JP2009072198A - mRNA結合プローブを用いる生存細胞の選択および単離 - Google Patents
mRNA結合プローブを用いる生存細胞の選択および単離 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】本発明は、生細胞におけるmRNA並びにその他のRNAの、信頼度の高い、効率的な検出法と、所望の特性に応じて細胞を特定し、要すれば細胞を分離するための用法に向けられる。この方法は、従来の処理過程を格段に簡単化し、その実行に必要な時間を短縮し、かつ、新規の研究法、例えば、ある特定のタンパク またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを生成する細胞の選択、複数タンパクを発現する細胞系統の生成、一つ以上のタンパクをノックアウトされた細胞系統の生成等の新規研究法をも提供する。
【選択図】なし
Description
本出願は、1999年11月23日出願の仮出願第60/166,987号に対する優先権を主張する。なお、この出願の全体を引用することにより本明細書に含める。
分子ビーコンは、ある特定の核酸配列の存在を認識し伝える核酸プローブである。このプローブは、標的配列に相補的なヌクレオチドの中央直線部と、短い相互に相補的な配列を含む末端部を備えるヘアピン型配列である。一方の末端はフルオロフォアに共有的に結合し、他方の末端は消光基に共有的に結合する。ハイブ リダイズした末端を有する天然の状態である場合には、フルオロフォアと消光分子の近接性は、蛍光が全く発せられない程度のものとなっている。このビーコンは、標的核酸にハイブリダイズした場合に、自然に蛍光発光性の立体構造変化を受ける。例えば、米国特許第5,925,517号を参照されたい。
(項目1)
少なくとも一つのRNAを発現する細胞を単離する方法であって、
a)前記少なくとも一つのRNAをコードするDNAを細胞中に導入する工程;
b)前記細胞を、前記少なくとも一つのRNAにハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、RNAに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;および、
c)蛍光を発する前記細胞を単離する工程
を含む方法。
(項目2)
二つ以上のRNAの少なくとも一つを発現する細胞を単離する方法であって、
a)第1RNAをコードする第1DNAを細胞中に導入する工程;
b)少なくとも一つの第2RNAをコードする第2DNAを前記細胞に導入する工程;
c)前記細胞を、前記第1RNAにハイブリダイズすると蛍光を発する第1分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第1RNAに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;
d)前記細胞を、前記少なくとも第2RNAにハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第2分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第2RNAに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;および、
e)前記分子ビーコンの少なくとも一つが、その対応RNAにハイブリダイズした際に蛍光を示す細胞を単離する工程、
を含む方法。
(項目3)
少なくとも一つのRNAを発現する細胞を単離する方法であって、
a)前記少なくとも一つのRNAおよび少なくとも一つのタグ配列をコードするDNAを細胞中に導入する工程;
b)前記細胞を、前記タグ配列のRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、タグ配列のRNA転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;および、
c)蛍光を発する前記細胞を単離する工程
を含む方法。
(項目4)
二つ以上のRNAの少なくとも一つを発現する細胞を単離する方法であって、
a)第1RNAおよび少なくとも一つの第1タグ配列をコードする第1DNAを細胞中に導入する工程;
b)少なくとも一つの第2RNAおよび少なくとも一つの第2タグ配列をコードする第2DNAを前記細胞に導入する工程;
c)前記細胞を、第1タグ配列にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第1分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第1タグ配列のRNA転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;
d)前記細胞を、第2タグ配列にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第2分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、前記第2タグ配列のRNA転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;および、
e)前記分子ビーコンの少なくとも一つが、前記タグ配列の対応RNA転写物にハイブリダイズした際に蛍光を示す細胞を単離する工程、
を含む方法。
(項目5)
少なくとも一つのRNAを過剰発現する細胞を単離する方法であって、
a)前記少なくとも一つのRNAと少なくとも一つの第1タグ配列とをコードする少なくとも一つの第1DNA、および、前記少なくとも一つのRNAと少なくとも一つの第2タグ配列とをコードする少なくとも一つの第2DNAを細胞中に導入し、前記第1タグ配列は前記第2タグ配列とは異なるものとする工程;
b)前記細胞を、前記少なくとも第1タグ配列のRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第1分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第1タグ配列のRNA転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;
c)前記細胞を、前記少なくとも第2タグ配列のRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第2分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第2タグ配列のRNA転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;および
d)前記分子ビーコンの少なくとも一つが、前記タグ配列の対応RNA転写物にハイブリダイズした際に蛍光を示す細胞を単離する工程、
を含む方法。
(項目6)
少なくとも一つの第1タンパク質を過剰発現するが、少なくとも一つの第2タンパク質については機能的ゼロ発現またはその発現が低下している細胞を単離する方法であって、
a)前記少なくとも一つの第1タンパク質をコードする少なくとも一つのRNAと、少なくとも一つの第1タグ配列とをコードする少なくとも一つの第1DNA、および、前記少なくとも一つのRNAと、少なくとも一つの第2タグ配列とをコードする少なくとも一つの第2DNAを細胞中に導入し、前記第1お よび第2タグ配列とは異なるものとする工程;
b)前記少なくとも第2タンパク質のmRNA転写物に結合する少なくとも一つのアンチセンスRNAをコードする少なくとも一つの第3DNAを細胞中に導入する工程;
c)前記細胞を、前記少なくとも第1タグ配列のRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第1分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第1タグ配列のRNA転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;
d)前記細胞を、前記少なくとも第2タグ配列のRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第2分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第2タグ配列のRNA転写物に対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;
e)前記細胞を、前記少なくとも一つのアンチセンスRNAにハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第3分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、アンチセンスRNAに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;および、
f)前記分子ビーコンが、それぞれのRNAにハイブリダイズした際に発する蛍光を発する細胞を単離する工程、
を含む方法。
(項目7)
少なくとも一つの第1RNAを発現する細胞を単離する方法であって、
a)前記少なくとも第1RNAを発現する能力を有する細胞を供給する工程;
b)前記細胞を、前記少なくとも第1RNAにハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第1分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第1RNAに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;
c)蛍光を発する前記細胞を単離する工程、
を含む方法。
(項目8)
前記細胞はさらに少なくとも一つの第2RNAを発現する能力を有しており、
a)前記細胞を、前記少なくとも第2RNAにハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第2分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第2RNAに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含むものとする工程;および、
b)前記分子ビーコンが、前記第2RNAにハイブリダイズした際に蛍光を示す細胞を単離する工程、
をさらに含むことを特徴とする、項目7に記載の方法。
(項目9)
前記タンパク質は、細胞表面局在タンパク質および細胞内タンパク質からなる群から選ばれることを特徴とする、項目7に記載の方法。
(項目10)
前記第2タグ配列は、第1タグ配列と同じか、または、異なることを特徴とする、項目2または4に記載の方法。
(項目11)
前記第2分子ビーコンは、第1分子ビーコンのものと同じか、または、異なる蛍光物質を有する、項目2、4、5および8のいずれか1項に記載の方法。
(項目12)
前記第1、第2および第3の分子ビーコンが、同じか、別々の蛍光物質、または、それらの組み合わせを有する、項目6に記載の方法。
(項目13)
前記第1RNAの前記工程が、前記第2RNAの対応工程と同時に、継時的に、またはその両方のいずれかで実行される、項目2、4および8のいずれか1項に記載の方法。
(項目14)
前記第1タグ配列および第2タグ配列の前記工程が、同時に、継時的に、またはその両方のいずれかで実行される、項目5に記載の方法。
(項目15)
前記第1タグ配列、第2タグ配列およびアンチセンスRNAの前記工程が、同時に、継時的に、またはその両方のいずれかで実行される、項目6に記載の方法。
(項目16)
前記第1DNAおよび前記第2DNAが、同じ構築体、または、異なる構築体上に存在する、項目2,4および5のいずれか1項に記載の方法。
(項目17)
前記第1DNA、第2DNAおよび第3DNAが、同じ構築体、異なる構築体、またはそれらの組み合わせの上に存在する、項目6に記載の方法。
(項目18)
前記二つ以上のRNAが同じか、または異なる、項目2または4に記載の方法。
(項目19)
蛍光を発する前記細胞を単離する工程が、蛍光活性化細胞ソーター技術または蛍光顕微鏡法によって実行される、項目1から8のいずれか1項に記載の方法。
(項目20)
前記RNAはアンチセンスRNAである、項目1から8のいずれか1項に記載の方法。
(項目21)
前 記単離された細胞は、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質の発現が機能的にゼロであるか、または発現が低下しており、前記アンチセンスRNAは、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質の、事実上全てのmRNA,またはその転写物の実質的部分に結合する、項目20に記載の方法。
(項目22)
前記DNAは、条件付プロモーターに作動可能に結合される、項目1から6のいずれか1項に記載の方法。
(項目23)
前記プロモーターは誘導可能であり、前記細胞を分子ビーコンに曝露する前にインデューサーが適用される、項目22に記載の方法。
(項目24)
工程a)の後に、ただし、前記細胞を前記分子ビーコンに曝露する前に細胞を選択する工程をさらに含む、項目1から6のいずれか1項に記載の方法。
(項目25)
前記少なくとも一つのDNAは少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをさらにコードし、前記方法は、前記マーカーによって耐性を付与されて、少なくとも一つの薬剤に対して耐性を持つようになった細胞を選択する工程をさらに含む、項目1から6のいずれか1項に記載の方法。
(項目26)
項 目1から6のいずれか1項によるRNAを発現するトランスジェニック動物を作製する方法であって、項目1から6のいずれか1項による工程を実行すること、胚幹細胞を利用すること、前記幹細胞の生存率を決定すること、および、前記生存胚幹細胞を用いて、前記トランスジェニック動物を生産することを含む方法。
(項目27)
前 記RNAはアンチセンスRNAであり、前記トランスジェニック動物は、アンチセンスRNAが、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質のmRNA転写物の、事実上全て、またはその実質的部分に結合することによって、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質の発現が機能的にゼロであ るか、または発現が低下する、項目26に記載の方法。
(項目28)
生物学的サンプルにおける少なくとも一つの第1RNA発現のレベルを定量するための方法であって、
a)前記生物学的サンプルを、前記第1RNAとハイブリダイズすると蛍光を発する第1分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第1RNAに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的な配列とを含むものとする工程;
b)前記生物学的サンプルにおける蛍光レベルを定量する工程;および、
c)前記蛍光レベルを、前記少なくとも第1RNAの前記レベルと相関させる工程、
を含む方法。
(項目29)
前記生物学的サンプルは、細胞サンプルおよび組織サンプルからなる群から選ばれる、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記生物学的サンプルは固定されている、項目28に記載の方法。
(項目31)
前記蛍光は、蛍光顕微鏡法または蛍光活性化細胞ソーター技術によって定量される、項目28に記載の方法。
(項目32)
少 なくとも一つの第2RNAの発現のレベルが、前記生物学的サンプルにおいて、前記第2RNAにハイブリダイズすると蛍光を発する第2分子ビーコンによって定量され、前記第2分子ビーコンは、第2RNAに対して相補的なヌクレオチドと、互いに相補的なヌクレオチドとを含む、項目28に記載の方法。
(項目33)
前記第2RNAの前記工程が、前記少なくとも第1RNAの対応工程と同時に、継時的に、またはその両方のいずれかで実行される、項目32に記載の方法。
(項目34)
前記第2分子ビーコンが、第1分子ビーコンのものと同じか、または、異なる蛍光物質を有する、項目32に記載の方法。
(項目35)
前記細胞サンプルは細胞である、項目28または32に記載の方法。
(項目36)
前記少なくとも第1RNAまたは第2RNAまたはその両方の発現レベルに基づいて、前記細胞を単離する工程をさらに含む、項目35に記載の方法。
(項目37)
前記細胞は、蛍光活性化細胞ソーター技術または蛍光顕微鏡法を用いて単離される、項目36に記載の方法。
(項目38)
前記細胞を育成する工程をさらに含む、項目1から8および36のいずれか1項に記載の方法。
(項目39)
一つの細胞系統、または、複数の細胞系統が生成される、項目38に記載の方法。
(項目40)
前記RNAは、タンパク質をコードするRNA、構造的RNA、アンチセンスRNA、ペプチドをコードするRNA、リボソームRNA、hnRNAおよびsnRNAの一つ以上である、項目1から8および28から32のいずれか1項に記載の方法。
(項目41)
タンパク質分解活性を生成する単一ハイブリダイゼーションプローブであって、
標的配列に対して相補的な1本鎖標的相補配列;
標的相補配列を両側挟持する、一対のオリゴヌクレオチドアームであって、5‘末端に共有的に結合する5’アーム配列と、3‘末端に共有的に結合する3’アーム配列とから成り、ステム2本鎖を形成する前記一対のオリゴヌクレオチドアーム;
タンパク質分解酵素と前記タンパク質分解酵素の阻害剤とを含む相互作用ペアであって、各ペアの一方のメンバーは5‘アーム配列にコンジュゲートされ、他方のメンバーは3’アーム配列にコンジュゲートされ、前記阻害剤は、前記タンパク質分解酵素と相互作用を持つと、前記タンパク質分解酵素のタンパク質分解活 性を少なくとも部分的に不活性化することが可能である相互作用ペア、
を含むハイブリダイゼーションプローブ。
(項目42)
項 目41に記載のプローブであって、前記標的配列不在のアッセイ条件下では、そのタンパク質分解活性レベルは、前記タンパク質分解酵素と前記阻害剤との相互作用の程度を表す関数となるという特徴的なタンパク質分解活性を有し、前記標的配列が過剰に存在する条件下では、標的相補配列の標的配列へのハイブリダイ ゼーションが、前記特徴的タンパク質分解活性のレベルを上昇させる、プローブ。
(項目43)
前記アッセイ条件は、標的配列を検出するための検出温度を有する、項目42に記載のプローブ。
(項目44)
前記タンパク質分解酵素阻害剤はペプチドである、項目41に記載のプローブ。
(項目45)
前記タンパク質分解酵素、および前記タンパク質分解酵素の前記阻害剤は、
ア ミノペプチダーゼとアマスタチン、トリプシン様システインプロテアーゼとアンチパイン、アミノペプチダーゼとベスタチン、キモトリプシン様システインプロテアーゼとキモスタチン、アミノペプチダーゼとジプロチンAまたはB、カルボキシペプチダーゼAとEDTA、エラスターゼ様セリンプロテアーゼとエラスチ ナール、および、テルモリシンまたはアミノペプチダーゼMと1,10−フェナントロリンからなる群から選ばれる、項目41に記載のプローブ。
一つの局面では、本発明は、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する方法であって、
a)少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとをコードする少なくとも一つのDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程;
c)選択された細胞を、第1分子ビーコンに曝露し、第1分子ビーコンは、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質のRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程;
d)蛍光を発する細胞を単離する工程;
e)単離された細胞を培養することによって少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する工程;
を含む方法に向けられる。
a)少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、少なくとも一つの第1エピトープタグをコードする少なくとも一つのDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程;
c)選択された細胞を、第1分子ビーコンに曝露し、第1分子ビーコンは、第1エピトープタグのRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程;
d)蛍光を発する細胞を単離する工程;および
e)単離された細胞を培養することによって少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する工程;
を含む方法が提供される。
a)少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスRNA分子および少なくとも一つの薬剤耐性遺伝子をコードするDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程;
c)細胞を、アンチセンスRNA分子にハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに曝露する工程;
d)蛍光を発する細胞を単離する工程;および、
e)単離された細胞を培養することによってあらかじめ選択されたアンチセンスRNA配列を発現する細胞系統を生成する工程;
を含む方法が提供される。
a)少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスRNA分子、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、第1エピトープタグヌクレオチド配列をコードするDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程;
c)選択された細胞を、第1エピトープタグのmRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第1分子ビーコンに曝露する工程;
d)蛍光を発する細胞を単離する工程;
e)単離された細胞を培養することによってあらかじめ選択された少なくとも一つのアンチセンスRNA分子を発現する細胞系統を生成する工程;
を含む方法が提供される。
a)少なくとも一つのタンパク質を発現することが予想される細胞を供給する工程;
b)その少なくとも一つのタンパク質をコードするmRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの分子ビーコンに、前記細胞を曝露する工程;
c)蛍光を発する細胞を単離する工程、
を含む方法が提供される。
a)その生物学的サンプルを、前記RNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第1分子ビーコンに曝露する工程;
b)生物学的サンプルにおける蛍光レベルを定量する工程;および、
c)蛍光レベルを、前記少なくとも一つのRNA転写物のレベルと相関させる工程、
を含む方法に向けられる。
a)少なくとも二つのDNA配列であって、一方の配列は、前記タンパク質、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分を有し、かつ、第2配列は、前記タンパク質、少なくとも一つの第2エピトープタグ、および、少なくとも一つの第2薬剤耐性マーカーをコード する部分を有する、そのような少なくとも二つのDNA配列によって細胞をトランスフェクトする工程;
b)第1および第2薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのDNA配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程;
c)選択された細胞を第1および第2分子ビーコンに曝露し、それらの分子ビーコンは、それぞれ、第1および第2エピトープタグのRNA転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程;
d)第1および第2分子ビーコンそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程;および、
e)単離した細胞を培養することによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を過剰発現する細胞系統を生成する工程、
を含む方法が提供される。
a)少なくとも二つのDNA配列であって、一方の配列は、前記タンパク質、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分を有し、かつ、第2配列は、前記タンパク質、少なくとも一つの第2エピトープタグ、および、少なくとも一つの第2薬剤耐性マーカーをコード する部分を有する、そのような二つのDNA配列によって細胞をトランスフェクトする工程;
b)第1および第2薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのDNA配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程;
c)選択された細胞を第1および第2分子ビーコンに曝露し、それらの分子ビーコンは、それぞれ、第1および第2エピトープタグのRNA転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程;
d)第1および第2分子ビーコンそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程;および、
e)単離した細胞を培養することによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスRNA分子を過剰発現する細胞系統を生成する工程、
を含む方法が提供される。
a)組み換え配列から転写されたRNA配列と非組み換え配列から転写されたRNA配列とからなる群から選ばれるRNA配列とハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに細胞を曝露する工程;
b)前記細胞を検出または選択抽出する工程、
を含む方法である。
本明細書の発明は、分子プローブが、生細胞においてRNA配列の同定を可能とする能力と、一つ以上の波長において蛍光のある特定のレベル(単数または複数)を示す細胞を同定および/または分離する蛍光細胞ソーターまたは関連技術の使用に基づく。EDACが、通常使用される各種最強蛍光分子の発光を抑止可 能であることは今では既知である。生細胞においてmRNAのみならずその他のRNAをも安定的にかつ効率的に検出することが可能になったということは、所望の特性に基づいて、例えば、蛍光活性化細胞ソーター(FACS)を用いて、細胞を同定するために、要すればそのような細胞を分離するためにそれらの RNAを用いることが可能になったということである。本出願は、従来の既知の処理過程を格段に簡単化し、かつ、その実行に必要な時間を格段に短縮する方法を多数提供すると共に、新規方法をも提供する。ビーコンや生細胞を用いる従来の試験は、コントロールに対して際立った差を示さなかった。この問題は、先ず より強力な蛍光分子を用いることによって、さらに、ステムループ分子の内ステム部分を形成するヌクレオチドの数を、従来使用されていた5または6ヌクレオチド長よりも長くなるようにビーコンを修飾することによって取り除かれる。このように修飾することによって、ステムループ分子が、標的配列不在の場合に非 蛍光状態をより確実に維持できるようになるので、背景は低下されることになる。
a)前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとをコードする少なくとも一つのDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択する工程であって、前記細胞は少なくとも一つのDNA構築体と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写している、工程;
c)選択された細胞を、第1分子ビーコンに曝露し、第1分子ビーコンは、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質のRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する、工程;
d)蛍光を発する前記細胞を単離する工程;
e)前記単離された細胞を増殖させることによって少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する工程;
を含む方法。
a)前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、少なくとも一つの第1エピトープタグをコードする少なくとも一つのDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有する細胞を選択する工程であって、前記細胞は少なくとも一つのDNA構築体と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写している、工程;
c)前記細胞を、第1分子ビーコンに曝露し、第1分子ビーコンは、第1エピトープタグのRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する、工程;
d)蛍光を発する前記細胞を単離する工程;および
e)前記単離された細胞を増殖させることによって前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する工程;
を含む方法が提供される。
a)少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスRNA分子、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードするDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有する細胞を選択する工程であって、前記細胞は少なくとも一つのDNA構築体と、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写している、工程;
c)前記アンチセンスRNA分子にハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに、前記細胞を曝露する工程;
d)蛍光を発する前記細胞を単離する工程;および
e)前記単離された細胞を増殖させることによって前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたRNA配列を発現する細胞系統を生成する工程、
を含む。
a)少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスRNA分子、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および第1エピトープタグヌクレオチド配列をコードするDNA構築物を用いて細胞株をトランスフェクトする工程;
b)前記マーカーが耐性を与えるような薬物に対する細胞耐性について選択する工程であって、前記細胞は、少なくとも一つのDNA構築物と少なくとも一つの薬物耐性マーカーとを転写している、工程;
c)前記選択された細胞を、前記第1エピトープタグのmRNA転写物にハイブリダイズする際に蛍光を発する第1分子ビーコンに曝露する工程;
d)蛍光を発する前記細胞を単離する工程;および
e)前記単離された細胞を増殖させることによってあらかじめ選択された少なくとも一つのアンチセンスRNA分子を発現する細胞株を生成する工程
を包含する方法が使用され得る。
a)前記少なくとも一つのタンパクを発現することが予想される細胞を提供する工程;
b)前記少なくとも一つのタンパクをコードするmRNA転写物にハイブリダイズする際に蛍光を発する少なくとも一つの分子ビーコンに、前記細胞を曝露する工程;
c)蛍光を発する前記細胞を単離する工程、
を含む方法が提供される。
a)その生物学的サンプルを、前記RNA転写物にハイブリダイズする際に蛍光を発する第1分子ビーコンに曝露する工程;
b)生物学的サンプルにおける蛍光レベルを定量する工程;および、
c)蛍光レベルを、少なくとも一つのmRNA転写物の前記レベルと相関させる工程、
を含む。
選択し、そして同定することによって達成される。この工程は、
a)少なくとも二つのDNA配列によって細胞をトランスフェクトする工程であって、前記配列はそれぞれ、タンパク、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分;ならびに同じタンパク、少なくとも一つの第2エピトープタグ、および、少なくとも一つの第2薬剤 耐性マーカーをコードする部分を有する、工程;
b)第1および第2薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのDNA配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程;
c)選択された細胞を、第1および第2分子ビーコンに曝露する工程であって、各分子ビーコンは、それぞれ、前記第1および第2エピトープタグのRNA転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズする際に蛍光を発する、工程;
d)前記第1および第2分子ビーコンのそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程;および、
e)単離した細胞を増殖させることによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を過剰発現する細胞株を生成する工程、
を含む。
a)少なくとも二つのDNA配列によってトランスフェクトする工程であって、その配列は、前記アンチセンスRNA分子、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分;ならびに前記アンチセンスRNA分子、少なくとも一つの第2エピトープタグ、および、少なく とも一つの第2薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、工程;
b)前記第1および第2薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのDNA配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程;
c)前記選択された細胞を第1および第2分子ビーコンに曝露する工程であって、各分子ビーコンは、それぞれ、前記第1および第2エピトープタグのRNA転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズす際に蛍光を発する、工程;
d)前記第1および第2分子ビーコンのそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程;および、
e)前記単離した細胞を増殖させることによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスRNA分子を過剰発現する細胞株を生成する工程、
を含む。
a)組み換え配列から転写されたRNA配列と非組み換え配列から転写されたRNA配列とからなる群から選ばれるRNA配列とハイブリダイズする際に蛍光を発する分子ビーコンに、細胞を曝露する工程;
b)前記RNA配列を発現する前記細胞を検出する工程、
を含む方法が提供される。
全体的なプロトコール。開始材料:分子ビーコンは、プラスミド由来のRNAを全く発現しない細胞に導入され得るか、または、プラスミドでコードされたRNAメッセージを検出するのに使用され得る。ビーコンを、これら2種類の細胞に導入する方法は同一である。下記のプロトコールは、分析される細胞が互い に分離可能であり、その分離がFACS分析に従うことのみを必要とする。
ビーコンによる細胞の選択
1)ビーコンを細胞にトランスフェクトさせる。ビーコンは、RNAに内在する配列にハイブリダイズするか、または、天然のRNA配列に添加されたタグにハイブリダイズするかのいずれかによって、所望のRNAを認識するように設計されていなければならない。ビーコンの設計は、本明細書において詳細に論じられ ている。
一つ以上のRNAを発現する細胞株の生成
FACS選択の後、ポジティブと記録した細胞を、本明細書においてさらに詳細に記述されるように、適当な培養液中に維持することが可能である。この細胞は、目的のRNAを発現する細胞株となる。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
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