MXPA05002192A - Seleccion y aislamiento de celulas vivientes utilizando soluciones de ensayo para union con arnm. - Google Patents

Seleccion y aislamiento de celulas vivientes utilizando soluciones de ensayo para union con arnm.

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Abstract

La invencion se dirige a la deteccion confiable y eficaz de ARNm asi como tambien otros ARN en celulas vivientes y su uso para identificar y, si se desea, celulas separadas con base en sus caracteristicas deseadas. Estos metodos simplifican y reducen bastante el tiempo necesario para llevar a cabo los procedimientos conocidos anteriormente, y tambien ofrece procedimientos novedosos, tales como por ejemplo, seleccionar las celulas que generen una proteina particular o oligonucleotido antisentido, generar lineas celulares que expresen multiples proteinas, generar lineas celulares que inactiven a una o mas proteinas, y otros.

Description

SELECCIÓN Y AISLAMIENTO DE CÉLULAS VIVIENTES UTILIZANDO SOLUCIONES DE ENSAYO PARA UNIÓN CON ARNm ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una radiobaliza molecular es una solución de ensayo de ácido nucleico que reconoce y reporta la presencia de una secuencia especifica de ácido nucleico. Las soluciones de ensayo son secuencias con forma de horquilla con un trecho central de nucleótidos complementarios a la secuencia blanco, y términos que comprenden secuencias cortas mutuamente complementarias. Un término se une covalentemente a un fluoróforo y el otro a una entidad de inactivación. Cuando en su estado natural con los términos hibridados, la proximidad del fluoróforo y el inactivador es tal que no se produce ninguna fluorescencia. La radiobaliza experimenta un cambio conformacional fluorogénico espontáneo cuando se hibriza a su ácido nucleico blanco. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 5,925,517. Esta propiedad ha permitido que los investigadores detecten ácidos nucleicos específicos principalmente en las reacciones in vitro y en algunos casos incluso en células vivientes. La visuali zación in situ del ARN mensajero se ha alcanzado utilizando radiobalizas moleculares suministradas a células vivientes en liposomas (Matsuo, 1998, Biochim. Biophys . Acta 1379: 178-184) . Los estudios que involucran células a la fecha han empleado radiobalizas generadas con EDANS fluoróforo muy débil a medida que esto era lo único conocido para ser inactivado por el inactivador EDAC. Los resultados aunque apreciables son escasamente asi y la aplicabilidad de esta linea de investigación para la detección in vivo no fue prometedora.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención se dirige a un método para generar una linea celular que exprese al menos una proteina preseleccionada que comprende los pasos de: a) transfectar una linea celular con al menos una estructura de ADN que codifica para al menos una proteina preseleccionada y al menos un marcador resistente a fármacos; b) seleccionar células resistentes a un fármaco a las cuales el marcador confiere resistencia, las células que transcriben al menos un marcador resistente a fármacos; c) exponer las células seleccionadas a una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para una transcripción de ARN de al menos una proteina preseleccionada; d) aislar las células que experimentan fluorescencia; e) generar una linea celular que expresa al menos una proteina preseleccionada al hacer crecer las células aisladas. El método mencionado anteriormente se puede llevar a cabo utilizando tecnología clasificadora de células activadas por fluorescencia. En un aspecto adicional, se puede hacer que la línea celular exprese una segunda proteína preseleccionada llevando a cabo pasos adicionales entre los que se incluyen, transfectar la línea celular con una segunda estructura de ADN que codifica para una segunda proteína preseleccionada y un segundo marcador de resistencia a fármacos; seleccionar las células que expresen el segundo marcador; exponer las células a una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para una transcripción de ARN de la segunda proteína preseleccionada y las aislamiento de células que exhiben fluorescencia cada una de al menos uno y la segunda transcripción de ARNm. Las líneas celulares que expresan más de dos proteínas se pueden proporcionar repitiendo los pasos. El método para introducir la segunda proteína se puede realizar simultánea o secuencialmente . Sí el primero y segundo marcadores de resistencia a fármacos son los mismos, la selección simultánea se puede alcanzar al aumentar el nivel del fármaco. En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para generar una línea celular que expresa al menos una proteína pre s eleccionada que comprende los pasos de: a) transfectar una línea celular con al menos una estructura de ADN que codifica para al menos una proteína preseleccionada, al menos un marcador de resistencia a fármacos y al menos una primera marca de epítopes; b) seleccionar células resistentes a un fármaco a las cuales el marcador confiere resistencia, las células transcriben al menos un marcador de resistencia a fármacos c) exponer las células a una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con la transcripción de ARN de la primera marca de epítopes; d) aislar las células que experimentan fluorescencia; y e) generar una linea celular que expresa al menos una proteina preseleccionada al hacer crecer las células aisladas. El método mencionado anteriormente se puede llevar a cabo utilizando una tecnología clasificadora de células activadas por fluorescencia. La porción de ADN de la estructura que codifica para la marca de epitopes puede estar dentro de un marco o fuera de un marco con la porción de la estructura de ADN que codifica para al menos una proteina. En una modalidad adicional, se puede hacer que la linea celular exprese al menos una segunda proteina preseleccionada; los pasos además incluyen transfectar la linea celular con una segunda estructura de ADN que codifica para la segunda proteina preseleccionada, un segundo marcador de resistencia a fármacos y una segunda marca de epitopes, seleccionando células que transcriben el segundo marcador; exponiendo las células a una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con la transcripción de ARN de la segunda marca de epitopes, y aislar las células que exhiben la fluorescencia de cada una de la primera y la segunda marca de epitopes. En el caso de dos proteínas, la porción de la secuencia de ADN que codifica para la segunda marca de epitopes también puede estar dentro del marco o fuera del marco con la porción de la secuencia de ADN que codifica para la segunda proteína. La segunda proteína preseleccionada se puede transfectar simultánea o secuencialmente con la primera. El método se debe realizar simultáneamente, y el mismo marcador de resistencia a fármacos utilizado para ambas estructuras, se puede utilizar un nivel superior de fármacos para seleccionar células que expresan ambas estructuras. Además, se pueden proporcionar más de dos proteínas en la línea celular repitiendo los pasos mencionados anteriormente . Todavía en un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un método para generar una línea celular que expresa al menos molécula de ARN antisentido preseleccionada que comprende los pasos de: a) transfectar una línea celular con una estructura de ADN que codifica para al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada y al menos un gen de resistencia a fármacos; b) seleccionar células resistentes a un fármaco a las cuales el marcador confiere resistencia, las células transcriben al menos un marcador de resistencia a fármacos c) exponer las células a una radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación a la molécula de ARN antisentido; d) aislar las células que experimentan fluorescencia; y e) generar una linea celular que expresa la secuencia de ARN antisentido preseleccionada al hacer crecer las células aisladas. El aislamiento de las células que experimentan fluorescencia se puede llevar a cabo utilizando tecnología clasificadora de células activadas por fluorescencia. Se puede hacer que la línea celular exprese al menos una segunda molécula de ARN antiser.tido preseleccionada, los pasos incluyen además transfectar simultánea o secuencí alment e la línea celular con una segunda estructura de ADN que codifica para una segunda molécula de ARN antisentido preseleccionada y un segundo marcador de resistencia a fármacos; seleccionar la célula que expresa el segundo marcador; exponer las células a una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación a la segunda molécula de ARN antisentido; y aislar las células que exhiben fluorescencia de cada una de al menos una y las segundas transcripciones de ARNm . Si el método se realiza simultáneamente y se utiliza el mismo marcador de resistencia a fármacos en ambas estructuras, se puede alcanzar la selección utilizando un nivel superior de fármacos. Se pueden proporcionar más de dos moléculas de ARN antisentido repitiendo los pasos mencionados anteriormente con otra estructura. Todavía en otro aspecto de la invención, se proporciona un método para generar una línea celular que expresa al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada que comprende los pasos de: a) transfectar una línea celular con una estructura de ADN que codifica para al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada, al menos un marcador de resistencia a fármacos y una primera secuencia de nucleótidos con marca de epítopes; b) seleccionar células resistentes a un fármaco a las cuales el marcador confiere resistencia, las células que transcriben al menos un marcador de resistencia a fármacos; c) ) exponer las células seleccionadas a una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para una t anscripción de ARNm de la primera marca de epitopes; d) aislar las células que experimentan fluorescencia; y e) generar una linea celular que expresa al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada al hacer crecer las células aisladas. Se puede hacer que la linea celular exprese al menos un segundo ARN antisentido marcado con epitopes preseleccionado , los pasos además incluyen transfectar la linea celular con una segunda estructura de ADN que codifica para una segunda molécula de ARN antisentido marcada con epitopes preseleccionada, un segundo marcador de resistencia a fármacos; selección celular que expresa el segundo marcador; exponer las células a una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para una transcripción de ARN de la segunda marca de epitopes; y aislar las células que exhiben la fluorescencia de ambos al menos una y las segundas transcripciones de ARNm. Estos pasos se pueden llevar a cabo simultánea o secuencialmente con el primero. La selección utilizando transfección simultánea con ambas construcciones que tengan el mismo marcador de resistencia a fármacos alcanzado al utilizar un nivel superior a fármacos. Se pueden llevar a cabo pasos adicionales para introducir más de dos moléculas antisentido marcadas con epitopes. Los métodos anteriores se pueden utilizar para preparar células que expresan moléculas de ARN antisentido o cualquier otro tipo de molécula de ARN, incluyendo de manera enunciativa: ARN estructurales, entre los que se incluyen ARNr, asi como también, ARNhn y ARNsn. Además, se debe observar que todos los métodos en los cuales se proporciona una marca de epitopes para detección por una radiobaliza molecular de la estructura transfectada, no tiene importancia si la marca de epitopes está dentro del marco o fuera del marco con la proteina codificada, siempre y cuando la secuencia de marca con epitopes es perceptible por la radiobaliza molecular. Todavía en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para aislar células que expresan al menos una proteína o ARN que comprende los pasos de: a) proporcionar células sospechosas de expresar al menos una proteína; b) exponer las células a al menos una radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con una transcripción de ARNm que codifica al menos una proteina; c) aislar las células que experimentan fluorescencia. La tecnología clasificadora de células activadas por fluorescencia se puede utilizar para aislar las células que experimentan fluorescencia. La proteína puede ser, a manera de ejemplo no limitante, una proteína localizada en la superficie celular o una proteína intracelular . También se puede detectar cualquier otro ARN . ?1 método también se puede utilizar para identificar células que también expresan una segunda proteína o ARN, utilizando una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con su ARN blanco se expone a células, las células que tienen fluorescencia de cada una de la primera y segunda radiobalizas moleculares se aislan. También se puede alcanzar la expresión simultánea de más de dos proteínas.
La presente invención también se dirige a un método para cuantificar el nivel de al menos una expresión de transcripción de ARN en una muestra biológica que comprende los pasos de: a) exponer la muestra biológica a una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con la transcripción de ARN; b) cuantificar el nivel de fluorescencia en 7 la muestra biológica; y c) correlacionar el nivel de fluorescencia con el nivel de al menos una transcripción de ARN. La muestra biológica puede ser una muestra celular o una muestra de tejido. La muestra se puede fijar. La transcripción de ARN puede ser, aunque no se limita a, ARN que codifica para una proteína, un ARN estructural, o un ARN antisentido. La fluorescencia se puede cuantificar mediante microscopía de fluorescencia o tecnología clasificadora de células activadas por fluorescencia. El nivel de al menos una segunda expxesión de transcripción de ARN también se puede cuantificar en la muestra biológica utilizando una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación a la segunda transcripción de ARN. Todavía en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para generar una línea celular que sobre-expresa al menos una proteína que comprende los pasos de: a) transfectar células con al menos dos secuencias de ADN, una secuencia que tiene una porción que codifica para la proteína, al menos una marca de epítopes, y al menos un marcador de resistencia a fármacos; y una segunda secuencia que tiene una porción que codifica para la proteína, al menos una segunda marca de epítopes, y al menos un segundo marcador de resistencia a fármacos; b) seleccionar células t ansfect adas con al menos dos secuencias de ADN mediante la expresión del primero y el segundo marcadores de resistencia a fármaco s ; c) exponer las células seleccionadas a un primera y una segunda radiobaliza molecular, cada una que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para las secuencias nucleotídicas de transcripciones de ARN de la primera y la segunda marca de epítopes respectivamente; d) aislar las células que exhiben fluorescencia de cada una de la primera y segunda radiobalizas moleculares; y e) generar una linea celular que sobre-expresa al menos una proteina preseleccionada al hacer crecer las células aisladas. En el aspecto anterior de la invención, al menos dos secuencias de ADN pueden residir en la misma estructura. La primera y la segunda marcas de epitopes cada una puede estar independientemente dentro del marco o fuera del marco con la proteina. Se puede utilizar FACS para aislar las células que expresan ambas construcciones al aislar las células que expresan la fluorescencia más fuerte. Al igual que con los métodos anteriores descritos en la presente, la transfección se puede realizar simultánea o secuencialmente . La selección cuando el mismo marcador de resistencia a fármacos está presente en ambas estructuras y la transfección simultánea se realiza se puede alcanzar aumentando el nivel del fármaco. En un aspecto adicional, se proporciona un método para generar una linea celular que sobre-exprese al menos una molécula de ARN antisentido que comprende los pasos de: a) transfectar células con al menos dos secuencias de ADN, una secuencia que tiene una porción que codifica para la proteína, al menos una marca de epítopes, y al menos un marcador de resistencia a fármacos; y una segunda secuencia que tiene una porción que codifica para la proteina, al menos una segunda marca de epítopes, y al menos un segundo marcador de resistencia a fármacos; b) seleccionar células t ransf ec adas con al menos dos secuencias de ADN mediante la expresión del primero y segundo marcadores de resistencia a fármaco s ; c) exponer las células seleccionadas a una primera y una segunda radiobaliza molecular, cada una experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para las secuencias nucleotidicas de transcripciones de ARN de la primera y la segunda marca de epítopes respectivamente; d) aislar las células que exhiben fluorescencia de cada una de la primera y segunda radiobalizas moleculares; y e) generar una línea celular que sobre-expresa al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada al hacer crecer las células aisladas .
Al menos dos secuencias de ADN pueden residir en la misma estructura. La primera y la segunda marcas de epitopes cada una independientemente puede estar dentro del marco o fuera del marco con la molécula de ARN antisentido. Las condiciones y métodos alternativos para alcanzar el producto deseado son como se observó anteriormente. Además, se puede proporcionar cualquier forma de ARN. En otro aspecto de la invención, se proporciona un método para generar células funcionalmente nulas para la expresión de al menos una proteina preseleccionada o ARNr que comprende los pasos de proporcionar en las células una pluralidad de ARN antisentido a la proteina preseleccionada o ARN, en donde la pluralidad de ARN antisentido a al menos una proteina · preseleccionada o ARN une esencialmente todas las transcripciones de ARN del ARNm u otro ARN que será eliminado. En caso de producir células nulas para una proteina preseleccionada, la proteina preseleccionada puede ser específicamente sólo una o un subconjunto de formas empalmadas alternativamente de un producto génico . En un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método generar un animal transgénico que es un mutante de expresión funcionalment e nula de al menos una proteína preseleccionada que comprende llevar a cabo los pasos como se describió anteriormente al utilizar hemocitoblast os embrionarios, determinando la viabilidad de los hemocitoblastos funcionalment e nulos que expresan la proteína preseleccionada, y utilizando los hemocitoblastos embrionarios viables para producir el animal transgénico. Además, un método para generar una línea celular que es funcionalmente nula al expresar al menos una proteína y sobre-expresar al menos otra proteína que comprende llevar a cabo los métodos descritos en la presente en las mismas células. Además, se proporciona un método para generar una línea celular que expresa un ARN antisentido letal bajo el control de un promotor inducible al llevar a cabo los métodos anteriores en donde el paso (a) se realiza en presencia de una cantidad mínima de un inductor. Un método para identificar eventos de re combi na c i ón genética en células vivientes comprende los pasos de : a) exponer una célula a una radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con una secuencia de ARN seleccionada del grupo que consiste de esa transcripción proveniente de una secuencia recombinada y esa transcripción de la secuencia no recombinada; b) detectar u ordenar las células. La detección y/u ordenamiento de las células se puede realizar mediante FACS o microscopio. En otro aspecto, la presente invención se dirige a una solución de ensayo para hibridación unitaria que genera actividad proteolít ica , en la presente se denomina como una proteasa de la solución de ensayo. Estas proteasas de solución de ensayo funcionan de una forma similar a una radiobaliza molecular, aunque en lugar de un cambio en la fluorescencia en la interacción de la radiobaliza con su secuencia de ácido nucleico blanco, la proteasa de la solución de ensayo se hace proteolitica en presencia del objetivo. La composición de proteasa de la solución de ensayo proporciona en un extremo de un oligonucleótido tipo radiobaliza molecular una proteasa, y en el otro, un inhibidor de proteasa complemen aria. Cuando el oligonucleótido no se híbrida a una secuencia blanco, la proximidad de los extremos del oligonucleótido permite que la proteasa y el inhibidor de proteasa actúen reciprocamente, inhibiendo la actividad proteolitica de la proteasa. Sin embargo, en la hibridación de la secuencia blanco del oligonucleót ido al objetivo, la proteasa y su inhibidor se separan, activando la proteasa. La actividad de la proteasa se puede medir fácilmente, y además, se puede emplear proteasa activa en presencia de una secuencia blanco de ácido nucleico particular no sólo para fines de detección sino que también para fines terapéuticos, en los cuales, por ejemplo, una célula en la cual se suministra la proteasa de solución de ensayo se proteoliza y se hace no viable si se transcribe un gen particular, por ejemplo, uno relacionado con la transformación celular, oncogenesis, disproliferación y lo semejante. La solución de ensayo mencionada anteriormente puede tener un inhibidor enzimático proteolitico que es un péptido u otra molécula capaz de inactivar reversiblemente la enzima. Los ejemplos no limitantes de enzimas e inhibidores incluyen aminopeptidasa y amastatina, cisteina proteasas similares a tripsina y antipaína, aminopeptidasa y bestatina, cisteina proteasas similares a quimiotripsina y quimiostatina , aminopeptidasa y diprotina A o B, carboxipept idasa A y EDTA, serina proteasas similares a elastasa y elastinal, y terraolisina o aminopeptidasa M y 1 , 10-fenantrolina . Éstos y otros aspectos de la invención se apreciarán a partir de la siguiente descripción detallada .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en la capacidad de las soluciones de ensayo moleculares para identificar las secuencias de ARN en células vivientes, y el uso de tecnología celular o relacionada clasificadora de fluorescencia para identificar y/o separar células que exhiben un cierto nivel o niveles de fluorescencia a una o más longitudes de onda. Actualmente se sabe que EDAC puede inactivar las emisiones de una variedad de fluoróforos utilizados normalmente más fuertes. La capacidad para detectar los ARNm confiable y eficazmente, así como también otros ARN en células vivientes permite su uso para identificar y, si se desea, las células se separan con base en sus características deseadas, por ejemplo al utilizar un Clasificador Celular Activado por Fluorescencia (FACS) . La solicitud proporciona muchos métodos que simplifican y reducen bastante el tiempo necesario para llevar a cabo los procedimientos conocidos anteriormente, y también ofrece procedimientos novedosos. Los estudios llevados a cabo hasta ahora que involucran radiobalizas y células vivientes no muestran una diferencia significativa sobre el control. El problema se elimina primero al utilizar fluoróforos más fuertes, y también al modificar las radiobalizas de tal forma que el número de nucleótidos que forman la porción de origen de la molécula de asa original son mayores que la longitud clásica de cinco o seis nucleótidos que se utiliza. Esto lo realiza más probablemente para que la molécula se mantenga en su asa de origen, el estado no fluorescente en ausencia de la secuencia blanco, reduciendo asi el respaldo. Es posible con la metodología descrita anteriormente generar lineas celulares transfectadas establemente que expresen ARN con diferentes funciones; es decir, algunas ni codifican para la proteina ni actúan como el ARN antisentido aunque las mismas se expresan no obstante por las células, otras que sirven como ARN mensajeros, y otras que son ARN antisentido a las dos clases ya listadas. Estos otros ARN incluyen ARN estructurales tales como por ejemplo, ARN ribosomales, ARNhn, ARNsn, etc. 1. Generación de lineas celulares que expresan proteínas. Algunos de los pasos más tediosos involucrados en la generación de lineas celulares se eliminan mediante la aplicación de radiobalizas moleculares según se describe en la presente. Después de la selección de fármacos de las células transfectadas con una estructura de ADN que codifica para un gen deseado, asi como también, la resistencia a fármacos, se introducen en estas células radiobalizas moleculares diseñadas para reconocer el mensaje del gen de interés. Aquellas células que transcriben el gen serán fluorescentes. El análisis FACS posterior dará por resultado en el aislamiento de las células fluorescentes que luego se hacen crecer para dar lugar a lineas celulares que expresan el gen de elección. Si la radiobaliza diseñada para reconocer un mensaje de interés es capaz de detectar endógenamente secuencias blanco existentes, la proporción de éstas en comparación con la proporción de la secuencia blanco producida por células transfectadas es tal que el clasificador es capaz de diferenciar los dos tipos celulares. Alternativamente, el problema de la fluorescencia endógena se elimina al marcar el gen de interés con una marca de epitopes y al diseñar la radiobaliza para que reconozca la secuencia nucleotidica que codifica para la marca. Estos nucleótidos o pueden ya sea estar en el marco con el mensaje del gen o fuera del marco con el mismo, dependiendo de la marca que se desee para la proteina producida . Adicionalraente, el nivel de expresión del gen de interés en cualquier célula determinada puede variar. FACS se aplica aquí para evaluar los niveles de expresión; se utiliza para seleccionar diferencialment e células individuales que expresan el mismo gen. 2. Generación de lineas celulares que expresan antisentido. Existen diversos estudios que describen la generación de líneas celulares que no expresan ARN que codifica para una proteína, sino más bien uno que es el antisentido de un gen o porción de un gen. Estos métodos se dirigen a la reducción de la cantidad de una proteína específica en una célula determinada. Los pasos descritos anteriormente para la generación de líneas celulares que expresan proteínas son igualmente aplicables aquí y virtualmente idénticos excepto que aquí la radiobaliza se diseña para detectar un ARN que es un ARN antisentido. No todos los esfuerzos para producir lineas celular que expresan antisentido transíectadas establemente dar por resultado en lineas celulares donde la expresión de la proteina blanco se afecta suficientemente. Esta dificultad ha hecho que valga menos la pena seguir con la producción de estas lineas celulares. Sin embargo, dada la facilidad del procedimien o descrito aquí, se analiza fácilmente la eficacia de muchas secuencias genéticas diferentes por su capacidad para producir líneas celulares que expresan antisentido activo. 3. Diferenciación entre células con base en antígenos localizados en la superficie celular Los inmunólogos y otros han utilizado FACS por mucho tiempo para clasificar células. De acuerdo con la presente invención, para detectar la presencia de proteína localizada en la superficie celular, se produce una radiobaliza, que tiene como su blanco el ARNm que codifica para la proteína de interés. La radiobaliza se introduce en las células mediante transfección y el clasificador celular luego se utiliza para aislar las células de marca positiva aisladas . Adicionalmente, FACS se utiliza actualmente para clasificar células con base en su expresión de hasta tres proteínas localizadas en la superficie celular. Esta característica de FACS se lleva a cabo mediante el uso de radiobalizas moleculares según se describe en la presente si se utiliza una combinación de radiobalizas, cada ARNm blanco de una de las proteínas de interés, y cada una marcada de manera diferente. Se realizan múltiples ciclos de clasificación para separar células con base en más de los tres ARN expresados. 4. Análisis de células para la expresión de ARN específicos y cuantificar el nivel de expresión de ARN en células Si el ARN blanco de una radiobaliza molecular que se introduce en una célula está presente, la célula será fluorescente. Esta información se puede evaluar cualitativamente mediante el uso de un Microscopio de Fluorescencia o FACS, y también se puede cuantificar mediante cualquiera de éstos. Por ejemplo, en lugar de realizar la reacción en cadena polimerasa transcripción inversa (RT-PCR) in situ en rodajas de tejidos para determinar un patrón de expresión para un ARN particular, se utiliza una radiobaliza para llevar a cabo el mismo experimento. Además, al utilizar una combinación de radiobalizas fluorescentes de manera diferente, cada uno se dirige a un ARN especifico, se analiza para la presencia o cantidad de diversos ARN de interés en un paso.
. Localización de antigenos en combinación con la detección de ARNs en células y tejidos Mediante la utilización de células fijas o rodajas de tejido, se utiliza inmunocitoquímica para describir la localización de los antigenos proteinicos reconocidos, y utilizando ARN específicos dirigidos a la Radiobaliza Molecular, se co-localizan en las mismas muestras los ARN de interés. Se ha mostrado que las Radiobalizas Moleculares dirigidas a ARN funcionan en células fijas. 6. Generación de lineas celulares que expresan proteínas múltiples Al utilizar los métodos de la presente invención, se generan muy rápidamente líneas celulares transfectadas establemente que expresan cualquier número de proteínas, incluso sin la necesidad de mantener estas células en presencia de una mezcla de muchos fármacos selectivos. Siguiendo la transfección génica y la selección de fármacos, una combinación de radiobalizas moleculares, una para cada mensaje proteinico, se introduce en las células. ?1 diseñar la secuencia ciclo de cada radiobaliza para hibridar al ARNm de sólo uno de los genes o a la secuencia nucleotidica de sólo una de las marcas de epitopes (véase anteriormente) con las cuales los mensajes pueden asociar, cada radiobaliza se diseña para reconocer el ARNm codificado únicamente por uno de los genes. Las células luego se clasifican mediante FACS . Al seleccionar una, dos, o todas las tres señales fluorescentes, se genera una variedad de lineas celulares en una aplicación individual. Se puede tener la necesidad de producir una linea celular que exprese más de tres ARN de interés. Por ejemplo, seria bastante informativo tener una linea celular en la cual se sobre-expresen todas las proteínas y secuencias de ARN que se piensa están involucradas en la formación de un complejo particular. Para alcanzar esto, se repiten los pasos descritos anteriormente utilizando células que ya expresan una combinación de ARN como las células hospederas en las cuales se podrían transfectar estructuras adicionales que codifican para los ARN adicionales . Si múltiples ARN que serán expresados se clonan todos en estructuras que confieren resistencia de las células al mismo fármaco, se utiliza FACS para aislar células que expresan todos los ARN deseados. Debido a que las secuencias se integran establemente en el genoma, las células no pierden la expresión de cualquiera de las secuencias. Sin embargo, es posible que se puedan perder una o más de las secuencias. Si éste es el caso, se aumenta la concentración del fármaco selectivo en el medio en el cual se desarrollan estas células, -haciendo esta posibilidad menos probable. Alternativamente, se utilizan construcciones cada una de las mismas confiere resistencia a un fármaco diferente, y mantiene las "células en una mezcla adecuada de fármacos. También, un subconjunto de las estructuras que serán transíectadas establemente en células se selecciona de tal forma que codifique para un gen de resistencia para un fármaco, y otro subconjunto para codificar para un gen de resistencia para otro fármaco . Además, si algunas células de una linea celular pierde un ARN de interés, entonces como un recurso, se realiza el primer experimento según se describió anteriormente para aislar la linea celular se repite y se obtienen células nuevas. Alternativamente, la mezcla de células descrita se analiza mediante FACS, con el objetivo de re-aislar células que expresen todos los ARN deseados. Éste es un procedimiento muy útil ya que proporciona nuevamente células que produce una linea celular con la misma preparación genética de la linea celular original seleccionada. Los procedimientos descritos anteriormente proporcionan un suministro ilimitado de células que expresan cualquier combinación de proteínas y secuencias de ARN, aceptables para métodos de análisis virtualmente ilimitados. Incluso es posible que una proteína que se sobre-expresa pueda ser tóxica para la célula, y como se analizará después, esta posibilidad se puede enfrentar fácilmente. Se debe observar que la facilidad con la cual es posible re-aislar células que expresen todos los ARN deseados de los clones de la línea celular donde la población de células incluye algunas células que ya no expresan todos los ARN hace posible mantener las líneas celulares sin presencia ningún fármaco o concentraciones mínimas de fármacos. 7. Generación de lineas celulares que sobre-expresan dramáticamen e una o más proteinas Para cada gen que esté bastante sobre-expresado, por ejemplo, primero se clonan dos o más secuencias para el mismo gen en estructuras de ADN que confieren resistencia a fármacos. Cada una de las secuencias múltiples para cada gen se diseña para que incluya la secuencia que codifica para una marca de epitopes diferente. Después de la transfección de las estructuras de ADN en células y la posterior selección de fármacos, las radiobalizas moleculares, cada una de las mismas se dirige sólo a una marca de epitopes y marcada fluorescentemente de manera diferencial, se introducen en las células y el clasificador celular se utiliza para aislar las células positivas por sus señales. Estas células han integrado en sus genomas al menos una copia de cada secuencia de epitopes marcada diferencialmente dirigida a genes, y de esta forma la expresión de la secuencia de interés se presenta a partir de un número aumentado de copias de esencialmente la misma secuencia de interés. Este método se utiliza junto con el uso de FACS para elegir aquellas células que se marcan más intensamente para la señal de cada fluoróforo. 8. Generación de lineas celulares que expresan múltiple ARN antisentido Las lineas celulares transfectadas establemente que producen múltiples mensajes antisentido se crean como sigue. Estos mensajes antisentido se dirigen ya sea a los ARN u otros ARN. Se seleccionan células que expresan diferentes niveles de cualquiera de las secuencias antisentido transfectadas. A través de ciclos repetidos de transfecciones estables, se seleccionan fácilmente células que podrían dar surgimiento a lineas celulares transfectadas establemente que expresan el mensaje antisentido de un número ilimitado de los ARN. Por supuesto, las células que expresan otros ARN distintos de los ARN antisentido se pueden preparar mediante los métodos descritos en la presente. Estos ARN incluyen de manera enunciativa: ARNm, ARNr , otros ARN estructurales, ARNhn , o ARNsn. 9. Generación de lineas celulares que son eliminaciones funcionales para una o más proteínas Los métodos de la presente invención proporcionan el medio para preparar eliminaciones funcionales en células cultivadas . Esto elimina la necesidad de intentar descifrar la función de las proteínas humanas al estudiar sus características de la eliminación en levadura o ratones. Se generan líneas celulares que son eliminaciones funcionales de cualquier proteína de interés al generar células que se expresan de múltiples sitios virtualmente al mismo ARN antisentido para una secuencia de ARN única. Por ejemplo, se transfecta establemente en estructuras de múltiples células cada una de las cuales podría codificar el ARN antisentido para un gen particular. Aquí cada secuencia de ARN antisentido sólo difiere en que cada una se podría marcar con la secuencia nucleotídica de una marca de epítopes única. Se seleccionan aquellas células que expresan todos los ARN antisentido marcados diferencialment e . Debido a que se utiliza FACS para cuantificar la fluorescencia como se describió anteriormente, esta característica permite seleccionar aquellas células que expresan más fuertemente cualquiera de una o más de las secuencias antisentido . De manera importante, se utilizan en este procedimiento diferentes secuencias antisentido para dirigirse al mismo gen. Por ejemplo, algunos de los ARN antisentido, la expresión del mismo se selecciona al utilizar radiobalizas moleculares y FACS, se diseñan para que se dirijan a una región particular del ARN mensajero para el gen, mientras que otros se diseñan de tal forma que se dirigen a una porción alternada del mismo mensajero. Con el fin de generar lineas celulares que sean eliminaciones funcionales de una proteina de interés, se transfectan establemente en células muchas secuencias genéticas que codifican para los ARN antisentido similar o diferentes al mismo gen de interés según sea necesario para la producción de una linea celular que no exhibe ningún nivel perceptible de expresión de la proteina de interés, o alternativamente, niveles de expresión aceptablemente bajos. Además, se generan lineas celulares en las cuales se eliminan funcionalment e múltiples proteínas al repetir el procedimiento descrito anteriormen e mientras que se dirige cualquier número de secuencias que se eliminarán funcionalment e por el antisentido. Por ejemplo, para estudiar la función de un complejo de proteínas, se eliminan todas o cualquiera de las combinaciones de las proteínas que constituyen el complej o .
. Generación de lineas celulares que son eliminaciones funcionales de únicamente las formas empalmadas alternativamente de uno o más genes Las versiones empalmadas dif erencialmente de un gen individual con frecuencia se traducen en proteínas con diferentes funciones. Utilizando los métodos de la presente invención, se generan líneas celulares que son eliminaciones funcionales de formas empalmadas sólo seleccionadas alternativamente de una o más proteínas. Por ejemplo, al diseñar el antisentido que podría dirigirse sólo a aquellas versiones empalmadas alternativamente del ARN mensajero del gen que se podría eliminar de la célula, se eliminan funcionalment e todos los ARN empalmados alternativamente del gen de interés excepto para aquellos mensajes empalmados alternativamente que son de interés. 11. Generación de lineas celulares que expresan una o más proteínas mientras se eliminan funcionalmente de una o más proteínas Con la metodología descrita anteriormente es posible generar líneas celulares transfectadas establemente que expresen los ARN con diferentes funciones; es decir, algunos de los cuales que ni codifican para la proteína ni actúan como el ARN antisentido pero que se expresan no obstante por las células, otros que sirven como ARN mensajeros, y otros que son ARN antisentido para las dos clases ya listadas. Éstos incluyen de manera enunciativa: ARN estructurales tales como por ejemplo, ARN ribosomal, ARNhn, ARN sn , y otros sin ARNm. Por ejemplo, para un grupo determinado de proteínas que se piensa actúan recíprocamente entre sí, se pueden estudiar sus interacciones al generar líneas celulares transí ectadas establemente en las cuales una o más de las proteínas de interés se eliminan funcionalmente mediante la expresión de la célula de los ARN antisentido. Luego se puede estudiar la función de las proteínas restantes de interés en la célula, aunque quizá de manera más interesante, tal como por ejemplo, una célula se podría alterar adicionalmente mediante la manipulación adicional de tal forma que ahora se sobre-expresen una o más de las proteínas restantes de interés. Este pensamiento se puede impulsar adicionalmente, permitiendo que se sobre-exprese o elimine la expresión de proteínas adicionales en células . Los métodos descritos anteriormente transforman la ciencia de las células mamíferas y otras células aceptables para mantenerse en cultivo de tejidos para permitir muchas manipulaciones genéticas nunca antes posibles. Por primera vez, es posible generar eliminaciones funcionales en células humanas, y para que también tengan estas proteínas de sobre-expresión. Nuevamente, es posible que la sobre-expresión de ciertas proteínas o una eliminación funcional de ciertas proteínas puede ser letal para las células. Éste es un problema que se enfrentará más adelante. 12. Generación de ratones transgénicos Para algunos fines, el estudio de células en cultivo no es suficiente. La metodología descrita anteriormente, sin embargo, también se puede prestar por sí mismo hacia la manipulación de hemocitoblastos embrionarios . Se pueden obtener hemocitoblastos embrionarios que podrían ya sea expresar múltiples proteínas o actuar como eliminaciones funcionales de múltiples proteínas o como un subconjunto de formas empalmados alternativamente de múltiples proteínas, etc., siguiendo los procedimientos anteriores. Luego se utilizan estos hemocitoblastos embrionarios como la base para la generación de animales inactivos. Utilizando estos procedimientos, se determina antes de realizar un intento para generar un animal inactivo si el experimento da por resultado en un fenotipo letal. Por ejemplo, si una proteína que es esencial se elimina funcionalment e en hemocitoblastos embrionarios, entonces estas células pueden no sobrevivir después de su aislamiento mediante el FACS . 13. Generación de lineas celulares transfectadas establemente inducibles La sobre-expresión o la falta de expresión de ciertas proteínas o ARN en células pueden ser letal. Todavía puede ser de importancia decisiva estudiar una célula que sobre-expresa una proteína tóxica o ARN, o una que sea una eliminación funcional de una proteína o ARN sin que la célula sea incapaz de sobrevivir. Para este fin, se generan células transfectadas establemente, donde los ARN seleccionados tienen estos efectos perj diciales en la célula, que están bajo el control de promotores inducibles. Para aislar estas líneas celulares, las células transfectadas y seleccionadas por fármacos se inducen primero mínimamente para afectar la transcripción de los genes inducibles, y las células luego se someten a análisis de FACS después de la transfección en las radiobalizas moleculares diseñadas para reconocer los ARN adecuados. Las células obtenidas se mantienen de tal forma que los ARN tóxicos están sin inducir y sólo se transcriben cuando sea necesario. Los sistemas inducibles pueden ser ventajosos para aplicaciones distintas a la expresión de los ARN tóxicos. Por ejemplo, se induce la expresión de secuencias genéticas transfectadas establemente en células a un cierto punto durante el ciclo celular de una linea celular sincronizada. Alternativamente, si los productos expresados de un conjunto de una o más secuencias genéticas transfectadas establemente se piensa que actúan sobre los productos expresados de otro conjunto, luego es de interés clonar las secuencias genéticas del primer conjunto bajo el control de un promotor inducible, y aquellas del segundo conjunto bajo el control de un segundo promotor inducible. Mediante inducciones variadas, se estudian los productos expresados codificados por cualquier conjunto de secuencias genéticas en ya seas la ausencia o la presencia de los productos expresados del otro conjunto. 14. Detección de los eventos de recombinación genética en células vivientes y el aislamiento posterior de células no recombinadas o recombinadas diferencialmente Paralelo al uso de radiobalizas moleculares para detectar los eventos de recombinación que conducen a lineas celulares estables es el uso de radiobalizas para detectar y aislar de una mezcla de células vivientes aquellas células que han sufrido otros eventos de recombinación específicos. El mismo principio se puede utilizar para analizar la recombinación de VDJ, translocación y la integración del genoma viral, por e emplo . En los eventos de recombinación celular, por ejemplo, una secuencia de ADN genómico se intercambia para otra. Si una secuencia de ADN que codifica para una región donde un evento de recombinación ocurrido se transcribe en el ARN, entonces la presencia de este evento se detecta mediante una radiobaliza molecular diseñada para ya sea reconocer el ARN transcrito de la secuencia de ADN sin recombinar, o que se transcribe a partir de la secuencia recombinada. Este análisis también se lleva a cabo mediante el Microscopio Fluo escente. Si se deseara separar entre sí células que se han recombinado de aquellos que no, entonces las células se someten al FACS y se clasifican. Además, el FACS se utiliza para clasificar células con base en la presencia o ausencia en las mismas de muchos eventos de recombinació .
. Clasificación de células con base en los ARN expresados El uso de radiobalizas moleculares según se describe en la presente permite clasificar células con base en su expresión de proteínas localizadas internamente, asi como también las proteínas contra las cuales puede no ser capaz de generar anticuerpos. Por ejemplo, iniciando a partir de una población mezclada de células, se aislan aquellas células que expresan proteínas localizadas internamente de interés al diseñar radiobalizas moleculares que reconozcan los ARNm que dan surgimiento a estas proteínas. Estas radiobalizas moleculares se transfectan en la mezcla de células y se utiliza el FACS para clasificarlas según sea adecuado. Se pueden llevar a cabo ciclos múltiples de clasificación. Adicionalmente, un investigador puede estar interesado, por ejemplo, en aislar células que se inducen en el momento de la estimulación por una citocina que expresa el ARNm de una o más proteínas más específicas de aquellas que fracasan para ser inducidas semejantemente. Para este fin, primero se induce mediante la citocina · una mezcla de células, luego se transfectan con radiobalizas cada una de las cuales se diseña para reconocer el ARNm que darla lugar a una de las proteínas de interés. El FACS luego se utiliza para aislar aquellas células que marcan positivo para el ARNm de interés. En una modalidad alternativa, también se analizan células infectadas con un virus, por ejemplo, por su expresión de un gen particular. Con la metodología descrita anteriormente es posible detectar células positivas para la presencia de ARN con funciones diferentes; es decir, algunas que ni codifican para la proteína ni actúen como ARN antisentido pero que no obstante se expresen por células, otras que sirvan como los ARN mensajero, y otras que sean ARN antisentido para las dos clases ya listada. Éstas incluyen de manera enunciativa: ARNs estructurales tales como por ejemplo, ARN ribosomal, ARNhn, ARNsn, y otras sin ARNm. 16. Detección in vivo de ácidos nucleicos, en relación con la selección posterior de células Debido a que la química requerida está bien caracterizada, se pueden modificar las radiobalizas moleculares de muchas formas, proporcionando nuevas posibilidades. Por ejemplo, las células que expresan un ARNm específico la expresión que conduce a la transformación maligna de la célula se destruyen selectivamente, mientras que las células que no expresan este ARNm quedan más o menos sin afectar, según se describe más adelante. Se selecciona una radiobaliza molecular que consiste de un oligonucleót ido diseñado para reconocer e hibridarse a una secuencia específica de ácido nucleico contenido en un gen de interés que se transcribe en alguna de una mezcla de células. El oligonucleótido tiene unido covalent emente un extremo de una proteasa, y en su otro extremo una o más moléculas del inhibidor de la proteasa, por ejemplo ¦ un inhibidor peptídico. Obsérvese que es importante para el oligonucleótido utilizado para sintetizar esta radiobaliza que tenga extremos que se puedan hibridar entre sí, como es el caso con las radiobalizas moleculares. Siempre y cuando la molécula descrita proporcione su estructura de asa original, el inhibidor peptídico en un extremo de la molécula estará suficientemente cerca de la proteasa que está en el otro extremo para afectar la inhibición. Para facilidad de análisis, estas moléculas recién descritas se denominarán como Proteasas para Solución de Ensayo. En el momento de la transfección de las proteasas de la solución de ensayo en células que expresan el ARN que está reconocido por una Proteasa para Solución de Ensayo, la Proteasa para Solución de Ensayo híbrida a su objetivo. Esto provoca la activación de la proteasa al igual que en su estado hibridado, la proteasa ya no está en la vecindad de su inhibidor peptídico. Una célula en la cual el objetivo de esta Proteasa para Solución de Ensayo está presente y reconocida se daña y de esta forma se contra-selecciona. Adicionalmen e , las Proteasas para Solución de Ensayo son útiles en varias aplicaciones distintas. Por ejemplo, dada una mezcla de células en la cual algunas de las células se infectan por un virus particular, se introduce en las células una Proteasa para Solución de Ensayo que se dirige a un ARNm específicamente viral. Las células que portan este ARNm activan la actividad proteolítica de la Proteasa para Solución de Ensayo que contienen, y esto destruye estas células. Con la metodología descrita anteriormente es posible generar líneas celulares t ransfect adas establemente que expresan ARN con funciones diferentes; es decir, algunas que ni codifican para proteínas ni actúan como ARN antisentido pero que se que expresan no obstante por células, otras que sirven como los ARN mensajero, y otras que son los ARN antisentido para las dos clases ya listadas. Con base en la descripción anterior, se pueden llevar a cabo los siguientes métodos. Se proporciona un método para generar una linea celular que exprese al menos una proteina preseleccionada que comprende los pasos de: a) transfectar lineas celulares con al menos una estructura de ADN que codifica para al menos una proteina preseleccionada y al menos un marcador resistente a fármacos; b) seleccionar células resistentes a un fármaco a las cuales el marcador confiere resistencia, las células que transcriben al menos un marcador resistente a fármacos; c) exponer las células seleccionadas a una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para una transcripción de ARN de al menos una proteina preseleccionada; d) aislar las células que experimentan fluorescencia; e) generar una linea celular que expresa al menos una proteina preseleccionada al hacer crecer las células aisladas.. En este método, el aislamiento de las células que experimentan fluorescencia se puede llevar a cabo utilizando tecnología clasificadora de células activadas por fluorescencia. La línea celular puede preparar adicionalmente para que exprese una segunda proteína preseleccionada, en forma ya sea simultánea o secuencial, los pasos adicionales incluyen transfectar la línea celular con una segunda estructura de ADN que codifica para una segunda proteína preseleccionada y un marcador de resistencia a fármacos; al seleccionar células que expresan el segundo marcador; al exponer las células a una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para una transcripción de ARN de la segunda proteína preseleccionada y el aislamiento de células que exhiben fluorescencia de cada uno de al menos uno y las segundas transcripciones del ARNm. Hoy en día, la tecnología actual permite la detección de hasta tres fluoróforos diferentes durante un procedimiento de clasificación, el procedimiento anterior se puede repetir simultáneamente para obtener la expresión de hasta tres proteínas diferentes. Si se desea, entonces se puede utilizar una línea celular que exprese tres proteínas diferentes como el punto de partida para la introducción de más proteínas después del procedimiento. La estructura de ADN utilizada para la transfección puede codificar para un solo gen y un marcador de resistencia a fármacos, o para genes adicionales con marcadores correspondientes. La transfección exitosa de cada gen se puede alcanzar mediante la selección con el fármaco correspondiente. Como se observó anteriormente, si la introducción de genes adicionales se realiza simultánea o secuencialmente, el número de mensajes expresados perceptibles a la vez se puede limitar por la tecnología de fluorescencia, aungue el método se puede llevar a cabo repetidamente para introducir más genes. Si se pueden detectar hasta tres fluoróforos, se pueden introducir a la vez tres genes. Se expone un procedimiento relacionado en el cual una marca de epítopes asociada con el gen transfectado se utiliza como el objetivo para la radiobaliza molecular, al permitir la selección de células que expresan proteínas cuyos ARNm pueden ser difíciles de identificar sobre el fondo, por ejemplo, si la radiobaliza molecular detecta una especies de ARN estrechamente relacionada. Por consiguiente, se proporciona un método para generar una línea celular que expresa al menos una proteína preseleccionada que comprende los pasos de: a) transfectar una linea celular con al menos una estructura de ADN que codifica para al menos una proteína preseleccionada; al menos un marcador resistente a fármacos y al menos una primera marca de epítopes; b) seleccionar células resistentes a un fármaco a las cuales el marcador confiere resistencia, las células que transcriben al menos una estructura de ADN y al menos un marcador resistente a fármaco s ; c) exponer las células seleccionadas a una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para una transcripción de ARN de la marca de epítopes; d) aislar las células que experimentan fluorescencia; e) generar una linea celular que expresa al menos una proteina preseleccionada al hacer crecer las células aisladas. Los métodos son esencialmente iguales a los descritos anteriormente, excepto que las radiobalizas moleculares que se utilizan se diseñan para reconocer la marca de epitopes en lugar de la transcripción de ARN de la proteína introducida deseada. Un beneficio de este procedimiento con respecto al anterior es que sólo un pequeño número de radiobalizas moleculares, que corresponden al número de diferentes marcas de epitopes, es necesario preparar muchas líneas celulares diferentes que expresan una o más proteínas. Al igual que la tecnología clasificadora de fluorescencia se limita ahora a tres fluoróforos, sólo tres radiobalizas diferentes son necesarias de este método. Debido a que la última tecnología permite detectar números aumentados de fluoróforos simultáneamente, esto puede aumentarse. Sin embargo, se pueden agregar hasta tres proteínas introducidas al mismo tiempo, luego se pueden utilizar las células transfectadas con éxito con los tres genes al igual que el punto de partida para la adición de genes adicionales .
Los ejemplos de marcas de epitopes que se pueden utilizar en la invención, y con los cuales se pueden preparar las radiobalizas incluyen de manera enunciativa: HA (proteina de influenza hemaglut inina ) , myc, his, proteina C, VSV-G, FLAG, o FLÜ . Se conocen por alguien con experiencia en la técnica éstas y otras marcas de epitopes. En el sentido en que se utiliza en la presente, la marca de epitopes proporciona una secuencia de ácido nucleico única para reconocimiento por una radiobaliza molecular. Ya sea que la secuencia de ácido nucleico esté o no dentro del marco o fuera del marco con la proteína codificada en una estructura no es decisivo; la radiobaliza molecular puede reconocer cualquiera. De esta forma, el ARN trascrito que porta la secuencia de ácido nucleico de la marca de epitopes no necesita ser traducido para la detección de la transcripción por la radiobaliza molecular. Por supuesto, el método anterior se puede utilizar para introducir más de una proteina en las células, los pasos adicionales realizados simultánea o secuencialmente entre los que se incluyen transfectar la línea celular con una segunda estructura de ADN que codifica para la segunda proteína preseleccionada, un segundo marcador de resistencia a fármacos y una segunda marca de epitopes, seleccionar las células que expresan el segundo marcador; exponer las células a una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con la transcripción de ARN de la segunda marca de epitopes, y aislar las células que exhiben fluorescencia de cada una de la primera y segunda marca de epitopes. La segunda marca de epitopes puede estar dentro del marco o fuera del marco con la porción de la secuencia de ADN que codifica para la segunda proteina. La selección de células t ans fec ada s con éxito se lleva a cabo mediante procedimientos estándar para hacer crecer células en presencia del fármaco contra el cual se proporciona el marcador de resistencia a fármacos. Si la selección es para dos diferentes marcadores, éstos se pueden seleccionar simultánea o secuencialmente . Si se utiliza el mismo marcador de resistencia a fármacos en dos diferentes estructuras transfectadas , puede ser necesario seleccionar para células transf ec adas un nivel superior de fármacos con las dos estructuras, para tomar en cuenta el efecto de la dosis. Los métodos anteriores para preparar lineas celulares que expresan una o más proteínas pueden ser tan sencillos como se aplica para la generación de lineas celulares que expresan una o más moléculas de ARN antisentido. El método comprende: a) transfectar una linea celular con una estructura de ADN que codifica para al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada y al menos un gen de resistencia a fármacos; b) seleccionar células resistentes a un fármaco para las cuales el marcador confiere resistencia, las células transcriben al menos una estructura de ADN y al menos un marcador de resistencia a fármacos; c) exponer las células a una radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para la molécula de ARN antisentido ; d) aislar las células que experimentan fluorescencia; y e) generar una linea celular que expresa la secuencia de ARN antisentido preseleccionada al hacer crecer las células aisladas. Todos detallan de estos métodos son como se describieron anteriormente. En el caso donde una radiobaliza no puede detectar el ARNm particular, se puede utilizar el método para marca de epítopes, a saber : a) transfectar una linea celular con una estructura de ADN que codifica para al menos la molécula de ARN antisentido preseleccionada, al menos un marcador de resistencia a fármacos y una primera secuencia nucleotidica con marca de epítopes; b) seleccionar células resistentes a fármacos para las cuales el marcador confiere resistencia, las células transcriben al menos una estructura de ADN y al menos un marcador de resistencia a fármacos; d) exponiendo las células seleccionadas a una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para una transcripción de ARNm de la primera marca de epítopes; d) aislar las células que experimentan fluorescencia; y e) generar una línea celular que expresa al menos la molécula de ARN antisentido preseleccionada al hacer crecer las células aisladas. Como se observó anteriormente, la ventaja del método para detección de la marca de epítopes es que no se tiene que realizar la separación de radiobalizas para cada ARN antisentido; son necesarias radiobalizas para sólo unas cuantas marcas de epitopes, que se pueden utilizar en los pasos sucesivos para introducir muchas moléculas antisentido, o la sobre-expresión de una molécula en una linea celular. Naturalmente, los métodos anteriores se pueden repetir para introducir simultánea o consecutivamente dos o a más moléculas de ARN antisentido en una linea celular determinada. Además, las células producidas para expresar una proteina o proteínas particulares se pueden utilizar como el punto de partida para crear células que expresen proteínas y moléculas de ARN antisentido. Por supuesto, las células que expresan las moléculas antisentido se pueden utilizar como el punto de partida para agregar proteínas expresadas, utilizando los métodos de la presente. También se puede realizar la transfección simultánea de proteínas y moléculas antisentido, con las radiobalizas correspondientes y, si se desea, marcas de epitopes. En la presente se abarcan las diversas combinaciones de los p ocedimientos mencionados. Asimismo, se proporcionan los métodos para aislar células que expresan al menos una proteína que comprende los pasos de: a) proporcionar células sospechosas de expresar al menos una proteína; b) exponer las células a al menos una radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con una transcripción ARNm que codifica para al menos una proteína; c) aislar las célula-s que experimentan fluorescencia. Estos métodos son particularmente útiles para las proteínas que son proteínas localizadas en la superficie celular o una proteína intracelula . Los mismos no requieren el uso de soluciones de ensayo para las proteínas mismas, que puede ser más difícil que afecten o afectarán la célula de tal forma que no se pueden realizar experimentos adicionales. Utilizando una pluralidad de radiobalizas moleculares se puede identificar más de una proteína, hasta el número simultáneamente perceptible por la tecnología utilizada para el aislamiento. Naturalmente, se pueden utilizar los procedimientos mencionados anteriormente para cuantificar el nivel de al menos una expresión de transcripción de ARN en una muestra biológica que comprende los pasos de: a) exponer la muestra biológica a una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con la transcripción de ARN; b) cuantificar el nivel de fluorescencia en la muestra biológica; y c) correlacionar el nivel de fluorescencia con el nivel de al menos una transcripción de ARNm. La muestra biológica puede ser una muestra celular o una muestra de tejido; éstas se pueden fijar, por ejemplo, con formaldehí do, glut araldehí do , o cualquier número de fijadores celulares conocidos que no interfieren con la detección de ARN utilizando radiobalizas moleculares. La trans ripción de ARN detectada puede ser ARN que codifica para una proteina, un ARN estructural, y un ARN antisentido. La fluorescencia se puede cuantificar mediante microscopía de fluorescencia o tecnología clasificadora de células activadas por fluorescencia. Las especies de ARN adicionales se pueden cuantificar simultáneamente utilizando una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para una segunda transcripción de ARN.
En otro uso de los métodos anteriores, se proporciona un método para generar una linea celular que sobre-exprese al menos una proteina. Esto se alcanza al transfectar células con dos o más secuencias que codifican para la misma proteina, al seleccionar e identificar la expresión a través de las marcas de epitopes asociadas con las copias por separado de la trans ripción. Los pasos incluyen: a) transfectar células con al menos dos secuencias de ADN, cada una de las secuencias tiene una porción que codifica para la proteina, al menos un marca de epitopes, y al menos un marcador de resistencia a fármacos; y una porción que codifica para la misma proteina, al menos una segunda marca de epitopes, y al menos un segundo marcador de resistencia a fármacos; b) seleccionar células transfectadas con al menos dos secuencias de ADN mediante la expresión del primero y segundo marcadores de resistencia a fármacos; c) exponer las células seleccionadas a una primera y una segunda radiobaliza molecular, cada una que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para las secuencias nucleot idicas de las transcripciones de ARN de la primera y segunda marca de epitopes respectivamente; d) aislar las células que exhiben fluorescencia de cada una de la primero y segunda radiobalizas moleculares; y e) generar linea celular que sobre-exprese al menos una proteina preseleccionada al hacer crecer las células aisladas. Como se observó anteriormente, si se utiliza el mismo marcador de resistencia a fármacos para cada copia del gen, puede ser necesario un nivel superior de fármacos para seleccionar células transfectadas con ambas secuencias. Al igual que en los métodos anteriores, al menos dos secuencias de ADN pueden residir en la misma estructura. La primera y segunda marcas de epitopes cada una puede estar independientemente dentro del marco o fuera del marco con la proteina. El procedimiento mencionado anteriormente se puede aplicar fácilmente para generar células que sobre-expresen al menos una molécula de ARN antisentido. El método comprende los pasos de: a) transfectar células con al menos dos secuencias de ADN, las secuencias cada una tiene una porción que codifica para la molécula de ARN antisentido, al menos un marca de epitopes, y al menos un marcador de resistencia a fármacos; y una porción que codifica para la molécula de ARN antisentido, al menos una segunda marca de epitopes, y al menos un segundo marcador de resistencia a fármacos ; b) seleccionar células transíectadas con al menos dos secuencias de ADN mediante la expresión del primero y segundo marcadores de resistencia a fármaco s ; c) exponer las células seleccionadas a una primera y una segunda radiobaliza molecular, cada una que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para las secuencias nucleot idicas de las transcripciones de ARN de la primer y segunda marcas de epitopes respectivamente; d) aislar las células que exhiben fluorescencia de cada una de la primera y segunda radiobalizas moleculares; y e) generar una linea celular que sobre-exprese al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada al hacer crecer las células aisladas. Los detalles son los mismos que aquellos descritos anteriormente.
La introducción de moléculas de ARN antisentido en células es útil para eliminar funcionalment e una o más proteínas de la célula. Siguiendo los métodos anteriores, se proporciona un método para generar células funcionalmente nulas para la expresión de al menos una proteína preseleccionada que comprende los pasos de proporcionar en las células una pluralidad de ARN antisentido para la proteína preseleccionada, cada una proporcionada de acuerdo con los métodos mencionados anteriormente, en donde la pluralidad de ARN antisentido para al menos una proteína preseleccionada une esencialmente todas las transcripciones de ARNm de al menos una proteína preseleccionada. La proteína preseleccionada se puede empalmar alternativamente para formar un producto génico. Siguiendo líneas similares, se proporciona un método para generar un animal transgénico que es un mutante de expresión funcionalment e nula de al menos una proteína preseleccionada que comprende llevar a cabo los pasos descritos anteriormente utilizando hemocit oblas tos embrionarios, que determinan la viabilidad de los hemocitoblas tos que expresan funcionalmente nula la proteína preseleccionada, y utilizando los hemocitoblastos embrionarios viables para producir el animal transgénico. Asimismo, se proporciona un método para generar una linea celular que es funcionalmente nula que expresa al menos una proteina y sobre-expresa otra proteina que comprende llevar a cabo los métodos de la presente en las mismas células. En forma similar, se proporciona un método para generar una linea celular que exprese un ARN antisentido letal bajo el control de un promotor inducible al llevar a cabo el método de la presente en donde el paso de transfección se realiza en presencia de una cantidad mínima de un inductor. Se proporciona un método en la presente para identificar los eventos de recombinación genética en células vivientes que comprende los pasos de: a) exponer una célula a una radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con una secuencia de ARN seleccionada del grupo que consiste de esa transcripción proveniente de una secuencia recombinada y que se transcribe a partir de la secuencia no recombinada; y b) detectar las células que expresan la secuencia de ARN.
La presente invención también se dirige a una forma novedosa de radiobaliza molecular que, en contraste con las propiedades fluorescentes exhibidas por las radiobalizas moleculares de la técnica anterior sobre la unión a sus ácidos nucleicos objetivo, exhiben actividad proteolitica en el momento de esta unión. Esta actividad proteolitica se puede utilizar para fines de detección, aunque también para degradar las secuencias proteinicas particulares en una célula si el ARNra que codifica la proteina debe estar presente en la célula. Por ejemplo, una proteasa que escinde específicamente una proteína viral puede activar la transcripción del virus activado, tal como por ejemplo, en una infección latente. De preferencia, el inhibidor enzimático proteolítico es un péptido, aunque también son útiles otras moléculas incluyendo metales y quelantes metálicos, para proporcionar una inhibición reversible de la enzima en el momento de la interacción con el inhibidor. Los ejemplos de pares útiles de enzimas prot eolíticas y los inhibidores de la enzima proteolitica incluyen de manera enunciativa: aminopeptidasa y amastatina, cisteína proteasas similares a tripsina y antipaína, aminopeptidasa y bestatina, cisteina proteasas similares a quimiotripsina y quimiostatina, aminopeptidasa y diprotina A o B, carboxipeptidasa A y EDTA, serina proteasas similares a elastasa y elastina, y termolisina o aminopeptidasa M y 1,10-fenantrolina. La presente invención se entenderá mejor haciendo referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes, los cuales se proporcionan como ejemplos de la invención. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar de manera más completa las modalidades preferidas de la invención. Sin embargo, los mismos de ninguna manera se deben interpretar como limitaciones del amplio alcance de la invención.
EJEMPLO 1 Protocolo General. Material de partida: Las Radiobalizas Moleculares se pueden introducir en células que no expresan ninguno de los ARN provenientes de plásmidos, o se pueden utilizar para detectar mensajes de ARN codificados provenientes de plásmidos. El método de introducción de las radiobalizas en cualquiera de estos dos tipos de células es idéntico. El siguiente protocolo sólo requiere que las células que serán analizadas se puedan separar entre si y son aceptables para análisis de FACS . 1) según se describió de manera más completa en la descripción de la invención, se pueden utilizar las radiobalizas junto con FACS para clasificar las células de un tejido con base en la expresión o falta de expresión dentro de las células de los ARN específicos. Con este fin, las células primero se deben separar entre sí mediante el estándar y métodos bien establecidos tales como por ejemplo, homogeneización y tratamiento químico adicional. Las radiobalizas adecuadas luego se pueden introducir en estas células de acuerdo con el siguiente protocolo. 2) En segundo lugar, se puede utilizar radiobalizas para seleccionar células que expresan ARN particulares codificados por plásmidos que se han transfectado en una población de células. Para este fin, primero se debe transfectar en un cultivo de células un plásmido o plásmidos que codifiquen para los ARN deseados. Luego se pueden generar radiobalizas para reconocer estos ARN, según se describió con mayor detalle en la descripción de la invención. La transfección de plásmidos en células se puede alcanzar a través de una inmensa variedad de métodos al utilizar cualquiera de los propios reactivos o equipos obtenidos de firmas biotecnológi cas (Qiagen, Promega, Geneporter, Invitrogen, Stratagene, etc.), siguiendo las instrucciones del fabricante. Los plásmidos se deben seleccionar de tal forma que cada uno confiera resistencia a un antibiótico. Después de estos plásmidos en las células y después de un breve periodo para la recuperación de las células (usualmente 24 horas), las células se podrían someter a antibióticos adecuados de tal forma que sólo aquellas células a las cuales los plásmidos han conferido resistencia antibiótica sobrevivirán. Esto generalmente toma de tres a cuatro días, dependiendo tanto del tipo de célula como del antibiótico utili zado . El resultado es que un grupo de células permanece y todas podrían ser resistentes a antibióticos, aunque sólo una pequeña fracción de las cuales expresan los ARN de interés. Para seleccionar las células que expresan los ARN deseados, se puede seguir el siguiente protocolo.
EJEMPLO 2 Selección de células que utilizan radiobalizas 1) Transfección de radiobalizas en células: Las radiobalizas se deben diseñar de tal forma que reconocerán el ARN deseado al hibridarse a una secuencia endógena en el ARN o al hibridarse a una marca que se agrega a la secuencia de ARN natural. El diseño de las radiobalizas se establece en la descripción de la invención. La transfección se puede llevar a cabo mediante una inmensa variedad de métodos, similares a la transfección de plásmidos en células . El método empleado se debe seleccionar con base en el tipo celular que se utilizará a medida que algunas células responden mejor a algunos métodos de transfección con respecto a otros métodos. La transfección se debe realizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante del reactivo de transfección utilizado. La transfección de radiobalizas en células se puede llevar a cabo en células en suspensión o en células que crecen en superficies de sólidas, dependiendo del reactivo de transfección utilizado. 2) Después de la transfección de radiobalizas en células, las células entonces se pueden someter a análisis FACS. El FACS se puede utilizar para clasificar células positivas para cualquiera de una o más de las radiobalizas utilizadas. También se puede utilizar para clasificar células con base en la intensidad de la señal de las radiobalizas, permitiendo con esto al investigador seleccionar células que expresen los ARN a diferentes grados.
EJEMPLO 3 Generación de lineas celulares que expresan uno o más ARN Después de la selección mediante FACS, las células con marca positiva se pueden mantener en medio adecuado como se describe con mayor detalle en la descripción de la invención. Estas células podrían dar lugar a lineas celulares que expresen los ARN de interés . Concentración de la radiobaliza: La concentración de la radiobaliza que será utilizada depende de diversos factores. Por ejemplo, se debe considerar la abundancia dentro de las células del ARN será detectado y la accesibilidad de este ARN a la radiobaliza. Por ejemplo, si el ARN que será detectado está presente en cantidades muy bajas o si se encuentra en una porción del ARN al que no se tiene fácil acceso con base en el plegado tridimensional del ARN, entonces se debe utilizar más radiobaliza aqui que en los casos donde el ARN será detectado en abundancia alta y donde el sitio reconocido por la radiobaliza es totalmente accesible. La cantidad exacta de radiobaliza que será utilizada tendrá que ser determinada empíricamente para cada aplicación. Esto se puede llevar a cabo al introducir diferentes cantidades de radiobalizas en diferentes grupos de células y al seleccionar la condición donde la fluorescencia de fondo es baja y donde la señal es alta (la condición donde no todas pero algunas de las células marcan positivo para la radiobaliza) .

Claims (45)

  1. REIVINDICAC IONE S 1. Un método para aislar células que expresan al un ARN, que comprende los pasos de: a) introducir en las células ADN que codifica para al menos un ARN; b) exponer las células a al menos una radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para al menos un ARN, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para el ARN y nucleótidos mutualmente complementarios; y c) aislar las células que experimentan fluorescencia.
  2. 2. Un método para aislar células que expresan al menos uno de dos o más ARN, que comprende los pasos de : a) introducir en las células un primer ADN que codifica para un primer ARN; b) introducir en las células un segundo ADN que codifica para al menos un segundo AR ; c) exponer las células a una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para el primer ARN, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para el primer ARN y nucleótidos mutualmente complementarios; d) exponer las células a al menos una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para al menos el segundo ARN, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para el segundo ARN y nucleótidos mutualmente complementarios; y e) aislar las células que exhiben fluorescencia en el momento de la hibridación de al menos una de las radiobalizas moleculares a su respectivo ARN.
  3. 3. Un método para aislar células que expresan al menos un ARN, que comprende los pasos de: a) introducir en las células ADN que codifica para al menos un ARN y al menos una secuencia marca; b) exponer las células a al menos una radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para la primera transcripción de ARN de la secuencia marca, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para la transc ipción de ARN de la secuencia marca y nucleótidos mutualmente complementarios; y c ) aislar las células que experimentan fluorescencia.
  4. 4. Un método para aislar células que expresan al menos uno de dos o más ARN, que comprende los pasos de : a) introducir en las células un primer ADN que codifica para un primer ARN y al menos una primera secuencia marca; b) introducir en las células un segundo ADN que codifica para un segundo ARN y al menos una segunda secuencia marca; c) exponer las células a al menos una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con la primera secuencia marca, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para la transcripción de ARN de la primera secuencia marca y nucleótidos mutualmente complementarios; d) exponer las células a al menos una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con la segunda secuencia marca, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para la transcripción de ARN de la segunda secuencia marca y nucleótidos mutualmente complementarios; y e) aislar las células que exhiben fluorescencia en el momento de la hibridación de al menos una radiobaliza molecular para sus respectivas transcripciones de ARN de las secuencias marca.
  5. 5. Un método para aislar células que sobre-expresan al menos un ARN, que comprende los pasos de: a) introducir en las células al menos un primer ADN que codifica para al menos un ARN y al menos una primera secuencia marca; y al menos un segundo ADN que codifica para al menos un ARN y al menos una segunda secuencia marca; en donde la primera secuencia marca es diferente de la segunda secuencia marca; b) exponer las células a al menos una primero radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con la transcripción de ARN de al menos una primera secuencia marca, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para la transcripción de ARN de la primera secuencia marca y nucleótidos mutualmente complementarios; c) exponer las células a al menos una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con la transc ipción de ARN de al menos una segunda secuencia marca, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para la transcripción de ARN de la segunda secuencia marca y nucleótidos mutualmente complementarios; y d) aislar las células que experimentan fluorescencia en el momento de la hibridación de al menos una de las radiobalizas moleculares para sus transcripción de ARN respectivas de las secuencias marca .
  6. 6. Un método para aislar células que sobre-expresan al menos una primera proteina y que son funcionalment e nulas que expresan o reducen en la expresión para al menos una segunda proteina, que comprende los pasos de: a) introducir en las células al menos un primer ADN que codifica para al menos un ARN que codifica para el menos una primera proteina, y al menos una primera secuencia marca; y al menos un segundo ADN que codifica para al menos un ARN y al menos una segunda secuencia marca, en donde la primera y segunda secuencias marca son diferentes; b) introducir en las células al menos un tercer ADN que codifica para al menos un ARN antisentido que se une a la transcripción de ARNm de al menos la segunda proteína; c) exponer las células a al menos una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con la transcripción de ARN de al menos una primera secuencia marca, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para la transcripción de ARN de la primera secuencia marca y nucleótidos mutualmente complementarios; d) exponer las células a al menos una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con la transcripción de ARN de al menos una segunda secuencia marca, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para la transcripción de ARN de la segunda secuencia marca y nucleótidos mutualmente complementarios; e) exponer las células a al menos una tercera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con al menos un ARN antisentido, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para el ARN antisentido y nucleótidos mutualmente complementarios; y f ) aislar las células que experimentan fluorescencia en el momento de la hibridación de las radiobalizas moleculares para sus respectivas transcripciones de ARN.
  7. 7. Un método para aislar células que expresan al menos un primer ARN, que comprende los pasos de: a) proporcionar células que expresen potencialmente al menos un primer ARN; b) exponer las células a al menos una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con al menos el primer ARN, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para el primer ARN y nucleótidos mutualmente complementarios; c) aislar las células que experimentan fluorescencia.
  8. 8. El método según la reivindicación 7, en donde las células además expresan potencialment e al menos un segundo ARN, que comprende además los pasos de : a) exponer las células a al menos una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación para al menos el segundo ARN, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para el segundo ARN y nucleótidos mutualmente complementarios; y b) aislar las células que exhiben fluorescencia en el momento de la hibridación de la radiobaliza molecular con el segundo ARN.
  9. 9. El método según la reivindicación 7 en donde la proteina se selecciona del grupo que consiste de una proteína localizada en la superficie celular y una proteína intracelular .
  10. 10. El método según la rei indicación 2 6 4, en donde la segunda secuencia marca es igual o diferente de la primera secuencia marca.
  11. 11. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2, 4, 5, y 8, en donde la segunda radiobaliza molecular tiene el mismo o diferente fluoróforo que el de la primera radiobaliza molecular .
  12. 12. El método según la reivindicación 6, en donde la primera, segunda y tercera radiobalizas moleculares tienen el mismo o diferentes fluoróforos, o una combinación de los mismos.
  13. 13. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 y 8, en donde los pasos del primer ARN se realizan ya sea simultánea, secuencialment e , o ambos, con los pasos correspondientes del segundo ARN.
  14. 14. El método según la reivindicación 5, en donde los pasos de la primera secuencia marca y la segunda secuencia marca se realizan ya sea simultánea, secuencialment e , o ambos.
  15. 15. El método según la reivindicación 6, en donde los pasos de la primera secuencia marca, la segunda secuencia marca y el ARN antisentido se realizan ya sea simultánea, secuencialmente, o ambos.
  16. 16. El método según cualquiera de las reivindicaciones 2, 4 y 5, en donde el primer ADN y el segundo ADN están sobre la misma estructura o diferentes estructuras.
  17. 17. El método según la reivindicación 6, en donde el primer ADN, el segundo ADN y el tercer ADN están sobre la misma estructura, diferentes estructuras o una combinación de las dos.
  18. 18. El método según la reivindicación 2 ó 4, en donde los dos o más ARN son iguales o diferentes.
  19. 19. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el paso de aislar células que experimentan fluorescencia se lleva a cabo utilizando tecnología clasificadora de células activadas por fluorescencia o microscopía de fluorescencia.
  20. 20. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el ARN es un ARN antisentido .
  21. 21. El método según la reivindicación 20, en donde las células aisladas son funcionalment e nulas para la expresión o reducidas en la expresión de al menos una proteína preseleccionada, en donde el ARN antisentido une esencialmente todo el ARNm o una porción sustancial de transcripciones de al menos una proteína preseleccionada.
  22. 22. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el ADN está unido funcionalment e a un promotor condicional.
  23. 23. El método según la reivindicación 2, en donde el promotor se puede inducir, y se aplica un inductor antes de exponer las células a la radiobaliza molecular.
  24. 24. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además el paso de seleccionar las células después del paso a), pero antes de exponer las células a las radiobalizas moleculares .
  25. 25. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde al menos un ADN codifica adicionalment e para al menos un marcador resistente a fármacos, y el método comprende además el paso de seleccionar células resistentes a al menos un fármaco al cual el marcado confiere resistencia.
  26. 26. Un método para generar un animal transgénico que expresa el ARN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende llevar a cabo los pasos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, utilizando hemocitoblastos embrionarios, determinar la viabilidad de los hemocitoblastos, y utilizar los hemocitoblastos embrionarios para producir el animal transgénico.
  27. 27. El método según al reivindicación 26, en donde el ARN es un ARN antisentido, y el animal transgénico es f ncionalment e nulo en la expresión o reducido en la expresión para al menos una proteína preseleccionada mediante la unión del ARN antisentido a esencialmente todas o una porción sustancial de transcripciones de ARNm de al menos una proteina preseleccionada.
  28. 28. Un método para cuantificar el nivel de al menos una primera expresión de ARN en una muestra biológica que comprende los pasos de: a) exponer la muestra biológica a una primera radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación con el primer ARN, en donde la radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para el primer ARN y nucleótidos mutualmente complementarios ; b) cuantificar el nivel de fluorescencia en la muestra biológica; y c) correlacionar el nivel de fluorescencia con el nivel de al menos un primer ARN.
  29. 29. El método según la reivindicación 28, en donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de una muestra celular y una muestra de te idos .
  30. 30. El método según la reivindicación 28, en donde se fija la muestra biológica.
  31. 31. El método según la reivindicación 28, en donde la fluorescencia se cuantifica mediante microscopía de fluorescencia o tecnología clasificadora de células activadas por fluorescencia.
  32. 32. El método según la reivindicación 28, en donde el nivel de al menos una segunda expresión de ARN se cuantifica en la muestra biológica utilizando una segunda radiobaliza molecular que experimenta fluorescencia en el momento de la hibridación al segundo ARN, en donde la segunda radiobaliza molecular comprende nucleótidos complementarios para el segundo ARN y nucleótidos mutualmente complementarios .
  33. 33. El método según la reivindicación 32, en donde los pasos del segundo ARN se realizan ya séa simultánea, secuencialmente o ambos con los pasos correspondientes de al menos un primer ARN.
  34. 34. El método según la reivindicación 32, en donde la segunda radiobaliza molecular tiene el mismo o diferente fluoróforo del de la primera radiobaliza molecular.
  35. 35. El método según la reivindicación 28 ó 32, en donde la muestra celular son células.
  36. 36. El método según la reivindicación 35, que comprende además el paso de aislar las células con base en el nivel de expresión de al menos el primer ARN o el segundo ARN, o ambos.
  37. 37. El método según la reivindicación 36, en donde las células se aislan utilizando tecnología clasificadora de células activadas por fluorescencia o microscopía de fluorescencia.
  38. 38. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 36, que comprende además el paso de hacer crecer las células.
  39. 39. El método según la reivindicación 38, en donde se genera una línea celular o una pluralidad de líneas celulares.
  40. 40. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 28 a 32, en donde el ARN es uno o más ARN que codifica para una proteína, un ARN estructural, un ARN antisentido, un ARN que codifica para un péptido, un ARN ribosomal, un ARNhn y un ARN s n .
  41. 41. Una actividad proteolitica que genera una solución de ensayo para hibridación unitaria que comprende : una secuencia complemento blanco de cadena individual que es complementaria para la secuencia blanco; flanquear una secuencia complemento blanco, un par de ramificaciones de oligonucleótidos de una secuencia de ramificación 5' unida covalentemente al término 5' y una secuencia de ramificación 3' unida covalentemente al término 3' , el par de ramificaciones de oligonucleótidos que forman un dúplex original, un par de interacción que comprende una enzima proteolitica y un inhibidor de la enzima proteolitica, un miembro de cada par conjugado a la secuencia de ramificación 5' y el otro miembro conjugado a la secuencia de ramificación 3' , en donde el inhibidor es capaz de inactivar al menos parcialmente la actividad proteolitica de la enzima proteolitica cuando interactúan con las mismas.
  42. 42. La solución de ensayo según la reivindicación 41 que tiene, bajo condiciones de análisis en ausencia de la secuencia blanco, una actividad proteolitica característica cuyo nivel es una función del grado de interacción de la enzima proteolitica y el inhibidor, en donde bajo las condiciones en presencia de un exceso de la secuencia blanco, la hibridación de la secuencia complemento blanco para la secuencia blanco aumenta el nivel de la actividad proteolitica característica.
  43. 43. La solución de ensayo según la reivindicación 42, en donde las condiciones de análisis tienen una temperatura de detección para detectar la secuencia blanco.
  44. 44. La solución de ensayo según la reivindicación 41, en donde el inhibidor enzimático proteolitico es un péptido.
  45. 45. La solución de ensayo según la reivindicación 41, en donde la enzima proteolitica y el inhibidor de la enzima proteolitica se seleccionan del grupo que consiste de aminopeptidasa y amastatina, cisterna proteasas similares a tripsina y antipaina, aminopeptidasa y bestatina, cisteina proteasas similares a quimiotripsina y quimiostatina , aminopeptidasa y diprotina A o B, carboxipept idasa A y EDTA, serina proteasas similares a elastasa y elastinal, y termolisina o aminopeptidasa M y 1,10-fenantr olina .
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