KR20090095614A - 단백질 생산을 위해 최적화된 숙주 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 목적 RNA 또는 단백질을 증가된 수준으로 발현시키는 세포를 단리하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포는 변경된 성장 프로파일을 나타내는데, 예컨대 성장률의 증가 또는 감소, 아폽토시스 비율의 증가 또는 감소, 또는 이상성 성장 프로파일을 나타내는 세포 등이다.

Description

단백질 생산을 위해 최적화된 숙주 세포{OPTIMIZED HOST CELLS FOR PROTEIN PRODUCTION}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2006년 11월 30일 가출원된 미국 가출원 제60/872,281호를 우선권으로 주장한다. 이 출원의 내용을 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
재조합 단백질을 높은 수준으로 생산하는 세포주의 선별은 생명공학 분야의 최고 도전 분야 중 하나이다. 단백질 생산에 사용되는 숙주 세포 개체군은 대체로 상이한 성장성 및 다른 특성을 갖는 유전적으로 이종성인 세포를 의미한다. 이러한 숙주 개체군이 개별 세포에서 유래한 개체군을 의미하는 경우에도, 시간 경과에 따라 이러한 세포의 배양은 개별 세포들이 하나 이상의 누적된 유전적 상이함을 특징으로 하는 세포 개체군을 생성시키게 된다. 단백질 생산을 위해, 목적 단백질(들)을 코딩하는 하나 이상의 유전 서열을 세포에 도입시킨다. 유전 서열(들)을 도입시킨 각각의 세포 개체군은 가변적인 카피수의 유전 서열을 흡수할 수 있고 이들 각각은 상기 세포의 게놈 내에 가변적인 위치에 통합될 수 있다. 그 결과, 각각의 세포가 목적 단백질 생산에 대해 상이한 가능성을 가질 수 있는 상당히 다양한 세포가 발생하게 된다. 단백질 생산을 위해, 유전 서열이 도입된 숙주 세포 전부 또는 일부를 사용하는 것이 가능하거나, 또는 최적의 단백질 생산성 및 단백질 생산에 이로울 수 있는 일정한 성장성 또는 증식 특징 등의 다른 특징을 갖는 세포 개체군에서 개별적으로 단리한 세포 유래의 클론성 세포 개체군 또는 세포주를 시험하는 것이 가능하다. 높은 다양성의 세포가 주어지면, 수천 또는 수만 세포 개체군에서 목적 RNA(목적 단백질을 코딩하는 RNA)의 생산능이 증가된 개별 세포를 동정 및 단리하는 것이 어려워진다. 수백개의, 그리고 로봇에 의해 자동화된 경우에는 수천개의 개별 단리된 세포를 배양하여 클론성 개체군을 생성시킨 후 단백질 생산에 대해 분석하게 되는 단백질 생산을 위한 세포주의 동정을 위한 통상의 방법 중 하나가 제한 희석법이다. 그러나, 단백질 생산 및 다른 특징 예컨대 성장성 또는 증식률 등의 관점에서 높은 세포 다양성으로 인해, 비교적 적은 수의 세포를 시험하는 것은 대부분의 최적 세포주를 동정하기에는 비효율적인 방법이다. 단일 세포를 분석하고 분리하는 능력이 있는 유세포 계측 또는 세포 분류법은 다수의 개별 세포를 시험할 수 있어서 희박 세포를 선별하는데 도움이 될 수 있는 또 다른 방법이다. 하지만, RNA 또는 단백질 생산을 측정하기 위해 유세포계측법에 사용되는 많은 표준 방법들은 측정하려는 세포를 사멸시켜야 하는 것이 요구되거나 또는 개별 세포에서 단백질 생산을 측정할 수 없다. 또한, 현재 사용되는 이들 방법은 세포 증식률을 측정하는 것이 불가능하다. 따라서, 최적의 성장성 및 증식 특성에 따라 세포를 선별하면서, RNA 또는 단백질 생산률이 증가된 세포를 동정, 단리 및 배양하기 위한 고효율의 방법이 요구되고 있다.
세포에서 단백질 생산을 증가시키기 위한 이전 방법은 또한 배지 배합을 최 적화하는데 중점을 두었다. 예를 들어, 다양한 성장 배지 성분 예컨대 당류, 염, 아미노산, 비타민 등을 증가시키거나 감소시켰다. 예를 들어, 문헌 [Chu and Robinson, Curr Opin Biotechnol. 2001 Apr; 12(2): 180-7; Chun et al., Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb;19(l):52-7; Dempsey et al., Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb;19(l):175-8; 및 Sauer et al., Biotechnol Bioeng. 2000 Mar 5;67(5):585-97]을 참조한다. 이들 문헌은 이종성 세포 개체군에 대해 그 노력을 기울여 왔다. 또한 신뢰할만하게 높은 수준으로 단백질을 생산하는 클론성 세포 개체군을 생성시키는 것이 가능하고 이러한 클론성 개체군을 위해 배지를 최적화하는 것이 가능하다.
또한, 목적 RNA를 높은 수준으로 발현하는 세포는 단백질 생산에 그들의 상당한 에너지를 소비할 수 있으며, 따라서 성장률 감소를 겪을 수 있다(Gu et al., Cytotechnology. 1992;9(l-3):237-45 and Kromenaker et al., Biotechnol Prog. 1994 May-Jun; 10(3):299-307). 구체적으로 비클론성 세포 개체군을 사용하는 경우, 성장률 감소는 단백질 생산 감소와 함께 세포의 과성장을 초래할 수 있다. 상이하거나 또는 최적화된 배지 조건 하에서 최적의 성장 및 증식 프로파일을 갖는 세포를 선별하는 방법은 또한 최적화된 단백질 생산을 위해 세포 개체군을 확립하는데 도움이 될 수 있다.
-본 발명의 요약-
본 발명은 목적 RNA 또는 단백질을 높은 수준으로 발현하는 세포를 단리하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포 증식률이 변경된 세포, 예컨대 세 포 증식률이 증가하거나 감소한 세포를 단리하기 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 세포 증식률이 변경된(예컨대 세포 증식률이 증가 또는 감소된) 세포를 단리하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 세포는 또한 목적 RNA 또는 단백질을 높은 수준으로 발현한다.
일 구체예에서, 본 발명은 세포 증식률이 증가된 세포를 단리하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 세포 개체군을 세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약과 접촉시키는 단계 및 세포 증식 증가와 관련된 형광 시약의 형광도를 나타내는 세포를 단리하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 세포 증식률이 증가된 세포를 단리하기 위한 방법을 제공하고, 여기서 상기 세포는 또한 목적 RNA를 높은 수준으로 발현시킨다. 상기 방법은 세포 개체군을 목적 RNA와 혼성화시에 형광발광하는 형광발광 프로브와 접촉시키는 단계; 상기 개체군을 세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약과 접촉시키는 단계; 및 형광발광 프로브의 형광성 증가 및 세포 증식 증가와 관련된 형광 시약의 형광도를 나타내는 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 형광발광 프로브의 형광성 검출은 세포 증식률을 모니터링하기 위한 시약의 형광성 검출과 동시에 분석할 수 있다. 다르게, 형광발광 프로브의 형광성 검출은 세포 증식률을 모니터링하기 위한 시약의 형광성 검출과는 개별 단계로 분석할 수 있다. 세포 증식률을 검출하기 위한 형광 시약은 형광발광 프로브와 동일하거나 또는 상이한 파장에서 형광발광할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 단리된 세포는 세포 배양물 또는 세포주를 생성하기 위하여 더욱 배양할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 방법은 세포 배양물의 밀도를 측정하는 단계를 더 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 세포 밀도가 증가된 세포 배양물을 제조하기 위한 방법을 제공하며, 여기서, 상기 세포 배양물의 세포는 목적 RNA를 높은 수준으로 발현시킨다. 상기 방법은 세포 개체군을 목적 RNA와 혼성화시 형광발광하는 형광발광 프로브와 접촉시키는 단계; 형광발광 프로브의 증가된 형광성을 나타내는 개체군으로부터 세포를 단리하는 단계; 단리된 세포를 배양하여 제1 세포 배양물을 제조하는 단계; 선행 단계를 반복하여 제2 세포 배양물을 단리하는 단계; 제1 및 제2 세포 배양물의 밀도를 측정하는 단계; 및 세포 밀도가 증가되거나 또는 보다 높은 세포 배양물을 동정하는 단계로서, 여기서 상기 세포 배양물의 세포는 목적 RNA를 증가된 높은 수준으로 발현시키는 것인 단계를 포함한다.
일 구체예에서, 본 발명은 또한, 이상성 성장 프로파일을 갖는 세포를 단리하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 세포는 성장 프로파일의 제1부에서 성장률이 증가하고, 성장 프로파일의 제2부에서 성장률이 감소한다. 일 구체예에서, 상기 방법은 세포 개체군을 세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약과 접촉시키는 단계 및 성장 파일의 제1부에서 형광 시약의 형광도가 변경되고 성장 프로파일의 제2부에서 형광 시약의 형광도가 변경되지 않거나 감소된 것으로 나타나는 세포를 단리하는 단계를 포함한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 이상성 성장 프로파일을 갖는 세포를 단리하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 세포는 성장 프로파일의 제1부에서 성장률이 증가하고, 성장 프로파일의 제2부에서 성장률이 감소하며, 성장 프로파일의 제1부 보다 성장 프로파일의 제2부에서 동일하거나 더 높은 수준으로 목적 RNA를 발현시킨다. 다른 구체예에서, 본 발명은 이상성 성장 프로파일을 갖는 세포를 단리하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 세포는 성장 프로파일의 제1부에서 성장률이 증가하고, 성장 프로파일의 제2부에서 성장률이 감소하며, 상기 세포는 성장 프로파일의 제1부보다 성장 프로파일의 제2부에서 보다 낮은 수준으로 RNA를 발현시킨다. 일 구체예에서, 상기 방법은 세포 개체군을 상기 목적 RNA와 혼성화시 형광발광하는 형광발광 프로브와 접촉시키는 단계; 상기 개체군을 세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약과 접촉시키는 단계로서, 상기 시약은 형광발광 프로브와 상이한 파장에서 형광 발광하는 것인 단계; 및 프로파일의 제1부에서 형광 시약의 형광성이 변경되고, 성장 프로파일의 제2부에서 형광 시약의 형광 강도 변화가 감소되거나 또는 변경되지 않고, 성장 프로파일의 제2부에서 형광발광 프로브의 형광성이 증가된 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 방법은 세포 개체군을 상기 목적 RNA와 혼성화시 형광발광하는 형광발광 프로브와 접촉시키는 단계; 상기 개체군을 세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약과 접촉시키는 단계로서, 상기 시약은 형광발광 프로브와 상이한 파장에서 형광발광하는 것인 단계; 및 성장 파일의 제1부에서 형광 시약의 형광성이 변경되고, 성장 프로파일의 제2부에서 형광 시약의 형광성이 증가하고, 성장 프로파일의 제2부에서 형광발광 프로브의 형광성이 증가한 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 세포 개체군을 상기 목적 RNA와 혼성화시 형광발광하는 형광발광 프로브와 접촉시키는 단계; 상기 개체군을 세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약과 접촉시 키는 단계로서, 여기서 상기 시약은 형광발광 프로브와 상이한 파장에서 형광발광하는 것인 단계; 및 성장 프로파일의 제1부에서 형광 시약의 형광성이 변경되고, 성장 프로파일의 제2부에서 형광 시약의 형광성이 변경되지 않거나 감소되고, 성장 프로파일의 제2부에서 형광발광 프로브의 형광성이 감소된 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 형광발광 프로브의 형광성 검출은 성장 프로파일의 제2부 동안 세포 증식률을 모니터링하기 위한 시약의 형광성 검출과 동시에 분석한다. 다르게, 형광발광 프로브의 형광성 검출은 세포 증식률을 모니터링하기 위한 시약의 형광성 검출과는 개별 단계에서 분석한다. 다른 구체예에서, 세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약은 형광발광 프로브와 동일한 파장에서 형광발광한다. 본 발명의 방법에 따라 단리된 세포는 세포 배양물 또는 세포주를 생성하기 위해 더욱 배양할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 방법은 세포 배양물의 밀도를 측정하는 단계를 더 포함한다.
본 발명에서 기술한 모든 방법은 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 모니터링하기 위한 시약과 본 발명의 세포를 접촉시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명에서 기술한 방법은 증식률이 증가하거나 또는 RNA 또는 단백질 생산이 증가한 세포를 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 모니터링하기 위한 시약과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, 형광발광 신호 프로프의 형광성이 증가하고 세포 증식률을 모니터링하기 위한 시약의 형광성이 변경된 세포를 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 모니터링하기 위한 시약과 접촉시킬 수 있다. 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 발현하는 세포는 음성 선별일 수 있 다.
본 발명의 방법을 이용하여 검출할 수 있는 RNA는 제한없이, 단백질을 코딩하는 메신저 RNA, 안티센스 RNA 분자, 구조 RNA, 리보솜 RNA, hnRNA 및 snRNA를 포함하는 내재성 또는 이종성 RNA를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 방법은 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, 단쇄 Fv, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fab' 또는 (Fab')2, 또는 면역글로불린의 항원 결합 단편을 코딩하는 mRNA를 검출하기 위해 사용된다.
본 발명의 일 구체예에서, 형광성 검출은 형광 현미경, 형광세포 계측법, 유세포 분류법 또는 형광 플레이트 리더법을 통해 분석한다. 형광성 검출은 개별 샘플에서, 또는 한번에 다수 샘플에서, 예컨대 고효율 분석법으로 검출할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약은 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르, SNARF-1 카르복실산, 아세테이트 숙신이미딜 에스테르, PKH26, Hoechst CPA1, Cyquant GR 및 NF 염료, MTT 및 CTT로 이루어진 군에서 선택한다.
일 구체예에서, 본 발명의 방법은 포유류 세포, 박테리아 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 미생물 세포, 해조류 세포 또는 진균류 세포를 단리 및/또는 배양하는데 유용하다. 일 구체예에서, 포유류 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, HEK 293 세포 및 Per.C6 세포로 이루어진 군에서 선택된다. 일 구체예에서, CHO 세포는 CHOK1 세포, CHOK1SV 세포, CHO-S 세포 또는 DG44 세포이다. 다른 구체예에서, 상기 박테리아 세포는 BL21 세포이다. 또 다른 구체예에서, 진균류 세포는 크리소스포리움(Chrysosporium) 세포, 아스퍼질러스(Aspergillus) 세포, 트리코더마(Trichoderma) 세포, 딕티오스테리움(Dictyostelium) 세포, 캔디다(Candida) 세포, 사카로마이세스(Saccharomyces) 세포, 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 세포 및 페니실리움(Penicillium) 세포로 이루어진 군에서 선택된다. 다른 구체예에서, 곤충 세포는 SF9 세포 또는 SF21 세포이다.
1. 정의
프로브와 관련하여 사용된 용어 "인접한"은 상호작용하는 한쌍이 서로 기능적으로 상호작용할 수 있게 근접한 상태를 의미한다. 예를 들어, 근접한 상태는 형광단이 소광제에 의해 소광되거나 또는 부분 소광되도록 한다. 현재 공지된 형광단 및 소광제가 상호작용하기 위해 요구되는 거리는 약 20∼100 Å이다.
용어 "생물량"은 2 이상의 생존 세포의 개체군을 의미한다. 생존 세포는 임의 부피의 배양 배지에 존재할 수 있다.
용어 "벌지(bulge) 영역"은 염기쌍을 이루지 않은 하나의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드의 단일 가닥 영역을 의미한다. 벌지 뉴클레오티드는 상호 상보적인 영역이 측접할 수 있다.
용어 "덤벨(dumbbell) 구조"는 각각의 스템 영역으로부터 암(arm)의 말단을 통해 연결된 2개의 스템-루프 구조의 형태를 갖는 핵산 또는 변형 핵산의 가닥을 의미한다. 상기 연결부는 비상보성 영역이거나, 또는 변형되거나 변형되지 않은 포스포디에스테르 결합일 수 있다.
용어 "상호작용 쌍"은 상호 인접한 경우 기능적으로 상호작용하며, 상호 인접하지 않은 경우에는 상호작용하는 화학 기가 생성하는 신호 또는 배경 신호 부재시와 비교하여 검출가능한 신호를 생성하거나, 또는 상호작용하는 화학기가 생성하는 신호와는 상이한 신호를 내는 2개의 화학기를 의미한다. 상호작용 쌍은 이에 제한되는 것은 아니며, 형광단과 소광제, 화학발광 표지 및 소광제 또는 부가물, 염료 다이머 및 FRET 도너 및 억셉터, 또는 이의 조합을 포함한다. 신호화 프로프는 하나 이상의 상호작용 쌍을 포함할 수 있다. 예를 들어, 파장-이동성 신호화 프로브는 제1 형광단 및 제2 형광단을 가지며, 이 둘은 모두 소광제와 상호작용하고, 상기 2 형광단은 FRET 도너 및 억셉터 쌍이다.
용어 "루프 영역"은 염기쌍을 이루지않는 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 변형된 뉴클레오티드의 단일 가닥 영역을 의미한다. 루프는 또한 상호 상보적이거나 또는 상호 부분 상보적인 하나 이상의 뉴클레오티드의 2 영역 사이에 위치할 수 있다. 예를 들어, 루프의 상향 영역은 루프의 하향 영역에 상보적이거나 부분 상보적이다.
용어 "신호화 프로브"는 적어도 상호 상보적인 영역 및 표적 핵산 서열에 상보적인 서열을 포함하고, 적어도 상호작용하는 쌍을 더 포함한다. 신호화 프로브가 이의 표적 서열에 결합하지 않는 경우, 상호작용하는 쌍의 부분은 서로 인접하여 신호를 생성하지 않거나, 거의 생성하지 않거나 상이한 신호를 생성하게 된다. 신호화 프로브가 표적 서열에 결합한 경우, 상호작용하는 쌍의 부분은 서로 더 이상 인접하지 않고 검출가능한 신호 또는 미결합 상태의 프로브가 생성하는 신호와는 상이한 신호를 생성한다. 일 구체예에서, 신호화 프로브는 형광단 및 소광제 부위를 포함하고, 형광성 변화는 표적 서열과 혼성화시 일어난다. 상호작용 쌍의 부분은 신호화 프로브의 말단에 부착하거나 핵산 서열 내에 부착될 수 있다. 신호화 프로브의 서열에 내부적으로 도입될 수 있는 부위의 예에는 이에 제한되는 것은 아니며, 소광제: dabcyl dT, BHQ2 dT 및 BHQl dT, 그리고 형광단: 플루오레세인 dT, Alexa dT 및 Tamra dT를 포함한다.
용어 "미스매치 영역"은 핵산 분자 또는 변형된 핵산 분자의 이중 가닥 영역으로서, 여기서 염기 또는 변형된 염기는 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하지 않는 이중 가닥 영역을 의미한다. 미스맷치 영역은 2개의 염기쌍 영역이 측접한다. 이중 가닥 영역은 비수소 결합이거나 또는 후그스틴 염기쌍을 형성하는 수소 결합일 수 있고, 또는 이 둘 다 일 수 있다.
용어 "상호 상보성 영역"은 왓슨-크릭 염기쌍을 형성하는 핵산 분자 또는 변형된 핵산 분자의 영역을 의미한다.
용어 "비상보성 영역"은 왓슨-크릭 염기쌍을 이루지 않는 핵산 분자 또는 변형된 핵산 분자의 영역을 의미한다. 예를 들어, 비상보성 영역은 벌지 뉴클레오티드, 단일 가닥 루프, 5' 또는 3' 말단에 오버행 뉴클레오티드 또는 미스매치 영역을 갖도록 디자인할 수 있다.
용어 "스템 영역"은 2 이상의 왓슨-크릭 염기쌍을 갖는 핵산 분자 또는 변형된 핵산 분자의 영역을 의미한다. 예를 들어, 스템 영역은 비상보성 영역에 의해 연결된 하나 이상의 상호 상보성 영역을 갖거나 또는 연속적인 상호 상보성 영역을 형성하도록 디자인할 수 있다.
용어 "스템-루프 구조"는 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드 또는 변형 올리고뉴클레오티드 암의 쌍이 측접한 단일 가닥 루프 서열을 갖는 핵산 분자 또는 변형된 핵산 분자를 의미한다. 상기 5' 및 3' 암은 스템 영역을 형성한다.
용어 "3-암 접합 구조"는 스템 영역의 암을 통해서 함께 연결된 스템 영역, 제1 스템-루프 영역 및 제2 스템-루프 영역의 형태를 갖는 핵산 또는 변형된 핵산 가닥을 의미한다. 제1 스템-루프 영역은 제2 스템-루프 영역에 대해 5'이다. 상기 3 영역은 비 상보성 영역, 포스포디에스테르 결합 또는 변형된 포스포디에스테르 결합, 또는 이의 조합을 통해 연결될 수 있다.
달리 정의하지 않으면, 본 발명에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 당분야의 당업자가 공통적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 논쟁이 있는 경우, 상기 정의를 포함한 본 명세서는 조절될 수 있다. 또한, 본 발명에서 달리 요구하지 않는다면, 단수 용어는 복수를 포함하고 복수 용어는 단수를 포함하게 된다. 일반적으로, 본 발명에서 기술한 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학, 발생 생물학, 세포 생물학 등의 기술 및 이와 관련되어 사용되는 명명법은 당분야에서 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다.
이 명세서 및 구체예 전반에 걸쳐, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는" 등은 언급한 구성요소 또는 일군의 구성요소를 포함하고자 하는 의도로 이해하지만 임의의 다른 정수 또는 정수 그룹은 배제하는 것은 아니다.
본 발명에서 언급한 모든 공개물 및 다른 참고문헌은 전체로 참조하여 포함시킨다. 다수의 문헌을 본 발명에서 인용하지만, 이러한 인용이 임의의 이들 문헌이 당분야의 공통적인 일반적 지식의 일부를 형성하는 것을 승인하는 것은 아니다.
2. 본 발명의 방법
세포 개체군에서 전체 RNA 및 단백질 생산에 영향을 주는 2가지 배양 매개변수는 다음의 (i) 및 (ii)를 포함한다: (i) 세포 특이적 생산률 및 (ii) RNA 및/또는 단백질 생산에 사용된 세포 개체군의 성장 특징. 본 발명의 방법 및 조성물은 이들 매개 변수 중 하나 또는 둘 모두를 최적화시킨다. 세포 개체군의 단백질 생산에 영향을 줄 수 있는 세 번째 변수는 세포의 증식률이다. 예를 들어, 증식률이 높은 세포는 성장률이 낮은 세포와 비교하여 보다 짧은 기간에 일정한 생물량의 단백질 생산 세포를 얻을 수 있다. 따라서, 주어진 시간 동안 생산된 단백질의 양이 최대가 된다. 일부 경우에서, 세포는 에너지 산출량을 단백질 생산에 대해 전환시켜 세포 증식을 감소시킬 수 있다. 그러므로, 다른 구체예에서, 본 발명은 세포 증식률이 감소된 세포를 단리하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 상기 세포는 또한 목적하는 단백질 코딩 RNA를 증가된 수준으로 발현시킨다.
본 발명의 방법은 세포를 고정하거나 용해시킬 필요없이 생존 세포에서 검출가능한 신호를 생성하도록 증식 마커로서 사용할 수 있는 형광발광 신호화 프로브 및 시약의 능력을 기초로 한다. 형광발광 신호화 프로브는 살아있는 세포에서 표적 RNA 서열과 혼성화시에 검출가능한 신호를 생성하고, RNA가 단백질 코딩 RNA인 경우에 세포가 생성하는 상응하는 단백질의 양과 관련될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 신호화 프로브 및 증식 마커가 생성하는 신호는 시험한 세포 개체군에서 생성된 평균(예를 들어, 배경 형광성)보다 검출가능하게 높거나 상이해야 한다. 따라서, 평균 세포가 전혀 형광성을 생성하지 않는 것이 필수적이지는 않다. 일 구체예에서, 본 발명은 목적 RNA 또는 단백질 생산이 증가된 세포를 단리하거나 또는 세포주를 생성시키기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 시험한 개체군의 세포에서 목적 RNA 또는 단백질의 생산과 비교시 목적 RNA 또는 단백질의 생산이 증가된 세포를 단리하거나 또는 세포주를 생성시키기 위해 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 대조구 세포는 본 발명의 단리된 세포와 동일하지만, 본 발명에서 기술한 어떠한 방법을 이용하여, RNA 또는 단백질 생산의 증가 또는 감소를 위해 선별되지 않았거나, 또는 세포 증식률 변경에 대해 선별되지 않은 세포이다.
RNA 또는 단백질 생산 증가를 위해 최적화된 세포주의 생성
본 발명에서 기술한 바와 같이 증식 마커로서 사용할 수 있는 시약 및 신호화 프로브의 사용으로 목적 RNA(예를 들어, 단백질을 코딩하는 RNA)의 생산 증가를 위해 최적화된 세포를 동정하는 것이 가능하다. 세포내 성분을 분석하기 위해 세포를 고정하거나 용해시킬 필요가 있는 시약과는 달리, 신호화 프로브 및 증식 마커 유래의 형광성을 이용하여 살아있는 세포의 세포 내 RNA 및 단백질 수준을 분석할 수 있다. 이러한 특징으로 목적 RNA의 생산이 증가된 세포를 단리하여 증식시킬 수 있다. 일 구체예에서, 목적 RNA를 코딩하는 유전자를 포함하는 DNA 구성체와 함께 세포에 목적 단백질(들)을 코딩하는 유전 서열(들)을 도입(예를 들어, 형질감염)시킨 후, 목적 RNA를 인식하는 형광발광 신호화 프로브를 세포에 도입시킨다. 이러한 단계는 형질감염시킨 DNA 구성체가 또한 약물 내성을 코딩하는 경우에 선별 마커, 예를 들어 약물 선별 등을 이용한 최적 선별 이후에 수행할 수 있다. 유전자를 전사하는 세포는 형광발광하게 된다.
다른 구체예에서, 세포를 증식 마커, 예컨대 CFSE와 접촉시킨다. CFSE로 염색한 후, 세포 분열을 시간 경과에 따라 모니터링하거나 또는 증식 마커의 신호를 정량화하기 전 기간 동안 세포 분열이 일어나도록 할 수 있다. 이 세포들은 증식 마커 유래 신호를 정량화하기 전에 1시간 미만 내지 1일, 1일 내지 5일, 3일 내지 10일, 5일 내지 15일, 1주 내지 2주, 1.5주 내지 4주 또는 최대 20주 동안 증식시킬 수 있다. 일 구체예에서, 세포 증식률이 증가한 세포를 단리한다. 이들 세포의 단리는 예를 들어, 증식 마커의 형광 신호 감소를 기준으로 할 수 있다. 증식률이 다양한 세포는 증식 마커 유래 신호의 상이한 수준을 기준으로 단리할 수 있다. 다른 구체예에서, 세포 증식률이 감소된 세포를 단리하는데, 여기서 이 세포는 목적 RNA 또는 단백질을 증가된 수준으로 발현시킨다. 세포를 동시에 또는 다른 시기에 증식 마커 및 신호화 프로브에 노출시킬 수 있다. 다른 시점인 경우, 세포는 신호화 프로브 노출 전 또는 이후에 증식 마커에 노출시킬 수 있다. 세포를 상이한 시점에 증식 마커 및 신호화 프로브에 노출시킬 수 있지만 분석은 동시에 수행하는데, 예를 들어 세포를 먼저 증식 마크에 노출시키고 평균 세포 배가 시간을 기준으로 수 세포 분열에 요구되는 시간 길이에 상응하는 기간 이후에 2차로 신호 프로브에 노출시킬 수 있다.
CFSE 염색 또는 신호 프로브 혼성화로부터 다양한 수준으로 형광발광하는 세포는 형광성 검출을 위해 공지된 임의 방법을 이용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, CFSE 염색 또는 신호 프로브 혼성화로부터 형광발광하는 세포는 유세포 분류법으로 단리할 수 있다. 이렇게 단리된 세포를 이용하여 목적 RNA를 높은 수준으로 발현하고 또한 증식률이 증가하거나 증식률이 감소한 세포주를 생산할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물은 또한 세포를 선별 약물 또는 선별제 존재하에 유지시킬 필요없이도, 하나 이상의 목적 RNA의 생산이 증가된 세포를 단리하는데 사용할 수 있다. 세포를 2 이상의 DNA 또는 RNA로 형질감염시키거나 아니면 이들을 도입시킬 수 있다. 상기 세포는 2 이상의 DNA 또는 RNA 구성체로 동시에 또는 순차적으로 형질감염시킬 수 있다. 제1 목적 RNA에 대한 신호화 프로브는 다른 목적 RNA에 대한 신호화 프로브 유래 신호와 동일하거나 상이한 신호를 생성할 수 있다. 예를 들어, 이들은 동일하거나 상이한 형광단을 가질 수 있다. 2 이상의 RNA를 발현하는 세포 또는 세포주는 상기 단계들을 동시에 또는 순차적으로 반복하여 제공할 수 있다. DNA 또는 RNA 구성체는 선택적으로 하나 이상의 약물 또는 선별제 마커를 포함한다. 형질감염, 및 선택적인 약물 선별이후, 각각의 목적 RNA에 대한 신호화 프로브를 세포에 도입한다. 일 구체예에서, 이후 세포를 유세포 분류법으로 분류하여, 2 이상의 목적 RNA 또는 단백질을 임의 조합으로 발현하는 세포를 단리한다.
일 구체예에서, 본 발명에 기술한 방법의 다수 라운드를 이용하여 2 이상의 목적 RNA 또는 단백질의 발현이 증가된 세포를 얻을 수 있다. 예를 들어, 세포에 목적 RNA 또는 단백질을 코딩하는 1 이상의 RNA 또는 DNA로 형질감염시키고 본 발명의 방법에 따라 단리한다. 단리된 세포에 대해서 목적 RNA 또는 단백질을 코딩하는 1 이상의 다른 RNA 또는 DNA 구성체로 추가 라운드의 형질감염을 실시하고 다시 한번 단리한다. 이 방법은 예를 들어, 단백질 복합체, 동일하거나 또는 관련 생물학적 경로의 RNA 또는 단백질, 서로 상류 또는 하류에서 작용하는 RNA 또는 단백질, 서로에 대해 조절, 활성화 또는 억제 기능을 하는 RNA 또는 단백질, 기능 또는 활성에 대해 서로 의존적인 RNA 또는 단백질 또는 상동성(예를 들어, 서열, 구조 또는 기능적 상동성)을 공유하는 RNA 또는 단백질의 발현이 증가된 세포를 생성하는데 유용하다. 예를 들어, 이 방법은 면역글로불린 단백질(예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM)의 중쇄 및 경쇄 또는 이의 항원 결합 단편의 발현이 증가된 세포주를 생성하는데 사용할 수 있다. 면역글로불린 단백질은 완전한 인간, 인간화 또는 키메라 면역글로불린 단백질일 수 있다.
세포 증식률이 변경된 세포를 단리하기 위한 방법
일 구체예에서, 본 발명은 개체군의 평균 세포 성장과 비교시 세포 증식률이 증가한 세포 개체군 유래의 세포주를 생성하거나 세포를 단리하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, 본 발명은 개체군의 평균 세포 성장과 비교시 세포 증식률이 감소한 세포 개체군 유래의 세포를 단리하거나 또는 세포주를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 세포는 또한 선택적으로 목적 RNA 또는 단백질을 증가된 수준으로 발현시킨다. 출발 개체군에서 단리한 세포의 세포 증식률은 출발 개체군의 평균 세포 증식률과 비교시 1.3배 증가하거나 감소할 수 있다. 다른 구체예에서, 출발 개체군에서 단리한 세포 유래 세포의 세포 증식률은 출발 개체군 세포의 평균 증식률과 비교시 1.5배 이상, 2.0배 이상, 2.5배 이상, 3.0배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상 증가하거나 감소한다. 일 구체예에서, 세포 증식률은 배지 배합을 최적화(예를 들어, 영양성분, 예컨대 당류, 염, 아미노산, 비타민 등의 농도 최적화)하여 변경(예를 들어, 증가 또는 감소)시킬 수 있다. 다른 구체예에서, 세포 증식률은 유전적 또는 대사적 조작을 통해 변경시킨다. 예를 들어, 세포 증식률은 세포 증식률에 영향을 주는 유전자 또는 단백질을 발현시키거나, 과발현시키거나 또는 발현을 변화시켜 변경할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Mazur et al., Biotechnol Prog. 1998]을 참조하며, 이를 전체로 참조하여 포함시킨다. 일 구체예에서, 세포 증식률은 세포 주기, 세포 분열 또는 DNA 복제에 관여하는 유전자 또는 단백질, 예컨대 사이클린, 사이클린 의존적 키나제, 세포 주기 의존적 포스파타제, 사이클린 의존적 키나제의 억제제, 세포 주기 전사 인자, DNA 폴리머라제, 히스톤 및 DNA 복제 개시에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키거나, 과발현시키거나 또는 발현을 변화시켜 변경할 수 있다. 유전적으로 또는 대사적으로 조작된 특정 유전자 또는 단백질은 본 발명에서 사용되는 유기체에 따라 좌우되며 당분야의 당업자가 결정할 수 있다. 일 구체에예서, 세포 증식률은 하나 이상의 MYC 유전자, 예컨대 c-MYC를 발현시켜 변경시킨다. 예를 들어, 문헌 [Ifandi et al., Biotechnol Prog. 2005; 21 :671-677]를 참조하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
다른 구체예예서, 본 발명은 출발 세포 배양 개체군 유래의 세포 배양물의 평균 세포 밀도와 비교시 세포 배양물의 세포 밀도를 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 상기 세포는 선택적으로 또한 목적 RNA 또는 단백질을 증가된 수준으로 발현시킨다. 세포 배양물의 세포 밀도는 출발 세포 배양물 개체군 유래 세포의 평균 세포 밀도와 비교시 1.2배 이상 증가될 수 있다. 다른 구체예에서, 세포 밀도는 출발 세포 개체군 유래 세포의 세포 배양물의 평균 세포 밀도와 비교시 1.5배 이상, 2.0배 이상, 2.5배 이상, 3.0배 이상, 5배 이상 또는 10배 이상 증가된다. 일 구체예에서, 세포 배양물 밀도는 배지 배합의 최적화(예를 들어, 영양 성분, 예컨대 당류, 염, 아미노산, 비타민 등의 농도 최적화)를 통해 증가시킨다. 다른 구체예에서, 세포 배양물 밀도는 유전적 또는 대사적 조작에 의해 증가시킨다. 예를 들어, Bcl-2, BCI-XL 또는 p21CIP1을 발현시켜 세포에서 아폽토시스를 억제한다. 아폽토시스의 억제는 단백질 생산 증가뿐만 아니라 세포 배양물의 밀도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Itoh et al., Biotechnology and Bioengineering 2004;48:118-122; Chiang et al., Biotechnology and Bioengineering 2005;91:779-792; 및 Jung et al., Biotechnology and Bioengineering 2002;79:180-187]을 참조하며, 이들을 전체로 참조하여 포함시킨다. 일 구체예에서, 하나 이상의 MYC 유전자를 Bcl-2와 공동 발현시켜서 세포 증식률과 세포 밀도 모두를 증가시킨다. 예를 들어, 문헌 [Ifandi et al., Biotechnol. Prog. 2005; 21 :671-677 and Bissonnette et al., Nature. 1992; 359:552-554]을 참조한다.
세포 증식률은 본 발명의 방법에서 사용되는 세포의 유형에 따라 다양하다. 예를 들어, 박테리아 세포는 30분 이내에 2개의 생존 딸 세포를 생산하도록 분열될 수 있는 반면, 포유류 세포는 매 10-24시간에 한번 분열하게 되거나 세포 분열 당 1일 이상이 걸릴 수 있다. 예를 들어, 진핵세포는 매 12-30시간에 한번 분열될 수 있다. 세포 에 대한 배가 시간은 세포 성장 주기의 증식기 동안 개체군의 생존 세포수의 증가를 모니터링하여 당업자가 결정할 수 있다.
세포 증식 증가는 또한 영양 상태에 의존적이다. 일 구체예에서, 세포 증식률은 배지 배합의 최적화(예를 들어, 영양성분, 예컨대 당류, 염, 아미노산, 비타민 등의 농도 최적화)를 통해 증가된다. 예를 들어, 문헌 [Chu and Robinson, Curr Opin Biotechnol. 2001 Apr;12(2): 180-7; Chun et al., Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb;19(l):52-7; Dempsey et al., Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb;19(l):175-8; and Sauer et al., Biotechnol Bioeng. 2000 Mar 5;67(5):585-97]을 참조하며, 이들을 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
환경 조건 또한 재조합 단백질 수율 증가를 위해 최적화할 수 있다. 예를 들어, 포유류 세포에 대해 생리적 온도 이하의 온도를 가하여 재조합 단백질 수율을 증가시킬 수 있다. 예를 들어 문헌 [Al-Fageeh et al., Biotechnology and Bioengineering. 2006 93:829-835 and Baik et al., Biotechnology and Bioengineering. 2006 93:361-371]을 참조하며, 이를 전체로 참조하여 포함시킨다.
세포는 표준 방법 및 장치를 이용하여 정량화할 수 있다. 예를 들어, 세포의 일부를 고체 성장 배지 상에 도말하고 개체군의 콜로니 형성 세포 유닛의 수를 측정한다. 다르게, 분광광도계 또는 혈구계측기 등의 기구를 사용할 수 있다. Guava ViaCount 분석 및 Beckman Coulter Vi-CELL 자동화 세포 생존능 분석기 등 세포 밀도를 측정하기 위한 자동화 기법 및 장치도 이용할 수 있다.
세포를 단리하기 위한 본 발명의 모든 방법에 있어서, 세포를 배양하여 세포 배양물을 생성하거나 세포주를 생성할 수 있다.
세포 증식률이 증가한 세포를 단리하거나 세포주를 생성하기 위한 본 발명의 모든 방법들은 또한 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커에 대해 세포를 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 아폽토시스 및 프리아폽토시스 마커는 예를 들어, DNA 절단, 핵 분절화, 염색체 축합, 괴사, 세포막의 기포화, 폴리(ADP-리보스)폴리머라제의 절단, 캐스파제3 활성화 또는 아폽토시스에 관여하는 다른 유전자의 발현을 포함한다. 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커는 또한 프로피듐 요오드 또는 7-AAD에 대한 투과성을 포함한다. 일 구체예에서, 본 발명의 방법은 증식률이 증가하거나 또는 RNA 또는 단백질 생산이 증가한 세포를 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 모니터링하기 위한 시약과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 예를 들어, 형광발광 신호화 프로프의 형광성이 증가하고 세포 증식률을 모니터링하기 위한 시약의 형광성이 변경된 세포를 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 모니터링하기 위한 시약과 접촉시킬 수 있다. 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 모니터링하기 위한 제제는 당분야에서 공지이다. 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 모니터링하기 위한 형광성 시약의 예로는 형광 표지된 아넥신-V 및 프로피듐 요오드를 포함한다.
밀도가 증가된 세포 배양물을 제조하기 위한 방법
일 구체예에서, 본 발명은 세포 밀도 증가에 대한 경향이 높은 세포 배양물을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들어, 단백질을 생산할 수 있는 생존 세포의 수, 또는 생물량을 증가시켜서(예를 들어, 세포 배양물 밀도를 증가시켜서) 생물량에 의해 생성되는 단백질 총량을 증가시킨다. 세포 배양물 밀도는 1 내지 10배(예를 들어, 1.5배, 2배, 3배, 5배 또는 10배) 만큼, 10 내지 100배(예를 들어, 15배, 25배, 50배 또는 100배) 만큼, 100 내지 1000배(예를 들어, 150배, 250배, 500배 또는 1000배) 만큼 또는 100배 이상 만큼 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 최종 세포 배양물 밀도는 대략 배양물 ㎖ 당 1×104 세포/㎖∼1×105 세포/㎖, 1×105 세포/㎖∼1×106 세포/㎖, 1×106 세포/㎖∼1×107 세포/㎖, 1×107 세포/㎖∼1×108 세포/㎖ 범위 또는 1×108 cells/㎖ 보다 높은 범위일 수 있다. 세포 배양 밀도의 증가는 영양 및 환경 조건에 따라 좌우되고, 본 발명에서 사용되는 세포 유형에 따라 다양하게 된다. 하나 이상의 증식 마커를 이용한 다양한 표지화 수준에 따라서 단리된 세포를 배양할 수 있고 얻어진 개체군을 시험하여 보다 높은 세포 밀도를 얻는 경향이 높은 개체군을 동정할 수 있다.
일 구체예에서, 단백질 생산 세포의 생물량은 배지 배합의 최적화(예를 들어, 영양성분, 예컨대 당류, 염, 아미노산, 비타민 등의 농도 최적화)를 통해 증가시킨다. 예를 들어, 문헌 [Chu and Robinson, Curr Opin Biotechnol. 2001 Apr; 12(2): 180-7; Chun et al., Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb;19(l):52-7; Dempsey et al., Biotechnol Prog 2003 Jan- Feb;19(l):175-8; and Sauer et al., Biotechnol Bioeng. 2000 Mar 5;67(5):585-97]을 참조하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다. 다른 구체예에서, 단백질 생산 세포의 생물량은 단백질 생산 세포의 개체군에서 세포 사멸 또는 아폽토시스를 방지하여 증가시킨다. 다른 구체예에서, 본 발명은 세포 밀도가 증가된 세포 배양물을 제조하기 위한 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양물 중 세포는 목적 RNA를 높은 수준으로 발현시킨다. 예를 들어, 또한 빠르게 증식하는 생존성있고 생산력 있는 세포를 높은 농도로 제조하기 위한 방법을 제공한다.
다른 구체예에서, 본 발명은 유전적 또는 대사적 조작을 통해 세포 개체군의 세포 배양물 밀도를 변경시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 세포 밀도는 아폽토시스 세포 사멸을 억제하여 증가시킬 수 있다. 일 구체예에서, 항아폽토시스 생존 단백질, 예컨대 bcl-1 또는 bcl-xL을 발현시킨다. 다른 구체예에서, 캐스파제 억제 또는 분자 샤페론 HSP70의 발현을 이용하여 세포 밀도를 증가시킨다. 다른 구체예에서, 대사적 조작법을 이용할 수 있다. 대사적 조작법을 이용하여 락테이트 및 암모니아 등의 독성 대사 부산물의 축적을 억제하거나 또는 대사 경로가 개선되게 조작하여서 세포 밀도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 피루베이트 카르복실라제 발현은 트리카르복실산 사이클로 글루코스 유입을 증가시킬 수 있다.
세포 밀도가 증가된 세포 배양물을 제조하기 위한 본 발명에 기술한 모든 방법은 또한 아폽토시스 세포 사멸을 위해 세포를 모니터링하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 본 발명에 기술한 방법은 세포 배양물의 세포를 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 모니터링하기 위한 시약과 접촉시키는 단계를 더 포함한다. 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 모니터링하기 위한 제제는 당분야에서 공지이다. 아폽토시스를 모니터링하기 위한 형광 시약의 예는 형광 표지된 아넥신-V 및 프로피듐 요오드를 포함한다. 일 구체예에서, 아폽토시스 세포 또는 아폽토시스 경향이 있는 세포은 음성 선별된다.
이상성 성장 프로파일을 갖는 세포를 단리하기 위한 방법
본 발명은 이상성 성장 프로파일을 갖는 세포를 단리하기 위한 방법을 제공한다. 이상성 성장 프로파일은 성장 프로파일의 제1부에서 빠른 증식을 특징으로 할 수 있다. 이러한 빠른 증식은 단기간에 단백질 생산 세포의 개체군을 축적가능하게 한다. 빠른 성장 기간 이후에 빠른 증식에서 느린 증식 또는 증식이 일어나지 않게 된다. 감소되거나 낮아진 증식 기간은 단백질 생산 증가를 특징으로 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 단리한 세포는 이의 성장 프로파일의 제1부에서 성장률이 증가할 수 있다. 이러한 성장 프로파일 부분은 또한 단백질 생산률이 증가하거나 감소하는 것을 특징으로 할 수 있다. 성장 프로파일의 제2부에서, 세포 또는 세포들은 증식률이 감소하거나 낮아질 수 있으며, 여기서 세포는 성장 프로파일의 제1부 동안의 발현 수준에 비하여 목적 RNA를 증가된 수준으로 발현시킨다. 일 구체예에서, 세포는 또한 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커가 최소로 존재하는 세포 개체군을 선별하기 위하여 세포 사멸 및 아폽토시스에 대해 모니터링한다.
형광성을 검출하는 방법
형광 세포 분류법 또는 관련 방법은 형광발광 프로브 또는 증식 마커를 이용하여 하나 이상의 파장에서 일정 수준 또는 수준들의 형광성을 나타내는 세포를 동정 및/또는 분리하는데 사용할 수 있다. 예를 들어, 신호화 프로브 및 증식 마커의 형광성은 형광 현미경, 형광세포계측법, 유세포 분류법 또는 형광 플레이트 리더를 통해 검출 및/또는 정량할 수 있다. 유세포 분류법은 현재 초 당 최대 70,000 세포를 분류할 수 있다. 2분 이하내에 5,000,000 세포를 분류할 수 있다.
본 발명에서 기술한 방법은 또한 세포 내 사건, 상태 또는 조성(예를 들어, 아폽토시스, 괴사, Ca2+/이온 유입, pH 유입, 세포 부착, 세포 분열 및 성장 또는 DNA 함량 등) 등의 검출을 위한 형광 리포터를 이용하는 분석법과 동시에 이용할 수 있다. 세포 내 사건을 검출하는 형광 분석법의 예는, 예를 들어 형광 염색법(예를 들어, 핵산, 단백질 및/또는 막의 형광 염색 등 및 단백질 간에 또는 단백질과 핵산간의 상호작용을 검출하기 위한 분석법을 포함한다. 이러한 분석법에서 사용하기 위한 형광 표지할 수 있는 시약에는 이에 제한되는 것은 아니며 단백질(형광 분자 또는 자가형광 단백질로 표지됨); 형광 대사 지시제(예를 들어, C12 레사주린); 형광 기질 또는 부산물; 형광 표지된 렉틴; 형광 화학물; 케이징된 형광 화합물; 형광 핵산 염료; 및 형광 중합체, 지질, 아미노산 잔기 및 뉴클레오티드/뉴크레오사이드 유사체 등이 포함된다.
세포
본 발명의 방법은 본 발명에서 기술한 신호화 프로브 및 증식 마커를 이용하는데 적절한 모든 세포를 이용할 수 있다. 일 구체예에서, 세포는 포유류 세포, 박테리아 세포, 식물, 미생물, 해조류 및 진균류 세포로 이루어진 군에서 선택된다. 일 구체예에서, 세포는 포유류 세포, 예컨대 인간, 마우스, 래트, 염소, 말, 토끼, 햄스터 또는 소 세포 등이다. 예를 들어, 상기 세포는 이에 제한되는 것은 아니나 HeLa, NSO, SP2/0, HEK 293T, Vero, Caco, Caco-2, MDCK, COS-I, COS-7, K562, Jurkat, CHO-Kl, DG44, CHOKlSV, CHO-S, Huvec, CV-I, HuH-7, NIH3T3, HEK293, 293, A549, HepG2, IMR-90, MCF-7, U-2 OS, Per.C6, SF9, SF21 또는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 비롯하여 임의의 확립된 세포주 유래일 수 있다. 일 구체예에서, 세포는 진균류 세포 예컨대 크리소스포리움(Chrysosporium) 세포, 아스퍼질러스(Aspergillus) 세포, 트리코더마(Trichoderma) 세포, 딕티오스테리움(Dictyostelium) 세포, 캔디다(Candida) 세포, 사카로마이세스(Saccharomyces) 세포, 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 세포 및 페니실리움(Penicillium) 세포로 이루어진 군에서 선택된 세포이다. 다른 구체예에서, 세포는 박테리아 세포, 예컨대 이.콜라이(E. coli), 비.서브틸리스(B. subtilis) 또는 BL21 세포일 수 있다.
재조합 DNA 구성체
일 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 목적 RNA(예를 들어, 목적 단백질을 코딩하는 RNA)이 생산이 증가된 세포를 단리하기 위해 사용한다. 목적 RNA는 DNA 구성체 상의 유전자에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 목적 RNA로 전사되는 DNA 구성체를 세포에 도입한다. DNA 구성체는 세포 게놈의 상이한 위치에 통합될 수 있거나 또는 세포의 세포질에 남아 있을 수도 있다. 하나 이상의 특정 좌위에서 통합이 일어날 수도 있다. 다음으로, 형질감염된 세포를 신호화 프로브 및/또는 증식 마커에 노출시킨다. 신호화 프로브 및 증식 마커를 동시에, 다른 것 직후에, 전체적으로 상이한 시점에, 임의 순서로 세포에 노출시킬 수 있다. 세포를 신호화 프로브 및/또는 증식 마커에 노출시킨 후, 검출가능한 신호가 발생하면 목적 세포를 단리한다. 공지의 임의 방법으로 세포를 단리 및 배양할 수 있는데, 예를 들어, 세포는 개별적으로 또는 뱃치에서 단리 및 도말할 수 있다. 세포주는 단리된 세포를 성장시켜 생성시킬 수 있다.
본 발명의 모든 방법은 선별 마커를 이용하여 수행할 수 있다. 약물 선별(또는 임의의 다른 적절한 선별 마커를 이용한 선별)이 필수 단계는 아니지만, 형질감염된 구성체가 약물 내성을 부여하도록 설계된 경우라면, 목적 단백질을 코딩하는 DNA 구성체로 안정하게 형질감염된 세포에 대한 세포 개체군을 농축하기 위해 사용할 수 있다. 신호화 프로브를 이용한 선별법을 형질감염 이후에 너무 빨리 수행하면, 일부 양성 세포가 순간적으로만 형질감염되고 안정하게 형질감염되지 않을 수 있다. 하지만, 이는 본 발명에 기술된 방법에 따른 소정의 다수 라운드의 선별화 또는 비안정적으로 형질감염된 세포로부터 형질감염된 플라즈미드의 희석 또는 손실을 일으킬 수 있는 소정의 충분한 세포 계대를 최소화시킬 수 있다.
예시적인 목적 RNA 및 단백질
본 발명의 세포를 형질감염시키는 DNA 구성체는 하나 이상의 하기의 상이한 역할을 갖는 목적 단백질을 코팅하는 RNA로 전사되는 서열을 포함한다: 단백질, 융합 단백질, 단백질에 융합된 펩티드, 유출 신호, 유입 신호, 세포내 위치화 신호 또는 단백질이나 펩티드에 융합될 수 있는 다른 신호. 임의 단백질을 본 발명의 방법에 따라 생산할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 생산할 수 있는 단백질이 예는 제한없이, 페티드 호르몬(예를 들어, 인슐린), 당단백질 호르몬(예를 들어, 에리쓰로포이어틴), 항생제, 사이토카인, 효소, 백신(예를 들어, HIV 백신, HPV 백신, HBV 백신), 항암 치료제(예를 들어, Muc1) 및 치료용 항원을 포함한다. 특정 구체예에서, RNA는 면역글로불린 단백질 또는 이의 항원 결합 단편, 예컨대 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, 단쇄 Fv, 항체 단편, 예컨대 Fab, Fab' 또는 (Fab')2 또는 면역글로불린의 항원 결합 단편을 코딩한다. 특정 구체예에서, RNA는 에리쓰로포이어틴을 코딩한다. 다른 특정 구체예에서, RNA는 상피세포 성장 인자 수용체(EGFR), HER1 또는 c-Erb-1, 예컨대 Erbitux®(세투시맙)에 결합하는 하나 이상의 면역글로불린 단백질 또는 이이 단편을 코딩한다. 본 발명의 방법 및 조성물에 의해 생산된 RNA는 또한 하나 이상의 하기 역할을 가질 수 있다: 안티센스 RNA, siRNA, 구조 RNA, 이에 제한되는 것은 아니며 예컨대 리보솜 RNA, tRNA, hnRNA, snRNA를 포함하는 세포 RNA; 무작위 RNA, cDNA 또는 EST에 상응하는 RNA; 다양한 종 유래 RNA, 올리고뉴클레오티드에 상응하는 RNA, 전체 세포, 조직 또는 유기 cDNA 조제물에 상응하는 RNA; 다른 핵산, 단백질, 다른 세포 성분 또는 약물 분자에 대해 어느 정도 결합 활성을 갖는 RNA; 다양한 거대분자 복합체에 도입될 수 있는 RNA; 일부 세포 기능에 영향을 줄 수 있는 RNA; 또는 상기 언급한 기능이나 활성은 없지만 그럼에도 세포에서 발현될 수 있는 RNA; 바이러스 또는 외래 RNA에 상응하는 RNA, 링커 RAN 또는 하나 이상의 RNA를 연결하는 서열; 또는 태그로서 기능하는 RNA 또는 하나 이상의 상기 언급한 임의의 비변형된 돌연변이화, 무작위화 또는 셔플링 서열의 조합 또는 재조합물.
본 발명의 DNA 구성체는 이에 제한되는 것은 아니며, 유도성, 억제성, 조직 특이적, 열 충격, 발생, 세포 계통 특이적 또는 일시적 프로모터를 비롯한 항상성 또는 조건적 프로모터 또는 하나 이상의 상기 언급한 임의의 비변형 또는 돌연변이화, 무작위화, 셔플링 서열의 조합 또는 재조합물에 작동적으로 연결된 목적 RNA를 코딩하는 DNA를 포함할 수 있다.
3. 신호화 프로브
특정 핵산 서열의 존재를 인식하고 리포트하는 핵산 프로브를 사용하여 특정 핵산을 검출하였다. 예를 들어, U.S. 특허 제5,925,517호를 참조하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
프로브의 한 유형은 뉴클레오티드의 중심 스트렛치는 표적 서열에 상보적이고 말단은 짧은 상호 상보성 서열을 포함하는 헤어핀 또는 스템-루프형 구조를 갖도록 디자인되었다. 예를 들어, 문헌 [Tyagi and Kramer, Nature Biotechnology, 14, 303-308 (1996)]을 참조하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다. 프로브의 한 말단은 형광단에 공유 결합되어 있고 다른 한쪽은 소광 부위에 결합되어 있다. 이들의 혼성화 말단과의 본래 상태에서는, 형광단과 소광제의 근접성은 비교적 적거나 본직적으로 형광성을 생성하지 않는다. 상기 프로브는 표적 핵산과의 혼성화시에 구조적인 변화를 겪어서 형광단으로부터의 형광발광성에 검출가능한 변화가 일어나게 된다. 이러한 프로브를 이용하여 생존 세포에서 메신저 RNA를 가시화하였다(Matsuo, 1998, Biochim. Biophys. Acta 1379: 178-184). 유사한 프로브를 사용하여 RNA 서열의 발현을 기준으로 살아있는 세포를 단리하였다. 예를 들어, U.S. 특허 출원 제6,692,965호를 참조하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
본 발명에서 사용되는 신호 프로브는 목적 RNA 의 일부에 또는 이의 5' 부분 또는 3' 미번역 영역에 상보적이도록 디자인되었다. 목적 RNA를 코딩하는 유전자는 태그 서열로 태깅될 수 있고 신호화 프로브는 이 태그 서열을 인식하도록 디자인될 수 있다. 상기 태그 서열은 생산되는 단백질에 태깅을 원하는지에 따라서 유전자 메시지의 단백질 코딩 부분과 인 프레임으로 존재하거나 또는 아웃 프레임으로 존재할 수 있다. 태그 서열은 신호화 프로브의 서열에 상보적이거나 부분 상보적인 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 단백질 태그의 예는 제한 없이, c-myc, 헤마글루티닌 및 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 포함한다.
상호작용 쌍
신호화 프로브는 하나 이상의 상호작용 쌍을 포함하고, 상이한 상호작용 쌍을 포함할 수도 있다. 일 구체예에서, 신호화 프로브는 형광발광 프로브이다. 예를 들어, U.S. 특허 제6,692,965호 및 국제 공개 특허 제2005/079462호를 참조하며, 이를 전체로 참조하여 포함시킨다. 일 구체예에서, 형광발광 프로브는 비혼성화 상태에서는 배경값 수준의 형광을 발광하지 않지만, 표적과 결합시에는 배경값 수준 이상으로 형광발광하게 된다. 다중 형광단을 사용하여 상이한 색상 범위에서 형광성을 제공하거나 신호를 증가시킬 수 있다. 다중 소광제를 사용하여 표적 서열 부재시에 신호를 줄이거나 제거할 수 있다. 소광제의 예는 이에 제한되는 것은 아니나 DABCYL, EDAC, 세슘, p-크실렌-비스-피리디늄 브로마이드, 탈륨 및 금 나노입자를 포함한다. 형광단의 예는 이에 제한 되는 것은 아니며 설포로다민 101, 아크리딘, 5-(2'-아미노에틸)아미노아프탈린-1 -설폰산(EDANS), 텍사스 레드, 에오신 및 보디피(Bodipy) 및 알렉사 플루오르(알렉사 플루오르) 350, 알렉사 플루오르 405, 알렉사 플루오르 430, 알렉사 플루오르 488, 알렉사 플루오르 500, 알렉사 플루오르 514, 알렉사 플루오르 532, 알렉사 플루오르 546, 알렉사 플루오르 555, 알렉사 플루오르 568, 알렉사 플루오르 594, 알렉사 플루오르 610, 알렉사 플루오르 633, 알렉사 플루오르 635, 알렉사 플루오르 647, 알렉사 플루오르 660, 알렉사 플루오르 680, 알렉사 플루오르 700, 알렉사 플루오르 750, 알로피코시아닌, 아미노쿠마린, 보디피-FL, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, 카르복시플루오레세인(FAM), 캐스캐이드 블루, APC-Cy5, APC-Cy5.5, APC-Cy7, 쿠마린, ECD(Red613), 플루오레세인(FITC), 헥사클로르플루오로세인(HEX), 히드록시쿠마린, 리사민 로다민 B, 루시퍼 옐로우, 메톡시쿠마린, 오레곤 그린 488, 오레곤 그린 514, 퍼시픽 블루, PE-Cy7 접합체, PerC, PerCP-Cy5.5, R-피코에리트린(PE ), 로다민, 로다민 그린, 로다민 레드-X, 테트라클로로플루오로세인(TET), TRITC, 테트라메틸로다민, 텍사스 레드-X, TRITC, XRITC 및 퀀텀 도트를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Tyagi et al. Nature Biotechnology 16:49-53, (1998) and Dubertret et al., Nature Biotechnology, 19:365-370 (2001)]을 참조하며, 이들을 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
본 발명은 또한 파장 이동이 일어난 신호화 프로브를 제공한다. 일 구체예에서, 프로브의 한쪽 말단은 적어도 수집 형광단 및 이미터 형광단을 가지며, 프로브의 인접 말단은 적어도 소광제 부위를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Tyagi et al., Nature Biotechnology, 18, 1 191-1196 (2000)]을 참조하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다. 일 구체예에서, 수집 형광단 및 이미터 형광단은 동일 말단에 존재하고, 여기서 이미터 형광단은 말단에 있고, 소광제 부위는 수집 형광단의 반대 말단에 존재한다. 이미터 형광단은 수 뉴클레오티드의 스페이서 암에 의해 수집 형광단과 떨어져 있을 수 있다. 수집 형광단은 단색성 광원의 파장 범위에서 강하게 흡광한다. 표적 서열 부재시에 두 형광단은 소광되어 있다. 표적 존재시에, 프로브는 이미터 형광단의 발광 범위에서 형광발광한다. 발광 스펙트럼의 이동은 형광 공명 에너지 이동에 의하여 수집 형광단에서 이미터 형광단으로 흡광 에너지가 이동하기 때문이다. 이러한 유형의 신호화 프로브는 단색성 광원유래의 에너지를 효율적으로 흡수할 수 없는 형광단을 함유한 신호화 프로브보다 강한 신호를 제공할 수 있다. 일 구체예에서, 수집 형광단은 플루오레세인이고 이미터 형광단은 6-카르복시로다민 6G, 테트라메틸로다민 또는 텍사스 레드이다.
다른 구체예에서, 프로브의 한쪽 말단은 적어도 형광단 F1이고, 다른 인접한 말단은 적어도 다른 형광단 F2이다. 2 형광단은 이 둘이 가까이 근접했을 때 형광 공명 에너지 이동(FRET)이 일어나게 된다. 프로브가 이의 표적 서열에 결합하지 않은 경우, F1의 흡광 밴드에서 여기시에, F1의 형광성이 F2에 의해 소광되고, F2의 형광성이 관찰된다. 프로브가 이의 표적 서열에 결합시, FRET가 감소 또는 제거되고 F1의 형광성이 증가하게 되는 반면 F2의 형광성은 감소하거나 사라지게 된다. 이러한 형광 강도의 차이를 모니터링할 수 있고 F1 및 F2의 형광성 간에 비율을 산출할 수 있다. 잔류 형광성이 때때로 형광단-소광제 시스템에서 관찰되기 때문에, 이러한 시스템은 표적 서열의 정량적 검출에서 보다 이로울 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Zhang et al., Angrew. Chem. Int. Ed., 40, 2, pp. 402-405 (2001)]을 참조하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다. FRET 도너-억셉터 쌍의 예는 이에 제한되는 것은 아니며, 각각 쿠마린 기 및 6-카르복시플루오레세인 기를 포함한다.
일 구체예에서, 신호화 프로브는 발광성 표지 및 부가물 쌍을 포함한다. 발광 표지와 부가물의 상호작용은 표지에서 생성되는 신호를 감소시킨다. 예를 들어, 문헌 [Becker and Nelson, U.S. 특허 제5,731,148호]를 참조하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
다른 구체예에서, 신호화 프로브는 하나 이상의 염료 이량체를 포함한다. 프로브가 표적 서열에 결합한 경우, 염료로부터의 신호는 이량체 형태의 염료 신호화는 상이하다.
신호화 프로브 또는 다른 프로브의 형태
이중 가닥 구조
본 발명은 상호 어닐링하거나 또는 적어도 서로 상보성 영역을 형성하도록 디자인된 2 이상의 개별 가닥의 핵산을 포함하는 신호화 프로브 또는 다른 프로브를 제공한다. 한 가닥의 적어도 한쪽 말단은 다른 가닥의 말단과 인접한다. 핵산은 DNA, RNA 또는 변형 DNA 또는 RNA일 수 있다. 2 가닥은 자가 이량체를 형성하는 동일한 가닥일 수 있다. 상기 가닥은 또한 서열이 동일하지 않을 수 있다.
2개의 개별 가닥은 완전하게 상보성이거나 또는 상보성 영역 및 비상보성 영역을 포함하도록 디자인할 수 있다. 일 구체예에서, 2개의 개별 가닥은 서로 완전하게 상보성이도록 디자인한다. 일 구체예에서, 2 가닥은 각 말단에 4∼9, 5∼6, 2∼10, 10∼40 또는 40∼400의 연속적인 염기쌍의 상호 상보성 영역을 형성한다. 상기 가닥은 5∼7, 8∼10, 11∼15, 16∼22, 30 이상, 3∼10, 11∼80, 81∼200, 또는 200 이상의 뉴클레오티드 또는 변형 뉴클레오티드를 함유할 수 있다. 2 가닥은 동일하거나 상이한 수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 예를 들어, 한 가닥은 다른 가닥보다 길 수 있다. 일 구체예에서, 한 가닥의 5' 말단은 다른 가닥으로부터의 분지이거나, 또는 이 가닥의 3' 말단은 다른 가닥으로부터의 분지이거나, 또는 둘 모두이고, 여기서 상기 분지는 최대 10, 최대 20 또는 최대 30의 뉴클레오티드 또는 변형 뉴클레오티드이다.
표적 서열에 혼성화하는 영역은 한 가닥 또는 양 가닥의 상보성 영역 또는 비상보성 영역 또는 이의 조합에 존재할 수 있다. 1 이상의 표적 핵산 서열을 동일한 신호화 프로브가 표적화할 수 있다. 1 이상의 표적은 동일하거나 상이한 서열 상에 있을 수 있고, 이들은 표적이 결합하도록 디자인된 프로브의 부분에 정확하게 상보적이거나 또는 적어도 충분하게 상보적일 수 있다. 일 구체예에서, 2 가닥은 각각의 말단에서 상호 상보성 영역을 형성하고 표적 상보성 서열은 말단에서 상호 상보성 영역 이외의 영역에 존재한다.
일 구체예에서, 2 이상의 개별 가닥을 갖는 신호화 프로브는 형광발광 프로브이다. 일 구체예에서, 한 가닥은 한쪽 말단에 적어도 소광제 부분을 가지고, 다른 가닥의 인접 말단에 형광단을 갖는다. 일 구체예에서, 한 가닥의 각각 5' 및 3' 말단은 동일하거나 상이한 형광단을 가지며, 다른 가닥의 각각 5' 및 3' 말단은 동일하거나 상이한 소광제 부위를 갖는다. 일 구체예에서, 한 가닥의 5' 말단은 형광단을 가지며 3' 말단은 소광제 부위를 가지고, 다른 가닥의 3' 말단은 동일하거나 상이한 소광제 부위를 가지고 5' 말단은 동일하거나 상이한 형광단을 갖는다.
스템 -루프 구조
다른 구체예에서, 신호화 프로브는 적어도 상호 상보성 영역 및 적어도 비상보성 영역을 포함하는 핵산 또는 변형 핵산의 가닥이다. 일 구체예에서, 프로브는 스템-루프 구조를 형성한다. 스템 영역은 상호 상보적이거나, 또는 상호 상보성 영역 및 비상보성 영역을 포함할 수 있다. 예를 들어, 스템 영역은 염기쌍을 이루지 않는 벌지 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 스템 영역은 또한 염기쌍을 형성하지 않는 5' 또는 3' 말단에 오버행 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
스템 영역이 완전하게 상보적이면, 이 스템 영역은 3∼4, 5∼6, 7∼8, 9∼10, 2∼6, 7∼10 또는 11∼30 염기쌍을 포함할 수 있다. 루프 영역은 10∼16, 17∼26, 27∼36, 37∼45, 3∼10, 11∼25 또는 25∼60 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 스템 영역은 4∼10, 4 또는 5의 연속 염기쌍을 형성한다.
일 구체예에서, 스템-루프 구조는 2종의 화학기를 포함하는 적어도 상호작용성 쌍을 포함하는데, 하나의 화학 기는 가닥의 각 말단에 존재한다. 일 구체예예서, 신호화 프로브는 가닥의 각 말단에 적어도 형광단 및 소광제를 갖는다.
일 구체예에서, 스템 영역은 비상보성 영역을 통해 연결된 2개의 상호 상보성 영역을 포함하며, 상호작용성 쌍에 인접한 상호 상보성 영역은 5 내지 9 염기쌍을 형성하고, 루프 영역에 인접한 상호 상보성 영역은 5 내지 5 염기쌍을 형성한다. 일 구체예에서, 비상보성 영역은 단일 가닥 루프 영역, 미스매치 영역 또는 둘 다이다. 다른 구체예에서, 스템 영역은 2개의 비상보성 영역을 통해 연결된 3개의 상호 상보성 영역을 포함하며, 상호작용성 쌍에 인접한 제1 상호 상보성 영역은 4 내지 5 염기쌍을 형성하고, 제2 상호 상보성 영역은 2 내지 3 염기쌍을 형성하며, 루프 영역에 인접한 제3 상호 상보성 영역은 2 내지 3 염기쌍을 형성한다.
스템-루프 구조에서, 표적 서열에 상보성인 영역은 하나 이상의 스템 영역 또는 루프 영역에 존재할 수 있다. 표적에 혼성화하는 스템 내 영역은 상호 상보성 영역, 비상보성 영역 또는 두 영역에 존재할 수 있다. 일 구체예에서, 표적 상보성 영역은 단일 가닥 루프 영역에 존재한다. 일 구체예에서, 상호작용성 쌍에 인접한 스템 영역 이외의 영역은 표적 상보성 서열이다. 1 이상의 표적 핵산 서열은 동일한 프로브에 의해 표적화될 수 있다. 1 이상이 표적은 동일하거나 상이한 서열 상에 존재할 수 있고, 이들은 표적에 결합하도록 디자인된 프로브의 일부에 정확하게 상보적이거나 또는 적어도 충분하게 상보적일 수 있다.
스템 길이 증가는 이들의 닫힌 구조에서 신호화 프로브의 안정성을 증가시킬 수 있으며, 따라서 검출가능한 신호의 노이즈 비율까지 신호를 증가시킬 수 있다. 이들 신호 프로브를 세포에 노출시키는 것은 정상 온도로 복귀한 이후에 세포에 여전히 안전한 약간의 고온에서 수행할 수 있다. 보다 높은 온도에서, 신호화 프로브는 개방되어서 존재하는 표적에 결합하게 되다. 냉각시에, 표적에 결합하지 않은 신호화 프로브는 스템의 높은 안정성에 의해 보조되는 이들의 닫힌 상태로 되돌아간다. 유사하게, 다른 힘을 사용하여 동일한 결과를 얻을 수 있는데, 예를 들어, 염기쌍을 풀리게 하는 것으로 여겨지는 DMSO 등이다.
신호화 프로브의 화학적 변형
본 발명은 또한 화학적으로 변형된 신호화 프로브 또는 다른 프로브를 제공한다. 하나 이상의 당-포스포디에스테르 유형 골격, 2'OH, 염기를 변형시킬 수 있다. 포스포디에스테르 결합의 치환에는 이에 제한되는 것은 아니며, -OP(OH)(O)O-, -OP(O- M+)(O)O-, -OP(SH)(O)O-, -OP(S-M+)(O)O-, -NHP(O)2O-, -OC(O)2O-, -OCH2C(O)2NH-, - OCH2C(O)2O-, -OP(CH3)(O)O-, -OP(CH2C6H5)(O)O-, -P(S)(O)O- 및 - OC(O)2NH-를 포함한다. M+는 무기 또는 유기 양이온이다. 골격은 또한 펩티드 핵산일 수 있는데, 여기서 데옥시리보스 포스페이트 골격은 슈도 펩티드 골격으로 교체된다. 펩티드 핵산은 문헌 [Hyrup and Nielsen, Bioorganic&Medical Chemistry 4:5-23, 1996, 및 Hydig-Hielsen and Godskesen, WO 95/32305]을 참조하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
당의 2' 위치는 이에 제한되는 것은 아니며, H, OH, C1-C4 알콕시, OCH2-CH=CH2, OCH2-CH=CH-CH3, OCH2-CH=CH-(CH2)nCH3 (n=0, 1...30), 할로겐(F, Cl, Br, I), C1-C6 알킬 및 OCH3을 포함한다. C1-C4 알콕시 및 C1-C6 알킬은 직쇄, 분지형 또는 환형인 기이거나 이들을 포함할 수 있다.
뉴클레오티드의 염기는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실, 이노신 중 어느 하나 이거나 또는 이들의 변형물일 수 있다. 변형 염기는 이에 제한되는 것은 아니나 N4-메틸 디옥시구아노신, 데아자 또는 아자 퓨린 및 피리미딘을 포함한다. 고리 질소 예컨대 아데닌의 N1, 구아닌의 N7, 시토신의 N3은 알킬화될 수 있다. 피리미딘 염기는 5 또는 6 위치에서 치환될 수 있고 퓨린 염기는 2, 6 또는 8 위치에서 치환될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Cook, WO 93/13121; Sanger, Principles of Nucleic Acid Structure, Springer- Verlag, New York (1984)]을 참조하며, 이를 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킨다.
통상의 뉴클레오티드의 유도체는 당분야에서 공지이며, 예를 들어, 상이한 유형의 당을 갖는 분자를 포함한다. 당의 O4' 위치는 S 또는 CH2로 치환될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 염기 인식 서열은 연결 부위로 연결된 시클로부틸 부위를 가질 수 있는데, 여기서 시클로부틸 부위는 이에 부착된 복소환 염기를 갖는다. 예를 들어, 문헌 [Cook et al., 국제 공개 특허 제WO 94/19023호]를 참조한다(여기서 전체로 참조하여 본 발명에 포함시킴).
세포에 프로브 전달을 촉진하는데 유용한 프로브의 다른 화학 변형에는 이에 제한되는 것은 아니나, 콜레스테롤, 트랜스덕션 펩티드(예를 들어, TAT, 페네트라틴 등)가 포함된다.
4. 증식 마커
일 구체예에서, 세포 분열이 형광 마커를 본 발명의 방법에서 사용한다. 세포를 표지하는 형광 마커는 표지된 세포의 형광성 변경이 세포 분열을 나타내기 때문에 세포 분열을 모니터링하는데 유용하다. 형광성은 세포 증식률을 확립하기 위해 시간 경과에 따라 모니터링할 수 있다. 세포 증식 증가는 세포를 표지하는데 사용한 형광 마커의 증가 또는 감소와 관련된다. 일 구체예에서, 세포 분열의 형광 마커의 형광성 감소는 세포 증식률의 증가와 관련된다. 다른 구체예에서, 세포 분열의 형광 마커의 형광성 증가는 세포 증식률 증가와 관련된다.
특정 구체예에서, 세포는 리신 측쇄 및 다른 이용가능한 아민 기와의 반응을 통해서 세포 단백질에 자발적이고 비가역적으로 결합하는 형광 염료인 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CFSE)로 표지된다. CFSE 염료를 시험관 내에서 세포에 적재하고 시간 경과에 따라 형광성을 모니터링하는데, 세포 분열은 CSFE 표지화를 위한 세포 개체군의 분석 전 시간 동안 허용된다. 분열시, CFSE는 딸 세포 간에 동일하게 분리되어서 세포 내 형광 강도는 각각의 연속 세대에 따라 2배로 감소하게 된다. 이러한 CFSE의 성질은 주어진 세포가 겪은 정확한 분열수의 추적을 가능하게 한다(Weston and Parish, J Immunol Methods. 1990 Oct 4;133(l):87-97; Lyons and Parish, J Immunol Methods. 1994 May 2;171(l):131-7; Parish, Immunol Cell Biol. 1999 Dec;77(6):499-508; Lyons, J Immunol Methods. 2000 Sep 21;243(l-2):147-54)). CFSE로 표지된 세포의 형광 강도는 형광 신호를 모니터링하는데 적합한 장치, 예컨대 유세포 분류기, 형광세포계측기, 형광 현미경 또는 형광 플레이트 리더 등으로 검출할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 세포 분열의 다른 형광성 마커는 제한 없이, CFSE 유도체, 카르복실산 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 염료 및 이들의 유도체, 예컨대 오레곤 그린 488 카르복실산 디에스테르의 숙신 이미딜 에스테르(카르복시-DFFDA SE), 5-(및-6)-카르복시에오신 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(CEDA SE), PKH26, Hoechst CPA1, Cyquant GR 및 NF 염료, MTT, CTT 및 SNARF-1 카르복실산, 아세테이트 숙신이미딜 에스테르를 포함한다.
실시예 1
목적 RNA 를 높은 수준으로 생산하는 이상성 성장 프로파일을 갖는 세포
재조합 DNA 플라즈미드(예를 들어, 상피세포 성장 인자 수용체에 결합하는 단쇄 Fv 면역글로불린 단편을 코딩하는 것)로 세포를 형질전환시켰다. 표준 세포 형질전환법이 공지되어 있다. 세포 형질전환은 시판되는 시약 또는 키트(Qiagen, Promega, Invitrogen, Stratagene)를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 다양한 방법을 통해 수행할 수 있다. 필요하면, 세포는 표준의 확립된 방법 예컨대 균질화 및 후속 화학 처리 등을 통해 서로 분리시킬 수 있다. 이어 세포는 동일(또는 상이한) 플라즈미드가 부여하는 선별적 항생제 내성에 노출시켜서 세포 게놈에 목적하는 재조합 유전자가 통합된 세포를 농축시킨다. 다음으로, 세포를 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르(DSFE)로 염색하고 정해진 시간 기간 동안 저밀도로 성장시킨다. 이후 세포를 목적 RNA(예를 들어, 상피세포 성장 인자 수용체에 결합하는 단쇄 Fv 면역글로불린 단편을 코딩하는 RNA)와 혼성화하는 형광발광 프로브에 노출시킨다.
상기 형광발광 프로브는 목적 RNA와 혼성화시에 프로브의 형광성이 증가되는 것을 선택한다. CFSE 형광성의 빠른 손실 및 형광발광 프로브의 높은 형광도를 기준으로 세포(저밀도에서 빠르게 성장하면서 목적 유전자(들)의 RNA 발현을 높은 수준으로 유지하는 세포)를 선별하였다. 단리된 세포는 충분한 수로 성장시켰다.
단리된 세포를 CFSE로 다시 염색하고 고밀도로 성장시켰다. 수일 주기로, 유세포계측을 수행하였다. 세포는 다음의 2가지를 기준으로 하여 단리하였다: 1) 고밀도 세포 배양물에서 CFSE의 형광성 손실률의 감소 및 2) 형광발광 프로프의 형광성 증가. 상기 세포를 또한 프로피듐 요오드 또는 아넥신-V로 염색하여 아폽토시스 세포를 제거하였다. 최고 밀도 세포 배양물은 형광발광 프로브의 높은 형광성 및 저수준의 아폽토시스를 유지시키는 것에 따라 좌우되었다. 얻어진 세포 배양물에 대해 유세포계측을 수행하여 이상성 성장 프로파일을 가지고, 목적 RNA를 높은 수준으로 생산할 수 있으며, 낮은 아폽토시스로 높은 밀도로 성장할 수 있는 세포 클론을 단리하였다.

Claims (51)

  1. 세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약과 세포 개체군을 접촉시키는 단계; 및
    세포 증식 증가와 관련된 형광 시약의 형광도를 나타내는 세포를 단리하는 단계
    를 포함하는 세포 증식률이 증가된 세포의 단리 방법.
  2. 제1항에 있어서, 형광성 검출은 유세포 분류법(flow cytometric cell sorting technology)을 이용하여 수행하는 것인 단리 방법.
  3. 세포 증식률이 증가된 세포의 단리 방법으로서,
    상기 세포는 또한 목적 RNA를 높은 수준으로 발현시키며,
    상기 목적 RNA와 혼성화시 형광발광하는 형광발광 프로브와 세포 개체군을 접촉시키는 단계;
    세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약과 상기 개체군을 접촉시키는 단계로서, 상기 시약은 형광발광 프로브와 상이한 파장에서 형광발광하는 것인 단계; 및
    세포 증식 증가와 관련된 형광 시약의 형광도 및 형광발광 프로브의 형광성 증가를 나타내는 세포를 단리하는 단계
    를 포함하는 단리 방법.
  4. 제3항에 있어서, 형광발광 프로브의 형광성 검출은 형광 시약의 형광성 검출과 동시에 분석하는 것인 단리 방법.
  5. 제3항에 있어서, 형광성 검출은 유세포 분류법을 이용하여 수행하는 것인 단리 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약은 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르, SNARF-1 카르복실산 또는 아세테이트 숙신이미딜 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 것인 단리 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 세포는 포유류, 박테리아, 곤충, 식물, 미생물, 해조류 또는 진균류 세포인 단리 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 포유류 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, HEK 293 세포 및 Per.C6 세포로 이루어진 군에서 선택된 것인 단리 방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 BL21 세포인 단리 방법.
  10. 제7항에 있어서, 상기 진균류 세포는 크리소스포리움(Chrysosporium) 세포, 아스퍼질러스(Aspergillus) 세포, 트리코더마(Trichoderma) 세포, 딕티오스테리움(Dictyostelium) 세포, 캔디다(Candida) 세포, 사카로마이세스(Saccharomyces) 세포, 시조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 세포 및 페니실리움(Penicillium) 세포로 이루어진 군에서 선택된 것인 단리 방법.
  11. 제7항에 있어서, 상기 곤충 세포는 SF9 세포 또는 SF21 세포인 단리 방법.
  12. 제3항에 있어서, 형광발광 프로브의 형광성 증가 및 형광 시약의 형광성 변경을 나타내는 세포를 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 모니터링하기 위한 시약과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 단리 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 시약은 아넥신-V 또는 프로피듐 요오드인 단리 방법.
  14. 제3항에 있어서, 목적 RNA는 단백질을 코딩하는 메신저 RNA, 안티센스 RNA 분자, 구조 RNA, 리보솜 RNA, hnRNA 및 snRNA로 이루어진 군에서 선택된 것인 단리 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 메신저 RNA는 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, 단쇄 Fv, Fab, Fab' 또는 (Fab')2 항체 단편 또는 면역글로불린의 항원 결합 단편을 코딩하는 것인 단리 방법.
  16. 제3항에 있어서, 목적 RNA는 내재성 RNA인 단리 방법.
  17. 제3항에 있어서, 목적 RNA는 이종성 RNA인 단리 방법.
  18. 제3항에 있어서, 단리된 세포를 배양하여 세포 배양물을 제조하는 단계를 더 포함하는 것인 단리 방법.
  19. 제18항에 있어서, 세포 배양물의 밀도를 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 단리 방법.
  20. 세포 밀도가 증가된 세포 배양물의 제조 방법으로서,
    상기 세포 배양물의 세포는 목적 RNA를 높은 수준으로 발현시키며,
    상기 목적 RNA와 혼성화시에 형광발광하는 형광발광 프로브와 세포 개체군을 접촉시키는 단계;
    형광발광 프로브의 형광성 증가를 나타내는 개체군에서 세포를 단리하는 단계;
    단리된 세포를 배양하여 제1 세포 배양물을 제조하는 단계;
    상기 선행 단계들을 반복하여 제2 세포 배양물을 단리하는 단계;
    제1 및 제2 세포 배양물의 최대 수득 밀도를 비교하는 단계; 및
    세포 밀도가 증가된 세포 배양물 동정하는 단계로서, 상기 세포 배양물의 세포는 목적 RNA를 높은 수준으로 발현하는 것인 단계
    를 포함하는 제조 방법.
  21. 제20항에 있어서, 형광성 검출은 유세포 분류법을 이용하여 수행하는 것인 제조 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 세포는 포유류, 박테리아, 곤충, 식물, 해조류 또는 진균류 세포인 제조 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 포유류 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, HEK 293 세포 및 Per.C6 세포로 이루어진 군에서 선택된 것인 제조 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 BL21 세포인 제조 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 진균류 세포는 크리소스포리움 세포, 아스퍼질러스 세포, 트리코더마 세포, 딕티오스테리움 세포, 캔디다 세포, 사카로마이세스 세포, 시조사카로마이세스 세포 및 페니실리움 세포로 이루어진 군에서 선택된 것인 제조 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 곤충 세포는 SF9 세포 또는 SF21 세포인 제조 방법.
  27. 제20항에 있어서, 형광발광 프로브의 형광성 증가를 나타내는 세포를 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 모니터링하기 위한 시약과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 제조 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 시약은 아넥신-V 또는 프로피듐 요오드인 제조 방법.
  29. 제20항에 있어서, 목적 RNA는 단백질을 코딩하는 메신저 RNA, 안티센스 RNA 분자, 구조 RNA, 리보솜 RNA, hnRNA 및 snRNA로 이루어진 군에서 선택된 것인 제조 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 메신저 RNA는 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, 단쇄 Fv, Fab, Fab' 또는 (Fab')2 항체 단편 또는 면역글로불린의 항원 결합 단편을 코딩하는 것인 제조 방법.
  31. 제20항에 있어서, 목적 RNA는 내재성 RNA인 제조 방법.
  32. 제20항에 있어서, 목적 RNA는 이종성 RNA인 제조 방법
  33. 이상성 성장 프로파일을 갖는 세포의 단리 방법으로서, 상기 세포는 성장 프로파일의 제1부에서 증식률이 증가하고, 성장 프로파일의 제2부에서 증식률이 감소하며,
    세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약과 제1 세포 개체군을 접촉시키는 단계;
    상기 세포 개체군을 낮은 세포 밀도로 배양하는 단계,
    성장 프로파일의 제1부에서 형광 시약의 형광성 변경을 나타내는 상기 세포 개체군에서 세포를 단리하는 단계;
    단리된 세포를 배양하여 제2 세포 개체군을 제조하는 단계;
    세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약과 상기 제2 세포 개체군을 접촉시키는 단계;
    상기 제2 세포 개체군을 높은 세포 밀도로 배양하는 단계; 및
    성장 프로파일의 제1부에서 형광 시약의 형광성 변경과 비교하여 성장 프로파일의 제2부에서 형광 시약의 형광성 변경률이 느리거나 변경되지 않은 것으로 나타나는 세포를 단리하여서, 이상성 성장 프로파일을 갖는 세포를 단리하는 단계로서, 여기서 상기 세포는 성장 프로파일의 제1부에서 증식률이 증가하고, 성장 프로파일의 제2부에서 증식률이 감소한 것인 단계
    를 포함하는 단리 방법.
  34. 이상성 성장 프로파일을 갖는 세포의 단리 방법으로서,
    상기 세포는 성장 프로파일의 제1부에서 증식률이 증가하고 성장 프로파일의 제2부에서는 증식률이 감소하며, 여기서 상기 세포는 성장 프로파일의 제2부에서 목적 RNA를 높은 수준으로 발현시키고,
    상기 목적 RNA와 혼성화시 형광발광하는 형광발광 프로브와 세포 개체군을 접촉시키는 단계;
    세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약과 상기 개체군을 접촉시키는 단계로서, 상기 시약은 형광발광 프로브와 상이한 파장에서 형광을 발광하는 것인 단계; 및
    성장 프로파일의 제1부에서 형광 시약의 형광성 변경, 성장 프로파일의 제2부에서 형광 시약의 형광성 미변경 또는 변화 감소, 및 성장 프로파일의 제2부에서 형광발광 프로브의 형광성 증가를 나타나는 세포를 단리하는 단계
    를 포함하는 단리 방법.
  35. 제34항에 있어서, 세포는 성장 프로파일의 제1부에서 증가된 밀도로 성장하는 것인 단리 방법.
  36. 제34항에 있어서, 형광발광 프로브의 형광성 검출은 성장 프로파일의 제2부 동안 형광 시약의 형광성 검출과 동시에 분석하는 것인 단리 방법.
  37. 제34항에 있어서, 형광성 검출은 유세포 분류법을 이용하여 수행하는 것인 단리 방법.
  38. 제34항에 있어서, 상기 세포 증식률을 모니터링하기 위한 형광 시약은 카르복시플루오레세인 디아세테이트 숙신이미딜 에스테르 및 SNARF-1 카르복실산, 아세테이트 숙신이미딜 에스테르로 이루어진 군에서 선택된 것인 단리 방법.
  39. 제34항에 있어서, 상기 세포는 포유류, 박테리아, 곤충, 식물, 미생물, 해조류 또는 진균류 세포인 단리 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 포유류 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, NS0 세포, HEK 293 세포 및 Per.C6 세포로 이루어진 군에서 선택된 것인 단리 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 BL21 세포인 단리 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 진균류 세포는 크리소스포리움 세포, 아스퍼질러스 세포, 트리코더마 세포, 딕티오스테리움 세포, 캔디다 세포, 사카로마이세스 세포, 시조사카로마이세스 세포 및 페니실리움 세포로 이루어진 군에서 선택된 것인 단리 방법.
  43. 제39항에 있어서, 상기 곤충 세포는 SF9 세포 또는 SF21 세포인 단리 방법.
  44. 제34항에 있어서, 형광성 프로프의 형광성 증가 및 형광 시약의 형광성 미변경을 나타내는 세포를 아폽토시스 또는 프리아폽토시스 마커를 모니터링하기 위한 시약과 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것인 단리 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 시약은 아넥신-V 또는 프로피듐 요오드인 단리 방법.
  46. 제34항에 있어서, 목적 RNA는 단백질을 코딩하는 메신저 RNA, 안티센스 RNA 분자, 구조 RNA, 리보솜 RNA, hnRNA 및 snRNA로 이루어진 군에서 선택된 것인 단리 방법.
  47. 제46항에 있어서, 상기 메신저 RNA는 면역글로불린 중쇄, 면역글로불린 경쇄, 단쇄 Fv, Fab, Fab' 또는 (Fab')2 항체 단편 또는 면역글로불린의 항원 결합 단편을 코딩하는 것인 단리 방법.
  48. 제34항에 있어서, 목적 RNA는 내재성 RNA인 단리 방법.
  49. 제34항에 있어서, 목적 RNA는 이종성 RNA인 단리 방법.
  50. 제34항에 있어서, 단리된 세포를 배양하여 세포 배양물을 제조하는 단계를 더 포함하는 것인 단리 방법.
  51. 제50항에 있어서, 세포 배양물의 밀도를 측정하는 단계를 더 포함하는 것인 단리 방법.
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