CN100587452C - 一种卵母细胞石蜡切片的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种卵母细胞石蜡切片的制备方法，本发明方法包括固定、脱水、透明处理以及石蜡包埋和切片等步骤，本发明方法在固定脱水透明处理等过程中使卵母细胞在液体环境中转移，并且全程没有外力直接作用，因此可以使得卵母细胞最大程度上保持原始的形态结构；使用无色透明器皿盛装卵母细胞，使得卵母细胞清晰可见；卵母细胞转移到模盒后，将二甲苯去除，露出卵母细胞，可以更容易地找到卵母细胞；在石蜡包埋前，在卵母细胞周围撒上有色颗粒，可以便于卵母细胞在石蜡中定位。本发明方法可以对少量甚至单个的直径在100微米到600微米的禽类卵母细胞进行石蜡切片的制作，获得的切片结构清晰完整，染色效果好。

Description

一种卵母细胞石蜡切片的制备方法

技术领域

本发明涉及一种石蜡切片的制备方法，具体地说是一种卵母细胞石蜡切片的制备方法，本发明方法特别适用于禽类卵巢细胞切片的制备。

背景技术

免疫组织化学(Immunochistochemistry)又称免疫细胞化学是指运用免疫学原理，通过特异的抗原抗体结合反应，并对抗体标记上可见的显色物来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。可以识别定位细胞中的各种组织成分，如酶、多肽、核酸、多糖、激素等，最后通过特异性染色可以在光学显微镜或荧光显微镜下观察其所在细胞中准确位置，利用细胞分光光度计、图像分析仪可对检测物进行细胞的原位定量测定。免疫组织化学技术特异性强、灵敏度高、定位准确并且简便快速，能够有机的同形态、功能及代谢的研究结合起来，适合具体研究组织和细胞中的一些理化因子的分布和功能。免疫组化检测通常需要先对样本进行包埋制片处理，如石蜡切片，冰冻切片等。在样本切片上进行理化因子的免疫学检测。

生物显微制片技术是研究细胞结构与组织化学的主要方法，而石蜡切片的制作是组织学和病理学中最常用的一种方法，适合于免疫组化检测的样本石蜡切片组织平面平整，厚薄适当，完整地保留组织的结构形态，染色效果好，反差强，并且可以长时间的保存。随着细胞生物学的发展和体外培养技术的进步，通过细胞培养研究卵母细胞的生长发育愈渐深入，对于卵母细胞结构尤其是关于其生长发育过程中的一些基因表达的产物和调控激素类物质的作用更是人们研究的热点之一，以往关于卵母细胞的发育研究通常采用卵巢局部组织切片来获得卵母细胞的生长发育信息，对局部卵巢组织进行切片优点是一张切片中可以包含很多处于不同发育时期的卵母细胞，缺点是由于其中除含有卵母细胞外还有疏松结缔组织等其它成分，在样本的脱水过程中由于其所含多种组织性质的不均一，导致缩水程度不一致，最后卵母细胞发生形变，无法保持其原有的形态结构；并且在免疫组化检测中会消耗大量昂贵的抗体，不仅不能使卵母细胞的特异性检测效果增强反而会导致非卵母细胞特异性染色的发生，增加背景干扰程度。如果要研究某个重要调控因子在雌性家禽卵母细胞中的作用，运用卵巢切片的方法还必须在不同时期杀死多只雌禽取样，这样不仅耗时耗力成本加大，周期延长，而且个体针对性不强，检测的准确性不高，置信区间变宽。

现在细胞体外培养的技术和条件均已成熟和完善，雌禽卵巢上卵母细胞的分离培养技术也已建立，一只雌禽卵巢上分离的卵母细胞在体外就可以培养到不同的发育阶段，因此越来越多的学者投向对家禽卵母细胞体外培养过程的研究，体外分离得到或经体外培养的家禽卵母细胞的初期直径通常小于400μm，石蜡包埋切片前的酒精脱水和二甲苯透明等复杂工序极易造成卵母细胞的结构破坏和丢失，所以广泛用于卵巢组织切片的常规石蜡包埋制片的方法，并不适合于少量甚至单个卵母细胞的切片制作，这为利用生物显微制片技术来对卵母细胞发育过程中的形态观察及一些理化因子的免疫组化检测带来不便。

发明内容

本发明的目的在于针对上述不足提供一种卵母细胞石蜡切片的制备方法，用于对微小卵母细胞样本制备石蜡切片，本发明方法特别适用于制备禽类卵母细胞切片。

本发明方法包括如下步骤：

1、固定：将卵母细胞样本用吸管转移到含有固定液的无色透明器皿中固定过夜，所述的固定液有10％的甲醛溶液、80-95％的乙醇溶液或5％醋酸溶液；

2、脱水及透明处理：用移液枪将卵母细胞从固定液中吸出，经脱水后，用移液枪将脱水后的卵母细胞转移到含有透明处理液的无色透明器皿中进行透明处理，所述的透明处理液为二甲苯、苯、甲苯或氯仿；

3、包埋及切片：将透明处理后的卵母细胞用移液枪转移到模盒中，去除透明处理液，露出卵母细胞，在卵母细胞周围点上有色染料，经石蜡包埋后切片。

本发明中的卵母细胞可以是从母体卵巢中中直接分离的卵母细胞也可以是经体外培养获得的卵母细胞；所用的透明器皿可以是玻璃器皿；可以用不同浓度梯度的酒精逐级脱水，具体可采用75％，85％，95％以及100％的酒精逐级脱水，每个梯度处理1小时；透明处理以1小时为宜；卵母细胞转移到模盒后，可以让透明处理液适当挥发或将其吸出，露出卵母细胞，以便观察和操作；所用的染料可以是伊红、品红、番红或次甲紫等不与石蜡反应的染料；可用常规程序包埋和切片。

本发明方法使卵母细胞在液体环境中转移，并且全程没有外力直接作用，因此可以减少卵母细胞形态和结构的改变，使得卵母细胞最大程度上保持原始的形态结构；使用无色透明器皿盛装卵母细胞，可以使得卵母细胞清晰可见；卵母细胞转移到模盒后，将二甲苯去除，露出卵母细胞，可以更容易地找到卵母细胞；在卵母细胞周围点上染料再进行包埋，可以便于卵母细胞在石蜡中定位。

本发明的另一个目的在于提供上述方法制备得到的卵母细胞切片，其不含有间质细胞等不需要的部分，便于染色，观察和检测。

本发明结合原有的石蜡切片技术并对之进行了改进创新，降低了成本，简化了工艺，使其对于少量甚至单个的直径在100微米到600微米的禽类卵母细胞也可以进行石蜡切片的制作。获得的切片结构清晰完整，经HE染色可以获得良好的染色和观察效果，结合运用免疫组化和原位杂交技术，可以更加准确的观察到卵母细胞在体外培养的不同时间，不同发育时期的不同调控蛋白和激素的作用，为研究体外培养的卵母细胞的动态发育过程提供了一种高效，简洁，低耗的新方法。

本发明方法具有如下优点：

1.简单有效，用具易得，成本低廉，可操作性好，可重复度高；

2.使卵母细胞在液体的环境中转移，卵母细胞的原始形态结构可以最大程度的保留；

3.可以清晰地反映细胞的结构和组织学特征，染色效果好；

4.同一样本可以获得的多张石蜡切片，可长期保存；

5.可以对同一卵母细胞进行多项不同分子和生化学指标的检测，检测时抗体使用量较卵巢组织切片大为减少并且没有引入卵巢切片带来的个体间遗传差异；

6.检测信号清晰，定位准确，结果对比度高，由于没有其他组织的残留，非特异性染色少，没有背景干扰，反映了单个卵母细胞的生存状态，在卵母细胞的体外培养研究方面应用前景广阔。

附图说明

图1是经透明处理后的卵母细胞；

图2是模盒中卵母细胞所在位置；

图3是去除二甲苯后露出的卵母细胞；

图4是经石蜡包埋后的卵母细胞(在有色颗粒中心)；

图5是经染色后卵母细胞切片。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1卵母细胞切片的制备

本例以禽类卵母细胞为样本来制备卵巢细胞石蜡切片，具体包括如下步骤：

1.卵母细胞的取材与固定：选取产蛋纪录好的母鸡处死获取卵巢，剥取卵母细胞并体外培养，将体外培养不同时间的卵母细胞在实体解剖镜下用玻璃吸管吸出，置于含有10％中性甲醛的玻璃瓶中固定过夜；

2.卵母细胞的脱水与透明处理：取4个玻璃瓶，加入75％，85％，95％，100％酒精，约2/3容积。用移液枪将甲醛固定液中的卵母细胞吸出，从75％到100％酒精逐级脱水，各1小时。将脱水后的卵母细胞用移液枪吸到一个小脚量杯(10ml)中，注入5ml二甲苯透明1小时，量杯封口；

3.卵母细胞的包埋：将小脚量杯中的卵母细胞用移液枪吸出，置于不锈钢模盒中，将模盒置于室外使二甲苯挥发或者使用移液枪缓慢将二甲苯吸出。此时卵母细胞可以目见，用针头将其拨到模具中央，在其四周放上一些伊红颗粒，用预热的勺子舀取熔化的石蜡注入模盒包埋卵母细胞，浸蜡40min后置于-20℃冰箱速冻30分钟成型；

4.卵母细胞的切片：将成型的石蜡块从模盒中取出，置于手动轮转切片机上卡住。先进行粗镟(从模具盒中取出的石蜡块切面不会太平整，先切几次得到光滑平整的切面的过程)，获得光滑平整的切面，看见伊红颗粒(如图4)后将切片厚度调整为5μm，连续切片，用毛笔将连续切片调入温水槽中展平，三折一段(含有一个样本切面的切片为一折，石蜡切片是连续的若干折连在一起，很长不易于操作，所以将其断开便于贴附在较小的载玻片上)用镊子断开，贴附于载玻片上，50℃烘箱中烤片40min，即可得到卵巢细胞切片。

在上述操作过程中，特别注意直径微小的卵母细胞不能丢失，选用折光性好的无色玻璃器皿盛装酒精和二甲苯，在玻璃瓶中脱水的卵母细胞呈白色，易于定位和转移，在小脚量杯中透明的卵母细胞无色透明，不易观察，但其因重力沉积在量杯底部，细致观察或结合使用普通放大透镜可以观察到其所在位置，如整个过程换用塑料制品则因其透光性差，二甲苯透明后不易找到卵母细胞，往往造成卵母细胞丢失。(图1中黑线所圈注的为单个卵母细胞)

在转移过程中，应使用口径适宜的枪头，其口径应大与被转运的卵母细胞直径200-300微米为宜，过小可能对卵母细胞造成硬伤，过大不便于卵母细胞的转运。在本例中卵母细胞样本为200微米，所采用的枪头口径为400微米。(图2中黑线圈注的部分为单个卵母细胞所在的位置)

经过二甲苯透明后的卵母细胞无色透明，在被从小脚量杯中吸到模具盒中时完全无法定位，只有去掉二甲苯才能找到卵母细胞，推荐加热或自然风干的方式使二甲苯挥发，露出卵母细胞，但此法应注意观察二甲苯挥发状况，不宜过干导致卵母细胞形变。也可使用砸扁的小枪头将二甲苯吸出，但此操作极易造成卵母细胞的丢失和可能的结构破坏。(图3黑线圈注的是二甲苯初退却时显露的单个卵母细胞，与背景反差明显)

采用本法制得的卵母细胞石蜡切片具有优异的质量，经过HE染色可得良好的观察效果，卵母细胞结构清晰完整，胞核胞浆对比分明。而且一个卵母细胞样本可以获得多张石蜡切片，可以应用于多项免疫组化检测，不仅检测成本降低，而且针对性和准确性相较于卵巢组织切片大为提高。此外本法获得的石蜡切片易于保存，便于回顾性研究。(图5中左图为HE染色结果，中图为荧光下凋亡颗粒细胞(亮点)的分布，右图为GDF-9(棕色)在卵母细胞中的分布情况)

Claims (9)

1、一种卵母细胞切片的制备方法，该方法包括如下步骤：

1)固定：将卵母细胞样本用吸管转移到含有固定液的无色透明器皿中固定过夜；

2)脱水及透明处理：用移液枪将卵母细胞从固定液中吸出，经75％，85％，95％以及100％的酒精逐级脱水后，用移液枪将脱水后的卵母细胞转移到含有透明处理液的小脚量杯中进行透明处理；

3)包埋及切片：将透明处理后的卵母细胞用移液枪转移到不锈钢模盒中，去除透明处理液，露出卵母细胞，在卵母细胞周围点上染料，经石蜡包埋后切片。

2、如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的无色透明器皿为玻璃器皿。

3、如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的移液枪枪头口径比卵母细胞的直径大200～300微米。

4、如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤1)中所述的固定液为10％的甲醛溶液或80-95％的乙醇溶液或5％醋酸溶液；其中步骤2)中所述的透明处理液为二甲苯、苯、甲苯或氯仿。

5、如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中所述的染料为伊红、品红、番红或次甲紫。

6、如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤3)中石蜡包埋的方法是用将融化的石蜡注入不锈钢模盒包埋卵母细胞，浸蜡40min后置于-20℃冰箱速冻30分钟成型。

7、如权利要求6所述的方法，其特征在于步骤3)中切片的方法是将成型的石蜡块从不锈钢模盒中取出，置于手动轮转切片机上卡住，先进行粗镟，看见染料后将切片厚度调整为5μm，连续切片，用毛笔将连续切片挑入温水槽中展平，用镊子挑取完整的切片，贴附于载玻片上，50℃烘箱中烤片40min。

8、如权利要求1～7任一项所述的方法，其特征在于所述的卵母细胞为禽类卵母细胞。

9、由权利要求1～7任一项所述的方法制备得到的卵母细胞石蜡切片。

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