CN103239479A - 一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法，包括：将收集的临床病例皮肤鳞状细胞癌组织制成单细胞悬液，分离出CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群，再和1x106人原代成纤维细胞，1x106人原代内皮细胞悬混在基质胶中，再将其注射至经人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境中。本发明的为进一步研究人皮肤原发性SCC肿瘤的分子生物学机制成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及一种肿瘤干细胞动物模型的建立方法，特别是涉及一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法。
背景技术
尽管肿瘤的分子水平发病机理和癌症的诊断治疗研究已经取得了很大进展，癌症的死亡率仍然很高，而且仍然缺乏有效的治愈方法。手术，放射治疗和全身治疗，如化疗或激素治疗的传统方法，旨在消除或杀死快速分裂的癌细胞。这些方法在临床上都具有局限性。所有这些传统的治疗只对早期或非转移肿瘤有效，却对已转移的肿瘤束手无策。
在过去的二三十年中，肿瘤干细胞（CSC）的概念渐渐被愈来愈多的研究所证实，目前报道已有多种类型肿瘤分离出CSC，包括生殖细胞癌，白血病和多种实体肿瘤，比如乳腺癌，脑癌，结肠癌，肝癌，胰腺癌，卵巢癌等。CSC肿瘤模型认为，癌症是由不同层次分化和增殖的细胞组成。肿瘤组织中存在数量稀少的癌细胞亚群，在肿瘤形成过程中充当干细胞的角色，具有自我更新、增殖和分化的潜能，虽然数量少，却在肿瘤的发生、发展、复发和转移中起着重要作用，被称为肿瘤干细胞或肿瘤启动细胞（TIC）。
肿瘤干细胞通过自我更新和无限增值维持着肿瘤细胞群的生命力；肿瘤干细胞的运动和迁徙能力又使肿瘤细胞的转移成为可能；肿瘤干细胞可以长时间处于休眠状态并具有多种耐药分子而对杀伤肿瘤细胞的外界理化因素不敏感，因此肿瘤往往在常规肿瘤治疗方法消灭大部分普通肿瘤细胞后一段时间复发。能够自我更新和长期重建肿瘤。进一步研究肿瘤干细胞的分子生物学特性及其维持肿瘤生成、转移的机制，开发针对肿瘤干细胞的药物以及治疗方法对于癌症的临床治疗具有重要的意义。
尽管这二三十年对一些肿瘤类型的SCS细胞群的研究如火如荼，但是，目前对于人的皮肤鳞状上皮细胞癌（SCC）的SCS群研究甚少。已报道的从头颈部鳞状上皮细胞癌细胞株中分离出的SP（sidepopulation）细胞，口腔粘膜鳞状上皮细胞癌细胞株的CD44+细胞，ALDH1+细胞，具有致瘤性强、耐药性等类似SCS的特质，但这些研究均基于肿瘤细胞株而非原发性肿瘤。人皮肤原发性鳞状上皮细胞癌分离的CD45+CD133+细胞虽然有富集肿瘤干细胞的特征，但细胞群的纯度低，没有有效排除肿瘤组织中的成纤维细胞和内皮细胞，无法进一步研究其特异表达的基因谱，小鼠致瘤成功率不高，特异性亦成问题。现在的研究已公认人肿瘤周围的微环境，包括成纤维细胞和内皮细胞在内等多种间质细胞及新生的毛细血管对于肿瘤的发生和转移有着至关重要的作用，本专利以此为基点，在小鼠体内模仿人体内部肿瘤的微环境从而建立人皮肤原发性鳞状上皮细胞癌及其肿瘤干细胞的老鼠模型。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种有效移植原发性皮肤鳞状上皮细胞癌细胞及其肿瘤干细胞至裸鼠皮下的方法，此动物模型的建立使进一步研究人皮肤原发性SCC肿瘤的分子生物学机制成为可能。
为实现上述目的，本发明所采用以下技术方案：
一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法，包括：
步骤一，将收集的临床病例皮肤鳞状细胞癌组织制成单细胞悬液，并用多种细胞表面标志物标记肿瘤细胞；
步骤二，将肿瘤细胞进一步和1x106人原代成纤维细胞，1x106人原代内皮细胞悬混在基质胶中；
步骤三，将步骤二中的悬混液注射至经人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境中。
按上述方案，步骤一执行完毕后，从肿瘤细胞中分离出CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群，并将该干细胞群用于执行步骤二和步骤三。
按上述方案，所述人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境的建立方法,包括：
在移植SCC细胞前14天，在裸鼠皮下埋入可溶性泡沫凝胶（0.5×0.5cm,×2）,并在可溶性泡沫凝胶中注射基质胶（Matrigel）100ul,其中悬混有1x106人原代成纤维细胞和1x106人原代内皮细胞,闭合创口正常饲养两周以形成利于移植人皮肤原发性SCC细胞的微环境。
本发明有益效果在于：
1）通过人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境有效并高效移植人皮肤原发性SCC肿瘤致裸鼠皮下。此动物模型的建立使进一步研究人皮肤原发性SCC肿瘤的分子生物学机制成为可能。建立移植人皮肤原发性SCC肿瘤裸鼠致瘤模型中，首先人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境：在裸鼠皮下埋入可溶性泡沫凝胶,并在可溶性泡沫凝胶中注射基质胶（Matrigel）,基质胶（Matrigel）是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中分离出基底膜基质，其主要成分由层粘连蛋白，Ⅳ型胶原，巢蛋白，硫酸肝素糖蛋白等组成，还包含生长因子和基质金属蛋白酶等，这些成分均有利于促进成纤维细胞和内皮细胞等间质细胞的生长和分化，以及新生毛细血管的形成。同时加入1x106人原代成纤维细胞和1x106人原代内皮细胞，闭合创口饲养两周，以形成利于移植人皮肤原发性SCC细胞的微环境。
2)首次使用悬混基质胶和两种间质细胞（人成纤维细胞和人内皮细胞）作为人性化裸鼠皮下致瘤微环境的方法，首次在肿瘤致瘤注射时使用混合两种间质细胞与人SCC肿瘤细胞或肿瘤干细胞的基质胶悬液，使建立人皮肤鳞状上皮细胞癌小鼠模型成为可能，并且提高了人SCC致瘤率，从最低需要106级的SCC肿瘤细胞降至105级.
3）通过多种细胞表面抗原标记筛选和流式细胞仪分选（FACS Sorting）分离出高纯度CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群，移植人性化裸鼠皮下建立肿瘤干细胞动物模型，最低可以100个SCC肿瘤干细胞致瘤。此方法采用四种CD表面抗原的阴性筛选，可极大纯化SCC肿瘤干细胞群，尽有可能的去除肿瘤组织中各种肿瘤间质细胞，流式细胞仪分析结果显示99-100%细胞为皮肤鳞状上皮细胞（图1C）。此高纯度的人SCC肿瘤干细胞群在本专利的裸鼠致瘤模型中致瘤率高出SCC肿瘤细胞339倍。此模型使研究CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞生物学特性及信号传导通路成为可能，并提供靶向性药物筛选治疗人原发性SCC肿瘤干细胞的体内实验的模型，对进一步研发靶向性治疗人SCC肿瘤干细胞奠定了基础。
附图说明
图1：流式细胞仪分选（FACSSorting）与多种细胞表面抗原标记鉴定和分离高纯度CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群，其中图A：.流式细胞仪分选（FACSSorting）方法二维位图示意图，红色方框显示分选细胞为CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+，左边为同型PE荧光阴性对照；图B.流式细胞仪分选后CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群的纯度检测结果图，二维位图显示CD133阳性细胞纯度为94.8%。X轴为CD24-FITC荧光，Y轴为CD133-PE荧光；图C.用细胞角蛋白（潘）抗体（识别所有的基本的细胞角蛋白的抗体鸡尾酒组合）标记的CD133+和CD133-细胞，流式细胞仪分析显示99-100%的CD133+细胞为潘抗体阳性，说明流式细胞仪分选后CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群为鳞状上皮细胞单一群体。左部图为细胞分门为CD133+(上，白色方框)和CD133-(下，白色方框)，X轴为CD24-APC/Cy7;右部图细胞来自CD133+分门细胞（左部图上方白色方框，）X轴为潘抗体(PAN)Y轴为CD133-PE，左边白色方框为潘抗体阴性细胞分门，右边白色方框为潘抗体阳性细胞分门；
图2：辐照NIH3T3饲养层细胞上进行无血清CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+干细胞培养.左上图为人正常角质上皮细胞在NIH3T3饲养层细胞上培养，只形成单层细胞群;左下图为人皮肤鳞状上皮细胞癌CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+干细胞在NIH3T3饲养层细胞上无血清培养，形成肿瘤干细胞球（Sphere）;右边上下二图分别为左下图里上、下方框的肿瘤干细胞球的放大图；
图3：体外肿瘤干细胞球形成和裸鼠体内移植瘤试验检验显示此CD133+肿瘤干细胞亚群具有肿瘤干细胞样特性，人皮肤鳞状上皮细胞癌在本专利裸鼠模型的致瘤率为67%（106移植细胞数）至33%（105移植细胞数），而人皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞在本专利裸鼠模型的致瘤率为100%（106-105移植细胞数），66.7%（104-103移植细胞数）和33%（100移植细胞数）。A.人皮肤鳞状上皮细胞癌细胞（蓝色条柱）的肿瘤干细胞球形成个数显著低于CD133阳性肿瘤干细胞（绿色条柱）的肿瘤干细胞球形成个数。B.CD133+肿瘤干细胞（蓝色条柱）裸鼠致瘤率显著高于皮肤鳞状上皮细胞癌总体肿瘤细胞（绿色条柱）。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明。
收集新鲜临床病人皮肤鳞状上皮细胞癌样本，立即用手术刀和剪刀尽量切碎肿瘤成1-2mm2的碎块，并在200Unit/ml胶原酶III和50U/ml分离酶中以37℃孵育30分钟,用GentleMACS组织分离器(Miltenyi-Biotec公司)D程序以进一步分离组织,常温下300g离心5分钟,弃去上清液,沉淀下的组织细胞团块继续用5ml0.05%胰蛋白酶在37℃消化5分钟,并用40μm的细胞过滤网以除去组织残存,过滤分离成单细胞悬液。
肿瘤单细胞悬液在4℃下300g离心10分钟，弃去上清液，用FACS液（含有5%FBS的PBS液）洗一次，复悬于FACS液中。加入10μg/ml浓度的多种细胞表面抗原CD133/1(AC133)-PE(Miltenyi-Biotec公司),CD24-FITC(Biolegend公司),CD31-PE/Cy7(Biolegend公司),CD61-APC(Invitrogen公司),和CD45-APC/Cy7(Biolegend公司)以及Fc受体阻断剂(Miltenyi-Biotec公司)以阻断非特异性结合。
在4℃孵育1小时，加入1mlFACS液洗涤一次，4℃下300g离心10分钟，弃去上清液，复悬于FACS液及加入7AAD以用于流式细胞仪分选（FACSSorting。）用BD公司的FACSAria-II流式细胞分选仪分选，首先选出7AAD阴性细胞为活细胞群，再由此分选出（gating）CD31-CD24-细胞，第三步从CD31-CD24-细胞中再分选出（gating）CD45-CD61-细胞，最后从CD31-CD24-CD45-CD61-细胞中分选出CD133+和CD133-的细胞，以此成功分离出了CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群（图1）。
肿瘤干细胞群进一步在辐照处理的NIH3T3饲养层细胞上进行无血清干细胞培养,干细胞活性检测以及裸鼠体内移植瘤试验、体外肿瘤干细胞球形成等检验显示此CD133+肿瘤干细胞亚群具有肿瘤干细胞样特性（图2，3）。
在移植人皮肤原发性SCC裸鼠致瘤模型的建立中，首先人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境：在移植SCC细胞前14天，在裸鼠皮下埋入可溶性泡沫凝胶（0.5cm×0.5cm，×2）,并在可溶性泡沫凝胶中注射基质胶（Matrigel）100ul,再悬混有1x106人原代成纤维细胞和1x106人原代内皮细胞。闭合创口，正常饲养两周以形成利于移植人皮肤原发性SCC细胞的微环境。两周后在相同部位注射悬混有人SCC肿瘤细胞（从106至102），1x106人原代成纤维细胞和1x106人原代内皮细胞的基质胶混合液。11周后可根据肿瘤的形成和大小收获肿瘤。此方法最低所需人SCC肿瘤细胞为105（图3B,绿色条柱）。
用多种细胞表面标志物标记人皮肤原发性SCC肿瘤细胞，用流式细胞仪分选（FACSSorting）分离出CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群。此方法采用表面抗原的阴性筛选，可极大纯化SCC肿瘤干细胞群，尽有可能的去除肿瘤组织中各种肿瘤间质细胞，流式细胞仪分析结果显示99-100%细胞为皮肤鳞状上皮细胞（图1C）。此高纯度的人SCC肿瘤干细胞群在本专利的裸鼠致瘤模型中致瘤率高出SCC肿瘤细胞339倍。
注射肿瘤细胞时，一并注射1x106人原代成纤维细胞和1x106人原代内皮细胞的基质胶（Matrigel）混合液。此步骤可进一步强化该部位人性化SCC致瘤的微环境。单独注射1x106人原代成纤维细胞虽然能106人SCC肿瘤细胞致瘤，但是却不能使高纯度人SCC肿瘤干细胞群在裸鼠体内生成肿瘤，即使用106细胞数亦为0致瘤率。
Claims (3)
1.一种人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法，包括：
步骤一，将收集的临床病例皮肤鳞状细胞癌组织制成单细胞悬液，并用多种细胞表面标志物标记肿瘤细胞；
步骤二，将肿瘤细胞进一步和1x106人原代成纤维细胞，1x106人原代内皮细胞悬混在基质胶中；
步骤三，将步骤二中的悬混液注射至经人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境中。
2.根据权利要求1所述的人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法，其特征在于：步骤一执行完毕后，从肿瘤细胞中分离出CD31-CD24-CD45-CD61-CD133+肿瘤干细胞群，并将该肝细胞群用于执行步骤二和步骤三。
3.根据权利要求1或2所述的人原发性皮肤鳞状上皮细胞癌肿瘤干细胞的动物模型建立方法，其特征在于：所述人性化裸鼠皮下致瘤部位的微环境的建立方法,包括：
在移植SCC细胞前14天，在裸鼠皮下埋入可溶性泡沫凝胶（0.5×0.5cm,×2）,并在可溶性泡沫凝胶中注射基质胶（Matrigel）100ul,其中悬混有1x106人原代成纤维细胞和1x106人原代内皮细胞,闭合创口，正常饲养两周以形成利于移植人皮肤原发性SCC细胞的微环境。
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