CN104784676A - 一种大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法，属于医学肺部疾病研究领域。本发明利用目前动物肺纤维化模型的诱导剂博莱霉素经气管内给药建立大鼠单肺肺纤维化模型，然后通过高分辨率CT观察，羟脯酸含量测定，并进行病理切片鉴定。本发明建立的大鼠单肺肺纤维化模型方法具有在同一动物上实现单肺肺纤维化而对侧肺部正常的动物模型，而且简易操作，成功率高，可重复性，肺纤维化部分明确等优点。该纤维化肺部模型的建立为深入研究肺纤维化发病机制、各种治疗肺纤维化药物体内初步筛选以及对正常肺部毒性评价，肺部成像仪器设备研制研究提供了一个较为理想可靠的动物模型。

Description

一种大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法

技术领域

本发明属于动物疾病模型领域，具体涉及一种大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法。

背景技术

目前，随着中国空气污染程度的加重，尤其是雾霾肆虐给国人健康带来严重隐患。雾霾中的颗粒物会可直接进入肺部，对肺泡和血管内皮造成缓慢持续的损伤，诱发肺部疾病的发生，如肺纤维化、慢性阻塞性等。肺纤维化是一种原因不明的弥漫性肺部疾病，为弥漫性肺泡炎、肺泡单位结构紊乱和肺纤维化，最终导致肺脏结构和功能的严重破坏。目前，由于肺纤维化的发病机制及病程尚不明确，临床上尚无有效的治疗方法，病死率较高。因此制作与人类特发性肺纤维化的病理过程相似的动物模型，对研究其发病机制、体内筛选治疗肺纤维化药物显得尤为重要。理想的实验动物疾病模型及其特定的病理生理特征是研究相应疾病的重要基础，在阐明疾病分子病理机制、评价诊断治疗效果中发挥巨大作用，然而疾病本身的复杂性决定了实验动物模型往往只能模拟疾病某一病理阶段/过程或某种特定病理学特征，与反映临床疾病实际病理生理状况尚存距离，而以疾病物理特征为背景的动物疾病模型更为罕见。由于博莱霉素(BLM)对肺的毒性机理比较明确，成为目前制备动物肺纤维化模型最常用的诱导剂。目前制备大鼠肺纤维化模型主要是通过口腔气管给药和腹腔给药两种方法。由于口腔气管给药不易操作，而且是药物通过气管进入双肺；而腹腔给药需要给药时间较长(大概持续给药10天)，注射博莱霉素的剂量也比口腔气管高(腹腔每天15mg/kg，气管是一次5mg/kg)。对于在同一个体上实现一侧肺部发生纤维化而对侧肺部正常的动物模型未有报道。本研究采用博莱霉素诱导大鼠单肺肺纤维化模型，为实现在同一个体上评价药物治疗肺纤维化的同时对正常肺部的毒性研究，肺纤维化和正常肺部组织基因表达谱分析、肺部代偿性增生的诱导机制等提供可靠的动物实验模型。

发明内容

本发明的目的是解决目前现有技术的不足，提供一种大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法。

本发明的另一目的是提供向左肺部灌注的控制方法。

本发明的另一目的是提供一种建立大鼠单肺肺纤维化模型过程中大鼠的固定方法。

本发明的另一目的是一种利用博莱霉素使大鼠肺纤维化的用途。

本发明采用的技术方案为：一种大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法，其特征在于，具体步骤包括：

第一步：首先对大鼠称进行体重，腹腔注射水合氯醛麻醉，固定在操作台上，对其颈部进行碘伏消毒，用手术剪剪开颈部皮肤，剥离露出气管，固定台竖起与桌面成80-70°夹角，然后向右倾斜与桌面成70-60°夹角。

第二步：根据大鼠体重抽取相应体积的博莱霉素溶液，然后用针头刺入气管内，缓慢注入博莱霉素溶液，注射完毕后，用Matrigel封闭气管针孔，然后缝合皮肤，大鼠生长21天以后，得到单肺肺纤维化模型。

优选地，大鼠为雄性，体重在150-200g。

优选地，所述第二步中注射博莱霉素诱导大鼠单肺肺纤维化的剂量，为每千克大鼠注射1.8mg的博莱霉素。

优选地，所述第二步中从颈部气管内向左侧肺部注射博莱霉素溶液的速度控制在60-50μL/min。

本发明中在同一只大鼠上实现一侧肺发生纤维化而另一侧肺正常。

本发明中摸索出麻醉单肺纤维化大鼠的麻醉药剂量：应该是正常大鼠使用剂量的2/3，即10％水合氯醛：0.2ml/100g。

本发明中观察到大鼠正常肺部功能的代偿性增加，表现为正常肺部体积和重量增加，为研究肺部代偿性增生机组提供了理想的实验动物模型。

本发明中大鼠单肺肺纤维化模型的症状与临床人类特发性肺纤维化的病理过程相似：呼吸快而短促等，为筛选新药物对肺纤维化疗效提供实验动物模型。

另外，本发明提供一种利用博莱霉素使大鼠肺纤维化的用途，其特征在于，建立博莱霉素诱导单肺肺纤维化大鼠注射剂量，即每千克大鼠注射1.8mg的博莱霉素；或者建立博莱霉素诱导双肺肺纤维化大鼠注射剂量，即每千克大鼠注射3.6mg的博莱霉素。

另外，本发明提供一种建立大鼠单肺肺纤维化模型过程中大鼠的固定方法，其特征在于建立从颈部气管内向单肺注射溶液的固定方式：大鼠仰卧固定于固定台上，把固定台竖起与桌面成80-70°夹角，然后向右倾斜与桌面成70-60°夹角。

本发明采用通过气管向左肺内博莱霉素建立大鼠单肺肺纤维化模型，观察大鼠左肺发生纤维化的分子和结构变化情况，为进一步的肺纤维化实验研究奠定基础，本发明模型的建立方法具有如下优点：

1、本发明采用目前经典的肺纤维化的诱导剂：博莱霉素，其诱导肺部发生纤维化的病理过程与人类特发性肺纤维化的病理过程非常相似，有利于研究肺部发生纤维化的分子表达变化和结构改变的机制。

2、本发明建立向大鼠左肺灌注溶液的固定角度和把液体完全注射到左肺部的控制流速，为后续其它溶液向肺部灌注提供了方法。

3、本发明建立起麻醉单肺肺纤维化大鼠的麻醉剂的使用剂量，避免麻醉过度导致的大鼠死亡或麻醉不足而引起的固定困难。

4、本发明的动物模型可作为研究单肺发生纤维化，呼吸功能调整过程中对侧肺部出现代偿性增生的生理生化指标的变化。

5、本发明的动物模型可作为针对治疗肺纤维化药物筛选和安全性评价的试验动物，通过观察治疗肺纤维化过程，对对侧肺部有无毒性等。

6、本发明的动物模型可为肺部成像仪器设备研制研究提供了一个较为理想可靠的动物模型。

附图说明

图1为大鼠左单肺内注射不同溶液21d后肺部CT扫描图；其中：图1A空白对照组大鼠左肺内注射生理盐水溶液21d后肺部CT扫描图；图1B处理模型组大鼠左肺内注射博莱霉素溶液21d后肺部CT扫描图；

图2为大鼠左单肺内注射不同溶液21d后肺部解剖图；其中：图2A空白对照组大鼠左肺内注射生理盐水溶液21d后肺部解剖图；图2B处理模型组大鼠左肺内注射博莱霉素溶液21d后肺部解剖图；

图3为大鼠左单肺内注射不同溶液21d后肺部病理切片图；其中：图3A空白对照组大鼠左肺内注射生理盐水溶液21d后左肺部病理切片图；图3B空白对照组大鼠左肺内注射博莱霉素溶液21d后右肺部病理切片图；图3C空白对照组大鼠左肺内注射博莱霉素溶液21d后左肺部病理切片图；

图4为大鼠左单肺内注射不同溶液21d后肺部羟脯氨酸含量检测；其中：图4中空白对照组大鼠左肺内注射生理盐水溶液21d后左肺内羟脯氨酸含量；图4中空白对照组大鼠左肺内注射博莱霉素溶液21d后右肺内羟脯氨酸含量；图4中空白对照组大鼠左肺内注射博莱霉素溶液21d后左肺内羟脯氨酸含量。

具体实施方式

以下结合附图以及具体实施例，对本发明进行详细说明如下。

实施例1：大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法

(1)材料来源

SD大鼠：雄性SD大鼠购自安徽医科大学实验动物中心，无特定病原体，并按照标准条件进行饲养和管理。

注射盐酸博莱霉素(日本化药株式会社，博莱霉素含量15mg)和0.9％氯化钠注射液(安徽丰原药业股份有限公司)购自中国科学院合肥物质科学研究院肿瘤医院。

(2)大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法

第一步：大鼠麻醉后固定

称取大鼠体重，用10％水合氯醛(注射剂量按照0.3ml/100g)腹腔注射进行麻醉，然后将其仰卧固定在无菌操作台上，对大鼠颈部进行碘伏消毒，用手术剪剪开颈部皮肤，剥离露出气管，然后把固定台竖起与桌面成80-70°夹角，然后向右倾斜与桌面成70-60°夹角。

第二步：向大鼠左肺注射博莱霉素溶液

取3ml氯化钠注射液注射到博莱霉素小瓶内，充分溶解，配置成5mg/ml备用，按照1.8mg/kg抽取相应体积的博莱霉素溶液，然后把注射器针头插入气管内缓慢注射博莱霉素溶液的速度约为60-50μL/min，使溶液流行左侧肺部，然后用生物用Matrigel胶封闭针孔，缝合皮肤，并用碘伏消毒。

空白对照大鼠注射相应体积的氯化钠注射液到左肺。

(3)CT扫描

上述处理过的两组大鼠饲养21天后进行CT观察记录肺部变化。用10％水合氯醛(注射剂量按照0.2ml/100g)腹腔注射进行麻醉，然后通过高分辨率CT进行扫描观察左右肺部变化，最佳的扫描条件：层厚0.67mm，120KV，300mAs。

扫描结果显示：

空白对照组的CT图，如图1A所示：右左肺部无明显异常；而处理模型组的CT图，如图1B所示：在右肺部无明显异常，但左肺部内有典型的肺纤维化特征：如蜂窝状阴影和磨玻璃影等。

(4)解剖观察

上述处理过的两组大鼠饲养21天后，脱臼处死大鼠，取下大鼠两侧肺部组织，进行拍照记录，另一部分放进10％福尔马林固定液固定进行病理鉴定(HE染色)，一部分发到超低温冰箱(-80°)保存进行羟脯氨酸含量测定。解剖结果显示：空白对照组的大鼠右左肺部外观均无明显异常，如图2A所示。而处理模型组，如图2B所示：在右肺部和空白对照组相似无明显异常，但左肺外观呈肉色，体积缩小，弹性差且硬度增加。

(5)病理切片鉴定(HE染色)

对空白对照组和处理模型组大鼠解剖的肺部组织进行常规病理切片进行观察和鉴定，结果显示：空白对照组右肺部：肺泡大小均匀，肺泡由肺上皮细胞构成(如图3A所示，物镜和目镜的放大倍数为10×10)，处理模型组的大鼠右肺部和空白对照组相似，肺泡分布均匀，肺泡内未见炎症细胞侵润和成纤维细胞增生(如图3B所示，物镜和目镜的放大倍数为10×10)，而处理模型组的大鼠右肺部明显可见：融合形成较大的肺泡或肺泡结构消失，有大量的成纤维细胞和纤维组织增生，炎性细胞侵润明显(如图3C所示，物镜和目镜的放大倍数为10×10)，病理学鉴定为：大鼠左肺部发生纤维化症状。

(6)羟脯氨酸含量测定

羟脯氨酸(HYP)是胶原纤维中特有的一类氨基酸，测定肺部HYP含量可以换算出胶原蛋白的含量，以判断肺纤维化程度。结果显示：空白对照组和处理组大鼠右肺部的羟脯氨酸含量分别为：4.32±0.21μg/g和4.5±0.23μg/g，而处理组大鼠左肺羟脯氨酸含量为：6.4±0.34μg/g，比空白对照组和处理组大鼠右肺部显著增多(P>0.01)。表明博莱霉素能显著诱导大鼠左肺部发生纤维化(如图4所示)。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法，其特征在于，具体步骤包括：

第一步：首先对大鼠称进行称重，腹腔注射水合氯醛麻醉，将大鼠固定在操作台上，对其颈部进行碘伏消毒，用手术剪剪开其颈部皮肤，剥离露出气管，把操作台竖起与桌面成80-70°夹角，然后向右倾斜与桌面成70-60°夹角；

第二步：根据大鼠体重抽取相应体积的博莱霉素溶液，然后用针头刺入气管内，缓慢注入博莱霉素溶液，注射完毕后，用Matrigel封闭气管针孔，然后缝合皮肤，大鼠生长21天以后，得到单肺肺纤维化模型。

2.按照权利要求1所述的大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法，其特征在于，大鼠为雄性，体重在150-200g。

3.按照权利要求1所述的大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法，其特征在于，建立博莱霉素诱导单肺肺纤维化大鼠注射剂量，即每千克大鼠注射1.8mg的博莱霉素。

4.按照权利要求1所述的大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法，其特征在于，建立从颈部气管内向左侧肺部注射博莱霉素溶液的速度：60-50μL/min。

5.按照权利要求1所述的大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法，其特征在于，在同一只大鼠上实现一侧肺发生纤维化而另一侧肺正常。

6.按照权利要求1所述的大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法，其特征在于，摸索出麻醉单肺纤维化大鼠的麻醉药剂量：应该是正常大鼠使用剂量的2/3，即10％水合氯醛：0.2ml/100g。

7.按照权利要求1所述的大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法，其特征在于，观察到大鼠正常肺部功能的代偿性增加，表现为正常肺部体积和重量增加，为研究肺部代偿性增生机组提供了理想的实验动物模型。

8.按照权利要求1所述的大鼠单肺肺纤维化模型的建立方法，其特征在于，大鼠单肺肺纤维化模型的症状与临床人类特发性肺纤维化的病理过程相似：呼吸快而短促，为筛选新药物对肺纤维化疗效提供实验动物模型。

9.一种利用博莱霉素使大鼠肺纤维化的用途，其特征在于，建立博莱霉素诱导单肺肺纤维化大鼠注射剂量，即每千克大鼠注射1.8mg的博莱霉素；或者建立博莱霉素诱导双肺肺纤维化大鼠注射剂量，即每千克大鼠注射3.6mg的博莱霉素。

10.一种大鼠的固定方法，其特征在于，建立从颈部气管内向单肺注射溶液的固定方式：大鼠仰卧固定于固定台上，把固定台竖起与桌面成80-70°夹角，然后向右倾斜与桌面成70-60°夹角。