ES2379731T3 - Selección y aislamiento de células vivas utilizando sondas de unión a ARN - Google Patents

Abstract

Un método para detectar células que expresan una primera proteína o ARN que comprende las etapas de: (a) introducir en las células un primer constructo de ADN que codifica la primera proteína o ARN, en donde dicho primer transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha primera proteína está asociado con una primera etiqueta epitópica que proporciona una única secuencia de ácido nucleico diana p 5 ara su reconocimiento por una baliza molecular; (b) exponer dichas células a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de dicha etiqueta epitópica; y (c) detectar dichas células que muestran fluorescencia de dicha primera baliza molecular.

Description

Selección y Aislamiento de Células Vivas Utilizando Sondas de Unión a ARN

Antecedentes de la Invención

Una baliza molecular es una sonda de ácido nucleico que reconoce e informa de la presencia de una secuencia de ácido nucleico específica. Las sondas son secuencias con forma de horquilla con un tramo central de nucleótidos complementario a la secuencia diana, y extremos que comprenden secuencias cortas mutuamente complementarias. Un extremo está unido covalentemente a un fluoróforo y el otro a un radical de extinción. Cuando está en su estado nativo con los extremos hibridados, la proximidad del fluoróforo y el extintor es tal que no se produce fluorescencia. La baliza experimenta un cambio conformacional fluorogénico espontáneo cuando se hibrida con su ácido nucleico diana. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5.925.517.

Esta propiedad ha permitido a los investigadores detectar ácidos nucleicos específicos principalmente en reacciones in vitro y en algunos casos incluso en células vivas. Se ha logrado la visualización in situ del ARN mensajero utilizando balizas moleculares liberadas en las células vivas en liposomas (Matsuo, 1998, Biochim. Biophys. Acta 1379:178-184). Los métodos que utilizan balizas moleculares difieren de los métodos anteriores tales como la detección de elementos de la cromatina específicos mediante asociación con genes informadores como describen Zahn-Zabal et al. (J. Biotechnol. 87:29-42 (2001)). Los estudios que implican células han empleado hasta la fecha balizas generadas con el fluoróforo muy débil EDANS ya que éste era el único que se sabía que era extinguido por el extintor EDAC. Los resultados aunque apreciables son escasos y así la aplicabilidad de esta línea de investigación a la detección in vivo no era prometedora.

Compendio de la Invención

La presente invención proporciona particularmente un método para detectar células que expresan una primera proteína o ARN que comprende las etapas de:

(a)

introducir en las células un primer constructo de ADN que codifica la primera proteína o ARN, donde dicho primer transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha primera proteína está asociado con una primera etiqueta epitópica que proporciona una única secuencia de ácido nucleico diana para su reconocimiento por una baliza molecular;

(b)

exponer dichas células a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de dicha etiqueta epitópica; y

(c)

detectar dichas células que muestran la fluorescencia de dicha primera baliza molecular.

También se describe en la presente memoria un método para generar una línea celular que expresa al menos una proteína preseleccionada que comprende las etapas de:

a) transfectar una línea celular con al menos un constructo de ADN que codifica al menos una proteína preseleccionada y al menos un marcador de resistencia a fármacos;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual dicho marcador confiere resistencia, transcribiendo dichas células el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer las células seleccionadas a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a un transcrito de ARN de la al menos una proteína preseleccionada;

d) aislar las células que emiten fluorescencia;

e) generar una línea celular que expresa la al menos una proteína preseleccionada haciendo crecer las células aisladas.

El método anteriormente mencionado se puede llevar a cabo utilizando la tecnología de clasificación de células activadas por fluorescencia. En un aspecto adicional, se puede elaborar la línea celular para expresar una segunda proteína preseleccionada llevando a cabo etapas adicionales incluyendo la transfección de la línea celular con un segundo constructo de ADN que codifica una segunda proteína preseleccionada y un segundo marcador de resistencia a un fármaco, la selección de las células que expresan el segundo marcador, la exposición de las células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a un transcrito de ARN de la segunda proteína preseleccionada y el aislamiento de las células que emiten fluorescencia de cada uno de los al menos uno y el segundo transcritos de ARNm. Se pueden proporcionar líneas celulares que expresan más de dos proteínas repitiendo las etapas. El método para introducir la segunda proteína se puede realizar simultáneamente o secuencialmente. Si el primer y el segundo marcador de resistencia a fármacos son los mismos, se puede lograr la selección simultánea aumentando el nivel del fármaco.

También se describe en la presente memoria un método para generar una línea celular que expresa al menos una proteína preseleccionada que comprende las etapas de:

a) transfectar una línea celular con al menos un constructo de ADN que codifica al menos una proteína preseleccionada, al menos un marcador de resistencia a fármacos y al menos una primera etiqueta epitópica;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual dicho marcador confiere resistencia, transcribiendo dichas células el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer las células a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de la primera etiqueta epitópica;

d) aislar las células que emiten fluorescencia; y

e) generar una línea celular que expresa la al menos una proteína preseleccionada haciendo crecer las células aisladas.

El método anteriormente mencionado se puede llevar a cabo utilizando la tecnología de clasificación de células activada por fluorescencia. La porción de ADN del constructo que codifica la etiqueta epitópica puede estar en marco

o fuera del marco con la porción del constructo de ADN que codifica la al menos una proteína. En una realización adicional, se puede elaborar una línea celular para que exprese al menos una segunda proteína preseleccionada; incluyendo las etapas adicionales la transfección de la línea celular con un segundo constructo de ADN que codifica la segunda proteína preseleccionada, un segundo marcador de resistencia a fármacos y una segunda etiqueta epitópica, la selección de las células que transcriben el segundo marcador, la exposición de las células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de la segunda etiqueta epitópica, y el aislamiento de las células que muestran fluorescencia de cada una de la primera y segunda etiquetas epitópicas. En el caso de las dos proteínas, la porción de la secuencia de ADN que codifica la segunda etiqueta epitópica también puede estar en marco o fuera del marco con la porción de la secuencia de ADN que codifica la segunda proteína. La segunda proteína preseleccionada se puede transfectar simultáneamente o secuencialmente con la primera. Se debe realizar el método simultáneamente, y utilizar el mismo marcador de resistencia a fármacos para ambos constructos, se puede utilizar un nivel superior de fármaco para seleccionar las células que expresan ambos constructos. Además, se pueden proporcionar más de dos proteínas en la línea celular repitiendo las etapas anteriormente mencionadas.

Además se describe en la presente memoria un método para generar una línea celular que expresa al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada que comprende las etapas de:

a) transfectar una línea celular con un constructo de ADN que codifica la al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada y al menos un gen de resistencia a fármacos;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual confiere resistencia dicho marcador, transcribiendo dichas células el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer las células a una baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a la molécula de ARN antisentido;

d) aislar las células que emiten fluorescencia; y

e) generar una línea celular que expresa la secuencia de ARN antisentido preseleccionada haciendo crecer las células aisladas.

El aislamiento de las células que emiten fluorescencia se puede llevar a cabo utilizando la tecnología de clasificación de células activada por fluorescencia. Se puede elaborar una línea celular para que exprese al menos una segunda molécula de ARN antisentido preseleccionada, incluyendo las etapas adicionales de transfectar simultáneamente o secuencialmente la línea celular con un segundo constructo de ADN que codifica una segunda molécula de ARN antisentido preseleccionada y un segundo marcador de resistencia a fármacos, seleccionar para la expresión celular el segundo marcador, exponer las células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a la segunda molécula de ARN antisentido, y aislar las células que muestran fluorescencia de cada uno de los al menos uno y el segundo transcritos de ARNm. Si se realiza el método simultáneamente y se utiliza el mismo marcador de resistencia a fármacos en ambos constructos, se puede lograr la selección utilizando un nivel superior de fármaco. Se pueden proporcionar más de dos moléculas de ARN antisentido repitiendo las etapas anteriormente mencionadas con otro constructo.

Se describe adicionalmente en la presente memoria un método para generar una línea celular que expresa al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada que comprende las etapas de:

a) transfectar una línea celular con un constructo de ADN que codifica la al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada, al menos un marcador de resistencia a fármacos y una primera secuencia de nucleótidos de etiqueta epitópica;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual confiere resistencia dicho marcador, transcribiendo dichas células el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer las células seleccionadas a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a un primer transcrito de ARNm de la primera etiqueta epitópica;

d) aislar las células que emiten fluorescencia; y

e) generar una línea celular que expresa la al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada haciendo crecer las células aisladas.

Se puede elaborar una línea celular que expresa al menos un segundo ARN antisentido preseleccionado con una etiqueta epitópica, incluyendo las etapas adicionalmente la transfección de la línea celular con un segundo constructo de ADN que codifica una segunda molécula de ARN antisentido con una etiqueta epitópica preseleccionada, un segundo marcador de resistencia a fármacos; seleccionar las células que expresan el segundo marcador, exponer las células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a un transcrito de ARN de la segunda etiqueta epitópica; y aislar las células que muestran fluorescencia tanto del al menos uno como del segundo transcritos de ARNm. Estas etapas se pueden llevar a cabo simultáneamente o secuencialmente con la primera. La selección utilizando la transfección simultánea con ambos constructos que tienen el mismo marcador de resistencia a fármacos se puede lograr utilizando un nivel superior de fármaco. Se pueden llevar a cabo etapas adicionales para introducir más de dos moléculas antisentido con etiquetas epitópicas.

Los métodos anteriores se pueden utilizar para preparar células que expresan moléculas de ARN antisentido o cualquier otro tipo de molécula de ARN, incluyendo pero no limitado a, ARN estructurales, incluyendo ARNr, asi como ARNhn y ARNsn. Además, se debe observar que en todos los métodos en los que se proporciona una etiqueta epitópica para la detección mediante una baliza molecular del constructo transfectado resulta intrascendente si la etiqueta epitópica está en marco o fuera del marco con la proteína codificada, con tal que la secuencia de la etiqueta epitópica sea detectable por la baliza molecular.

Adicionalmente se describe en la presente memoria un método para aislar las células que expresan al menos una proteína o ARN que comprende las etapas de:

a) proporcionar células que se sospecha que expresan la al menos una proteína;

b) exponer las células a al menos una baliza molecular que emite fluorescencia después de la hibridación con un transcrito de ARNm que codifica la al menos una proteína;

c) aislar las células que emiten fluorescencia.

Se puede utilizar la tecnología de clasificación celular activada por fluorescencia para aislar las células que emiten fluorescencia. La proteína puede ser, a modo de ejemplo no limitante, una proteína localizada en la superficie celular

o una proteína intracelular. También se puede detectar cualquier otro ARN. El método también se puede utilizar para identificar células que expresan una segunda proteína o ARN, utilizando una segunda baliza molecular que emite fluorescencia después de la hibridación cuando su ARN diana es expuesto a las células, las células que tienen fluorescencia de cada una de la primera y la segunda balizas moleculares se aíslan. También se puede lograr la expresión simultánea de más de dos proteínas.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para cuantificar el nivel de expresión de al menos un transcrito de ARN en una muestra biológica que comprende las etapas de:

a) exponer la muestra biológica a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN;

b) cuantificar el nivel de fluorescencia en la muestra biológica; y

c) correlacionar el nivel de fluorescencia con el nivel del al menos un transcrito de ARN.

La muestra biológica puede ser una muestra celular o una muestra de tejido. La muestra puede estar fijada. El transcrito de ARN puede ser, pero no está limitado a, un ARN que codifica una proteína, un ARN estructural, o un ARN antisentido. La fluorescencia puede ser cuantificada mediante microscopía de fluorescencia o tecnología de clasificación celular activada por fluorescencia. El nivel de expresión de al menos un segundo transcrito de ARN también se puede cuantificar en la muestra biológica utilizando una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a un segundo transcrito de ARN.

Adicionalmente se describe en la presente memoria un método para generar una línea celular que sobreexpresa al menos una proteína que comprende las etapas de:

a) transfectar células con al menos dos secuencias de ADN, una secuencia que tiene una porción que codifica la proteína, al menos una etiqueta epitópica, y al menos un marcador de resistencia a fármacos; y una segunda secuencia que tiene una porción que codifica la proteína, al menos una segunda etiqueta epitópica, y al menos un segundo marcador de resistencia a fármacos.

b) seleccionar las células transfectadas con las al menos dos secuencias de ADN por la expresión del primer y el segundo marcadores de resistencia a fármacos;

c) exponer las células seleccionadas a una primera y una segunda balizas moleculares, que emiten cada una fluorescencia tras la hibridación a las secuencias de nucleótidos de los transcritos de ARN de la primera y la segunda etiquetas epitópicas respectivamente;

d) aislar las células que muestran fluorescencia de cada una de la primera y la segunda balizas moleculares; y

e) generar una línea celular que sobreexpresa dicha al menos una proteína preseleccionada haciendo crecer las células aisladas.

En la descripción anterior, las al menos dos secuencias de ADN pueden residir en el mismo constructo. La primera y la segunda etiquetas epitópicas pueden estar cada una independientemente en marco o fuera del marco con la proteína. Se puede utilizar FACS para aislar las células que expresan ambos constructos aislando las células que expresan la fluorescencia más fuerte. Como con los métodos anteriores descritos en la presente memoria, la transfección se puede realizar simultáneamente o secuencialmente. Se puede lograr la selección cuando se encuentra presente el mismo marcador de resistencia a fármacos en ambos constructos y se realiza simultáneamente la transfección incrementando el nivel de fármaco.

En un aspecto adicional, se describe un método para generar una línea celular que sobreexpresa al menos una molécula de ARN antisentido que comprende las etapas de:

a) transfectar células con al menos dos secuencias de ADN, una secuencia que tiene una porción que codifica la proteína, al menos una etiqueta epitópica, y al menos un marcador de resistencia a fármacos; y una segunda secuencia que tiene una porción que codifica la proteína, al menos una segunda etiqueta epitópica, y al menos un segundo marcador de resistencia a fármacos;

b) seleccionar células transfectadas con las al menos dos secuencias de ADN mediante la expresión del primer y el segundo marcadores de resistencia a fármacos;

c) exponer las células seleccionadas a una primera y una segunda balizas moleculares que emiten cada una fluorescencia tras la hibridación a las secuencias de nucleótidos de los transcritos de ARN de la primera y la segunda etiquetas epitópicas respectivamente;

d) aislar las células que muestran fluorescencia de cada una de la primera y segunda balizas moleculares; y

e) generar una línea celular que sobreexpresa dicha al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada haciendo crecer las células aisladas.

Las al menos dos secuencias de ADN pueden residir en el mismo constructo. La primera y la segunda etiquetas epitópicas pueden estar cada una independientemente en marco o fuera de marco con la molécula de ARN antisentido. Las condiciones y los métodos alternativos para lograr el producto deseado se han comentado más arriba. Además, se puede proporcionar cualquier forma de ARN.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para generar células funcionalmente nulas para la expresión de al menos una proteína o ARN preseleccionados que comprende las etapas de proporcionar en las células una pluralidad de ARN antisentido para la proteína o ARN preseleccionados, donde la pluralidad de ARN antisentido para los al menos una proteína o ARN preseleccionados se une esencialmente a todos los transcritos de ARN del ARNm u otro ARN que se vaya a eliminar. En el caso de elaborar células nulas para una proteína preseleccionada, la proteína preseleccionada puede ser específicamente solamente una o un subgrupo de formas empalmadas alternativamente de un producto génico.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para generar un animal no humano transgénico que es un mutante de expresión funcionalmente nula de al menos una proteína preseleccionada que comprende llevar a cabo las etapas descritas anteriormente utilizando células troncales embrionarias no humanas, determinar la viabilidad de las células troncales funcionalmente nulas que expresan la proteína preseleccionada, y utilizar las células troncales embrionarias no humanas viables para producir el animal no humano transgénico.

Asimismo se describe en la presente memoria un método para generar una línea celular que tiene una expresión funcionalmente nula para al menos una proteína y sobreexpresa al menos otra proteína que comprende llevar a cabo los métodos descritos en la presente memoria en las mismas células. Además, se describe un método para generar una línea celular que expresa un ARN antisentido letal bajo el control de un promotor inducible llevando a cabo los métodos anteriores donde la etapa (a) se realiza en presencia de una cantidad mínima de un inductor.

Un método para identificar eventos de recombinación genética en células vivas que comprende las etapas de:

a) exponer una célula a una baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con una secuencia de ARN seleccionada del grupo que consiste en aquel transcrito a partir de una secuencia recombinada y aquel transcrito a partir de la secuencia no recombinada;

b) detectar o clasificar dichas células.

La detección y/o clasificación de las células se pueden realizar mediante FACS o microscopio.

Asimismo se describe en la presente memoria una sonda de hibridación unitaria que genera actividad proteolítica, referida en la presente memoria como proteasa sonda. Dichas proteasas sonda funcionan de una manera similar a una baliza molecular, pero en lugar de un cambio en la fluorescencia en la interacción de la baliza con su secuencia de ácido nucleico diana, la proteasa sonda se vuelve proteolítica en presencia de la diana. La composición de la proteasa sonda proporciona en un extremo de un oligonucleótido de tipo baliza una proteasa, y en el otro, un inhibidor de proteasa complementario. Cuando el oligonucleótido no está hibridado a la secuencia diana, la proximidad de los extremos del oligonucleótido permite que la proteasa y el inhibidor de proteasa interaccionen, inhibiendo la actividad proteolítica de la proteasa. No obstante, tras la hibridación de la secuencia diana del oligonucleótido a la diana, la proteasa y su inhibidor se separan, activando la proteasa. La actividad de la proteasa se puede medir fácilmente, y además, se puede emplear la proteasa activa en presencia de una secuencia diana de ácido nucleico concreta no solamente con fines de detección sino también con fines terapéuticos, en los que, por ejemplo, una célula en la cual es liberada la proteasa sonda se somete a proteolisis y se vuelve no viable si se transcribe un gen concreto, por ejemplo, uno relacionado con la transformación celular, la oncogénesis, la desproliferación, y similares.

La sonda anteriormente mencionada puede tener un inhibidor de enzima proteolítica que sea un péptido u otra molécula capaz de inactivar de manera reversible la enzima. Los ejemplos no limitantes de enzimas e inhibidores incluyen aminopeptidasa y amastatina, proteasas de cisteína de tipo tripsina y antipaína, aminopeptidasa y bestatina, proteasas de cisteína de tipo quimotripsina y quimostatina, aminopeptidasa y diprotina A o B, carboxipeptidasa A y EDTA, proteasas de serina de tipo elastasa y elastinal, y termolisina o aminopeptidasa M y 1,10-fenantrolina.

Descripción Detallada de la Invención

La invención de la presente memoria se basa en la capacidad de las sondas moleculares para identificar secuencias de ARN en células vivas, y el uso de la tecnología de clasificación de células por fluorescencia o tecnología relacionada para identificar y/o separar células que muestran cierto nivel o niveles de fluorescencia a una o más longitudes de onda. Se sabe ahora que EDAC puede extinguir las emisiones de una variedad de los fluoróforos más fuertes comúnmente utilizados. La capacidad de detectar claramente y eficazmente los ARNm así como otros ARN en las células vivas permite su uso para identificar y, si se desea, separar células basándose en sus características deseadas, por ejemplo utilizando un Clasificador Celular Activado por Fluorescencia (FACS). La aplicación proporciona numerosos métodos que simplifican y reducen enormemente el tiempo necesario para llevar a cabo procedimientos previamente conocidos, y también ofrece nuevos enfoques. Los estudios llevados a cabo hasta ahora que implican balizas y células vivas no muestran una diferencia significativa por encima del control. El problema se elimina primero utilizando fluoróforos más fuertes, y también modificando balizas de manera que el número de nucleótidos que forman la porción troncal de la molécula en horquilla sea mayor que el de la longitud clásica de cinco o seis nucleótidos que se utiliza. Esto hace más probable que la molécula se mantenga en su estado en horquilla, no fluorescente en ausencia de la secuencia diana, reduciendo de ese modo el fondo.

Con la metodología descrita anteriormente es posible generar líneas celulares transfectadas establemente que expresan ARN con diferentes papeles: esto es, algunas de las cuales ni codifican una proteína ni actúan como ARN antisentido pero que sin embargo son expresadas por células, otras de las cuales sirven como ARN mensajeros, y otras de las cuales son ARN antisentido para las dos clases ya enumeradas. Estos otros ARN incluyen ARN estructurales tales como ARN ribosómicos, ARNhn, ARNsn, etc.

1. Generación de Líneas Celulares que Expresan Proteínas Algunas de las etapas más tediosas implicadas en la generación de líneas celulares se eliminan mediante la aplicación de balizas moleculares como se describe en la presente memoria. Después de la selección con fármacos de las células transfectadas con un constructo de ADN que codifica un gen deseado así como la resistencia a un fármaco, se introducen en estas células balizas moleculares diseñadas para reconocer el mensaje del gen de interés. Esas células que transcriben el gen emitirán fluorescencia. El posterior análisis con FACS da como resultado el aislamiento de las células fluorescentes que después se hacen crecer para dar lugar a líneas celulares que expresan el gen de elección.

Si la baliza diseñada para reconocer un mensaje de interés es capaz de detectar secuencias diana existentes de manera endógena, la proporción de estas en comparación con la proporción de la secuencia diana producida por las células transfectadas es tal que el clasificador es capaz de discriminar los dos tipos de células. Como alternativa, el problema de la fluorescencia endógena se elimina etiquetando el gen de interés con una etiqueta epitópica y diseñando la baliza de manera que reconozca la secuencia de nucleótidos que codifica la etiqueta. Estos nucleótidos también pueden estar en marco con el mensaje del gen o fuera del marco con él, dependiendo de si se desea etiquetar la proteína producida.

Adicionalmente, el nivel de expresión del gen de interés en cualquier célula dada puede variar. Aquí se aplica el FACS para evaluar los niveles de expresión: se utiliza para seleccionar diferencialmente las células individuales que expresan el mismo gen.

2.

Generación de Líneas Celulares que Expresan Antisentido Existen varios estudios que describen la generación de líneas celulares que expresan no el ARN que codifica una proteína, sino el que es antisentido de un gen o una porción de un gen. Tales métodos pretenden reducir la cantidad de una proteína específica en una célula dada. Las etapas descritas más arriba para la generación de líneas celulares que expresan proteínas son igualmente aplicables aquí y virtualmente idénticas excepto que aquí la baliza se diseña para detectar un ARN que es un ARN antisentido. No todos los intentos para elaborar líneas celulares que expresan antisentidos transfectadas establemente dan como resultado líneas celulares en las que la expresión de la proteína diana resulta suficientemente afectada. Esta dificultad hace menos útil continuar con la producción de tales líneas celulares. Sin embargo, dada la facilidad del procedimiento descrito aquí, se analiza fácilmente la eficacia de numerosas secuencias genéticas diferentes para determinar su capacidad para producir líneas celulares que expresan antisentidos activos.

3.

Diferenciación Entre Células Basadas en Antígenos Localizados en la Superficie Celular Los inmunólogos y otros han utilizado durante mucho tiempo el FACS para clasificar las células. De acuerdo con la presente invención, para detectar la presencia de una proteína localizada en la superficie celular, se elabora una baliza que tiene como diana el ARNm que codifica la proteína de interés. La baliza es introducida en las células mediante transfección y después se utiliza para aislar las células con puntuación positiva.

Adicionalmente, actualmente se utiliza FACS para clasificar células basándose en la expresión de hasta tres proteínas localizadas en su superficie celular. Esta característica del FACS se verifica mediante el uso de balizas moleculares como se describe en la presente memoria si se utiliza una combinación de balizas, cada una dirigida al ARNm de una de las proteínas de interés, y cada una marcada de manera diferente. Se realizan múltiples rondas de clasificación para clasificar las células basadas en más de tres ARN expresados.

4.

Análisis de Células para determinar la Expresión de ARN Específicos y Cuantificación del Nivel de Expresión del ARN en las Células. Si el ARN diana de una baliza molecular que es introducida en una célula está presente, la célula emitirá fluorescencia. Esta información se puede evaluar cualitativamente mediante el uso del Microscopio de Fluorescencia o el FACS, y también es cuantificable por medio de cualquiera de estos. Por ejemplo, en lugar de realizar una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa in situ (RT-PCR) en porciones de tejidos para determinar un patrón de expresión para un ARN concreto, se utiliza una baliza para llevar a cabo el mismo experimento. Por otra parte, utilizando una combinación de balizas moleculares con diferente fluorescencia, dirigiéndose cada una a un ARN específico, se analiza la presencia o cantidad de varios ARN de interés en una etapa.

5.

Localización de Antígenos Combinada con la Detección de ARN en Células y Tejidos Utilizando células o porciones de tejidos fijados, se utiliza la inmunocitoquímica para describir la localización de los antígenos proteicos reconocidos, y utilizando Balizas Moleculares que se dirigen a ARN específicos, se colocalizan en las mismas muestras los ARN de interés. Se ha demostrado que las Balizas Moleculares dirigidas a los ARN funcionan en las células fijadas.

6.

Generación de Líneas Celulares que Expresan Múltiples Proteínas Utilizando los métodos de la presente invención, se pueden generar muy rápidamente líneas celulares transfectadas establemente que expresan cualquier número de proteínas, incluso sin la necesidad de mantener estas células en presencia de una mezcla de numerosos fármacos selectivos. Después de la transfección de los genes y la selección con fármacos, se introduce en las células una combinación de balizas moleculares, una para cada mensaje de proteína. Diseñando la secuencia bucle de cada baliza para que hibride con el ARNm solamente de uno de los genes o con la secuencia de nucleótidos de solamente una de las etiquetas epitópicas (véase más arriba) con la cual pueden estar asociados los mensajes, cada baliza se diseña para que reconozca el ARNm codificado solamente por uno de los genes. Las células se clasifican después mediante FACS.

Seleccionando una, dos, o las tres señales fluorescentes, se genera una variedad de líneas celulares en una única aplicación.

Puede ser necesario producir una línea celular que exprese más de tres ARN de interés. Por ejemplo, sería altamente informativo tener una línea celular en la que se sobreexpresan todas las proteínas y las secuencias de ARN que se piensa que están implicadas en la formación de un complejo concreto. Para lograr esto, se repiten las etapas descritas más arriba utilizando células que ya expresan una combinación de ARN como las células anfitrionas en las cuales serían transfectados constructos adicionales que codificaran ARN adicionales.

Si los múltiples ARN que se van a expresar están todos clonados en constructos que confieren a las células resistencia al mismo fármaco, se utiliza el FACS para aislar las células que expresan todos los ARN deseados. Debido a que las secuencias son integradas establemente en el genoma, las células no pierden la expresión de ninguna de las secuencias. Sin embargo, es posible que una o más de las secuencias se pueda perder. Si es este el caso, se aumenta la concentración del fármaco de selección en el medio en el cual se hacen crecer las células, haciendo menos posible esta probabilidad. Como alternativa, se utilizan constructos que confieren cada uno resistencia a un fármaco diferente, y se mantienen las células en una mezcla de fármacos apropiados. Asimismo, se seleccionan un subgrupo de los constructos que se van a transfectar establemente en las células con el fin de codificar un gen de resistencia para un fármaco, y otro subgrupo para codificar un gen de resistencia para otro fármaco.

Por otra parte, si algunas células de una línea celular pierden un ARN de interés, en ese caso como una reclasificación, se realiza el primer experimento como se ha descrito más arriba para aislar la línea celular y se obtienen nuevas células. Como alternativa, la mezcla de células descrita se analiza mediante FACS, con el propósito de volver a aislar las células que expresan todos los ARN deseados. Este es un procedimiento muy útil ya que proporciona de nuevo células que dan lugar a una línea celular con la misma composición genética que la línea celular original seleccionada.

Los enfoques descritos más arriba proporcionan un suministro ilimitado de células que expresan cualquier combinación de proteínas y secuencias de ARN, susceptibles de métodos de análisis virtualmente ilimitados. Todavía es posible que una proteína que es sobreexpresada pueda resultar tóxica para la célula, y como se comentará más adelante, esta posibilidad puede ser fácilmente tratada.

Se debe observar que la facilidad con la cual es posible volver a aislar las células que expresan todos los ARN deseados de los clones de la línea celular donde la población de células incluye algunas células que ya no expresan todos los ARN, hace posible mantener líneas celulares en ausencia de fármaco o en presencia de concentraciones mínimas de fármaco.

7.

Generación de Líneas Celulares que Sobreexpresan Dramáticamente Una o Más Proteínas. Para cada gen que va a ser enormemente sobreexpresado, por ejemplo, se clonan primero dos o más secuencias para el mismo gen en constructos de ADN que confieren resistencia a fármacos. Se diseña cada una de las múltiples secuencias para cada gen para que incluya la secuencia que codifica una etiqueta epitópica diferente. Después de la transfección de los constructos de ADN en las células y la subsiguiente selección con fármacos, se introducen las balizas moleculares, cada una de las cuales está dirigida solamente a una etiqueta epitópica y marcada fluorescentemente de manera diferente en las células y se utiliza el clasificador celular para aislar las células positivas para sus señales. Estas células han integrado en sus genomas al menos una copia de cada uno de los genes etiquetados diferencialmente con secuencias epitópicas, y de este modo se produce la expresión de la secuencia de interés a partir de un número incrementado de copias que tienen esencialmente la misma secuencia de interés. Este método se utiliza junto con el uso de FACS para escoger aquellas células que puntúan más intensamente para la señal de cada fluoróforo.

8.

Generación de Líneas celulares que Expresan Múltiples ARN Antisentido. Las líneas celulares transfectadas establemente que producen múltiples mensajes antisentido se crean como sigue. Dichos mensajes antisentido se dirigen o bien a ARNm o bien a otros ARN. Se seleccionan células que expresan a diferentes niveles una cualquiera de las secuencias antisentido transfectadas. Por medio de rondas repetidas de transfecciones estables, se seleccionan fácilmente células que darían lugar a líneas celulares transfectadas establemente que expresan el mensaje antisentido de un número ilimitado de ARN.

Por supuesto, las células que expresan otros ARN distintos de los ARN antisentido se pueden preparar mediante los mismos métodos descritos en la presente memoria. Dichos ARN incluyen, pero no están limitados a ARNm, ARNr, otros ARN estructurales, ARNhn, o ARNsn.

9.

Generación de Líneas Celulares que Tienen Una o Más Proteínas Desactivadas. Los métodos descritos en la presente memoria proporcionan los medios para preparar desactivaciones funcionales en células cultivadas. Esto elimina la necesidad de intentar descifrar el papel de las proteínas humanas estudiando sus características de desactivación en levaduras o ratones. Se generan líneas celulares que

son desactivaciones funcionales de una cualquiera de las proteínas de interés generando células que expresan a partir de múltiples loci virtualmente el mismo ARN antisentido para una única secuencia de ARN. Por ejemplo, se transfectan establemente en las células múltiples constructos cada uno de los cuales codificaría el ARN antisentido para un gen concreto. Aquí cada secuencia de ARN antisentido difiere solamente en que cada una estaría etiquetada con la secuencia de nucleótidos de una única etiqueta epitópica. Se seleccionan aquellas células que expresan todos los ARN antisentido etiquetados diferencialmente. Debido a que el FACS se utiliza para cuantificar la fluorescencia como se ha descrito previamente, esta característica permite seleccionar aquellas células que expresan más fuertemente una o más cualesquiera de las secuencias antisentido.

Más importante, en este enfoque se utilizan diferentes secuencias antisentido que se dirigen al mismo gen. Por ejemplo, algunos de los ARN antisentido, cuya expresión se selecciona utilizando balizas moleculares y el FACS, se diseñan de manera que se dirijan a una región concreta del ARN mensajero para el gen, mientras otros se diseñan de manera que se dirijan a una porción alternativa del mismo mensajero. Con el fin de generar líneas celulares que sean desactivaciones funcionales de una proteína de interés, se transfectan establemente en las células muchas secuencias genéticas que codifican ARN antisentido similares o diferentes para el mismo gen de interés ya que es necesario para la producción de una línea celular que no muestre niveles de expresión detectables de la proteína de interés, o alternativamente, niveles de expresión aceptablemente bajos.

Por otra parte, se generan líneas celulares en las cuales están funcionalmente desactivadas múltiples proteínas repitiendo el procedimiento descrito más arriba a la vez que el antisentido busca cualquier número de secuencias para desactivarlas funcionalmente. Por ejemplo, para estudiar la función de un complejo de proteínas, se desactivan todas o cualquier combinación de las proteínas que forman el complejo.

10.

Generación de Líneas Celulares Que son Desactivaciones Funcionales Solamente de Formas Empalmadas Alternativamente Seleccionadas de Uno o Más Genes. Las versiones diferencialmente empalmadas de un único gen son a menudo traducidas a proteínas con diferentes funciones. Utilizando los métodos descritos en la presente memoria se generan líneas celulares que son desactivaciones funcionales solamente de formas empalmadas alternativamente seleccionadas de una o más proteínas. Por ejemplo, diseñando antisentidos que se dirijan solamente a esas versiones empalmadas alternativamente del ARN mensajero del gen que a uno le gustaría eliminar de la célula, se desactivan funcionalmente todos los ARN empalmados alternativamente del gen de interés excepto aquellos mensajes empalmados alternativamente que tienen interés.

11.

Generación de Líneas Celulares que Expresan Una o Más Proteínas a la Vez que se Desactivan Funcionalmente Una o más Proteínas Diferentes. Con la metodología descrita antes es posible generar líneas celulares transfectadas establemente que expresan ARN con diferentes papeles: esto es, algunos de los cuales ni codifican una proteína ni actúan como ARN antisentido pero que sin embargo son expresados por células, otros que sirven como ARN mensajeros, y otros que son ARN antisentido para las dos clases ya enumeradas. Estos incluyen, pero no están limitados a, ARN estructurales tales como ARN ribosómico, ARNhn, ARNsn, y otros ARNm.

Por ejemplo, para un grupo dado de proteínas que se piensa que interaccionan entre sí, se pueden estudiar sus interacciones generando líneas celulares transfectadas establemente en las que una o más de las proteínas de interés están funcionalmente desactivadas por la expresión en la célula de ARN antisentido. La función de las proteínas de interés restantes en la célula se puede estudiar después, pero quizás, más interesantemente, dicha célula se podría alterar adicionalmente manipulándola de manera que ahora sobreexprese una o más de las proteínas de interés restantes. Dicho hilo de pensamiento se puede impulsar infinitamente, permitiendo sobreexpresar o eliminar la expresión de proteínas adicionales en las células.

Los métodos descritos antes transforman la ciencia de las células de mamífero y otras células susceptibles de mantenimiento en cultivos de tejidos para permitir muchas manipulaciones genéticas nunca posibles anteriormente. Por primera vez, es posible generar desactivaciones funcionales en células humanas, y también sobreexpresar estas proteínas. De nuevo, es posible que la sobreexpresión de ciertas proteínas o una desactivación funcional de ciertas proteínas sea letal para las células. Este es un problema que se tratará más abajo.

12.

Generación de Ratones Transgénicos. Para algunos fines, el estudio de las células en cultivo no es suficiente. La metodología descrita más arriba, no obstante, también se presta a la manipulación de células troncales embrionarias. Se pueden obtener células troncales embrionarias no humanas que o bien pueden expresar múltiples proteínas o bien actúan como desactivaciones funcionales de múltiples proteínas o un subgrupo de las formas empalmadas alternativamente de múltiples proteínas, etc. siguiendo los procedimientos anteriores. Dichas células troncales embrionarias no humanas se utilizan después como base para la generación de animales no humanos con genes desactivados. Utilizando estos procedimientos, se determina antes de realizar un intento para generar un animal no humano con un gen

desactivado si el experimento dará como resultado un fenotipo letal. Por ejemplo, si una proteína que es esencial es desactivada funcionalmente en células troncales embrionarias no humanas, en ese caso tales células pueden no sobrevivir después de su aislamiento por medio de FACS.

13.

Generación de Líneas Celulares Transfectadas Establemente Inducibles. La sobreexpresión o la carencia de expresión de ciertas proteínas o ARN en las células puede resultar letal. Puede tener una importancia crítica para estudiar una célula que sobreexpresa una proteína o un ARN tóxicos, o uno que es una desactivación funcional de una proteína o un ARN sin los cuales la célula es incapaz de sobrevivir. Con este fin, se generan células transfectadas establemente en las que los ARN seleccionados que tienen dichos efectos perjudiciales sobre la célula están bajo el control de promotores inducibles. Para aislar dichas líneas celulares, las células transfectadas y seleccionadas con fármacos se inducen primero mínimamente para que afecten a la transcripción de los genes inducibles, y después se someten las células a análisis FACS después de la transfección en ellas de las balizas moleculares diseñadas para reconocer los ARN apropiados. Las células obtenidas se mantienen de manera que los ARN tóxicos no sean inducidos y se transcriban solamente cuando sea necesario.

Los sistemas inducibles pueden ser ventajosos para aplicaciones distintas de la expresión de ARN tóxicos. Por ejemplo, se induce la expresión de secuencias genéticas transfectadas establemente en las células en un cierto punto durante el ciclo celular de una línea celular sincronizada. Como alternativa, si se piensa que los productos expresados de un grupo de una o más secuencias genéticas transfectadas establemente actúan sobre los productos expresados de otro grupo, en ese caso tiene interés clonar las secuencias genéticas del primer grupo bajo el control de un promotor inducible,

y las del segundo grupo bajo el control de un segundo promotor inducible. Por medio de inducciones variadas, se estudian los productos expresados codificados por cualquiera de los grupos de secuencias genéticas ya sea en ausencia o en presencia de los productos expresados del otro grupo.

14.

Detección de Eventos Recombinatorios Genéticos en Células Vivas y Posterior Aislamiento de Células No Recombinadas o Recombinadas Diferencialmente Paralelo al uso de balizas moleculares para detectar los eventos recombinatorios que conducen a líneas celulares estables se encuentra el uso de balizas para detectar y aislar de una mezcla de células vivas aquellas células que han experimentado otros eventos recombinatorios específicos. Se puede utilizar el mismo principio para el análisis en busca de la recombinación de VDJ, la translocación, y la integración en el genoma viral, por ejemplo.

En los eventos de recombinación celular, por ejemplo, se puede cambiar una secuencia de ADN genómico por otra. Si se transcribe a ARN una secuencia de ADN que codifica una región en la que se ha producido un evento recombinatorio, la presencia de dicho evento es detectada mediante una baliza molecular diseñada para reconocer o bien el ADN transcrito a partir de la secuencia de ADN no recombinada, o bien aquel que es transcrito a partir de la secuencia recombinada. Dicho análisis también se lleva a cabo por medio de un Microscopio de Fluorescencia. Si se quisieran separar cada una de las células que se han recombinado de las que no, se someterían las células al FACS y se clasificarían. Además, se utiliza el FACS para clasificar células basándose en la presencia o ausencia en ellas de numerosos eventos recombinantes.

15.

Clasificación de Células Basándose en los ARN Expresados. El uso de balizas moleculares como se describe en la presente memoria permite clasificar las células basándose en su expresión de proteínas localizadas internamente así como de proteínas contra las cuales no se pueden generar anticuerpos. Por ejemplo, partiendo de una población mixta de células, se aíslan aquellas que expresan proteínas localizadas internamente de interés diseñando balizas moleculares que reconocen los ARNm que dan lugar a esas proteínas. Estas balizas moleculares son transfectadas a la mezcla de células y se utiliza el FACS para clasificarlas según sea apropiado. Se pueden llevar a cabo múltiples rondas de clasificación. Adicionalmente, un investigador puede estar interesado, por ejemplo, en aislar células que son inducidas tras la estimulación por una citoquina para expresar el ARNm de una o más proteínas específicas entre aquellas que fracasan al ser inducidas de un modo similar. Con este fin, se induce primero una mezcla de células por medio de la citoquina, después se transfectan con las balizas cada una de las cuales se diseña para que reconozca el ARNm que daría lugar a una de las proteínas de interés. Luego se utiliza el FACS para aislar aquellas células que puntúan positivamente para el ARNm de interés. En una realización alternativa, también se pueden analizar células infectadas con un virus, por ejemplo, para determinar la expresión de un gen concreto.

Con la metodología descrita en la presente memoria es posible detectar células positivas para la presencia de ARN con diferentes papeles: esto es, algunas que ni codifican proteínas ni actúan como ARN antisentido pero que sin embargo son expresadas por las células, otras que sirven como ARN mensajeros, y otras que son ARN antisentido para las dos clases ya enumeradas. Estos incluyen, pero no están limitados a, ARN estructurales tales como ARN ribosómico, ARNhn, ARNsn, y otros distintos de ARNm.

16.

Detección In Vivo de �?cidos Nucleicos, en Relación con la Posterior Selección de Células. Debido a que la química requerida está bien caracterizada, se pueden modificar las balizas moleculares de muchas maneras, dando lugar a nuevas posibilidades. Por ejemplo, las células que expresan un ARNm específico cuya expresión conduce a una transformación maligna de la célula se destruyen selectivamente, mientras las células que no expresan este ARNm son más o menos no afectadas, como se describe más abajo. Se selecciona una baliza molecular que consiste en un oligonucleótido diseñado para que reconozca e hibride con una secuencia de ácido nucleico específica contenida en un gen de interés que es transcrito en algunas de una mezcla de células. El oligonucleótido tiene anclada covalentemente a un extremo una proteasa, y en su otro extremo una o más moléculas del inhibidor de la proteasa, por ejemplo, un inhibidor peptídico. Obsérvese que es importante para el oligonucleótido utilizado sintetizar una baliza tal que tenga extremos que puedan hibridar entre sí, como en el caso de las balizas moleculares. Con tal que la molécula descrita mantenga su estructura en horquilla, el inhibidor de péptido de un extremo de la molécula estará suficientemente cerca de la proteasa que está en el otro extremo como para afectar a la inhibición. Para facilitar el debate, dichas moléculas serán referidas como Proteasas Sonda.

Tras la transfección de las proteasas sonda en las células que expresan el ARN que es reconocido por una Proteasa Sonda, la Proteasa Sonda hibrida con su diana. Esto ocasiona la activación de la proteasa ya que en su estado hibridado la proteasa ya no está en las proximidades de su inhibidor peptídico. Una célula en la que está presente y es reconocida la diana de semejante Proteasa Sonda resulta dañada y de este modo es seleccionada.

Adicionalmente, las Proteasas Sonda son útiles en otras aplicaciones diferentes. Por ejemplo, dada una mezcla de células en la que algunas de las células están infectadas por un virus concreto, se introduce en las células una Proteasa Sonda que se dirige específicamente al ARNm viral. Las células que portan este ARNm activan la actividad proteolítica de la Proteasa Sonda que contienen, y esto destruye estas células.

Con el método descrito aquí más arriba es posible generar líneas celulares transfectadas establemente que expresan ARN con diferentes papeles: esto es, algunos que nunca codifican proteínas ni actúan como ARN antisentido pero que sin embargo son expresados por células, otros que sirven como ARN mensajeros, y otros que son ARN antisentido para las dos clases ya enumeradas.

Basándose en la descripción anterior, se pueden llevar a cabo los siguientes métodos.

Se describe un método para generar una línea celular que expresa al menos una proteína preseleccionada que comprende las etapas de:

a) transfectar líneas celulares con al menos un constructo de ADN que codifica dicha al menos una proteína preseleccionada y al menos un marcador de resistencia a fármacos;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual confiere resistencia dicho marcador, transcribiendo dichas células el al menos un constructo de ADN y el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer dichas células seleccionadas a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a un transcrito de ARN de dicha al menos una proteína preseleccionada;

d) aislar dichas células que emiten fluorescencia;

e) generar una línea celular que expresa dicha al menos una proteína preseleccionada haciendo crecer dichas células aisladas.

En este método, el aislamiento de dichas células que emiten fluorescencia se puede llevar a cabo utilizando la tecnología de clasificación de células activadas por fluorescencia. La línea celular se puede preparar adicionalmente para expresar una segunda proteína preseleccionada, ya sea de una manera simultánea o sucesiva, incluyendo las etapas adicionales de transfectar la línea celular con un segundo constructo de ADN que codifica una segunda proteína preseleccionada y un marcador de resistencia a fármacos; seleccionar las células que expresan dicho segundo marcador; exponer dichas células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a un transcrito de ARN de dicha segunda proteína preseleccionada y aislar las células que muestran fluorescencia de cada uno de dicho al menos uno y dicho segundo transcritos de ARN. En este momento, la tecnología actual permite la detección de hasta tres fluoróforos diferentes durante un procedimiento de clasificación celular, en el presente, el procedimiento anterior se puede repetir simultáneamente para obtener la expresión de hasta tres proteínas diferentes. Si se desea, se puede utilizar después una línea celular que expresa tres proteínas diferentes como punto de partida para la introducción de más proteínas siguiendo el procedimiento.

El constructo de ADN utilizado para la transfección puede codificar un único gen y un marcador de resistencia a fármacos, o genes adicionales con los correspondientes marcadores. Se puede lograr una transfección satisfactoria de cada gen por medio de la selección con el correspondiente fármaco. Como se ha observado más arriba, ya se realice la introducción de los genes adicionales simultáneamente o secuencialmente, el número de mensajes detectables expresados de una vez puede estar limitado por la tecnología de fluorescencia, pero el método se puede llevar a cabo repetidamente para añadir más genes. Si se pueden detectar hasta tres fluoróforos, se pueden introducir hasta tres genes de una vez.

Se describe un enfoque relacionado en el que se utiliza una etiqueta epitópica asociada con el gen transfectado como diana para la baliza molecular, permitiendo la selección de células que expresan proteínas cuyos ARNm pueden ser difíciles de identificar sobre el fondo, por ejemplo, si la baliza molecular detecta una especie de ARN íntimamente relacionada. Por consiguiente, se proporciona un método para generar una línea celular que expresa al menos una proteína preseleccionada que comprende las etapas de:

a) transfectar una línea celular con al menos un constructo de ADN que codifica dicha al menos una proteína preseleccionada, al menos un marcador de resistencia a fármacos y al menos una primera etiqueta epitópica;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual confiere resistencia dicho marcador, transcribiendo dichas células el al menos un constructo de ADN y el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer dichas células a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de dicha primera etiqueta epitópica;

d) aislar dichas células que emiten fluorescencia; y

e) generar una línea celular que expresa dicha al menos una proteína preseleccionada haciendo crecer dichas células aisladas.

Los métodos son esencialmente los mismos que se han descrito previamente, excepto que las balizas moleculares que se utilizan se diseñan para que reconozcan la etiqueta epitópica en lugar del transcrito de ARN de la proteína introducida deseada. Una ventaja de este procedimiento sobre el anterior es que solamente se necesita un pequeño número de balizas moleculares, correspondientes al número de etiquetas epitópicas diferentes para preparar una gran número de líneas celulares diferentes que expresan una o más proteínas. Como la tecnología de clasificación por fluorescencia está limitada actualmente a tres fluoróforos, solamente son necesarias en este método tres balizas diferentes. Puesto que la tecnología posterior debe permitir aumentar el número de fluoróforos que se van a detectar simultáneamente, éste se puede incrementar. Sin embargo, se pueden añadir hasta tres proteínas introducidas de una vez, después las células transfectadas satisfactoriamente con los tres genes se pueden utilizar como punto de partida para la adición de genes adicionales.

Los ejemplos de las etiquetas epitópicas que se pueden utilizar en la invención, y para las cuales se pueden preparar balizas incluyen, pero no están limitados a, HA (proteína hemaglutinina de influenza), myc, his, proteína C, VSV-G, FLAG, o FLU. Estas y otras etiquetas epitópicas son conocidas por los expertos en la técnica. Según se utiliza en la presente memoria, la etiqueta epitópica proporciona una secuencia de ácido nucleico única para el reconocimiento por una baliza molecular. Que la secuencia de ácido nucleico esté o no en marco o fuera del marco con la proteína codificada en un constructo no es crítico, la baliza molecular puede reconocer cualquiera. De este modo, el ARN transcrito que porta la secuencia de ácido nucleico de la etiqueta epitópica no necesita ser traducida para la detección del transcrito por la baliza molecular.

Por supuesto, se puede utilizar el método anterior para introducir más de una proteína en las células, realizar las etapas adicionales simultáneamente o secuencialmente incluyendo transfectar la línea celular con un segundo constructo de ADN que codifica la segunda proteína preseleccionada, un segundo marcador de resistencia a fármacos y una segunda etiqueta epitópica, seleccionar las células que expresan dicho segundo marcador, exponer dichas células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de dicha segunda etiqueta epitópica, y aislar dichas células que muestran fluorescencia de cada una de dicha primera y dicha segunda etiquetas epitópicas. La segunda etiqueta epitópica puede estar en marco o fuera de marco con la porción de la secuencia de ADN que codifica dicha segunda proteína.

La selección de las células transfectadas satisfactoriamente se lleva a cabo mediante procedimientos convencionales de crecimiento de células en presencia del fármaco contra el cual se proporciona el marcador de resistencia a fármacos. Si la selección es para dos marcadores diferentes, estos se pueden seleccionar simultáneamente o secuencialmente. Si se utiliza el mismo marcador de resistencia a fármacos en dos constructos transfectados diferentes, puede ser necesario un nivel superior de fármaco para seleccionar las células transfectadas con ambos constructos, para estimar el efecto de la dosis.

Los métodos anteriores para preparar líneas celulares que expresan una o más proteínas pueden ser los mismos que se aplican fácilmente para generar líneas celulares que expresan una o más moléculas de ARN antisentido. El método comprende:

a) transfectar una línea celular con un constructo de ADN que codifica dicha al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada y al menos un gen de resistencia a fármacos;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual confiere resistencia dicho marcador, transcribiendo dichas células el al menos un constructo de ADN y el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer dichas células a una baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a dicha molécula de ARN antisentido;

d) aislar dichas células que emiten fluorescencia; y

e) generar una línea celular que expresa dicha secuencia de ARN antisentido preseleccionada haciendo crecer dichas células aisladas.

Todos los detalles de estos métodos se han descrito más arriba. En el caso en el que una baliza no pueda detectar el ARNm concreto, se puede utilizar el método de la etiqueta epitópica, esto es:

a) transfectar una línea celular con un constructo de ADN que codifica dicha al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada, al menos un marcador de resistencia a fármacos y una primera secuencia de nucleótidos de una etiqueta epitópica;

b) seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual confiere resistencia dicho marcador, transcribiendo dichas células el al menos un constructo de ADN y el al menos un marcador de resistencia a fármacos;

c) exponer dichas células seleccionadas a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a un transcrito de ARNm de dicha primera etiqueta epitópica;

d) aislar dichas células que emiten fluorescencia; y

e) generar una línea celular que expresa dicha al menos una molécula de ARN antisentido preseleccionada haciendo crecer dichas células aisladas.

Como se ha indicado más arriba, la ventaja del método de detección de la etiqueta epitópica es que no se tienen que elaborar balizas separadas para cada ARN antisentido; se necesitan balizas solamente para unas pocas etiquetas epitópicas, que se pueden utilizar en etapas sucesivas para introducir un gran número de moléculas antisentido, o para la sobreexpresión de una molécula en una línea celular. Naturalmente, los métodos anteriores se pueden repetir simultáneamente o secuencialmente para introducir dos o más moléculas de ARN antisentido en una línea celular dada.

Además, las células elaboradas para expresar una proteína o proteínas concretas se pueden utilizar como punto de partida para crear células que expresan proteínas y moléculas de ARN antisentido. Por supuesto, las células que expresan las moléculas antisentido se pueden utilizar como punto de partida para añadir proteínas expresadas, utilizando los métodos de la presente memoria. También se puede realizar la transfección simultánea de proteínas y moléculas antisentido, con las correspondientes balizas y, si se desea, etiquetas epitópicas. Las diferentes combinaciones de los procedimientos anteriormente mencionados están incluidas en la presente memoria.

Del mismo modo, se describen los métodos para aislar células que expresan al menos una proteína que comprenden las etapas de:

a) proporcionar células que se sospecha que expresan dicha al menos una proteína;

b) exponer dichas células a al menos una baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con un transcrito de ARNm que codifica dicha al menos una proteína;

c) aislar dichas células que emiten fluorescencia.

Estos métodos son particularmente útiles para proteínas que son proteínas localizadas en la superficie celular o proteínas intracelulares. No requieren el uso de sondas para las proteínas como tales, que puede resultar más difícil

o afectar a la célula de manera que no se puedan realizar más experimentos. Se puede identificar más de una proteína utilizando una pluralidad de balizas moleculares, hasta el número detectable simultáneamente por la tecnología utilizada para el aislamiento.

Naturalmente, los procedimientos mencionados anteriormente se pueden utilizar para cuantificar el nivel de expresión de al menos un transcrito de ARN en una muestra biológica comprendiendo las etapas de:

a) exponer la muestra biológica a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con dicho transcrito de ARN.

b) cuantificar el nivel de fluorescencia en la muestra biológica; y

c) correlacionar el nivel de fluorescencia con dicho nivel del al menos un transcrito de ARNm.

La muestra biológica puede ser una muestra celular o una muestra de tejido; estas pueden estar fijadas, por ejemplo, con formaldehído, glutaraldehído, o cualquier número de fijadores celulares conocidos que no interfieran en la detección del ARN utilizando balizas moleculares.

El transcrito de ARN detectado puede ser ARN que codifica una proteína, un ARN estructural, y un ARN antisentido. La fluorescencia puede ser cuantificada mediante microscopía de fluorescencia o tecnología de clasificación celular activada por fluorescencia. Se pueden cuantificar especies de ARN adicionales simultáneamente utilizando una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación a un segundo transcrito de ARN.

En otra utilización de los métodos anteriores, se describe un método para generar una línea celular que sobreexpresa al menos una proteína. Esto se logra transfectando las células con dos o más secuencias que codifican la misma proteína, seleccionando e identificando la expresión por medio de etiquetas epitópicas asociadas con las copias separadas del transcrito. Las etapas incluyen:

a) transfectar células con al menos dos secuencias de ADN, teniendo cada una de dicha secuencias una porción que codifica la proteína, al menos una etiqueta epitópica, y al menos un marcador de resistencia a fármacos, y una porción que codifica la misma proteína, al menos una segunda etiqueta epitópica, y al menos un segundo marcador de resistencia a fármacos:

b) seleccionar las células transfectadas con las al menos dos secuencias de ADN por medio de la expresión del primer y el segundo marcadores de resistencia a fármacos;

c) exponer las células seleccionadas a una primera y una segunda balizas moleculares, que emiten cada una fluorescencia tras la hibridación a las secuencias de nucleótidos de los transcritos de ARN de dicha primera y segunda etiquetas epitópicas, respectivamente;

d) aislar las células que muestran fluorescencia de cada una de la primera y segunda balizas moleculares; y

e) generar una línea celular que sobreexpresa dicha al menos una proteína preseleccionada haciendo crecer las células aisladas.

Como se ha indicado más arriba, si se utiliza el mismo marcador de resistencia a fármacos para cada copia del gen, se puede necesitar un nivel superior de fármaco para seleccionar las células transfectadas con ambas secuencias. Como en los métodos anteriores, las al menos dos secuencias de ADN pueden residir en el mismo constructo. La primera y segunda etiquetas epitópicas pueden estar cada una independientemente en marco o fuera de marco con la proteína.

El procedimiento anteriormente mencionado es fácilmente aplicable para generar células que sobreexpresan al menos una molécula de ARN antisentido. El método comprende las etapas de:

a) transfectar células con al menos dos secuencias de ADN, teniendo cada una de las secuencias una porción que codifica dicha molécula de ARN antisentido, al menos una etiqueta epitópica, y al menos un marcador de resistencia a fármacos; y una porción que codifica dicha molécula de ARN antisentido, al menos un segunda etiqueta epitópica, y al menos un segundo marcador de resistencia a fármacos:

b) seleccionar las células transfectadas con dichas al menos dos secuencias de ADN por medio de la expresión de dicho primer y dicho segundo marcadores de resistencia a fármacos;

c) exponer dichas células seleccionadas a una primera y una segunda balizas moleculares, que emiten cada una fluorescencia tras la hibridación a las secuencias de nucleótidos de los transcritos de ARN de dichas primera y segunda etiquetas epitópicas respectivamente;

d) aislar dichas células que muestran fluorescencia de dichas primera y segunda balizas moleculares; y

e) generar una línea celular que sobreexpresa dicha al menos una molécula de ARN preseleccionada haciendo crecer dichas células aisladas.

Los detalles son los mismos que se han descrito más arriba.

La introducción de moléculas de ARN antisentido en las células es útil para eliminar funcionalmente una o más proteínas de la célula. Siguiendo los métodos anteriores, se describe un método para generar células funcionalmente nulas para la expresión de al menos una proteína preseleccionada que comprende las etapas de proporcionar en dichas células una pluralidad de ARN antisentido para dicha proteína preseleccionada, proporcionado cada uno de acuerdo con los métodos anteriormente seleccionados, en los que dicha pluralidad de ARN antisentido para dicha al menos una proteína preseleccionada se une esencialmente a todos los transcritos de ARNm de dicha al menos una proteína preseleccionada. La proteína preseleccionada puede ser una forma alternativamente empalmada de un producto génico. Siguiendo líneas similares, se describe un método para generar un animal transgénico no humano que es un mutante con la expresión funcionalmente nula de al menos una proteína preseleccionada que comprende llevar a cabo las etapas descritas antes utilizando células troncales embrionarias no humanas, determinar la viabilidad de dichas células troncales funcionalmente nulas para la expresión de dicha proteína preseleccionada, y utilizar dichas células troncales embrionarias no humanas viables para producir dicho animal transgénico no humano.

Del mismo modo, se describe un método para generar una línea celular que es funcionalmente nula para la expresión de al menos una proteína y sobreexpresa al menos otra proteína que comprende llevar a cabo los métodos de la presente memoria en las mismas células. De una manera similar, se describe un método para generar una línea celular que expresa un ARN antisentido letal bajo el control de un promotor inducible llevando a cabo el método de la presente memoria donde la etapa de transfección se realiza en presencia de una cantidad mínima de un inductor.

En la presente memoria se describe un método para identificar eventos de recombinación genética en células vivas que comprende las etapas de:

a) exponer una célula a una baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con una secuencia de ARN seleccionada del grupo que consiste en aquella transcrita a partir de una secuencia recombinada y aquella transcrita a partir de una secuencia no recombinada; y

b) detectar dichas células que expresan dicha secuencia de ARN.

Asimismo se describe en la presente memoria una forma novedosa de baliza molecular que, en contraste con las propiedades fluorescentes mostradas por las balizas moleculares de la técnica anterior al unirse a sus ácidos nucleicos diana, muestra actividad proteolítica después de dicha unión. Dicha actividad proteolítica se puede utilizar para la detección, pero también para degradar secuencias de proteína concretas en una célula si el ARNm que codifica la proteína está presente en la célula. Por ejemplo, una proteasa que escinde específicamente una proteína viral puede ser activada si la transcripción del virus se activa, tal como en una infección latente.

Preferiblemente, el inhibidor de la enzima proteolítica es un péptido, aunque también son útiles otras moléculas que incluyen metales y quelantes metálicos, para proporcionar una inhibición reversible de la enzima tras la interacción con el inhibidor. Los ejemplos de pares útiles de enzimas proteolíticas e inhibidores de la enzima proteolítica incluyen, pero no están limitados a, aminopeptidasa y amastatina, proteasas de cisteína de tipo tripsina y antipaína, aminopeptidasa y bestatina, proteasas de cisteína de tipo quimotripsina y quimostatina, aminopeptidasa y diprotina A

o B, carboxipeptidasa A y EDTA, serina proteasas de tipo elastasa y elastinal, y termolisina o aminopeptidasa M y 1,10-fenantrolina.

La presente invención se puede comprender mejor mediante la referencia a los siguientes Ejemplos no limitantes que se proporcionan como ilustrativos de la invención. Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de ilustrar más completamente las realizaciones preferidas de la invención. Sin embargo, no deben ser considerados en modo alguno limitantes del amplio alcance de la invención.

Ejemplo 1

Protocolo general. Material de partida: Se pueden introducir Balizas Moleculares en las células que no están expresando ningún ARN de los plásmidos, o se pueden utilizar para detectar mensajes de ARN codificados a partir de los plásmidos. El método de introducción de las balizas en cualquiera de estos dos tipos de células es idéntico. El protocolo de más abajo solamente requiere que las células que se va a analizar sean separables entre sí y sean susceptibles de análisis mediante FACS.

1) Como se describe más detalladamente en la descripción de la invención, se pueden utilizar balizas junto con FACS para clasificar las células de un tejido basándose en la expresión o en la carencia de expresión dentro de las células de ARN específicos. Con este fin, primero se deben separar las células entre sí mediante métodos convencionales y bien establecidos tales como la homogeneización y el tratamiento químico adicional. Después se pueden introducir las balizas apropiadas en dichas células de acuerdo con el protocolo de más abajo.

2) Segundo, se pueden utilizar balizas para seleccionar células que expresan ARN concretos codificados por plásmidos que han sido transfectados en una población de células. Con este fin, se debe transfectar primero en un cultivo de células un plásmido o plásmidos que codifican los ARN deseados. Después se pueden generar balizas para que reconozcan estos ARN, como se describe con mayor detalle en la descripción de la invención. La transfección de los plásmidos en las células se puede lograr a través de una amplia variedad de métodos utilizando o bien sus propios reactivos o bien kits obtenidos de marcas biotecnológicas (Qiagen, Promega, Geneporter, Invitrogen, Stratagene, etc.), siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Los plásmidos de deben elegir de manera que cada uno confiera resistencia a un antibiótico. Después de la transcripción de estos plásmidos en células y de un breve período para la recuperación de las células (normalmente 24 horas), las células se someterían a los antibióticos apropiados de manera que solamente estas células a las cuales los plásmidos han conferido resistencia a los antibióticos sobrevivan. Esto lleva generalmente de tres a cuatro días, dependiendo del tipo de célula y del antibiótico utilizado.

El resultado es que queda una reserva de células y que todas estas serían resistentes a los antibióticos, pero solamente una pequeña fracción de ellas expresaría los ARN de interés. Para seleccionar las células que expresan los ARN deseados, se puede seguir el siguiente protocolo.

Ejemplo 2

Selección de Células Utilizando Balizas

1) Transfectar las balizas en células: Se deben diseñar balizas de manera que reconozcan el ARN deseado ya sea hibridando a una secuencia endógena en el ARN ya sea hibridando a una etiqueta que se ha añadido a la secuencia del ARN nativo. El diseño de balizas se elabora basándose en la descripción de la invención.

La transfección se puede llevar a cabo por medio de una amplia variedad de métodos, similares a la transfección de plásmidos en células. El método empleado se debe seleccionar basándose en el tipo de células que se esté utilizando ya que algunas células responden mejor a algunos métodos de transfección que a otros métodos. La transfección se debe realizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante del reactivo de transfección utilizado.

La transfección de balizas en células se puede llevar a cabo en células en suspensión o en células que crecen sobre superficies sólidas, dependiendo del reactivo de transfección utilizado.

2) Después de la transfección de las balizas en células, las células se pueden someter a continuación a análisis FACS. Se puede utilizar el análisis FACS para clasificar células positivas para una cualquiera o más de las balizas utilizadas. También se puede utilizar para clasificar células basándose en la intensidad de la señal de las balizas, permitiendo de ese modo al investigador seleccionar células que expresan ARN en diferentes grados.

Ejemplo 3

Generación de Líneas Celulares que Expresan Uno o Más ARN

Después de la selección por medio de FACS, las células clasificadas como positivas se deben mantener en un medio apropiado como se describe con más detalle en la descripción de la invención. Estas células deberían dar lugar a líneas celulares que expresen los ARN de interés.

Concentración de la Baliza. La concentración de la baliza que se va a utilizar depende de numerosos factores. Por ejemplo, se debe considerar la abundancia del ARN que se va a detectar en las células y la accesibilidad de este ARN para la baliza. Por ejemplo, si el ARN que se va a detectar está presente en cantidades muy bajas o si se encuentra en una porción del ARN que no es fácilmente accesible basándose en el plegamiento tridimensional del ARN, se debe utilizar más baliza aquí que en los casos en los que el ARN que se va a detectar está en gran abundancia y en los que el sitio reconocido por la baliza es completamente accesible. La cantidad exacta de baliza que se va a utilizar tendrá que ser determinada empíricamente para cada aplicación.

Esto se puede completar introduciendo diferentes cantidades de balizas en diferentes grupos de células y seleccionando el estado en el que la fluorescencia del fondo es baja y en el que la señal es elevada (el estado en el que no todas pero algunas de las células tienen puntuación positiva para la baliza).

Claims (35)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para detectar células que expresan una primera proteína o ARN que comprende las etapas de:

   (a)

   introducir en las células un primer constructo de ADN que codifica la primera proteína o ARN, en donde dicho primer transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha primera proteína está asociado con una primera etiqueta epitópica que proporciona una única secuencia de ácido nucleico diana para su reconocimiento por una baliza molecular;

   (b)

   exponer dichas células a una primera baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de dicha etiqueta epitópica; y

   (c)

   detectar dichas células que muestran fluorescencia de dicha primera baliza molecular.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente aislar las células detectadas.

3. 3.

   El método de la reivindicación 2, en donde dichas células detectadas se aíslan utilizando la tecnología de clasificación celular activada por fluorescencia.

4. 4.

   El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la célula expresa una proteína localizada en la superficie celular o una proteína intracelular.

5. 5.

   El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la célula expresa un ARN seleccionado del grupo que consiste en ARN estructurales, ARN antisentido, ARNr, ARNhn, ARNsn y ARNm.

6. 6.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde se sospecha que dichas células expresan una segunda proteína o un segundo ARN, y el método comprende adicionalmente las etapas de exponer las células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el segundo ARN o con un transcrito de ARNm que codifica la segunda proteína, y detectar las células que muestran fluorescencia de cada una de dichas primera y segunda balizas moleculares.

7. 7.

   El método de la reivindicación 6, en donde dicha segunda proteína o ARN están asociados con una segunda etiqueta epitópica que proporciona una única secuencia de ácido nucleico diana para el reconocimiento por una baliza molecular, donde dicha segunda baliza molecular emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de la segunda etiqueta epitópica.

8. 8.

   El método de la reivindicación 6 o 7, en donde la primera proteína o ARN y la segunda proteína o ARN son los mismos.

9. 9.

   El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde las etapas de exposición y detección para dicha segunda proteína o ARN se realizan simultáneamente o secuencialmente a las etapas de exposición y detección para dicha primera proteína o ARN.

10. 10.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el ADN que codifica dicho primer o segundo ARN o dicha primera o segunda proteínas está conectado operativamente a

    (a)

    un promotor condicional; o

    (b)

    un promotor inducible con una aplicación de un inductor antes de la exposición de las células a la primera o segunda baliza molecular.

11. 11.

    El método de la reivindicación 1 o 7, en donde la secuencia de ADN que codifica dicha primera o segunda etiqueta epitópica está fuera del marco con una porción de la secuencia de ADN que codifica la primera o segunda proteína, respectivamente.

12. 12.

    El método de la reivindicación 1 o 7, en donde la secuencia de ADN que codifica dicha primera o segunda etiqueta epitópica está en marco con una porción de la secuencia de ADN que codifica la primera o segunda proteína, respectivamente.

13. 13.

    El método de la reivindicación 1, en donde la primera proteína o ARN es una proteína o un ARN preseleccionado, y donde dicho primer constructo de ADN que codifica la proteína o el ARN preseleccionados codifica adicionalmente un primer marcador de resistencia a fármacos; en donde el método comprende adicionalmente las etapas de:

    (d)

    seleccionar las células resistentes a un fármaco al que dicho primer marcador de resistencia a fármacos confiere resistencia;

    (e)

    aislar las células detectadas que emiten fluorescencia; y

    (f)

    generar una línea celular que expresa la proteína o ARN preseleccionados haciendo crecer las células aisladas.

14. 14.

    El método de la reivindicación 13, en donde dicho aislamiento de las células detectadas que emiten fluorescencia se lleva a cabo utilizando la tecnología de clasificación celular activada por fluorescencia.

15. 15.

    El método de la reivindicación 13 o 14, en donde la secuencia de ADN que codifica la primera etiqueta epitópica está en marco con la porción del constructo de ADN que codifica la primera proteína.

16. 16.

    El método de la reivindicación 13 o 14, en donde la secuencia de ADN que codifica la primera etiqueta epitópica está fuera de marco con la porción del constructo de ADN que codifica la primera proteína.

17. 17.

    El método de la reivindicación 13, en donde dicha línea celular expresa una segunda proteína preseleccionada o un segundo ARN preseleccionado; comprendiendo dichas etapas adicionalmente introducir en la línea celular un segundo constructo de ADN que codifica dicha segunda proteína preseleccionada o segundo ARN preseleccionado y un segundo marcador de resistencia a fármacos, seleccionar las células resistentes a un fármaco al que dicho segundo marcador de resistencia a fármacos confiere resistencia, exponer dichas células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el segundo ARN preseleccionado o un transcrito de ARNm que codifica dicha segunda proteína preseleccionada, y aislar las células que muestran fluorescencia de cada una de dichas primera y segunda balizas moleculares.

18. 18.

    El método de la reivindicación 17, en donde dicho segundo transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha segunda proteína está asociado con una segunda etiqueta epitópica que proporciona una secuencia de ácido nucleico diana única para el reconocimiento por una baliza molecular, donde dicha segunda baliza molecular emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de la segunda etiqueta epitópica.

19. 19.

    El método de la reivindicación 18, en donde la secuencia de ADN que codifica dicha segunda etiqueta epitópica está en marco con la porción del constructo de ADN que codifica dicha segunda proteína.

20. 20.

    El método de la reivindicación 18, en donde la secuencia de ADN que codifica dicha segunda etiqueta epitópica está fuera del marco con la porción del constructo de ADN que codifica dicha segunda proteína.

21. 21.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, en donde las etapas de introducción, selección, exposición y aislamiento para dicha segunda proteína o ARN preseleccionados se realizan simultáneamente o secuencialmente con la introducción, selección, exposición, y aislamiento para dicha primera proteína o ARN preseleccionados.

22. 22.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 21, en donde el ADN que codifica dicha primera o segunda proteína o ARN preseleccionados está conectado operativamente a

    (a)

    un promotor condicional; o

    (b)

    un promotor inducible con la aplicación de un inductor antes de la exposición de las células a la primera

    o segunda baliza molecular.

23. 23. El método de la reivindicación 13, en donde dicha proteína o ARN preseleccionados están sobreexpresados, que comprende adicionalmente las etapas de:

    g) introducir en las células un segundo constructo de ADN que codifica la primera proteína o ARN preseleccionados y un segundo marcador de resistencia a fármacos, y donde dicho transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha primera proteína está asociado con al menos una segunda etiqueta epitópica que proporciona una única secuencia de ácido nucleico diana para el reconocimiento por una baliza molecular;

    (h)

    seleccionar las células resistentes a un fármaco al cual confiere resistencia dicho segundo marcador de resistencia a fármacos;

    (i)

    exponer las células a una segunda baliza molecular que emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de la segunda etiqueta epitópica; y

    (j)

    aislar las células que muestran fluorescencia de cada una de la primera y segunda balizas moleculares.

24. 24.

    El método de la reivindicación 23, en donde la segunda etiqueta epitópica es la misma o diferente de la primera etiqueta epitópica.

25. 25.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 24, en donde la molécula de ARN se selecciona del grupo que consiste en ARN antisentido, ARNm, ARNr, ARNhn y ARNsn.

26. 26.

    El método de la reivindicación 23, en donde las etapas de introducción para dicho primer constructo de ADN y dicho segundo constructo de ADN se realizan secuencialmente.

27. 27.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en donde el ADN que codifica dicha primera o segunda proteína o ARN está conectado operativamente a

    (a)

    un promotor condicional; o

    (b)

    un promotor inducible con la aplicación de un inductor antes de exponer las células a la primera o segunda baliza molecular.

28. 28.

    El método de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente las etapas de:

    (d)

    cuantificar el nivel de fluorescencia de dicha primera baliza molecular en dichas células; y

    (e)

    correlacionar dicho nivel de fluorescencia de dicha primera baliza molecular con el nivel de expresión de dicho primer transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha primera proteína.

29. 29.

    El método de la reivindicación 6, que comprende adicionalmente las etapas de cuantificar el nivel de fluorescencia de dicha segunda baliza molecular en dichas células, y correlacionar dicho nivel de fluorescencia de dicha segunda baliza molecular con el nivel de expresión de dicho segundo transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha segunda proteína.

30. 30.

    El método de la reivindicación 29, en donde dicho segundo transcrito de ARN o ARNm que codifica dicha segunda proteína está asociado con una segunda etiqueta epitópica que proporciona una única secuencia de ácido nucleico diana para el reconocimiento por una baliza molecular, en donde dicha segunda baliza molecular emite fluorescencia tras la hibridación con el transcrito de ARN de la segunda etiqueta epitópica.

31. 31.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en donde dichos primer y segundo ARN se seleccionan del grupo que consiste en un ARN que codifica una proteína, un ARN estructural, y un ARN antisentido.

32. 32.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 31, en donde dichas células están fijadas.

33. 33.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, en donde dicha fluorescencia se cuantifica mediante microscopía de fluorescencia o tecnología de clasificación de células activada por fluorescencia.

34. 34.

    El método de una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 33, en donde dichas células que expresan el primer o segundo transcrito de ARN o ARNm que codifican la primera o segunda proteínas se aíslan utilizando la tecnología de clasificación celular activada por fluorescencia.

35. 35.

    El método de la reivindicación 11, que comprende adicionalmente aislar las células detectadas.