JP4502808B2 - mRNA結合プローブを用いる生存細胞の選択および単離 - Google Patents
mRNA結合プローブを用いる生存細胞の選択および単離 Download PDFInfo
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Description
本出願は、1999年11月23日出願の仮出願第60/166,987号に対する優先権を主張する。なお、この出願の全体を引用することにより本明細書に含める。
分子ビーコンは、ある特定の核酸配列の存在を認識し伝える核酸プローブである。このプローブは、標的配列に相補的なヌクレオチドの中央直線部と、短い相互に相補的な配列を含む末端部を備えるヘアピン型配列である。一方の末端はフルオロフォアに共有的に結合し、他方の末端は消光基に共有的に結合する。ハイブリダイズした末端を有する天然の状態である場合には、フルオロフォアと消光分子の近接性は、蛍光が全く発せられない程度のものとなっている。このビーコンは、標的核酸にハイブリダイズした場合に、自然に蛍光発光性の立体構造変化を受ける。例えば、米国特許第5,925,517号を参照されたい。
一つの局面では、本発明は、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する方法であって、
a)少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとをコードする少なくとも一つのDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程;
c)選択された細胞を、第1分子ビーコンに曝露し、第1分子ビーコンは、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質のRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程;
d)蛍光を発する細胞を単離する工程;
e)単離された細胞を培養することによって少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する工程;
を含む方法に向けられる。
a)少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、少なくとも一つの第1エピトープタグをコードする少なくとも一つのDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程;
c)選択された細胞を、第1分子ビーコンに曝露し、第1分子ビーコンは、第1エピトープタグのRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程;
d)蛍光を発する細胞を単離する工程;および
e)単離された細胞を培養することによって少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する工程;
を含む方法が提供される。
a)少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスRNA分子および少なくとも一つの薬剤耐性遺伝子をコードするDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程;
c)細胞を、アンチセンスRNA分子にハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに曝露する工程;
d)蛍光を発する細胞を単離する工程;および、
e)単離された細胞を培養することによってあらかじめ選択されたアンチセンスRNA配列を発現する細胞系統を生成する工程;
を含む方法が提供される。
a)少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスRNA分子、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、第1エピトープタグヌクレオチド配列をコードするDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択し、前記細胞は少なくとも一つの薬剤耐性マーカーを転写している工程;
c)選択された細胞を、第1エピトープタグのmRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第1分子ビーコンに曝露する工程;
d)蛍光を発する細胞を単離する工程;
e)単離された細胞を培養することによってあらかじめ選択された少なくとも一つのアンチセンスRNA分子を発現する細胞系統を生成する工程;
を含む方法が提供される。
a)少なくとも一つのタンパク質を発現することが予想される細胞を供給する工程;
b)その少なくとも一つのタンパク質をコードするmRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの分子ビーコンに、前記細胞を曝露する工程;
c)蛍光を発する細胞を単離する工程、
を含む方法が提供される。
a)その生物学的サンプルを、前記RNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する第1分子ビーコンに曝露する工程;
b)生物学的サンプルにおける蛍光レベルを定量する工程;および、
c)蛍光レベルを、前記少なくとも一つのRNA転写物のレベルと相関させる工程、
を含む方法に向けられる。
a)少なくとも二つのDNA配列であって、一方の配列は、前記タンパク質、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分を有し、かつ、第2配列は、前記タンパク質、少なくとも一つの第2エピトープタグ、および、少なくとも一つの第2薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、そのような少なくとも二つのDNA配列によって細胞をトランスフェクトする工程;
b)第1および第2薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのDNA配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程;
c)選択された細胞を第1および第2分子ビーコンに曝露し、それらの分子ビーコンは、それぞれ、第1および第2エピトープタグのRNA転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程;
d)第1および第2分子ビーコンそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程;および、
e)単離した細胞を培養することによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を過剰発現する細胞系統を生成する工程、
を含む方法が提供される。
a)少なくとも二つのDNA配列であって、一方の配列は、前記タンパク質、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分を有し、かつ、第2配列は、前記タンパク質、少なくとも一つの第2エピトープタグ、および、少なくとも一つの第2薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、そのような二つのDNA配列によって細胞をトランスフェクトする工程;
b)第1および第2薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのDNA配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程;
c)選択された細胞を第1および第2分子ビーコンに曝露し、それらの分子ビーコンは、それぞれ、第1および第2エピトープタグのRNA転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズすると蛍光を発するものとする工程;
d)第1および第2分子ビーコンそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程;および、
e)単離した細胞を培養することによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスRNA分子を過剰発現する細胞系統を生成する工程、
を含む方法が提供される。
a)組み換え配列から転写されたRNA配列と非組み換え配列から転写されたRNA配列とからなる群から選ばれるRNA配列とハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに細胞を曝露する工程;
b)前記細胞を検出または選択抽出する工程、
を含む方法である。
本明細書の発明は、分子プローブが、生細胞においてRNA配列の同定を可能とする能力と、一つ以上の波長において蛍光のある特定のレベル(単数または複数)を示す細胞を同定および/または分離する蛍光細胞ソーターまたは関連技術の使用に基づく。EDACが、通常使用される各種最強蛍光分子の発光を抑止可能であることは今では既知である。生細胞においてmRNAのみならずその他のRNAをも安定的にかつ効率的に検出することが可能になったということは、所望の特性に基づいて、例えば、蛍光活性化細胞ソーター(FACS)を用いて、細胞を同定するために、要すればそのような細胞を分離するためにそれらのRNAを用いることが可能になったということである。本出願は、従来の既知の処理過程を格段に簡単化し、かつ、その実行に必要な時間を格段に短縮する方法を多数提供すると共に、新規方法をも提供する。ビーコンや生細胞を用いる従来の試験は、コントロールに対して際立った差を示さなかった。この問題は、先ずより強力な蛍光分子を用いることによって、さらに、ステムループ分子の内ステム部分を形成するヌクレオチドの数を、従来使用されていた5または6ヌクレオチド長よりも長くなるようにビーコンを修飾することによって取り除かれる。このように修飾することによって、ステムループ分子が、標的配列不在の場合に非蛍光状態をより確実に維持できるようになるので、背景は低下されることになる。
a)前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとをコードする少なくとも一つのDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有するようになった細胞を選択する工程であって、前記細胞は少なくとも一つのDNA構築体と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写している、工程;
c)選択された細胞を、第1分子ビーコンに曝露し、第1分子ビーコンは、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質のRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する、工程;
d)蛍光を発する前記細胞を単離する工程;
e)前記単離された細胞を増殖させることによって少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する工程;
を含む方法。
a)前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および、少なくとも一つの第1エピトープタグをコードする少なくとも一つのDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有する細胞を選択する工程であって、前記細胞は少なくとも一つのDNA構築体と少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写している、工程;
c)前記細胞を、第1分子ビーコンに曝露し、第1分子ビーコンは、第1エピトープタグのRNA転写物にハイブリダイズすると蛍光を発する、工程;
d)蛍光を発する前記細胞を単離する工程;および
e)前記単離された細胞を増殖させることによって前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を発現する細胞系統を生成する工程;
を含む方法が提供される。
a)少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスRNA分子、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードするDNA構築体によって細胞系統をトランスフェクトする工程;
b)前記マーカーによって耐性を付与され薬剤に対して耐性を有する細胞を選択する工程であって、前記細胞は少なくとも一つのDNA構築体と、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーとを転写している、工程;
c)前記アンチセンスRNA分子にハイブリダイズすると蛍光を発する分子ビーコンに、前記細胞を曝露する工程;
d)蛍光を発する前記細胞を単離する工程;および
e)前記単離された細胞を増殖させることによって前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたRNA配列を発現する細胞系統を生成する工程、
を含む。
a)少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスRNA分子、少なくとも一つの薬剤耐性マーカー、および第1エピトープタグヌクレオチド配列をコードするDNA構築物を用いて細胞株をトランスフェクトする工程;
b)前記マーカーが耐性を与えるような薬物に対する細胞耐性について選択する工程であって、前記細胞は、少なくとも一つのDNA構築物と少なくとも一つの薬物耐性マーカーとを転写している、工程;
c)前記選択された細胞を、前記第1エピトープタグのmRNA転写物にハイブリダイズする際に蛍光を発する第1分子ビーコンに曝露する工程;
d)蛍光を発する前記細胞を単離する工程;および
e)前記単離された細胞を増殖させることによってあらかじめ選択された少なくとも一つのアンチセンスRNA分子を発現する細胞株を生成する工程
を包含する方法が使用され得る。
a)前記少なくとも一つのタンパクを発現することが予想される細胞を提供する工程;
b)前記少なくとも一つのタンパクをコードするmRNA転写物にハイブリダイズする際に蛍光を発する少なくとも一つの分子ビーコンに、前記細胞を曝露する工程;
c)蛍光を発する前記細胞を単離する工程、
を含む方法が提供される。
a)その生物学的サンプルを、前記RNA転写物にハイブリダイズする際に蛍光を発する第1分子ビーコンに曝露する工程;
b)生物学的サンプルにおける蛍光レベルを定量する工程;および、
c)蛍光レベルを、少なくとも一つのmRNA転写物の前記レベルと相関させる工程、
を含む。
選択し、そして同定することによって達成される。この工程は、
a)少なくとも二つのDNA配列によって細胞をトランスフェクトする工程であって、前記配列はそれぞれ、タンパク、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分;ならびに同じタンパク、少なくとも一つの第2エピトープタグ、および、少なくとも一つの第2薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、工程;
b)第1および第2薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのDNA配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程;
c)選択された細胞を、第1および第2分子ビーコンに曝露する工程であって、各分子ビーコンは、それぞれ、前記第1および第2エピトープタグのRNA転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズする際に蛍光を発する、工程;
d)前記第1および第2分子ビーコンのそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程;および、
e)単離した細胞を増殖させることによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質を過剰発現する細胞株を生成する工程、
を含む。
a)少なくとも二つのDNA配列によってトランスフェクトする工程であって、その配列は、前記アンチセンスRNA分子、少なくとも一つのエピトープタグ、および、少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをコードする部分;ならびに前記アンチセンスRNA分子、少なくとも一つの第2エピトープタグ、および、少なくとも一つの第2薬剤耐性マーカーをコードする部分を有する、工程;
b)前記第1および第2薬剤耐性マーカーの発現によって、前記少なくとも二つのDNA配列によってトランスフェクトされた細胞を選択する工程;
c)前記選択された細胞を第1および第2分子ビーコンに曝露する工程であって、各分子ビーコンは、それぞれ、前記第1および第2エピトープタグのRNA転写物のヌクレオチド配列にハイブリダイズす際に蛍光を発する、工程;
d)前記第1および第2分子ビーコンのそれぞれの蛍光を示す細胞を単離する工程;および、
e)前記単離した細胞を増殖させることによって、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたアンチセンスRNA分子を過剰発現する細胞株を生成する工程、
を含む。
a)組み換え配列から転写されたRNA配列と非組み換え配列から転写されたRNA配列とからなる群から選ばれるRNA配列とハイブリダイズする際に蛍光を発する分子ビーコンに、細胞を曝露する工程;
b)前記RNA配列を発現する前記細胞を検出する工程、
を含む方法が提供される。
全体的なプロトコール。開始材料:分子ビーコンは、プラスミド由来のRNAを全く発現しない細胞に導入され得るか、または、プラスミドでコードされたRNAメッセージを検出するのに使用され得る。ビーコンを、これら2種類の細胞に導入する方法は同一である。下記のプロトコールは、分析される細胞が互いに分離可能であり、その分離がFACS分析に従うことのみを必要とする。
ビーコンによる細胞の選択
1)ビーコンを細胞にトランスフェクトさせる。ビーコンは、RNAに内在する配列にハイブリダイズするか、または、天然のRNA配列に添加されたタグにハイブリダイズするかのいずれかによって、所望のRNAを認識するように設計されていなければならない。ビーコンの設計は、本明細書において詳細に論じられている。
一つ以上のRNAを発現する細胞株の生成
FACS選択の後、ポジティブと記録した細胞を、本明細書においてさらに詳細に記述されるように、適当な培養液中に維持することが可能である。この細胞は、目的のRNAを発現する細胞株となる。
Claims (15)
- 二つ以上の目的のRNAの少なくとも一つを発現する細胞を単離する方法であって、
a)目的の第1RNAをコードする第1DNAを細胞中に導入する工程;
b)少なくとも一つの目的の第2RNAをコードする第2DNAを前記細胞に導入する工程;
c)前記細胞を、前記第1RNAにハイブリダイズすると蛍光を発する第1分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第1RNAに対して相補的なヌクレオチドの領域と、互いに相補的なヌクレオチドの領域とを含むものとする工程;
d)前記細胞を、前記少なくとも第2RNAにハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第2分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第2RNAに対して相補的なヌクレオチドの領域と、互いに相補的なヌクレオチドの領域とを含むものとする工程;および、
e)蛍光活性化細胞ソーター技術を用いて、前記分子ビーコンの少なくとも一つが、その対応RNAにハイブリダイズした際に蛍光を示す細胞を単離する工程、
を含む方法。 - 二つ以上のRNAの少なくとも一つを発現する細胞を単離する方法であって、
a)少なくとも一つの第1タグ配列と結合した目的の第1RNAをコードする第1DNAを細胞中に導入する工程;
b)少なくとも一つの第2タグ配列と結合した少なくとも一つの目的の第2RNAをコードする第2DNAを前記細胞に導入する工程;
c)前記細胞を、第1タグ配列にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第1分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、第1タグ配列のRNA転写物に対して相補的なヌクレオチドの領域と、互いに相補的なヌクレオチドの領域とを含むものとする工程;
d)前記細胞を、第2タグ配列にハイブリダイズすると蛍光を発する少なくとも一つの第2分子ビーコンに曝露し、前記分子ビーコンは、前記第2タグ配列のRNA転写物に対して相補的なヌクレオチドの領域と、互いに相補的なヌクレオチドの領域とを含むものとする工程;および、
e)蛍光活性化細胞ソーター技術を用いて、前記分子ビーコンの少なくとも一つが、前記タグ配列の対応RNA転写物にハイブリダイズした際に蛍光を示す細胞を単離する工程、
を含む方法。 - 前記少なくとも第2タグ配列は、第1タグ配列と同じか、または、異なることを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第2分子ビーコンは、第1分子ビーコンのものと同じか、または、異なる蛍光物質を有する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1RNAの前記工程のいずれかが、前記少なくとも第2RNAの前記工程のいずれかと同時に、または継時的に実行される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記第1DNAおよび前記少なくとも第2DNAが、同じ構築体、または、異なる構築体上に存在する、請求項1または2に記載の方法。
- 前記二つ以上のRNAが同じか、または異なる、請求項1または2に記載の方法。
- 前記RNAはアンチセンスRNAである、請求項1または2に記載の方法。
- 前記単離された細胞は、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質の機能的発現を有しないか、または発現が低下しており、前記アンチセンスRNAは、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質の、事実上全てのmRNA,またはその転写物の実質的部分に結合する、請求項8に記載の方法。
- 前記DNAは、条件付プロモーターに作動可能に結合される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記プロモーターは誘導可能であり、前記細胞を分子ビーコンに曝露する前にインデューサーが適用される、請求項10に記載の方法。
- 工程a)の後に、ただし、前記細胞を前記分子ビーコンに曝露する前に細胞を選択する工程をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記少なくとも一つのDNAは少なくとも一つの薬剤耐性マーカーをさらにコードし、前記方法は、前記マーカーによって耐性を付与されて、少なくとも一つの薬剤に対して耐性を持つようになった細胞を選択する工程をさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 請求項1または2に記載のRNAを発現する非ヒトトランスジェニック動物を作製する方法であって、請求項1または2に記載の工程を実行すること、胚幹細胞を利用すること、前記幹細胞の生存率を決定すること、および、前記生存胚幹細胞を用いて、前記非ヒトトランスジェニック動物を生産することを含む方法。
- 前記RNAはアンチセンスRNAであり、前記非ヒトトランスジェニック動物は、アンチセンスRNAが、前記少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質のmRNA転写物の、事実上全て、またはその実質的部分に結合することによって、少なくとも一つのあらかじめ選択されたタンパク質の機能的発現を有しないか、または発現が低下している、請求項14に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
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