CCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCC CACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCC TGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACAT CTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGT CGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTT AATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGCTAGTTAA.

在一个具体的实施例中，所述嵌合抗原受体Secretory-CD70 scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的氨基酸序列如SEQ ID NO.64所示或 与其具有90％以上同源性的氨基酸序列，所述SEQ ID NO.6所示的氨基酸序列 如下：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIS KYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDI ATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGL VAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSAL KSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGT SVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLV VVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSASGGGGSGGGGSQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEE GSTIPIQEDYRKPEPACSPGGGGSGGGGSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNEL NLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIG MKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRTSGSGATNFSLLKQ AGDVEENPGPMGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSR DRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPP HATLVFDVELLKLEGGGGSGGGGSGAMVGALESLRGNADLAYILSMEPCGH CLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLA LLELARQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIF NGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQE GLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWA HSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSAS；

在一个具体的实施例中，所述嵌合抗原受体Secretory-CD70 scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示或与 其具有95％以上同源性的核苷酸序列，所述SEQ ID NO.7所示的核酸序列如 下：

ATGCTGCTGCTCGTTACATCACTCCTCCTGTGTGAACTCCCTCACCCA GCCTTCCTCCTGATCCCTCAGGTTCAGCTCGTGCAGTCCGGAGCCGAAGTT AAGAAACCAGGAGCTTCAGTTAAAGTGTCATGTAAAGCCTCCGGATACAC CTTTACCAACTATGGTATGAACTGGGTTAGACAAGCTCCTGGACAAGGTCT GGAGTGGATGGGTTGGATCAACACTTACACTGGAGAGCCAACCTACGCAG ATGCCTTTAAGGGCAGGGTTACCATGACTACCGATACTTCCACCTCCACTG CATACATGGAGCTGAGATCCCTCAGGTCCGACGATACAGCCGTCTATTACT GTGCTAGGGATTATGGAGATTACGGCATGGATTACTGGGGACAAGGTACCA CAGTGACCGTCTCTTCAGGCAGTACTTCAGGATCTGGTAAGCCTGGAAGCT CCGAAGGCAGTACCAAGGGAGACATCGTTATGACACAGTCTCCAGATTCT CTCGCAGTCAGTCTGGGAGAAAGGGCAACCATCAACTGTAGAGCCAGCA AGTCAGTCAGCACCTCTGGCTACTCTTTCATGCACTGGTATCAGCAGAAAC CTGGACAGCCACCAAAGCTCCTCATCTACCTGGCCTCAAATCTGGAGAGT GGCGTGCCTGATCGCTTTAGTGGAAGCGGTTCAGGGACAGACTTCACACT GACCATTAGTAGCCTGCAAGCCGAGGATGTCGCAGTGTACTACTGCCAGCA CAGCAGAGAGGTGCCTTGGACCTTTGGGCAGGGAACTAAGGTCGAAATCA AAGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGA AGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGT CCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGG GGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCT GGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATG ACTCCCCGCCGCCCTGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCGCTAGCGGAGGTGGAGGTTCTGG AGGTGGTGGAAGTCAAAGAAGGAAGTACCGCAGCAACAAAGGAGAATCT CCCGTCGAGCCAGCCGAGCCCTGTCATTATTCATGCCCAAGGGAGGAGGAGGGAAGTACAATCCCAATTCAAGAAGACTACAGGAAGCCCGAACCTGCAT GCAGTCCAGGTGGAGGCGGTTCTGGAGGCGGTGGCTCCCGGGTGAAATTC TCACGGTCTGCAGACGCACCCGCTTACCAGCAAGGCCAGAACCAACTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGA GACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCC TCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGA TGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCC TTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCACTAGTGGCTCCGGAGCCACGAACTTCTCTCTGTTAAAGCAAGCAGGAGACGTGGAAGAAAACCCCGGTCCCAT GGGAGTGCAGGTGGAAACCATCTCCCCAGGAGACGGGCGCACCTTCCCCA AGCGCGGCCAGACCTGCGTGGTGCACTACACCGGGATGCTTGAAGATGGAAAGAAAGTGGACTCCTCCCGGGACAGAAACAAGCCCTTTAAGTTTATGCT AGGCAAGCAGGAGGTGATCCGAGGCTGGGAAGAAGGGGTTGCCCAGATG AGTGTGGGTCAGAGAGCCAAACTGACTATATCTCCAGATTATGCCTATGGTGCCACTGGGCACCCAGGCATCATCCCACCACATGCCACTCTCGTCTTCGAT GTGGAGCTTCTAAAACTGGAAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGCGGCGGCA GCGGCGCCATGGTCGGTGCTCTTGAGAGTTTGAGGGGAAATGCAGATTTGGCTTACATCCTGAGCATGGAGCCCTGTGGCCACTGCCTCATTATCAACAAT GTGAACTTCTGCCGTGAGTCCGGGCTCCGCACCCGCACTGGCTCCAACAT CGACTGTGAGAAGTTGCGGCGTCGCTTCTCCTCGCTGCATTTCATGGTGGA GGTGAAGGGCGACCTGACTGCCAAGAAAATGGTGCTGGCTTTGCTGGAGC TGGCGCGGCAGGACCACGGTGCTCTGGACTGCTGCGTGGTGGTCATTCTC TCTCACGGCTGTCAGGCCAGCCACCTGCAGTTCCCAGGGGCTGTCTACGG CACAGATGGATGCCCTGTGTCGGTCGAGAAGATTGTGAACATCTTCAATGG GACCAGCTGCCCCAGCCTGGGAGGGAAGCCCAAGCTCTTTTTCATCCAGG CCTGTGGTGGGGAGCAGAAAGACCATGGGTTTGAGGTGGCCTCCACTTCC CCTGAAGACGAGTCCCCTGGCAGTAACCCCGAGCCAGATGCCACCCCGTT CCAGGAAGGTTTGAGGACCTTCGACCAGCTGGACGCCATATCTAGTTTGCC CACACCCAGTGACATCTTTGTGTCCTACTCTACTTTCCCAGGTTTTGTTTCC TGGAGGGACCCCAAGAGTGGCTCCTGGTACGTTGAGACCCTGGACGACAT CTTTGAGCAGTGGGCTCACTCTGAAGACCTGCAGTCCCTCCTGCTTAGGGT CGCTAATGCTGTTTCGGTGAAAGGGATTTATAAACAGATGCCTGGTTGCTTT AATTTCCTCCGGAAAAAACTTTTCTTTAAAACATCAGCTAGTTAA.

本发明中，所述嵌合抗原受体还包括启动子，所述启动子为EF1a、 CMV-TAR或CMV中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，所述的嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中 表达。

根据本发明，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序 列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞，优选为通过病毒载体转染到 T细胞。

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体中的任意一种或至 少两种的组合，优选为慢病毒载体。

第二方面，本发明提供一种重组慢病毒，将包含如第一方面所述的双重嵌 合抗原受体基因修饰的免疫细胞与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染 哺乳细胞得到的重组慢病毒。

本发明中，所述重组慢病毒可有效免疫细胞，包括T细胞，能够制备靶向 T细胞。

根据本发明，所述哺乳细胞为293细胞，293T细胞或TE671细胞中的任意 一种或至少两种的组合。

第三方面，本发明提供一种药物组合物，包含如第一方面所述的双重嵌合 抗原受体基因修饰的免疫细胞和/或如第二方面所述的重组慢病毒。

第四方面，本发明提供如第一方面所述的双重嵌合抗原受体基因修饰的免 疫细胞、如第二方面所述的重组慢病毒或如第三方面所述的药物组合物在制备 嵌合抗原受体T细胞、免疫活性细胞或肿瘤治疗药物中的应用。

本发明中，所述抗原受体T细胞具有良好靶向作用，同时能够释放低剂量 免疫因子，具备低毒性反应性质。

优选地，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病和/或实体瘤，所述肿瘤疾病选自 但不限于白血病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明的双重嵌合抗原受体通过对T细胞嵌合受体基因进行特定的改 造，基于CD19和CD70的双重CAR-T细胞与肿瘤表面抗原CD19和CD70结 合，杀肿瘤效果更强，肿瘤缩小效果更为明显；

(2)本发明的双重嵌合抗原受体能特异性的识别肿瘤表面抗原CD19和 CD70，CD19和CD70在白血病及淋巴瘤中表达量高，相比于其他嵌合抗原受 体和其他肿瘤抗原有更安全、更显著的效果，使得CAR-T细胞的免疫效果增 强，不易发生CD19逃逸，更容易到达疾病处，治疗疾病效果提高。

附图说明

图1为本发明的嵌合抗原受体CD19和CD70的合成基因序列图谱；

图2为本发明嵌合抗原受体CD19和CD70联合使用的原理图；

图3为B细胞肿瘤细胞株CD19和CD70流式分析结果图，图3(a)-图3(b) 白血病细胞株RS4-11，图3(c)-图3(d)淋巴瘤细胞株OCI-Ly3，图3(e)-图3(f)淋 巴瘤细胞株SUD-HL8；

图4为CD19和CD70嵌合抗原受体T细胞体外杀伤B细胞肿瘤细胞株的 结果图；

图5为CD19和CD70免疫组化染色结果图，样品为淋巴瘤病人肿瘤组织， 图5(a)为一中枢DLBCL IVA期患者肿瘤组织，图5(b)为复发性DLBCL non-GCB型患者肿瘤组织结构；

图6为17位B细胞淋巴瘤患者肿瘤组织免疫组化染色抗原表达强弱统计， 评分从1+到4+为弱到强表达，图6(a)CD19表达强弱分布，图6(b)CD70表达 强弱分布；

图7为CD19和CD70嵌合抗原受体T细胞临床试验流程图；

图8为临床联合应用CD19和CD70嵌合抗原受体T细胞治疗一中枢弥漫大 B细胞淋巴瘤IV期患者，图8(a)回输前、图8(b)回输后影像学比较；

图9为临床联合应用CD19和CD70嵌合抗原受体T细胞治疗一中枢弥漫大 B细胞淋巴瘤IV期患者，回输后患者体内测到CAR基因拷贝数；

图10为临床联合应用CD19和CD70嵌合抗原受体T细胞治疗一复发性弥 漫大B细胞淋巴瘤患者，图10(a)回输前、图10(b)回输后影像学比较。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过 具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范 围内。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或 条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可 通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1嵌合抗原受体的构建

(1)通过全基因合成Secretory信号肽、CD19或CD70抗原结合结构域，CD8α 和/或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域，CD3ζ 信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域，如图1所示，即Secretory-CD19 scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9及Secretory-CD70 scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9；具体序列如下：

Secretory-CD19 scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的核苷酸序列如 SEQ IDNO.5所示。

Secretory-CD70 scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9的核苷酸序列如 SEQ IDNO.7所示。

实施例2慢病毒包装

(1)使用293T细胞，培养17-18小时；

(2)加入新鲜的DMEM，内含10％的FBS；

(3)在无菌离心管中加入以下试剂：每孔取DMEM加入helper DNA mix (pNHP，pHEF-VSV-G)以及pTYF DNA载体，漩涡振荡；

(4)用Superfect或是任何转基因材料加至离心管，室温静置7-10分钟；

(5)将离心管中的DNA-Superfect混合液逐滴加入至每个培养细胞中，漩 涡打匀；

(6)37℃3％CO₂培养箱里培养4-5小时；

(7)吸走培养基的培养液，用293细胞培养液冲洗培养基，并加入培养液 继续培养；

(8)将培养基放回3％CO₂培养箱中培养过夜，第二天早上用荧光显微镜 观察转染效率。

实施例3慢病毒的纯化和浓缩

1)病毒纯化

通过离心1000g，5分钟除去细胞碎片，得到病毒上清液，用一个0.45微米 的低蛋白结合过滤器将病毒上清液过滤，病毒被分装成小份，储存在-80℃；

通常情况下，在每毫升的培养基中，转染细胞可以产生10⁶到10⁷转导单位 滴定的慢病毒载体。

2)用Centricon或类似过滤器浓缩慢病毒载体

(1)Centricon或类似过滤管中加入病毒上清液，然后在2500g离心30分 钟；

(2)震荡过滤管，然后400g离心2分钟，收集浓缩的病毒到收集杯中。 最后将所有管中的病毒集中到一个离心管中。

实施例4 CAR-T细胞的转染

将活化后的T细胞接种到培养皿中，加入浓缩目标基因的慢病毒，以100g 离心力的速度，离心100分钟，置于37℃培养24h，加入有细胞培养因子的AIM-V 培养基，培养2-3天后，将细胞收获并计数，即成为可用之CD19 CAR-T细胞。

实施例5联合使用CD19和CD70 CAR-T细胞的体外恶性B细胞株杀伤

(1)从图2可以看出，通过CD19联合CD70能够联合治疗肿瘤，表示本 发明选用的双重嵌合抗原受体能够对肿瘤治疗起到明显作用，特别是CD19表达 较弱的肿瘤，并且有效防止CD19逃逸。

(2)针对不同B细胞肿瘤的细胞株以流式细胞仪对CD19与CD70的表达 进行分析，包含白血病与淋巴瘤细胞株，结果如图3(a)-图3(f)所示，可以看出 在不同B细胞肿瘤中CD19与CD70表达程度不一，通过联合CD19与CD70 CART的治疗可更有效的针对B细胞肿瘤。

(3)体外评估双重CAR-T细胞对靶细胞的识别杀伤功能：将非专一性的T 细胞、GD2CAR-T细胞和本申请制备的CD19 CART和CD70 CART细胞与表 达CD19、CD70但不表达GD2之靶细胞，也就是表达绿色荧光之RS4-11人急 性淋巴白血病细胞株(T细胞：肿瘤细胞株＝2:1)，置于37°5％CO₂培养箱共 培养24hr；

(4)共培养之后，以AnnexinV及PI对因特异性杀伤而凋亡的细胞进行染 色，并以流式细胞仪分析。圈选出带有绿色荧光的靶细胞后，进一步分析PI与 Annexin V皆为阴性的细胞百分比，即经过24小时杀伤后仍存活的靶细胞百分 比，百分比越低代表杀伤效果越好。

结果如图4所示，相较于对照组T细胞和GD2 CART，CD19 CART、CD70 CART及本发明CD19 CART+CD70 CART都对RS4-11细胞造成明显的杀伤效 果，显示本发明CD19 CART+CD70CART能够对B细胞肿瘤进行消融。

实施例7 CAR-T细胞的临床应用

自2013年7月至2016年7月，本实验室与22所临床医学中心及医院合作，治 疗了102位符合入组条件的CD19阳性且化疗耐受性之B-ALL患者，总计有55名儿 童及47名成人，其中27位患者接受过异体造血干细胞移植，患者于接受CAR-T 治疗时，骨髓中幼稚白血病细胞百分比中位数为14.5％(范围从0％到98％)，其 中69名患者骨髓幼稚白血病细胞小于50％，另外33名患者骨髓幼稚白血病细胞大 于50％。从初次诊断到接受CAR-T细胞治疗的时间长中位数为17个月(范围从2 到164个月)。

目前CD19 CART已发展多年，对治疗B急性淋巴细胞白血病有很好的效果， 而在淋巴瘤的治疗上，我们发现未能像白血病一样达到85％以上的完全缓解，许 多病人只观察到部分缓解或是只维持肿瘤稳定，于是针对过去于本中心进行 CD19CART单靶治疗的淋巴瘤患者，且由本中心而非第三方机构对其肿瘤进行 CD19免疫组化染色的病人进行统计，结果如下表1所示，9位病人当中，有4位 CD19强表达的病人都达到完全缓解，另外5位CD19弱表达的病人，只有1位达到 完全缓解，其他4位只有部分缓解，维持疾病稳定或是疾病进展，显示了CD19 表达强弱影响了CD19 CART的治疗效果，针对此一局限，我们想联合其他靶点 与CD19 CART进行治疗。

表1

	CD19弱表达(≤2+)	CD19强表达(＞2+)
				n＝5	n＝4
CR(完全缓解)	1(20％)	4(100％)
			PR(部分缓解)	2(40％)	0
SD(维持稳定)	1(20％)	0
			PD(疾病进展)	1(20％)	0

实施例7肿瘤细胞的抗原染色鉴定抗原CART靶点

将手术取得的肿瘤组织做固定后，蜡块切片置于玻片上，进行对肿瘤抗原 染色，使用CD19以及CD70特异抗体。如图5(a)与图5(b)以两位弥漫大B淋巴瘤者 为例，对其肿瘤组织进行免疫组化染色，与对照组相比，这两位淋巴瘤患者肿 瘤同时表达CD19与CD70抗原，进一步针对17位B细胞淋巴瘤患者肿瘤组织免疫 组化染色抗原表达强弱进行统计，图6(a)显示有53％的病人CD19为强表达(3-4+)， 47％的病人弱表达或不表达CD19抗原(0-2+)，图6(b)显示有71％病人高表达CD70 抗原，29％的病人组织其CD70低表达或不表达。根据以上数据可看出，CD70确 实广泛地表达于淋巴肿瘤当中，可联合CD19 CART做治疗。

根据上述结果进行临床试验，流程图如图7所示，病人治疗案例具体步骤 如下，结果如图8(a)-图8(b)、图9、图10(a)-图10(b)所示：

(1)患者首先经过医院及实验室的评估，符合入组条件后采集自体或供者 白细胞。接下来依循标准操作流程，由PBMC中筛选出CD3阳性T细胞，进行 活化及转染4SCAR19和4SCAR70，制成CD19 CAR-T细胞和CD70 CAR-T细 胞；

(2)患者于输注前，经环磷酰胺及氟达拉滨预处理，平均输注细胞数为每 公斤体重1×10⁶细胞，白细胞及CAR-T细胞的品质、基因转染率、CAR-T细胞 扩增情况及有效CAR-T细胞输注数都经过评估及记录；

(3)患者回输CAR-T细胞后，在一个月内会密切监测其免疫因子风暴及 CAR拷贝数。长期的临床及实验室评估可以得到治疗毒性及最终治疗效果的结 论。毒性评估依据National Cancer Institute’s Common Terminology Criteria for Adverse Events(美国国立癌症研究所不良事件常用术语标准)(CTCAE v4.03)。

具体临床试验结果如下：

1)目前本中心有两位淋巴瘤患者接受CD19+CD70 CART的治疗，根据 CTCAE的毒性评估，两位病人只有轻微的疲倦头晕以及食欲不佳，体温以及其 他血液指标皆为正常，评估为一级的毒性反应，显示CD19+CD70 CART的联合 治疗具有很高的安全性。

2)其中一中枢弥漫大B淋巴瘤病人回输后一个月即达到肿瘤缓解，图8(a) 为回输前脑部肿瘤MRI图，回输CD19+CD70 CART后一个月的MRI报告8(b) 显示右侧颞叶术后残腔边缘颞顶叶肿块(淋巴瘤病变)消失(如箭头所示)，病 人达到缓解，图9为病人回输后外围血所测的CD19 CART与CD70 CART拷贝 数，目前病人已回输满一年，肿瘤未曾复发；

3)另一复发性弥漫大B淋巴瘤病人，回输前病灶位于腹腔，CD19+CD70 CART联合治疗后以PET-CT进行效果评估，图10(a)为回输前腹腔淋巴瘤病灶， 肿瘤大小1.6×1.1cm，SUV max为6.9，回输CART后两个月，可见图10(b)， 腹腔肿块消失，未见高代谢病灶，医生评估为完全缓解。

综上所述，本发明的双重嵌合抗原受体能特异性的识别肿瘤表面抗原CD19 和CD70，相比于使用其他单一嵌合抗原受体T细胞，联合使用两种CAR-T细 胞使得治疗效果更好，不易发生CD19逃逸，更容易让疾病缓解。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明 并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。 所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原 料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范 围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京美康基免生物科技有限公司

<120> 一种基于CD19和CD70的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用

<130> 2018

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

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35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

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Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

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Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

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Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

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Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

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Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

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210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 2

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1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

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Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Ala Phe

50 55 60

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65 70 75 80

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Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro

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Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg

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Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Met His Trp Tyr

165 170 175

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245

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<211> 423

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 3

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50 55 60

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65 70 75 80

Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys

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165 170 175

Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp Cys

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Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu Val

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<211> 986

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 4

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Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Asp Ile

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Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg

165 170 175

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180 185 190

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<210> 5

<211> 2955

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

atgctgctgc tggtcacaag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60

atccccgaca tccagatgac ccagaccacc agcagcctga gcgccagcct gggcgacaga 120

gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180

aaacccgacg gcaccgtgaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240

cccagcagat tttctggcag cggatctggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300

gaacaggaag atatcgctac ctacttctgt cagcagggca acaccctgcc ctacaccttc 360

ggcggaggca ccaagctgga aatcaccggc agcaccagcg gctccggcaa gcctggatct 420

ggcgagggca gcaccaaggg cgaagtgaag ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtcgcc 480

cctagccaga gcctgtccgt gacctgtacc gtgtccggcg tgtccctgcc cgactacggc 540

gtgtcctgga tcagacagcc ccccagaaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600

agcgagacaa cctactacaa cagcgccctg aagtcccggc tgaccatcat caaggacaac 660

agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720

tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780

accagcgtga cagtctcttc tgcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840

gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900

cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 960

gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020

agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccctgg gcccacccgc 1080

aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc cgctagcgga 1140

ggtggaggtt ctggaggtgg tggaagtcaa agaaggaagt accgcagcaa caaaggagaa 1200

tctcccgtcg agccagccga gccctgtcat tattcatgcc caagggagga ggagggaagt 1260

acaatcccaa ttcaagaaga ctacaggaag cccgaacctg catgcagtcc aggtggaggc 1320

ggttctggag gcggtggctc ccgggtgaaa ttctcacggt ctgcagacgc acccgcttac 1380

cagcaaggcc agaaccaact ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 1440

gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 1500

cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag 1560

attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc 1620

agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgcact 1680

agtggctccg gagccacgaa cttctctctg ttaaagcaag caggagacgt ggaagaaaac 1740

cccggtccca tgggagtgca ggtggaaacc atctccccag gagacgggcg caccttcccc 1800

aagcgcggcc agacctgcgt ggtgcactac accgggatgc ttgaagatgg aaagaaagtg 1860

gactcctccc gggacagaaa caagcccttt aagtttatgc taggcaagca ggaggtgatc 1920

cgaggctggg aagaaggggt tgcccagatg agtgtgggtc agagagccaa actgactata 1980

tctccagatt atgcctatgg tgccactggg cacccaggca tcatcccacc acatgccact 2040

ctcgtcttcg atgtggagct tctaaaactg gaaggtggag gcggttcagg cggcggcggc 2100

agcggcgcca tggtcggtgc tcttgagagt ttgaggggaa atgcagattt ggcttacatc 2160

ctgagcatgg agccctgtgg ccactgcctc attatcaaca atgtgaactt ctgccgtgag 2220

tccgggctcc gcacccgcac tggctccaac atcgactgtg agaagttgcg gcgtcgcttc 2280

tcctcgctgc atttcatggt ggaggtgaag ggcgacctga ctgccaagaa aatggtgctg 2340

gctttgctgg agctggcgcg gcaggaccac ggtgctctgg actgctgcgt ggtggtcatt 2400

ctctctcacg gctgtcaggc cagccacctg cagttcccag gggctgtcta cggcacagat 2460

ggatgccctg tgtcggtcga gaagattgtg aacatcttca atgggaccag ctgccccagc 2520

ctgggaggga agcccaagct ctttttcatc caggcctgtg gtggggagca gaaagaccat 2580

gggtttgagg tggcctccac ttcccctgaa gacgagtccc ctggcagtaa ccccgagcca 2640

gatgccaccc cgttccagga aggtttgagg accttcgacc agctggacgc catatctagt 2700

ttgcccacac ccagtgacat ctttgtgtcc tactctactt tcccaggttt tgtttcctgg 2760

agggacccca agagtggctc ctggtacgtt gagaccctgg acgacatctt tgagcagtgg 2820

gctcactctg aagacctgca gtccctcctg cttagggtcg ctaatgctgt ttcggtgaaa 2880

gggatttata aacagatgcc tggttgcttt aatttcctcc ggaaaaaact tttctttaaa 2940

acatcagcta gttaa 2955

<210> 6

<211> 984

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 6

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Ile Glu

260 265 270

Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr

275 280 285

Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro

290 295 300

Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu

305 310 315 320

Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

325 330 335

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

340 345 350

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

355 360 365

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Ala Ser Gly Gly Gly Gly Ser

370 375 380

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Arg Arg Lys Tyr Arg Ser Asn Lys Gly Glu

385 390 395 400

Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys His Tyr Ser Cys Pro Arg Glu

405 410 415

Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp Tyr Arg Lys Pro Glu

420 425 430

Pro Ala Cys Ser Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg

435 440 445

Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln

450 455 460

Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp

465 470 475 480

Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro

485 490 495

Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp

500 505 510

Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg

515 520 525

Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr

530 535 540

Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Thr

545 550 555 560

Ser Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp

565 570 575

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser

580 585 590

Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val

595 600 605

His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Val Asp Ser Ser Arg

610 615 620

Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile

625 630 635 640

Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala

645 650 655

Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro

660 665 670

Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu

675 680 685

Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Ala Met

690 695 700

Val Gly Ala Leu Glu Ser Leu Arg Gly Asn Ala Asp Leu Ala Tyr Ile

705 710 715 720

Leu Ser Met Glu Pro Cys Gly His Cys Leu Ile Ile Asn Asn Val Asn

725 730 735

Phe Cys Arg Glu Ser Gly Leu Arg Thr Arg Thr Gly Ser Asn Ile Asp

740 745 750

Cys Glu Lys Leu Arg Arg Arg Phe Ser Ser Leu His Phe Met Val Glu

755 760 765

Val Lys Gly Asp Leu Thr Ala Lys Lys Met Val Leu Ala Leu Leu Glu

770 775 780

Leu Ala Arg Gln Asp His Gly Ala Leu Asp Cys Cys Val Val Val Ile

785 790 795 800

Leu Ser His Gly Cys Gln Ala Ser His Leu Gln Phe Pro Gly Ala Val

805 810 815

Tyr Gly Thr Asp Gly Cys Pro Val Ser Val Glu Lys Ile Val Asn Ile

820 825 830

Phe Asn Gly Thr Ser Cys Pro Ser Leu Gly Gly Lys Pro Lys Leu Phe

835 840 845

Phe Ile Gln Ala Cys Gly Gly Glu Gln Lys Asp His Gly Phe Glu Val

850 855 860

Ala Ser Thr Ser Pro Glu Asp Glu Ser Pro Gly Ser Asn Pro Glu Pro

865 870 875 880

Asp Ala Thr Pro Phe Gln Glu Gly Leu Arg Thr Phe Asp Gln Leu Asp

885 890 895

Ala Ile Ser Ser Leu Pro Thr Pro Ser Asp Ile Phe Val Ser Tyr Ser

900 905 910

Thr Phe Pro Gly Phe Val Ser Trp Arg Asp Pro Lys Ser Gly Ser Trp

915 920 925

Tyr Val Glu Thr Leu Asp Asp Ile Phe Glu Gln Trp Ala His Ser Glu

930 935 940

Asp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Arg Val Ala Asn Ala Val Ser Val Lys

945 950 955 960

Gly Ile Tyr Lys Gln Met Pro Gly Cys Phe Asn Phe Leu Arg Lys Lys

965 970 975

Leu Phe Phe Lys Thr Ser Ala Ser

980

<210> 7

<211> 2961

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 7

atgctgctgc tcgttacatc actcctcctg tgtgaactcc ctcacccagc cttcctcctg 60

atccctcagg ttcagctcgt gcagtccgga gccgaagtta agaaaccagg agcttcagtt 120

aaagtgtcat gtaaagcctc cggatacacc tttaccaact atggtatgaa ctgggttaga 180

caagctcctg gacaaggtct ggagtggatg ggttggatca acacttacac tggagagcca 240

acctacgcag atgcctttaa gggcagggtt accatgacta ccgatacttc cacctccact 300

gcatacatgg agctgagatc cctcaggtcc gacgatacag ccgtctatta ctgtgctagg 360

gattatggag attacggcat ggattactgg ggacaaggta ccacagtgac cgtctcttca 420

ggcagtactt caggatctgg taagcctgga agctccgaag gcagtaccaa gggagacatc 480

gttatgacac agtctccaga ttctctcgca gtcagtctgg gagaaagggc aaccatcaac 540

tgtagagcca gcaagtcagt cagcacctct ggctactctt tcatgcactg gtatcagcag 600

aaacctggac agccaccaaa gctcctcatc tacctggcct caaatctgga gagtggcgtg 660

cctgatcgct ttagtggaag cggttcaggg acagacttca cactgaccat tagtagcctg 720

caagccgagg atgtcgcagt gtactactgc cagcacagca gagaggtgcc ttggaccttt 780

gggcagggaa ctaaggtcga aatcaaagcg gccgcaattg aagttatgta tcctcctcct 840

tacctagaca atgagaagag caatggaacc attatccatg tgaaagggaa acacctttgt 900

ccaagtcccc tatttcccgg accttctaag cccttttggg tgctggtggt ggttggggga 960

gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt 1020

aagaggagca ggctcctgca cagtgactac atgaacatga ctccccgccg ccctgggccc 1080

acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca ccacgcgact tcgcagccta tcgctccgct 1140

agcggaggtg gaggttctgg aggtggtgga agtcaaagaa ggaagtaccg cagcaacaaa 1200

ggagaatctc ccgtcgagcc agccgagccc tgtcattatt catgcccaag ggaggaggag 1260

ggaagtacaa tcccaattca agaagactac aggaagcccg aacctgcatg cagtccaggt 1320

ggaggcggtt ctggaggcgg tggctcccgg gtgaaattct cacggtctgc agacgcaccc 1380

gcttaccagc aaggccagaa ccaactctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 1440

tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 1500

aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 1560

agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1620

ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 1680

cgcactagtg gctccggagc cacgaacttc tctctgttaa agcaagcagg agacgtggaa 1740

gaaaaccccg gtcccatggg agtgcaggtg gaaaccatct ccccaggaga cgggcgcacc 1800

ttccccaagc gcggccagac ctgcgtggtg cactacaccg ggatgcttga agatggaaag 1860

aaagtggact cctcccggga cagaaacaag ccctttaagt ttatgctagg caagcaggag 1920

gtgatccgag gctgggaaga aggggttgcc cagatgagtg tgggtcagag agccaaactg 1980

actatatctc cagattatgc ctatggtgcc actgggcacc caggcatcat cccaccacat 2040

gccactctcg tcttcgatgt ggagcttcta aaactggaag gtggaggcgg ttcaggcggc 2100

ggcggcagcg gcgccatggt cggtgctctt gagagtttga ggggaaatgc agatttggct 2160

tacatcctga gcatggagcc ctgtggccac tgcctcatta tcaacaatgt gaacttctgc 2220

cgtgagtccg ggctccgcac ccgcactggc tccaacatcg actgtgagaa gttgcggcgt 2280

cgcttctcct cgctgcattt catggtggag gtgaagggcg acctgactgc caagaaaatg 2340

gtgctggctt tgctggagct ggcgcggcag gaccacggtg ctctggactg ctgcgtggtg 2400

gtcattctct ctcacggctg tcaggccagc cacctgcagt tcccaggggc tgtctacggc 2460

acagatggat gccctgtgtc ggtcgagaag attgtgaaca tcttcaatgg gaccagctgc 2520

cccagcctgg gagggaagcc caagctcttt ttcatccagg cctgtggtgg ggagcagaaa 2580

gaccatgggt ttgaggtggc ctccacttcc cctgaagacg agtcccctgg cagtaacccc 2640

gagccagatg ccaccccgtt ccaggaaggt ttgaggacct tcgaccagct ggacgccata 2700

tctagtttgc ccacacccag tgacatcttt gtgtcctact ctactttccc aggttttgtt 2760

tcctggaggg accccaagag tggctcctgg tacgttgaga ccctggacga catctttgag 2820

cagtgggctc actctgaaga cctgcagtcc ctcctgctta gggtcgctaa tgctgtttcg 2880

gtgaaaggga tttataaaca gatgcctggt tgctttaatt tcctccggaa aaaacttttc 2940

tttaaaacat cagctagtta a 2961

<210> 8

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 8

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 9

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 9

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

Claims (10)

1.一种基于CD19和CD70的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞，其特征在于，所述双重嵌合抗原受体包括嵌合抗原受体CD19和嵌合抗原受体CD70。

2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域和可诱导自杀融合结构域串联而成；

优选地，所述抗原结合结构域为针对肿瘤表面抗原CD19的单链抗体和针对肿瘤表面抗原CD70的单链抗体。

3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞，其特征在于，所述针对肿瘤表面抗原CD19的单链抗体的氨基酸序列具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：

(I)具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

(II)与SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列；

(III)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

所述氨基酸序列具有针对肿瘤表面抗原CD19的单链抗体的活性；

优选地，所述针对肿瘤表面抗原CD70的单链抗体的氨基酸序列具有(I)、(II)或(III)所示的氨基酸序列中的任意一个：

(I)具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列；

(II)与SEQ ID NO.2所示氨基酸序列具有≥90％，优选≥95％，更优选≥98％，最优选≥99％同源性的氨基酸序列；

(III)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；

所述氨基酸序列具有针对肿瘤表面抗原CD70的单链抗体的活性。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的免疫细胞，其特征在于，所述跨膜结构域为CD28跨膜结构域和/或CD8α跨膜结构域；

优选地，所述共刺激信号传导区为CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域或CD137信号传导结构域中的任意一种或至少两种的组合；

优选地，所述可诱导自杀融合结构域为包含胱天蛋白酶9结构域；

优选地，所述胱天蛋白酶9结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

优选地，所述可诱导自杀融合结构域通过2A序列与CD3ζ信号传导结构域相串联。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括信号肽、抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区、CD3ζ信号传导结构域、2A序列和可诱导自杀融合结构域串联而成；

优选地，所述嵌合抗原受体为Secretory信号肽、CD19抗原结合结构域和/或CD70抗原结合结构域，CD8α和/或CD28跨膜结构域，CD28信号传导结构域、CD27信号传导结构域，CD3ζ信号传导结构域、2A序列和胱天蛋白酶9结构域串联而成；

优选地，所述嵌合抗原受体CD19为Secretory-CD19scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9；所述嵌合抗原受体CD70为Secretory-CD70scFv-CD28-CD27-CD3ζ-2A-FBKP.Casp9；

优选地，所述嵌合抗原受体CD19的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示或与其具有90％以上同源性的氨基酸序列；

优选地，所述嵌合抗原受体CD70的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示或与其具有90％以上同源性的氨基酸序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的免疫细胞，其特征在于，所述双重嵌合抗原受体通过其编码的核酸序列转染到T细胞中表达；

优选地，所述转染的方式为通过病毒载体、真核表达质粒或mRNA序列中的任意一种或至少两种的组合转染到T细胞，优选为通过病毒载体转染到T细胞；

优选地，所述病毒载体为慢病毒载体或逆转录病毒载体中的任意一种或至少两种的组合，优选为慢病毒载体。

7.一种重组慢病毒，其特征在于，将包含如权利要求1-6中任一项所述的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞与包装辅助质粒pNHP和pHEF-VSVG共转染哺乳细胞得到的重组慢病毒；

优选地，所述哺乳细胞为293细胞，293T细胞或TE671细胞中的任意一种或至少两种的组合。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包括如权利要求1-6中任一项所述的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞和/或如权利要求7所述的重组慢病毒。

9.如权利要求1-6中任一项所述的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞、如权利要求7所述的重组慢病毒或如权利要求8所述的药物组合物在制备嵌合抗原受体T细胞、免疫活性细胞或肿瘤治疗药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为血液相关的肿瘤疾病；

优选地，所述血液相关的肿瘤疾病为白血病或淋巴瘤。