CN102302514B

CN102302514B - 猪血去蛋白提取物凝胶剂及其制备方法

Info

Publication number: CN102302514B
Application number: CN201110284379XA
Authority: CN
Inventors: 王光; 李莉; 万琳琳; 刘路; 刘延斌
Original assignee: SHENYANG SIJIA TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: SHENYANG NATURANCE BIOLOGICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd.
Priority date: 2011-09-23
Filing date: 2011-09-23
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2031-09-23
Also published as: CN102302514A

Abstract

本发明公开了一种猪血去蛋白提取物制剂，尤其是涉及猪血去蛋白提取物凝胶剂，更具体的说，涉及一种由各种原因引起的皮肤、眼部炎症损伤的治疗药物及其制备方法，它是猪血去蛋白提取物的一种新剂型，属于生物制药技术领域。猪血去蛋白提取物凝胶剂，它主要是由下述原料药按所述重量份数比制备而成：猪血去蛋白提取物溶液20-50份、甲基纤维素2-6份、甘油10-15份、尼泊金甲乙酯0.2-0.5份。本发明药物采用猪血为原料，与同类牛血产品相比具有高安全性、高生物活性的产品优势。本发明弥补了牛血制品存在的潜在风险，本发明猪血去蛋白提取物凝胶剂的安全性和治疗效果明显高于小牛血去蛋白凝胶。

Description

猪血去蛋白提取物凝胶剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及猪血去蛋白提取物制剂，尤其涉及猪血去蛋白提取物凝胶剂，更具体的说，涉及一种由各种原因引起的皮肤、眼部炎症损伤的治疗药物及其制备方法，它是猪血去蛋白提取物的一种新剂型，属于生物制药技术领域。

背景技术

外科的创伤、烧伤、烫伤以及包括褥疮、肢体与皮肤溃疡等疾病是十分常见的皮肤病。目前，治疗这方面疾病的用药种类及治疗方法较多，对于大面积Ⅰ^o-Ⅲ^o烧伤的治疗暴露治疗法，即用灯烤或红外线照射治疗，以减少渗出抗感染，对于小面积烧伤多数以膏剂、酊剂等涂敷暴露或半暴露治疗，这些方法不足之处在于抗感染及抗渗出能力差，疗程长，痛苦大，留疤率高，耗资大，特别是患者长期裸体暴露产生心理障碍，严重影响睡眠及食欲，对创面愈合造成一定影响。

对于眼球表炎症，一般采用抗生素类药物配合维生素类和微量激素类(含眼药)进行治疗，这种治疗效果不甚理想，尤其对急性炎症病变，对经久不愈性眼球表溃疡(碱烧伤溃疡，放射性溃疡和神经性营养障碍性溃疡)及感染性溃疡尚无满意治疗方法，常引起视力消失，造成患者终身残疾。

目前同类品种治疗上述创伤、烧伤、烫伤以及眼角膜损伤的药物均以小牛血为原料的去蛋白提取物，而近年来由于疯牛病的肆虐，疯牛病检测方法的局限性、疯牛病病毒灭活的限制性等因素，世界卫生组织严格限制使用牛血原料产品，广大民众对牛源性生物制品也产生严重的恐慌心理。专利号ZL200510083041.2，专利名称“一种小牛血去蛋白提取物凝胶剂”和专利号ZL200810010480.4，专利名称“含有小牛血去蛋白提取物眼用制剂组合物”，提供了一种治疗上述疾病的药物，但此技术是以小牛血为原料的去蛋白提取物药物制剂，受疯牛病检测方法的局限性、疯牛病病毒灭活的限制性等因素，使得药物效果不理想，在临床应用上受到广泛的限制；以小牛血为原料的凝胶制剂只是单纯使用水溶性凝胶剂基质润滑性差，易失水，有效成分易挥发，不能较好的发挥药效，其治疗时间长，延长了患者的痛苦。

虽然猪血去蛋白提取物具有促进细胞对氧和葡萄糖的摄取等作用，但不能直接用于患者临床应用，并且此提取物是水溶液，储存条件困难，只能冷冻保存，不仅耗电量大，一旦停电将直接影响其质量。并且现有的猪血去蛋白提取物为注射制剂，其注射剂主要为治疗脑血管疾病，并无皮肤、眼球炎症损伤治疗研究的报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种治疗各种原因引起损伤的猪血去蛋白提取物凝胶剂，其具有迅速止痛、杀菌效果好、能有效抑制渗出、创面迅速形成具有一定韧性的且通透性好的保护膜、结痂快、愈合后不留伤疤、疗程短、易于储存、治愈率高的特点。

为了达到上述目的，本发明是通过下述技术方案实现的：

猪血去蛋白提取物凝胶剂，它主要是由下述原料药按所述重量份数比制备而成：猪血去蛋白提取物溶液20-50份、甲基纤维素2-6份、甘油10-15份、尼泊金甲乙酯0.2-0.5份。

所述的最佳重量份数比为猪血去蛋白提取物溶液35份、甲基纤维素4份、甘油12.5份、尼泊金甲乙酯0.35份。

所述的猪血去蛋白提取物凝胶剂，它还包括pH调节剂，pH调节剂为0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L盐酸，pH调节剂的用量为将猪血去蛋白提取物凝胶剂的pH调节至6.0-8.0。

所述的猪血去蛋白提取物凝胶剂的制备方法，取符合所述重量份数的甲基纤维素和甘油加入到容器中，用玻璃棒搅拌，分散均匀，充分润湿后加注射用水重量份数为20-40的注射用水，再加入符合所述重量份数的加尼泊金甲乙酯，搅拌均匀，加0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L得盐酸，调节pH值至7.5-8.0，115℃高压灭菌30min，取出，冷却，得基质备用；在无菌条件下向基质中加入符合所述重量份数的猪血去蛋白提取物溶液，再加入8.5-27.8份的注射用水，再用0.1mol/L氢氧化钠或盐酸调节pH至6.0-8.0，混匀使成凝胶状，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，无菌分装，即得猪血去蛋白提取物凝胶。

所述的分装是分装至药用聚乙烯复合软管中。

本发明的猪血去蛋白提取物凝胶剂具有如下优点及效果：

本发明药物采用猪血为原料，与同类牛血产品相比具有高安全性、高生物活性的产品优势，并且药物中加入甘油作为保湿剂。由于猪血去蛋白提取物凝胶原料易得、成本低，生产工艺先进、周期短、收率高，与同类牛血产品相比具有价格优势。与以小牛血为来源的生物制品比较，本发明以猪血为来源的生物制品其原料易得、成本低、高安全性、高生物活性等优势，弥补牛血制品存在的潜在风险，本发明猪血去蛋白提取物凝胶剂的安全性和治疗效果明显高于小牛血去蛋白凝胶。经过试验数据可知，本发明制剂与小牛血制剂相比，治疗皮肤损伤具有迅速止痛，杀菌效果好，能有效抑制渗出，创面迅速形成具有一定韧性的且通透性好的保护膜，结痂快，愈合后不留伤疤；能有效的治疗角膜上皮层细胞的营养性损伤、创伤性角膜炎、免眼性角膜炎、角膜糜烂及异物性角膜损伤等眼科炎症。使用方便，无副作用，治愈率高。

本发明采用猪血去蛋白提取物溶液制成的含有小分子肽、核苷酸和寡糖类等的生物活性成分凝胶制剂，内含氨基酸、肽、羟基酸、核苷酸等有机物。其主要的药理作用是能在细胞水平上促进组织细胞线粒体对氧和葡萄糖的摄取和利用、ATP合成、营养物的运送、新陈代谢及组织再生、修复等。

本发明采用的基质易于涂展、无油腻感，能吸收组织渗出液不妨碍正常功能，由于单用甲基纤维素润滑性较差，易失水、霉变，故加入保湿剂甘油和抑菌剂尼泊金甲乙酯，保持药物稳定性。猪血去蛋白提取物凝胶剂既可用于治疗各种原因引起的皮肤损伤、溃疡、褥疮、整容、整形及矫形等外科手术后损伤，又可用于治疗眼科手术后引起的角膜、结膜的创伤、炎症及溃疡，包含角膜上皮层细胞的营养性损伤、创伤性角膜炎、免眼性角膜炎、神经麻痹性角膜炎、角膜移植手术并发症及预防并发症、角膜糜烂及异物性角膜损伤等。并且采用药用聚乙烯复合软管，与普通铝管比较，能有效保证药品无菌环境，避免增加药品染菌几率。

猪血去蛋白提取物能刺激细胞对氧和葡萄糖的摄取、利用，出尽细胞的增殖，抑制细胞的损失，但不能直接用于患者临床应用，并且此提取物是水溶性，储存条件困难，只能冷冻保存，本发明研发的凝胶剂则解决了这一问题，给药方便。

除了本发明采用了猪血去蛋白提取物外，其它原料与小牛血去蛋白凝胶的原料也不同，本发明经过大量实验筛选得出甲基纤维素、甘油、尼泊金甲乙酯混合作为基质，由实验数据可以看出，甲基纤维素、甘油、尼泊金甲乙酯这几种辅料不仅起到了基质的作用，同时与猪血去蛋白提取物产生了协同作用，进而提高了药物的治疗效果，稳定性好。

具体实例方式

下面结合实施例多本发明做进一步详细说明，但本发明的保护范围不受实施例所限。

下述的实施例中的实验方法如无特别说明，均为常规方法。

下述的实施例中的百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1：

猪血去蛋白提取物溶液的制备：按照专利号为ZL200510046289.1，发明名称为“从猪血中提取具有刺激细胞呼吸活性作用物质的方法”中描述的制备方法：取非传染区经检验合格的健康猪，采用无菌采血，去纤维蛋白，得去纤维蛋白血40L，反复冻融（-20℃～40℃）2-4次；于2-8℃条件下在胶体磨中匀浆2分钟，重复3次；取匀浆液于4000转/分钟离心20分钟后，弃去沉淀；取上清液，分别用截留分子量100000D、30000D、10000D、6000D的中空纤维超滤柱超滤，得滤液D 28.8L；将超滤液D经低温（25℃）减压浓缩（至总固体含量40mg/ml以上），得猪血去蛋白提取物溶液4800g。

实施例2：

猪血去蛋白提取物凝胶的制备：本实施例含猪血去蛋白提取物20%，制成1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

取10L的容器，取甲基纤维素100g，甘油500g，用玻璃棒搅拌，分散均匀，充分润湿后加注射用水2000g，加尼泊金甲乙酯10g，搅拌均匀，加0.1mol/L氢氧化钠适量，调节pH值至7.5-8.0，115℃高压灭菌30min，取出，冷却，得基质备用；无菌条件下向基质中加入猪血去蛋白提取物溶液1000g，再加注射用水至总重5000g，用0.1mol/L氢氧化钠或盐酸调节pH至6.0-8.0，混匀使成凝胶状，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，无菌分装，5g/支，共得1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

实施例3：

猪血去蛋白提取物凝胶的制备：本实施例含猪血去蛋白提取物27.5%，制成1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

取10L的容器，取甲基纤维素150g，甘油562.5g，用玻璃棒搅拌，分散均匀，充分润湿后加注射用水1750g，加尼泊金甲乙酯13.75g，搅拌均匀，加0.1mol/L氢氧化钠适量，调节pH值至7.5-8.0，115℃高压灭菌30min，取出，冷却，得基质备用；无菌条件下向基质中加入猪血去蛋白提取物溶液1375g，再加注射用水至总重5000g，用0.1mol/L氢氧化钠或盐酸调节pH至6.0-8.0，混匀使成凝胶状，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，无菌分装，5g/支，共得1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

实施例4：

猪血去蛋白提取物凝胶的制备：本实施例含猪血去蛋白提取物35%，制成1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

取10L的容器，取甲基纤维素200g，甘油625g，用玻璃棒搅拌，分散均匀，充分润湿后加注射用水1500g，加尼泊金甲乙酯17.5g，搅拌均匀，加0.1mol/L氢氧化钠适量，调节pH值至7.5-8.0，115℃高压灭菌30min，取出，冷却，得基质备用；无菌条件下向基质中加入猪血去蛋白提取物溶液1750g，再加注射用水至总重5000g，用0.1mol/L氢氧化钠或盐酸调节pH至6.0-8.0，混匀使成凝胶状，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，无菌分装，5g/支，共得1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

实施例5：

猪血去蛋白提取物凝胶的制备：本实施例含猪血去蛋白提取物42.5%，制成1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

取10L的容器，取甲基纤维素250g，甘油687.5g，用玻璃棒搅拌，分散均匀，充分润湿后加注射用水1250g，加尼泊金甲乙酯21.25g，搅拌均匀，加0.1mol/L氢氧化钠适量，调节pH值至7.5-8.0，115℃高压灭菌30min，取出，冷却，得基质备用；无菌条件下向基质中加入猪血去蛋白提取物溶液2125g，再加注射用水至总重5000g，用0.1mol/L氢氧化钠或盐酸调节pH至6.0-8.0，混匀使成凝胶状，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，无菌分装，5g/支，共得1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

实施例6：

猪血去蛋白提取物凝胶的制备：本实施例含猪血去蛋白提取物50%，制成1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

取10L的容器，取甲基纤维素300g，甘油750g，用玻璃棒搅拌，分散均匀，充分润湿后加注射用水1000g，加尼泊金甲乙酯25g，搅拌均匀，加0.1mol/L氢氧化钠，调节pH值至7.5-8.0，115℃高压灭菌30min，取出，冷却，得基质备用；无菌条件下向基质中加入猪血去蛋白提取物溶液2500g，再加注射用水至总重为5000g，用0.1mol/L氢氧化钠或盐酸调节pH至6.0-8.0，混匀使成凝胶状，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，无菌分装，5g/支，共得1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

实施例7：

猪血去蛋白提取物凝胶的制备：本实施例含蛋白提取物35%，制成1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

猪血去蛋白提取物溶液为实施例1方法制得，用此猪血去蛋白提取物溶液替代小牛血去蛋白提取物，并按照专利号ZL200510083041.2，专利名称“一种小牛血去蛋白提取物凝胶剂”描述的方法制备，制成1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

实施例8：

猪血去蛋白提取物溶液为实施例1方法制得，用此猪血去蛋白提取物溶液替代小牛血去蛋白提取物，并按照专利号ZL200810010480.4，专利名称“含有小牛血去蛋白提取物眼用制剂组合物”，制成1000支猪血去蛋白提取物凝胶。

实施例9：

猪血去蛋白提取物凝胶治疗家兔细菌性角膜炎试验

实验选用健康家兔80只，体重2.0-2.5kg，雌雄各半，雌性未孕。随机分为模型对照组、小牛血去蛋白凝胶组（专利号ZL200810010480.4，专利名称“含有小牛血去蛋白提取物眼用制剂组合物）、A组、B组、C组、D组、E组、F组分别按照实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例8的方法制备，每组10只。各组家兔以0.6%的盐酸丁卡因注射液滴眼2～3滴，轻轻按摩片刻，待角膜反射消失后用1ml 注射器抽取0.1ml 含菌培养基 (含金黄色葡萄球菌2.5×10⁹) 自角膜近中央处注入角膜实质内，造成约4mm 直径的白色水泡，然后分笼饲养。以上动物造模24h后开始给药，各组每日自10:00至15:30，2h给药一次，连续2周。每只动物于接种细菌24h 后开始观察记录一般情况和角膜炎症肉眼表现。以上动物分别于给药第1天开始按评分标准评分（表1），连续2周，然后进行统计学分析（表2）。第14天观察结束后取眼角膜作切片HE染色，于显微镜下观察角膜厚度、溃疡、炎细胞浸润、成纤维细胞增生等炎症表现。

表1 病变评分标准

Figure 201110284379X100002DEST_PATH_IMAGE001

表2 金黄色葡萄球菌型角膜炎治疗后的不同时间症状评分比较（±s）

Figure 201110284379X100002DEST_PATH_IMAGE003

注：与模型对照组比较，^*P＜0.05，^** P＜0.01

结果显示：模型对照组在接种24h出现明显的角膜炎反应，大量的分泌物，充血严重；角膜肿胀，呈白色混浊，难以窥见虹膜和瞳孔，角膜表面可见细小溃疡；接种10-14天眼睑严重粘连。猪血去蛋白提取物凝胶实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6组与模型对照组比较，有显著统计学差异（P＜0.01），以最佳配比组（实施例4）效果最为显著，给药3-4天出现分泌物减少，眼睑粘连，混合性充血和眼睑肿胀减轻，角膜菌斑缩小，可隐约窥见虹膜；给药7-10天分泌物较少甚至消失，角膜透明度增加，个别可恢复光泽并清晰窥见虹膜；后期治疗组多数角膜分泌物少，角膜光滑透明度好。实施例8组连续使用14天未见症状好转。小牛血去蛋白凝胶虽然与模型对照组比较，有统计学差异（P＜0.05），但其治疗效果远不及猪血别，并且恢复周期较长。

病理检查结果：模型组角膜显著增厚，多数角膜上皮剥脱，角膜伤口可达1/2基质层，周围可见大量坏死组织和炎细胞浸润，严重者甚至出现穿孔。猪血去蛋白提取物凝胶实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6组角膜结构较完整，伤口处由纤维细胞覆盖，愈合较好，感染后角膜炎性细胞浸润和角膜肿胀等明显缓解。实施例8组可见大量坏死组织和炎细胞浸润。小牛血去蛋白凝胶组角膜略增厚，周围可见少量坏死组织和炎细胞浸润。

实施例10：

猪血去蛋白提取物凝胶治疗家兔角膜碱烧伤试验

实验选用健康家兔80只，体重2.0-2.5kg，雌雄各半，雌性未孕。随机分为模型对照组、小牛血去蛋白凝胶组（专利号ZL200810010480.4，专利名称“含有小牛血去蛋白提取物眼用制剂组合物）、A组、B组、C组、D组、E组、F组分别按照实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例8的方法制备，每组10只。各组家兔以0.6％的盐酸丁卡因注射液滴眼2～3滴，轻轻按摩片刻，待角膜反射消失后，上开睑器，由助手按住白兔，固定其头部 (尽量不用全麻，以免动物死亡) 事先剪好的直径约8mm的滤纸片沾取1mol/L NaOH，注意不要太湿，刚刚浸透即可，用镊子小心夹起，贴于兔角膜中央1分钟，离开。用无菌生理盐水冲眼5min，约半瓶盐水，注意贴滤纸片时一定不要触及眼睑及第三眼睑，以免引起睑球粘连。以上动物造模48h后，开始给药，每日5次，每次2滴。角膜碱性化学伤后，给药前及给药后1、2、6、10和14天的15:00进行裂隙灯检查，荧光素染色照相，照片经计算机图像分析，计算角膜上皮愈合率(详见表3)。用药后14天处死动物，沿巩膜缘稍后取下角膜，进行光镜检查。

Figure 201110284379X100002DEST_PATH_IMAGE004

表3 角膜碱烧伤治疗后角膜上皮愈合率比较（%，

±s）

组别

第0天

第1天

第2天

第6天

第10天

第14天

模型对照组

38.5±8.4

40.2±11.3

53.1±9.3

63.2±10.1

55.7±12.0

64.2±8.9

小牛血组

37.3±9.3

38.2±10.4

45.1±10.1

61.5±9.5

62.5±11.4^*

68.3±10.2

A组

39.2±8.7

57.2±10.9 ^*

72.6±11.4 ^**

86.9±11.2 ^**

84.4±11.4 ^**

94.2±11.8 ^**

B组

37.9±7.9

58.9±10.2 ^*

73.1±9.7 ^**

87.5±11.7 ^**

85.2±9.7 ^**

93.8±9.9 ^**

C组

38.9±7.8

60.2±10.1 ^*

75.2±11.2 ^**

90.7±10.9 ^**

88.7±10.7 ^**

95.9±11.5 ^**

D组

39.4±8.4

58.6±11.2 ^*

73.7±10.3 ^**

88.4±11.0 ^**

83.9±11.5 ^**

94.6±11.2 ^**

E组

41.6±10.0

59.2±11.2^*

74.3±12.0^**

90.0±8.9^**

84.2±13.0^**

93.1±11.0^**

F组

39.1±7.5

42.3±10.1

60.8±10.7

70.0±9.9

66.7±11.2^*

79.8±10.7^*

注：与模型对照组比较，^* P＜0.05；^**P＜0.01

表3结果显示：猪血去蛋白提取物凝胶实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6组在给药第1-2天的角膜上皮愈合率与模型对照组相比均已呈现显著差异（P<0.05）；至给药第6天，上皮愈合率已达到近90%左右（P<0.01），而模型对照组的仅为63.2%（P<0.01）；至给药第14天时，愈合率均恢复到93%左右（P<0.01），小牛血去蛋白凝胶组仅为68.3%。在治疗过程中，最佳配比组（实施例4）对于角膜上皮愈合率优于其他组别。猪血去蛋白提取物凝胶实施例8组至给药第10 -14天时，愈合率与模型对照组相比有统计学差异（P<0.05），但第14天的愈合率只为79.8%，明显低于其他实施例组。小牛血去蛋白凝胶组仅在第10天时与模型对照组比较有差异，愈合率仅为68.3%。

病理检查结果：正常兔角膜由上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层组成，上皮细胞层由5-6层细胞组成，排列规则。角膜碱烧伤后，上皮层完全脱落，前弹力层模糊，角膜基质暴露、水肿、增厚，凝固性坏死，内皮细胞面见纤维素性渗出及少数炎性细胞浸润；至给药第14天，猪血去蛋白提取物凝胶实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6组的角膜原烧伤区已被4-6层上皮细胞覆盖，上皮细胞极向明显，细胞间连接紧密，前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层基本恢复正常；前弹力层已显现清晰，水肿减轻；小牛血去蛋白凝胶组大部分兔眼原烧伤区的角膜上皮细胞亦已有增殖再生，但新生上皮层表面细胞部分脱落，大部分基质纤维变性和水肿；模型对照组兔眼原烧伤区的角膜上皮细胞已见增殖再生，但细胞层数不均一，前弹力层模糊，角膜基质见部分水肿。

实施例11：

猪血去蛋白提取物凝胶对大鼠深Ⅱ°烫伤的影响试验

Wistar大鼠80只，体重1.5-1.7kg，雌雄各半，按36mg/kg的剂量腹腔注射戊巴比妥钠麻醉，背部用电动推剪毛。仰卧位将大鼠固定于造模木板上，使其背部皮肤暴露于模板孔内，将模板置于85℃电热恒温水浴锅内，造成大鼠深Ⅱ°烫伤(烫伤时间为12秒)。用纱布轻轻擦干创面水渍，0.3%碘伏清洁消毒。大鼠按烫伤面积均分为8组，每组10只，分别为模型对照组，小牛血去蛋白凝胶组（专利号ZL200510083041.2，专利名称“一种小牛血去蛋白提取物凝胶剂”）、A组、B组、C组、D组、E组、F组分别按照实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7的方法制备。试验药和阳性对照药均匀地涂于烫伤部位，模型对照组不给药，上敷生理盐水纱条或抗生素纱条，外敷透气性敷料。隔日给药一次，连续14天。观察大鼠第7、15天的创面结痂面积和脱痂愈合时间，对实验数据进行t检验。

表4 各药物组对大鼠深Ⅱ°烫伤各项指标的影响（±s，n=10）

Figure 201110284379X100002DEST_PATH_IMAGE005

注：与模型对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01

实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6与模型对照组比较，有统计学差异，第7天和第15天的创面结痂面积显著缩小，脱痂愈合时间显著缩短，尤以最佳配比组（实施例4）更为显著；实施例7组虽采用猪血为原料，但由于辅料的差别，直至第15天创面面积才有缩小差异（P<0.05）。小牛血去蛋白凝胶组与模型对照组比较无统计学差异。

实施例12：

猪血去蛋白提取物凝胶对大鼠皮肤创伤的影响

Wistar大鼠80只，体重1.5-1.7千克，雌雄兼用(雌性为未孕者)。腹腔注射1%戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，剃去背中部毛，用碘酒消毒，在相同部位用特制打孔器切割2个圆形创面，直径约2cm，面积约4cm²，深至皮下，形成机械损伤动物模型。大鼠随机分为8组，每组10只，分别为模型对照组，小牛血去蛋白凝胶组（专利号ZL200510083041.2，专利名称“一种小牛血去蛋白提取物凝胶剂”）、A组、B组、C组、D组、E组、F组分别按照实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7的方法制备。每天观察术后表皮、肉芽组织生长情况，动态观察创面愈合过程计算创面愈合率；于给药前和给药后第3、5、7、10、14天用透明薄膜描记创面面积。愈合率＝(原创面面积－现创面面积)/原创面面积×100%，评价创面的愈合速度。

表5 各药物组对大鼠皮肤创伤的影响（

±s，n=10）

注：与模型对照组比较，*P＜0.05；**P＜0.01

创面的一般观察：猪血去蛋白提取物凝胶实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6各组与模型组比较，创面修复情况有明显的差别。术后3天猪血去蛋白提取物凝胶实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6各组伤口开始出现少许红晕，表明肉芽组织已在生长，而猪血去蛋白提取物凝胶实施例7组、模型对照组和小牛血去蛋白凝胶组伤口湿润；给药3-5天，实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6各组肉芽组织生长明显，局部已长出薄层或点状上皮，创缘皮肤收缩明显；给药7-10天，实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6各组伤口干燥、无感染，创面已基本为肉芽组织填充，而实施例7组、模型对照组和小牛血去蛋白凝胶组伤口湿润，有渗出物，收缩不明显，仅见薄层肉芽，未见明显新生上皮。给药14天，实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6各组创面基本愈合，而实施例7组、模型对照组和小牛血去蛋白凝胶组修复欠佳。

动态观察创面愈合情况：猪血去蛋白提取物凝胶实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6各组与模型对照组比较，有统计学差异，治疗第14天时，最佳配比组（实施例4）差异更为显著（P<0.01），能明显加速皮肤创伤愈合，效果优于小牛血去蛋白凝胶组和猪血去蛋白提取物凝胶实施例7组。

实施例13：

猪血去蛋白提取物凝胶对豚鼠肝细胞呼吸活力的影响试验

系用瓦氏呼吸检压仪测定豚鼠肝细胞匀浆的呼吸活力，从测得的耗氧量计算出呼吸活力QO₂（μl·O₂/mg·h）和刺激指数（SI）。

供试品制备：A组、B组、C组、D组、E组、F组、G组分别按照实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8，小牛血去蛋白凝胶1组（按照专利号ZL200510083041.2，专利名称“一种小牛血去蛋白提取物凝胶剂”中描述的方法制备）、小牛血去蛋白凝胶2组（专利号ZL200810010480.4，专利名称“含有小牛血去蛋白提取物眼用制剂组合物）。

肝细胞分离：断头处死豚鼠，取肝重2g，于冷生理盐水中剥除血管等纤维成分，置于Hank’s液中漂洗1~2次，置1:10的Hank’s液中，反复吹打制成细胞悬液。将悬液注入离心管，室温放置5~10分钟，吸去上层脂肪等杂物，反复三次，200目纱网过滤即得肝细胞悬液，备用。

检测：采用瓦氏微量呼吸检压仪方法。

反应瓶中先加入Soerensen缓冲液1.1ml，加供试品0.2ml，然后加肝匀浆液1.0ml，加10%氢氧化钠溶液0.2ml于具一小滤纸条的反应瓶中间小杯。由于肝匀浆本身有耗氧作用，故实验时以Soerensen缓冲液0.2ml代替供试品，其余试剂同样品管，作为空白管。将装好的反应瓶按管号与测压计相连，置37℃恒温水浴中。开动振荡器振摇10分钟（75次/分）使反应瓶内外温度一致。将测压计右侧柱液面调至150mm，记下左侧液面初读数（A），然后关闭三向活塞，开始计时，反应30分钟记时后将测压计右侧柱液面再调至150mm，记下左侧液面读数（B）。打开三向活塞，重复上述过程，进行下一个30分钟的反应并记下左侧液面初读数（C）及30分钟后的液面读数（D）。实验过程中必须附加一套供校正用的温压计，在反应瓶中加2.5ml的Soerensen缓冲液，使其在与试验管完全相同的条件下试验，观察其压力的变化（△C），以消除试验过程中温度及大气压的影响。

计算：

QO₂（μl·O₂/mg·h）=[（A-B+C-D）×K₁-△C×K₂]/G/I（QO₂≥4.0）

式中K1为空白或样品的反应瓶常数，K2为温压计的反应瓶常数，G为每1ml肝匀浆的干重（mg），G=△W/2-9.3，9.3为Soerensen缓冲液的干重（mg），I为反应时间（小时）。

刺激指数（SI）=供试品QO₂/空白QO₂（SI≥2.5）

表6 猪血去蛋白提取物凝胶对豚鼠肝细胞呼吸活力影响的实验结果

组别	QO₂值（μl·O₂/mg·h）	SI值
			A组	5.21	3.08
B组	5.14	3.04
			C组	5.29	3.13
D组	5.10	3.02
			E组	4.99	2.95
F组	3.78	2.24
			G组	3.82	2.26
凝胶1组	3.92	2.32
			凝胶2组	3.97	2.35

通过对肝细胞呼吸活性的研究显示，A组、B组、C组、D组、E组均可影响组织细胞内线粒体有氧呼吸的链式反应，影响氧化还原酶活性，对细胞的呼吸活性有相同的作用，最佳配比组（实施例4）对活性作用略高于其他组别。而猪血去蛋白提取物凝胶实施例7、实施例8组的QO₂值和SI值均不符合规定要求。该试验方法检测两种专利的小牛血去蛋白凝胶QO₂值和SI值均处于边缘值，活性检测不稳定。

实施例10：

猪血去蛋白提取物凝胶稳定性数据：

1、样品制备：A组、B组、C组分别按照实施例4、实施例7、实施例8，小牛血去蛋白凝胶1组（按照专利号ZL200510083041.2，专利名称“一种小牛血去蛋白提取物凝胶剂”中描述的方法制备）、小牛血去蛋白凝胶2组（专利号ZL200810010480.4，专利名称“含有小牛血去蛋白提取物眼用制剂组合物）。

2、样品检验项目

2.1 高分子量物质：采用高效液相色谱法（《中国药典》2010年版三部附录Ⅲ B）试验，使用TSK-G2000SW柱，以乙腈－三氟醋酸－水(40:0.1:60)为流动相，流速为1ml/min，检测波长为214nm。

称取胰岛素（M.W＝5800）适量，用流动相配成浓度为2.5mg/ml的溶液作为对照品溶液。

取本品适量加乙腈40ml溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。将先于胰岛素峰保留时间的峰视为高分子物质，如有高分子量物质存在，按面积归一化法计算，高分子量物质含量不得过2.0%，并确定高分子量物质最大分子量，最大分子量限度不大于10000Da。

2.2 呼吸活性测定：

2.2.1 肝匀浆液的制备：取体重200—300g的雄性豚鼠一只，颈部打击处死（处死前需禁食至少24小时），立即切断颈动脉放血，打开腹腔取出肝脏，置冰水浴中的Soerensen缓冲液中（注意：不要损伤胆囊或胆管）。称取5.5g的肝脏，并切割为大小相同的7块，每块用7ml的Soerensen缓冲液匀浆（注意：以上操作必须在冰水浴中进行）。

2.2.2 测定法：预先把测压计反应瓶洗净并干燥，备用；装好测压液于测压管内，调节液面至150mm；反应瓶中先加入Soerensen缓冲液1.1ml，加供试品0.2ml，然后加肝匀浆液1.0ml；加10%氢氧化钠溶液0.2ml于具一小滤纸条的反应瓶中间小杯；由于肝匀浆本身有耗氧作用，故实验时以Soerensen缓冲液0.2ml代替供试品，其余试剂同样品管，作为空白管；将装好的反应瓶按管号与测压计相连（注意密闭，勿使漏气），置37℃恒温水浴中；开动振荡器振摇10分钟（75次/分）使反应瓶内外温度一致。将测压计右侧柱液面调至150mm，记下左侧液面初读数（A），然后关闭三向活塞，开始计时，反应30分钟记时后将测压计右侧柱液面再调至150mm，记下左侧液面读数（B）。打开三向活塞，重复上述过程，进行下一个30分钟的反应并记下左侧液面初读数（C）及30分钟后的液面读数（D）；实验过程中必须附加一套供校正用的温压计，在反应瓶中加2.5ml的Soerensen缓冲液，使其在与试验管完全相同的条件下试验，观察其压力的变化（△C），以消除试验过程中温度及大气压的影响；取2.0ml肝匀浆，置恒重的装有海沙的称量瓶中，110℃干燥至恒重，计算两次的重量差△W（mg）。

2.2.3 计算：

QO₂（μl·O₂/mg·h）=[（A-B+C-D）×K1-△C×K2]/G/I （QO₂≥ 4.0μl·O₂/mg·h）

刺激指数（SI）=供试品QO₂/空白QO₂ （SI≥2.5）

式中K1为空白或样品的反应瓶常数；K2为温压计的反应瓶常数；G为每1ml肝匀浆的干重（mg），G=△W/2-9.3，9.3为Soerensen缓冲液的干重（mg）；I为反应时间（小时）。

2.3 多肽测定：

2.3.1 标准曲线的制备：取带塞试管6支，按顺序精密加入牛血清白蛋白标准液0.00，0.50，0.70，0.90，1.10，1.30ml，再依次加水1.60，1.10，0.90，0.70，0.50，0.30ml，再精密加碱性铜试液4.0ml摇匀，室温放置10分钟，依次精密加入福林试液0.4ml摇匀，加塞，于30℃恒温水浴保温30分钟，冷却后，在660nm的波长处测定吸收度，以吸收度A为纵坐标，白蛋白标准溶液浓度C为横坐标，绘制C-A曲线，或用最小二乘法回归，求得回归方程。

2.3.2 供试品测定：取猪血去蛋白提取物凝胶1g，精密称定，加水10ml溶解，滤过，取续滤液作为供试品溶液。精密量取供试品溶液0.80ml，以下照标准曲线制备，自“再依次精密加碱性铜试液……”起，同法操作，测定吸收度，自标准曲线或回归方程求得供试液的mg数。每支含多肽不低于0.85mg。

2.4 氨基酸测定：

2.4.1 色谱条件：高效液相色谱仪（岛津LC-10ATvp）；流动相A：称取22.5g醋酸钠，加水1900ml，溶解后用冰醋酸调pH6.0，加乙腈100ml，混匀，用0.45μm滤膜过滤；流动相B：70%乙腈；流速：0.8ml/min；检测波长：254nm；柱温：40℃；

表7 梯度条件

时间（min）	流速(ml/min)	缓冲液A（%）	缓冲液B（%）
				0.01	0.8	100	0
4	0.8	97	3
				12	0.8	80	20
20	0.8	74	26
				28	0.8	70	30
31	0.8	50	50
				35	0.8	30	70
38	0.8	0	100
				40	0.8	100	0

2.4.2 氨基酸标准品的配制：分别取氨基酸标准品各约25.0mg，精密称定，于50ml量瓶中，用0.1mol/L的HCl溶液溶解，并定容至刻度，配成浓度均为0.5mg/ml的氨基酸标准品溶液。

正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸约10mg，加0.1mol/L盐酸溶液10ml溶解，混匀。

精密吸取氨基酸标准品溶液200μl，分别置1ml离心管中，每个离心管中精密加入正亮氨酸内标溶液20μl， 0.5mol/L三乙胺乙腈液80μl，50mmol/L异硫氰酸苯酯乙腈液80μl，摇匀，室温放置1小时，加正己烷320μl，振摇后放置10分钟，取下层溶液，用0.45μm微孔滤膜滤过，即得。

2.4.3 供试品制备：精密吸取猪血去蛋白提取物口腔膏适量，精密测定，加水10ml溶解，滤过，滤液分别置1ml离心管中，按前述“衍生方法”操作，制得猪血去蛋白提取物注射液的衍生物溶液。

2.4.4 测定：取氨基酸标准品衍生物溶液和供试品各2μl进样，记录色谱图。每支含氨基酸0.8mg-1.2mg。

3、加速试验测定

在温度40℃±2℃、相对湿度75%±5%的条件下放置6个月，在试验期间第1个月、2个月、3个月、6个月末分别取样一次，考察样品高分子量物质、呼吸活性、多肽、氨基酸测定。

4、各试验测定结果

表8 加速试验结果表

由各试验数据结果可知，本发明所设计的处方长期加速放置6个月均不影响产品的活性和质量，临床使用不会产生过敏等不良反应。由于各厂家对所规定的质量标准不同，本发明规定的质量标准要求高于其他同行业标准，检测更为严格，故小牛血去蛋白凝胶1组（按照专利号ZL200510083041.2，专利名称“一种小牛血去蛋白提取物凝胶剂”中描述的方法制备）、小牛血去蛋白凝胶2组（专利号ZL200810010480.4，专利名称“含有小牛血去蛋白提取物眼用制剂组合物）的各项指标均不符合规定要求，说明本发明所选用的辅料与猪血去蛋白提取物有较好的协同作用，并不影响药物效果。小牛血去蛋白凝胶所含有的指标性成分较少，直接影响产品的疗效，不及猪血去蛋白提取物凝胶。

Claims

1.猪血去蛋白提取物凝胶剂，其特征在于它是由下述原料药按所述重量份数比制备而成：猪血去蛋白提取物溶液20-50份、甲基纤维素2-6份、甘油10-15份、尼泊金甲乙酯0.2-0.5份；所述猪血去蛋白提取物溶液的制备方法如下：取非传染区经检验合格的健康猪，采用无菌采血，去纤维蛋白，得去纤维蛋白血40L，于-20℃～40℃反复冻融2-4次；于2-8℃条件下在胶体磨中匀浆2分钟，重复3次；取匀浆液于4000转/分钟离心20分钟后，弃去沉淀；取上清液，分别用截留分子量100000D、30000D、10000D、6000D的中空纤维超滤柱超滤，得滤液D 28.8L；将超滤液D经在25℃低温减压浓缩至总固体含量40mg/ml以上，得猪血去蛋白提取物溶液4800g。

2.根据权利要求1所述的猪血去蛋白提取物凝胶剂，其特征在于它是由下述原料药按所述重量份数比制备而成：猪血去蛋白提取物溶液35份、甲基纤维素4份、甘油12.5份、尼泊金甲乙酯0.35份。

3.根据权利要求1所述的猪血去蛋白提取物凝胶剂，其特征在于它还包括pH调节剂，pH调节剂为0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L盐酸，pH调节剂的用量为将猪血去蛋白提取物凝胶剂的pH调节至6.0-8.0。

4.一种权利要求1所述的猪血去蛋白提取物凝胶剂的制备方法，其特征在于取符合所述重量份数的甲基纤维素和甘油加入到容器中，用玻璃棒搅拌，分散均匀，充分润湿后加重量份数为20-40的注射用水，再加入符合所述重量份数的尼泊金甲乙酯，搅拌均匀，加0.1mol/L氢氧化钠或0.1mol/L的盐酸，调节pH值至7.5-8.0，115℃高压灭菌30min，取出，冷却，得基质备用；在无菌条件下向基质中加入符合所述重量份数的猪血去蛋白提取物溶液，再加入8.5-27.8份的注射用水，再用0.1mol/L氢氧化钠或盐酸调节pH至6.0-8.0，混匀使成凝胶状，用灭菌的玻璃棒搅拌均匀，无菌分装，即得猪血去蛋白提取物凝胶。

5.根据权利要求4所述的猪血去蛋白提取物凝胶剂的制备方法，其特征在于所述的分装是分装至药用聚乙烯复合软管中。