CN104826136A - 大鼠移植性肺癌模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种大鼠移植性肺癌模型的建立方法，包括如下步骤：Walker-256细胞腹水的制备；Walker-256细胞接种到SD大鼠肺部：SD大鼠麻醉后，对大鼠胸腔左部进行碘伏消毒，把Walker-256细胞悬液与等体积的Matrigel在冰上混匀形成混合液，然后在左肺肋5～6之间用注射器将混合液缓慢注入左肺部，进针深度为0.6-0.8cm，注射完后停针10s，缓慢拔出，大鼠生长14天以后，得到移植性肺癌模型。本发明对大鼠损伤小，仅需常规麻醉大鼠，直接把Walker-256细胞移植到左肺内部，形成肿瘤病灶部位明确，病灶单一而且病灶大小可控，此外该方法还具有制备简单，成瘤率高，动物死亡率低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及疾病的实验动物模型构建领域，具体涉及一种大鼠移植性肺癌模型的建立方法。
背景技术
目前，随着中国空气污染程度的加重，尤其是雾霾肆虐给国人健康带来严重隐患。世界卫生组织下属国际癌症研究机构指出，有充足证据显示，雾霾还是诱发肺癌的重要因素。肺癌已经成为世界上导致肿瘤患者死亡率最高的癌症之一，被卫生部列为今后癌症防治的重点。但由于肺癌临床表现复杂，难以早期发现和诊断等使得肺癌疗效得不到提高。因此，复制出与人类肺癌发病机制、发展过程相似的动物模型是肿瘤学研究必不可少的手段之一。
目前肺癌动物模型的制备方法多采用诱发性、移植性或转基因动物模型。移植性动物模型又可分为原位移植和异位移植，其中异位移植因其方法简便、成模率高而被广泛应用，但该类模型适用于抗癌药物疗效检测，不适合用于肿瘤发生和形成机制的研究。原位移植动物模型被认为是目前比较理想的模型，主要通过将癌细胞直接注射到肺部支气管复制肺癌原位模型，该模型能较真实地模拟肺癌患者的临床特征，但手术操作难度较大，动物死亡率高，成瘤率低。在人肺癌移植动物模型研究中，经常用基因工程改造鼠如免疫缺陷裸鼠、虽然该类免疫缺陷鼠能解决人肺癌细胞在动物体内生长问题，但由于肺癌微环境中人鼠混合细胞不利于研究癌细胞转移。此外饲养比较苛刻等因素制约该类模型的广泛应用。Walker-256是目前广泛认可的大鼠可移植性肿瘤细胞株，植入体内能较好地模拟人类恶性肿瘤的膨胀性和浸润生长方式。应用Walker-256细胞植入大鼠支气管，构建原位性肺癌模型，此造模方法对实验技术要求较高，术后动物死亡率高，在实际应用中成模率低。此外，虽然采用尾静脉注射能降低死亡率，提高成膜率，但是存在病灶部位不确定，病灶数目多(右左肺都有)，并向在其他脏器转移等缺陷。本发明要解决的技术问题是针对现有技术的不足，用Walker-256细胞准确移植到大鼠左肺中部，形成病灶部位明确，病灶大小可控的大鼠移植性肺癌模型及其制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有单一病灶且部位确定的大鼠肺癌模型，为研究恶性肺癌生长、转移、药物疗效评价、药物筛选、肺部疾病成像仪器的研制和精确放疗的疗效评估及监测提供动物模型和研究工具。
本发明的另一目的是提供建立不同体积的肺癌动物模型的方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供如下方案：
一种大鼠移植性肺癌模型的建立方法，包括如下步骤：
(1)Walker-256细胞腹水的制备：从液氮罐中取出冻存的Walker-256细胞，置于37±1℃水浴锅中迅速溶化，完全溶化后置于冰上，用注射器吸取细胞悬液，注射到3-4周龄且体重在80-100g的雄性SD大鼠腹腔中，待第7天后抽取腹水；然后用生理盐水稀释成不同浓度；
(2)Walker-256细胞接种到SD大鼠肺部：SD大鼠麻醉后，固定在操作台上，对大鼠胸腔左部进行碘伏消毒，把Walker-256细胞悬液与等体积的Matrigel在冰上混匀形成混合液，然后在左肺肋5～6之间用1ml注射器将混合液缓慢注入左肺部，进针深度为0.6-0.8cm，注射完后停针10s，缓慢拔出，大鼠生长14天以后，得到移植性肺癌模型。
优选地，当接种的混合液为10μL时，其中含有的Walker-256细胞的数量大于1×105时肺部成瘤率达到100％。
优选地，步骤(2)中通过CT引导建立起细针进入大鼠肺内部的准确进针深度为0.6-0.8cm。
优选地，所述的步骤(2)中的大鼠为：裸大鼠，步骤(2)中的癌细胞为：人肺癌细胞。
优选地，当注射混合液的体积为20μL，其中含有Walker-256细胞的数量为2×105时，14天后，主病灶直径为0.5cm；当注射混合液的体积约为15μL，其中含有Walker-256细胞的数量为1.5×105，14天后，主病灶直径约为0.35cm；当注射混合液的体积为10μL，其中含有Walker-256细胞的数量为1×105，14天后，主病灶直径约为0.2cm。
本发明采用肺部原位注射Walker-256细胞建立移植性肺癌模型，观察大鼠的成瘤及生存情况，为进一步的肿瘤实验研究奠定基础，本发明模型的建立方法具有如下优点：
1、本发明采用鼠源的肿瘤细胞株Walker-256，预先在大鼠腹腔扩增，容易操作，获得细胞活性高、数量多，能减少免疫排斥，能再短时间内形成明显的肿瘤病灶。
2、利用Matrigel和细胞悬液等体积混合后，接种到大鼠肺部，(低温下Matrigel成液体，室温下成固定的特性)，Matrigel能把Walker-256固定在肺内部，减少接种细胞外溢，提搞成瘤率，形成病灶单一，便于观察肿瘤的生长和转移。
3、本发明对大鼠损伤小，仅需要常规麻醉大鼠，直接把Walker-256细移植到肺内部，肿瘤病灶部位明确，病灶单一而且病灶大小可控，避免了要支气管内接种对实验技术要求高，术后动物死亡率高，成模率低的缺陷和尾静脉注射时左左肺内病灶区较多，容易在向其它脏器转移的缺陷，此外该方法还具有制备简单，成瘤率高，动物死亡率低等优点。
4、本发明利用通过CT引导建立起细针进入大鼠肺内部的准确进针深度0.6-0.8cm之间，减少因进针过深穿透肺部或进针不足而引起的成瘤率低的问题。
5、本发明的动物模型可作为抗肺癌药物筛选的试验动物，通过观察肺部肿瘤大小，向其它器官转移及癌细胞侵袭能力，对药物的疗效和安全进行体内实验评价。
6、本发明的动物模型可作为针对肺癌放疗效果，对荷瘤肺部进行照射，通过不同照射剂量、方式以及与药物的组合应用，现实化疗效果的最大化以减少对正常肺部的放射肺损伤。
7.、由于呼吸运动的存在，降低了肺部肿瘤放射治疗的准确性，本发明的不同病灶大小的肺癌动物模型可作目前精确放疗过程中体位固定摸索，计算肺部放疗靶区中心点定位差异的实验动物模型。
附图说明
图1为Walker-256细胞腹水扩增和细胞形态观察图：
其中：图1A为Walker-256细胞注射到大鼠腹腔7d后，大鼠的图片；
图1B为抽取大鼠腹水图；
图1C为显微镜下抽取的大鼠腹水中Walker-256细胞形态图。
图2为大鼠肺部接种混合液14d后CT扫描图：
其中：图2A为第一空白对照组大鼠接种混合液14d后CT扫描图；
图2B为第二空白对照组大鼠接种混合液14d后CT扫描图；
图2C为第一处理模型组大鼠接种混合液14d后CT扫描图；
图2D为第二处理模型组大鼠接种混合液14d后CT扫描图。
图3肺部进行组织切片HE染色后观察图：
其中：图3A为空白对照组的大鼠肺部HE染色后观察图；
图3B、C、D为处理模型组的大鼠肺部HE染色后观察图；
图4为接种不同体积混合液的大鼠肺部肿瘤示意图：
其中：图4A为接种20μL混合液的大鼠肺部肿瘤示意图；
图4B为接种15μL混合液的大鼠肺部肿瘤示意图；
图4C为接种10μL混合液的大鼠肺部肿瘤示意图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明如下。
实施例1：大鼠抑制性肺癌模型的建立方法
(1)材料来源：
SD大鼠：雄性SD大鼠购自安徽医科大学实验动物中心，无特定病原体。
大鼠Walker-256细胞：购于ATCC。
(2)大鼠抑制性肺癌模型的建立方法
第一步：Walker-256细胞腹水的制备
从液氮罐中取出冻存的Walker-256细胞，置于37℃水浴锅中迅速溶化，完全溶化后置于冰上，用2ml注射器吸取细胞悬液，取出3-4周龄且体重在80-100g的雄性SD大鼠，用手抓着大鼠，仰卧在手中，从腹腔中线处，以针头与腹腔皮肤之间呈45°角注射进腹腔，并每天观察大鼠的饮食，精神状态。待第7天左右，大鼠饮食减少，精神萎靡，同时大鼠的腹部有明显增大并有移动性腹水(如图1A所示)，然后用无菌的5mL一次性注射器抽出腹水(如图1B所示)，用生理盐水稀释，用细胞计数仪进行计数(如图1C所示)。
第二步：Walker-256细胞接种到大鼠肺部首先用10％水合氯醛(注射剂量按照0.3ml/100g)腹腔注射进行麻醉，大鼠麻醉后，将其仰卧固定在操作台上，对大鼠胸腔左部进行碘伏消毒，将大鼠分为以下4组：第一处理模型组、第二处理模型组、第一空白对照组、第二空白对照组，然后在左肺肋5～6之间用1ml注射器将混合液缓慢注入左肺部，进针深度为0.6-0.8cm，注射完后停针10s，缓慢拔出。
第一空白对照组：注射20μL混合液(生理盐水10μL与10μL Matrigel在冰上混匀)；
第二空白对照组：注射10μL混合液(生理盐水5μL与5μL Matrigel在冰上混匀)；
第一处理模型组：注射20μL混合液(细胞悬液10μL含有Walker-256细胞的数量2×105与10μL Matrigel在冰上混匀)；
第二处理模型组：注射10μL混合液(细胞悬液5μL含有Walker-256细胞的数量1×105与5μL Matrigel在冰上混匀)。
(3)CT扫描
上述四组大鼠接种混合液14天后进行CT观察记录肿瘤。用10％水合氯醛(注射剂量按照0.3ml/100g)腹腔注射进行麻醉，然后通过高分辨率CT进行扫描观察肺部是否有异物，最佳的扫描条件：层厚0.67mm，120KV，300mAs。
扫描结果显示：
第一、第二空白对照组的CT图，如图2A、图2B所示：左肺部无明显异常；而第一处理模型组的CT图，如图2C所示：在左肺部有明显近似球型的异物，体积约有0.61cm3；第二处理模型组的CT图，如图2D所示：在左肺部也有明显近似梭形的异物，体积约有0.33cm3。
(4)病理切片鉴定肺癌(HE染色)
对第二空白对照组和第二处理模型组大鼠解剖的肺部组织进行常规病理切片进行观察和鉴定。结果显示：第二空白对照大鼠肺部(10μL混合液：生理盐水5μL与5μL Matrigel在冰上混匀)在接种14d后，肺部无明显的异常，细胞形态规则，有正常的肺泡(如图3A所示，物镜和目镜的放大倍数为4×10)；而第二处理模型组(10μL混合液：细胞悬液5μL含有Walker-256细胞的数量1.×105与5μL Matrigel在冰上混匀)在接种14d后，在肺部中有明显被染成深色的异样细胞团，细胞团正挤压周围的肺泡，导致肺泡体积变小，甚至消失(如图3B所示，物镜和目镜的放大倍数为4×10)；进一步在高倍镜下观察显示异样团正向正常肺部组织侵袭，导致肺泡体积变小(恶性肿瘤的一个典型特征：侵袭性)(如图3C所示，物镜和目镜的放大倍数为10×10)；同时异样细胞内部细胞形态不一、细胞分裂旺盛、细胞排列无极性、核胞质比失调、有大量核分裂象，HE染色后着色较深(如图3D所示，物镜和目镜的放大倍数为10×10)，图3C和图3D为肿瘤病理区不同位置的观察图，经过病理学鉴定为肺癌。
实施例2：接种不同浓度的Walker-256细胞对肺部成瘤大小的影响
对SD大鼠分别注射以下混合液：
20μL混合液(细胞悬液10μL含有Walker-256细胞的数量2×105与10μLMatrigel在冰上混匀)；
15μL混合液(细胞悬液7.5μL含有Walker-256细胞的数量1.5×105与7.5μLMatrigel在冰上混匀)；
10μL混合液(细胞悬液5μL含有Walker-256细胞的数量1.×105与5μLMatrigel在冰上混匀)；
接种14d后，脱臼处死大鼠，解剖肺部进行观察并测量肺部异物大小，结果显示，在大鼠左肺都有呈肉色样的异物，异物都分布在左肺肺中部，异物大小不等，其中注射20μL混合液形成的异物直径最大约为0.5cm，如图4A所示；15μL混合液异物直径其次约为0.35cm，如图4B所示；10μL混合液异物直径最小约为0.2cm，如图4C所示。提示该方法制备的大鼠肺癌模型的病灶区明确；在左肺中部；病灶大小易控：改变注射细胞悬液体积。
实施例3：接种含有Walker-256细胞的混合液后，大鼠体内肿瘤生长情况的检测
对6只SD大鼠接种10μL混合液(含Walker-256细胞1×105)，在接种后14天，21天、28天，35天、42天，用CT观察记录肿瘤的大小，分析肺部肿瘤生长情况。CT结果显示：接种后14天，21天、28天，35天、42天，在大鼠肺部形成异物的体积分别为：0.292±0.042cm3，0.346±0.03cm3，0.388±0.051cm3，0.412±0.038cm3，0.462±0.0571cm3。表明接种的Walker-256细胞在肺部生长迅速，很好的模拟了肺癌的侵润性生长。
Claims (4)
1.一种大鼠移植性肺癌模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)Walker-256细胞腹水的制备：从液氮罐中取出冻存的Walker-256细胞，置于37±1℃水浴锅中迅速溶化，完全溶化后置于冰上，用注射器吸取细胞悬液，注射到3-4周龄且体重在80-100g的雄性SD大鼠腹腔中，待第7天后抽取腹水；然后用生理盐水稀释成不同浓度；
(2)Walker-256细胞接种到SD大鼠肺部：SD大鼠麻醉后，固定在操作台上，对大鼠胸腔右部进行碘伏消毒，把Walker-256细胞悬液与等体积的Matrigel在冰上混匀形成混合液，然后在左肺肋5～6之间用1ml注射器将混合液缓慢注入左肺部，进针深度为0.6-0.8cm，注射完后停针10s，缓慢拔出，大鼠生长14天以后，得到移植性肺癌模型。
2.根据权利要求1所述的大鼠移植性肺癌模型的建立方法，其特征在于，当接种的混合液为10μL时，其中含有的Walker-256细胞的数量大于1×105时肺部成瘤率达到100％。
3.根据权利要求1所述的大鼠移植性肺癌模型的建立方法，其特征在于，步骤(2)中通过CT引导建立起细针进入大鼠肺内部的准确进针深度为0.6-0.8cm。
4.根据权利要求1所述的大鼠移植性肺癌模型的建立方法，其特征在于，
当注射混合液的体积为20μL，其中含有Walker-256细胞的数量为2×105时，14天后，主病灶直径为0.5cm；当注射混合液的体积为15μL，其中含有Walker-256细胞的数量为1.5×105，14天后，主病灶直径为0.35cm；当注射混合液的体积为10μL，其中含有Walker-256细胞的数量为1×105，14天后，主病灶直径为0.2cm。
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