CN109100200A - 一种基于m-cdx成瘤模型的组织切片制作方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组织切片的制作方法，其具体是一种基于M‑CDX成瘤模型的组织切片制作方法。包括：将胚蛋在温度为36~38℃、湿度为60~80%的培养箱中孵育5~7天，在胚蛋顶端剪开1cmx1cm窗口；将0.5~8*106数量的肿瘤细胞掺入细胞外基质，制成细胞悬液，滴加到事先放于绒毛尿囊膜的硅胶圈内，37℃、60%湿度孵育3天，将组织连带其周围的绒毛尿囊膜用手术剪剪下，进行石蜡包埋，并切片，之后进行HE染色，并镜检。本发明制备的切片组织包含了完整的细胞结构类型，各层组织和细胞位置相对固定，便于观察各层组织和细胞的形态位置关系，且易于保存，适用于组织切片的快速大规模制备，为研究免疫学和肿瘤学形成过程中的作用提供了很好的试验基础。
Description
技术领域
本发明涉及组织切片的制作方法，其具体是一种基于M-CDX成瘤模型的组织切片制作方法。
背景技术
membrane-based cell-derived xenograft（M-CDX）是基于膜的细胞来源的异体移植，即将异种物种的肿瘤细胞系移植到鸡胚绒毛尿囊膜中构建的模型。此模型可用于血管新生与肿瘤发生发展的互相作用，以及筛选有效抗肿瘤化合物的研究。
现有技术一种循环肿瘤细胞小鼠模型、其构建方法及应用（CN201710364391.9），所述方法包括如下步骤：(1)皮下移植：将原代肿瘤组织样本移植到免疫缺陷小鼠的体内，构建原代癌症异种移植模型PDX；(2)采集循环肿瘤细胞：采集步骤(1)所述的原代癌症异种移植模型的外周血中的循环肿瘤细胞；(3)肾囊膜移植：将步骤(2)采集的循环肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠的肾囊膜内，即构建成功所述循环肿瘤细胞小鼠模型。本发明方法采用二次以上的多次传代移植的方式，将原代肿瘤异种移植模型中的CTCs通过肾囊膜移植到免疫缺陷小鼠体内，得循环肿瘤细胞小鼠模型，可用于研究CTCs体内转移的机制及扩散情况。
传统的CDX模型，荷瘤载体一般是裸鼠，裸鼠移植瘤可以保存原有组织学构造或各种功能，且将人癌组织的组织培养物移种于裸鼠时，能重现已在组织培养中消失的原有的癌结构。这些特征有助于分析人类肿瘤的性质，从而推动各方面的工作，为实验肿瘤学提供新的有效的工具。但是，由于裸鼠的饲养和繁殖要求条件比较严格，价格比较昂贵，相关裸鼠移植肿瘤模型存在一定局限性。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种基于M-CDX成瘤模型的组织切片制作方法，其将细胞种植在绒毛尿囊膜上后，过3天，取下该的组织及其周围的膜，将组织包埋在石蜡块里，用切片机切成薄片，再用苏木精－伊红(H-E)染色，用显微镜镜检。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种基于M-CDX成瘤模型的组织切片制作方法，包括：
步骤1：将胚蛋在温度为36~38℃、湿度为60~80%的培养箱中孵育5~7天，在胚蛋顶端剪开1cmx1cm窗口；
步骤2：将0.5~8*106数量的肿瘤细胞掺入细胞外基质，制成细胞悬液，滴加到事先放于绒毛尿囊膜的硅胶圈内，37℃、60%湿度孵育3天，将组织连带其周围的绒毛尿囊膜用手术剪剪下，进行石蜡包埋，并切片，之后进行HE染色，并镜检。
优选地，在步骤1中，将胚蛋在温度为37℃，湿度为60%的培养箱中孵育3天。
优选地，在步骤2中，所述细胞外基质为基质胶、层粘连蛋白以及纤连蛋白的一种。
优选地，在步骤2中，所述细胞外基质为粘基质胶，有助于细胞粘附到胞外基质上。
优选地，在步骤2中，所述细胞悬液制备方式为用离心机在25℃下，保持300~500RCF，离心3~5min即可。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明制备的切片组织包含了完成的细胞结构类型，各层组织和细胞位置相对固定，便于观察各层组织和细胞的形态位置关系，且易于保存，适用于组织切片的快速大规模制备，为研究免疫学和肿瘤学形成过程中的作用提供了很好的试验基础。
本发明区别于传统的切片制作方法，减少了切片制备过程中的酒精脱水时间，同时省去了用二甲苯透明步骤，使组织不会变脆而易于发生破碎和断裂现象，在节省时间和简化步骤的同时又能很好地保证切片的制备效果。整个过程不仅操作简便、耗时短，减低繁琐操作导致出错的概率；而且能够满足需要连续切片的结构学研究，技术适应性较好。
本方法所需操作器械、实验器材均较为简单易用，价格低廉，普通实验室可以常规配备，而制取过程又操作简便，无需长时间经验积累。
附图说明
图1、图2均为本发明制得的组织切片在显微镜下结构形态图。
具体实施方式
本发明提供一种基于M-CDX成瘤模型的组织切片制作方法，包括：
步骤1：将胚蛋在温度为36~38℃、湿度为60~80%的培养箱中孵育5~7天，在胚蛋顶端剪开1cmx1cm窗口；
步骤2：将0.5~8*106数量的肿瘤细胞掺入细胞外基质，制成细胞悬液，滴加到事先放于绒毛尿囊膜的硅胶圈内，37℃、60%湿度孵育3天，将组织连带其周围的绒毛尿囊膜用手术剪剪下，进行石蜡包埋，并切片，之后进行HE染色，并镜检。
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例
选择健康的胚蛋在温度为37℃，湿度为60%的培养箱中孵育7天，胚蛋完整无残缺，将开壳器轻轻插入胚蛋顶端，慢慢地撑开双壳，注意不要破坏外胚蛋的完整性。用剪刀沿壳边缘向壳顶方向剪取长宽各1cm的窗口；
将1*106数量的肿瘤细胞掺入上述的细胞外基质内，用离心机在25℃下，保持300RCF，离心5min获得；
将剪取的绒毛尿囊膜放入消毒后的硅胶圈内，置入37℃、60%湿度的培养箱中孵育3天，将组织连带其周围的绒毛尿囊膜用手术剪剪下，进行石蜡包埋，并切片，之后进行HE染色，并镜检。
上述中：
浸蜡时：将组织经过二次浸蜡过程，所用石蜡均是指熔点为50～58℃的Leica鳞片状切片石蜡，浸蜡过程在65℃温箱内进行。
石蜡包埋：将包埋蜡倒入包埋盒中，用烧热的镊子从石蜡中取出组织块放入其中，切面朝下，摆好位置，包埋盒内的石蜡完全凝固即形成蜡块。用解剖刀和单面刀片将包埋块修整成与组织块相似的长方形或梯形，在材料的周围各留2mm的石蜡即可，注意组织块的切面向下。最后将修好的蜡块固着在硬木块上，即可切片。
切片：将硬木块置于切片机上夹紧，调整好切片刀与组织包埋块的位置和角度，均匀转动手柄，切出连续蜡带，切片的厚度为7μm。
贴片：将蒸馏水滴加在涂有多聚赖氨酸的载玻片上，将蜡带的反面漂浮于其上放入烫板上（40℃）进行展片。蜡带完全展平后，吸去多余的水，在烤片过程中可快速镜检，寻找理想切片，可节约切片劳动量及载玻片。最后将玻片放在40℃恒温箱中烤片过夜使切片粘牢，备染。
HE染色（苏木精-伊红染色）：烤好的切片经过二次脱蜡处理后，每次脱蜡处理5~10min，用下行梯度乙醇复水和蒸馏水浸泡2min。其中，下行梯度乙醇复水的具体步骤为：第一次无水乙醇处理2min、第二次无水乙醇处理2min、90%乙醇处理2min、80%乙醇处理2min、70%乙醇处理2min、最后在蒸馏水中处理10min。将复水后的切片放入苏木精中染色10min，然后用流水冲洗10min，最后放入1%（体积百分含量）盐酸乙醇溶液中分化褪色15s，之后水洗15s，再用蒸馏水过洗10s，用0.5%伊红液染色2min,蒸馏水冲洗20s，90%乙醇处理2min、80%乙醇处理2min、70%乙醇处理2min，最后用中性树脂封片。
将制得的组织切片在光镜下观察、记录，数码显微镜拍照，对外套膜各层组织细胞的形态位置和结构变化进行观察，形成清晰、明了的组织切片图，如图1、图2所示。
结果表明：光镜下可见膜各层组织细胞结构完整，组织细微结构清晰、特征明显，经苏木精-伊红染色后组织结构的对比度适中而易于区分，胞核内核仁及染色质颗粒着色明显、清晰可见。本方法制备的切片图像色彩清晰、对比度适当，可准确显示各层组织细胞的细微结构及其在外套膜各部位的分布情况。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (5)
1.一种基于M-CDX成瘤模型的组织切片制作方法，其特征在于，包括：
步骤1：将胚蛋在温度为36~38℃、湿度为60~80%的培养箱中孵育5~7天，在胚蛋顶端剪开1cmx1cm窗口；
步骤2：将0.5~8*106数量的肿瘤细胞掺入细胞外基质，制成细胞悬液，滴加到事先放于绒毛尿囊膜的硅胶圈内，37℃、60%湿度孵育3天，将组织连带其周围的绒毛尿囊膜用手术剪剪下，进行石蜡包埋，并切片，之后进行HE染色，并镜检。
2.根据权利要求1所述的一种基于M-CDX成瘤模型的组织切片制作方法，其特征在于，在步骤1中，将胚蛋在温度为37℃，湿度为60%的培养箱中孵育3天。
3.根据权利要求1所述的一种基于M-CDX成瘤模型的组织切片制作方法，其特征在于，在步骤2中，所述细胞外基质为基质胶、层粘连蛋白以及纤连蛋白的一种。
4.根据权利要求1所述的一种基于M-CDX成瘤模型的组织切片制作方法，其特征在于，在步骤2中，所述细胞悬液制备方式为用离心机在25℃下，保持300~500RCF，离心3~5min即可。
5.根据权利要求1所述的一种基于M-CDX成瘤模型的组织切片制作方法，其特征在于，在步骤2中，在65℃温箱内进行两次浸蜡。
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