CN101240344B - 恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性检测芯片及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因多态性检测芯片，公开了一种恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性检测芯片，该芯片包括固相载体和探针，所述探针与待测恶性疟原虫药物抗性相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。本发明还公开了所述芯片用于检测恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性的方法。本发明的检测芯片能同时进行多种恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性的检测，可用于恶性疟原虫药物抗性相关分子标志的现场监测，以快速掌握恶性疟流行区的多种药物抗性产生情况，指导治疗方案的调整，从而提高恶性疟防治效果，减轻该病造成的社会、经济负担。

Description

恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性检测芯片及其应用

技术领域

本发明涉及疟原虫抗性相关基因多态性检测芯片，尤其涉及一种恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性检测芯片及其应用。

背景技术

恶性疟在世界范围内流行形势严峻，每年约100万人死于恶性疟，尚不包括间接引起的死亡。我国疟疾防治取得显著成就，但疟疾仍然是我国最重要的寄生虫病之一，且云南和海南仍然存在恶性疟流行，历年均有死亡病例报告。恶性疟对流行地区造成严重的社会经济负担，药物抗性的产生进一步加重其危害。20世纪50年代后期在泰缅边境和哥伦比亚出现氯喹抗性病例。随后，氯喹抗性几乎遍布恶性疟流行区，哌喹、甲氟喹、乙胺嘧啶和磺胺类药物抗性株相继出现，甚至青蒿素类药物的敏感性也开始下降。研究结果表明我国也存在较为严重的恶性疟原虫抗性问题，呈现以下趋势：抗一种药物→抗多种药物，低度抗性→高度抗性，单一抗性→多重抗性，产生抗性慢→产生抗性快。深入理解恶性疟抗性的产生机制，准确快速监测抗性株的分布和流行已成为当前恶性疟防治工作面临的重要问题。

近期研究表明抗疟药抗性的产生与恶性疟原虫某些关键基因的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)有关，目前发现多个基因的SNP可反映恶性疟原虫对相应药物的抗性情况，并在不同地区的多项研究中得到验证。已明确的恶性疟原虫抗性相关SNP包括：恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Pfcrt)的391T/A、392G/C、399G/T、400A/G、402T/A和404A/C多态性(对应72～76位氨基酸编码序列)与氯喹抗性相关联(Anderson TJ，Nair S，Qin H，et al.Antimicrob AgentsChemother，2005，49(6)：2180-2188；Tagelsir N，Ibrahim Z，Medani A，et al.Acta Trop，2006，97(1)：19-25；Dittrich S，Alifrangis M，Stohrer JM，et al.Trop Med Int Health，2005，10(12)：1267-1270)；恶性疟原虫多药抗性基因(Pfmdr1)的256A/T和257A/T多态性(对应86位氨基酸编码序列)与甲氟喹、氯喹等多种药物的抗性有关(Anderson TJ，Nair S，Qin H，et al.Antimicrob Agents Chemother，2005，49(6)：2180-2188；Tagelsir N，Ibrahim Z，Medani A，et al.Acta Trop，2006，97(1)：19-25；Duraisingh MT，Refour P.Mol Microbiol，2005，57(4)：874-877)；恶性疟原虫二氢喋酸合成酶基因(Pfdhps)的1482T/G、1483C/T/G、1486G/C、1794A/G、1918C/G和2013G/T/A多态性(对应436、437、540、581和613位氨基酸编码序列)与磺胺类药物抗性有关；恶性疟原虫二氢叶酸还原酶基因(Pfdhfr)的148T/C、152A/T、153T/C、175T/C、323G/A/C和490A/T多态性(对应50、51、59、108和164位氨基酸编码序列)与乙胺嘧啶抗性有关(官亚宜，汤林华.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005，23(2)：117-120；Happi CT，GbotoshoGO，Folarin OA，et al.Acta Trop，2005，95(3)：183-193；Ndiaye D，Daily JP，Sarr O，et al.Trop Med Int Health，2005，10(11)：1176-1179)；恶性疟原虫三磷酸腺苷酶第6亚基基因(PfATPase6)的2306G/A多态性(对应769位氨基酸编码序列)与青蒿素类药物IC50升高有关(Jambou R，Legrand E，Niang M，et al.Lancet，2005，366(9501)：1960-1963；Eckstein-Ludwig U，Webb RJ，Van Goethem ID，etal.Nature，2003，424(6951)：957-961)。在非洲和东南亚等恶性疟严重流行地区，上述SNP已被作为分子标志用于现场恶性疟原虫的药物抗性评价(官亚宜，汤林华.中国寄生虫学与寄生虫病杂志，2005，23(2)：117-120；Congpuong K，Na BangchangK，Mungthin M，et al.Trop Med Int Health，2005，10(8)：717-722；SyafruddinD，Asih PB，Casey GJ，et al.Am J Trop Med Hyg，2005，72(2)：174-181；NsimbaB，Jafari-Guemouri S，Malonga DA，et al.Trop Med Int Health.2005，10(10)：1030-1037)。

为找到一种高效、便捷的检测这些抗性分子标志的手段，国内外学者开展了大量研究，运用各种分子生物学技术，已建立起以下几种方法。

(1)突变特异性PCR(mutation-specific PCR)，该方法利用PCR引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计突变特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3’碱基与模板配对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。Djimde等运用该技术检测了pfcrt氨基酸76位点的突变情况(Djimde，A.，O.K.Doumbo，J.F.Cortese，et al.N Engl J Med.2001，344：257-263)。

(2)巢式PCR-RFLP，巢式PCR是指利用两对PCR引物对模板DNA进行两轮PCR扩增反应。在第一轮扩增中，外侧引物扩增出第一轮产物，再以此产物作为内侧引物模板，进行第二轮扩增。接下来，对第二轮扩增产物进行限制性酶切反应，根据酶切产物的电泳图谱，确定标本基因型。Djimde等设计了pfcrt和pfmdr1基因多态性的巢式PCR-RFLP检测方法，用于检测pfcrt氨基酸76位点和pfmdr1氨基酸86位点的SNP(Djimde，A.，O.K.Doumbo，J.F.Cortese，et al.N Engl J Med.2001，344：257-263)。

(3)巢式PCR-DNA测序，首先对模板DNA进行巢式PCR扩增，再对第二轮PCR产物进行测序，将测序结果与参考序列比对，确定待测标本的基因型。该方法被认为是目前最为可靠的检测方法，常用于评价其他检测方法的准确性。

(4)多重PCR-RFLP，多重PCR是指在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核苷酸片段，然后进行限制性酶切反应，根据酶切产物的电泳图谱，确定标本多个位点的基因型。如Veiga等通过进行两次多重PCR反应，完成pfcrt、pfmdr1和pfdhfr三个基因目的片段扩增，再结合限制性酶切反应，建立了检测pfcrt氨基酸76位点、pfmdr1氨基酸86位点和pfdhfr氨基酸51、59、108位点的多态性检测方法(Veiga，M.I.，P.E.Ferreira，A.Bjorkman，et al.Mol Cell Probes.2006，20：100-104)。

(5)斑点杂交(dot blot hybridization)，是将核酸样品点样并固定在硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再与标记探针进行杂交，洗脱非特异性杂交探针后，应用放射性探针自显影或非放射性探针显色检测杂交反应结果，从而进行DNA多态性分析。Abdel-Muhsin等通过紫外交联技术将恶性疟原虫基因组DNA的PCR扩增产物固定到尼龙膜上，利用7条³²P标记的序列特异性探针与之杂交，成功检测了pfdhfr氨基酸51、59和108位点的多态性(Abdel-Muhsin，A.M.，L.C.Ranford-Cartwright，et al.Am J Trop Med Hyg.2002，67：24-27)。Pearce等应用序列特异性寡核苷酸探针斑点杂交方法，建立了pfdhfr氨基酸50、51、59、108、164位点和pfdhps氨基酸436、437、540、581、613位点的SNP检测方法(Pearce，R.J.，C.Drakeley，D.Chandramohan，et al.Antimicrob Agents Chemother.2003，47：1347-1354)。

(6)分子信标(molecular beacons)，该技术是通过构建荧光物质标记的发卡型分子探针，这些探针在未结合时不产生荧光，即便只存在一个碱基的错配也不会发出荧光。当探针与模板链完全互补配对时，构象发生改变，由U型变为直线型，将自动发出荧光。可以通过观察荧光信号的有无或颜色不同，识别出对应位点的碱基类型。Durand等运用两个分子信标，其中之一被绿色荧光标记，另一被红色荧光标记，分别针对pfdhfr氨基酸108位点的野生型和突变型序列，实现了对该位点多态性的快速、灵敏检测(Durand，R.，J.Eslahpazire，S.Jafari，et al.Antimicrob AgentsChemother.2000，44：3461-3464)。

(7)实时PCR(real-time PCR)，是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。Alker等利用5’端核酸酶实时定量PCR方法(又称TaqMan

分析方法)，对pfdhfr氨基酸51、59、108位点和pfdhps氨基酸436、437、540、581、613位点的多态性进行了分析(Alker，A.P.，V.Mwapasa，and S.R.Meshnick.AntimicrobAgents Chemother.2004，48：2924-9)。

(8)PCR-ELISA，是一种在微孔板上对PCR产物进行快速、非放射性的检测。首先，提取样本基因组DNA，根据特异基因序列(模板DNA)设计的引物进行特异扩增。在扩增的同时，给PCR产物加上某种特殊标记，然后令该PCR产物与事先标记的捕获性探针(该探针能与模板DNA内部某段序列互补结合)进行杂交，再加入酶标抗体反应，最后加入底物显色，测定OD值，以此方法检测某种特定基因的存在或进行基因分型。Alifrangis等利用该技术建立了pfdhfr、pfdhps和pfcrt三个抗性基因9个位点的多态性检测方法(Alifrangis，M.，S.Enosse，R.Pearce，et al.Am JTrop Med Hyg.2005，72：155-162)。

(9)焦磷酸测序(pyrosequencing)，该技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并由Pyrogram^TM转化为一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比。然后加入下一种dNTP，在完成DNA链合成同时完成DNA的序列分析。Zhou等尝试利用该技术分析pfdhfr和pfdhps基因多个位点的SNP，获得成功(Zhou，Z.，A.C.Poe，J.Limor，et al.J Clin Microbiol.2006，44：3900-3910)。

以上检测方法各具优势，在恶性疟原虫抗性相关基因多态性检测中分别得到了不同程度的应用，但这些方法共有的特点是检测通量有限，每次反应都只能平行检测一个或数个位点的抗性相关SNP，且在检测之前普遍需要先采用巢式PCR方法对基因组DNA进行扩增，每检测一个SNP需进行两轮PCR反应，消耗较多人力，操作步骤复杂，所需费用高，时效性欠佳，制约了恶性疟原虫抗性相关分子标志在疟疾防治中的广泛应用，急于寻找一种高效、便捷的手段来检测这些基因中的抗性相关分子标志。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性检测芯片，能及时、快速检测出恶性疟原虫是否存在对多种抗疟药的抗性，进一步指导恶性疟治疗方案的选择。为此，本发明还提供一种应用上述芯片检测恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性的方法。

为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：

在本发明的一个方面，提供了一种恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性检测芯片，包括固相载体和探针，所述探针与待测恶性疟原虫药物抗性相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。

所述待测恶性疟原虫药物抗性相关基因至少包括一种或两种以上的下述基因：Pfdhfr(恶性疟原虫二氢叶酸还原酶基因)、Pfmdr1(恶性疟原虫多药抗性基因)、PfATPase6(恶性疟原虫三磷酸腺苷酶第6亚基基因)、Pfdhps(恶性疟原虫二氢喋酸合成酶基因)和Pfcrt(恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因)。

所述探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其衍生物。所述探针的长度没有限制，只要能完成与目的核苷酸序列特异性结合。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过40个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以20-30个碱基对之间的为最佳。所述探针的自身互补序列最好少于6个碱基对，以免影响杂交效率。

本发明检测芯片的探针为DNA，至少包括下述一种或两种以上的探针：

(1)与待测Pfdhfr基因杂交的探针，其包含选自(a)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：16所示序列，(b)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：16所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：16所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(2)与待测Pfmdr1基因杂交的探针，其包含选自(a)SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：20所示序列，(b)SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：20所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：20所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(3)与待测PfATPase6基因杂交的探针，其包含选自(a)SEQ ID NO：21～SEQ IDNO：23所示序列，(b)SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：23所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：23所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(4)与待测Pfdhps基因杂交的探针，其包含选自(a)SEQ ID NO：24～SEQ ID NO：40所示序列，(b)SEQ ID NO：24～SEQ ID NO：40所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：24～SEQ ID NO：40所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列；

(5)与待测Pfcrt基因杂交的探针，其包含选自(a)SEQ ID NO：41～SEQ ID NO：45所示序列，(b)SEQ ID NO：41～SEQ ID NO：45所示序列中每条序列的互补链，(c)与SEQ ID NO：41～SEQ ID NO：45所示序列中每条序列有至少70％同源性的序列。

优选的，本发明检测芯片的探针包括选自SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：45所示的序列。

所述探针序列可包含1-10个错配碱基，较佳地，可包含1-5个错配碱基，更佳地，可包含1-2个错配碱基。

本发明检测芯片还包括至少一种对照探针，所述对照探针选自：阴性对照探针、阳性对照探针、杂交对照探针和固定化对照探针。

所述探针可通过连接臂固定于固相载体上。连接臂可以为探针形成双链的部分提供一个自由的空间以减少空间位阻，有助于杂交反应的进行[Afanassiev V，HanemannV，Wolfl S.Nucleic Acids Res.2000，28：e66；USA Patent No.5556752]。连接臂越长，杂交效率越高。典型的连接臂包括15～30个功能基团长度。连接臂可以选用适当形式的功能基团，如Poly T(A、C或G)、C原子或聚乙烯乙二醇与Poly T(A、C或G)的嵌合体、聚乙醇、聚酷、聚氨、聚硫酸酷和其组合物。

所述探针或连接臂通过连接分子固定于固相载体上。探针固定到载体上可以通过C-C键实现，例如，聚三氟氯乙烯表面；或更好的用硅氧烷键(玻璃或二氧化硅作支持物时使用)。硅氧烷键键合可以通过支持物和连接分子的三氯甲硅烷基或三烷氧基甲硅烷基等基团反应完成。氨基烷基硅烷、轻基烷基硅烷、2一轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷、轻乙基一氨丙基三乙氧基硅烷或轻丙基三乙氧基硅烷都是很有用的表面吸附基团。

所述探针可以被修饰，修饰方法可以是5’-NH₂修饰、5’-SH修饰、5’-Poly T(A、C或G)修饰、5’-生物素修饰、3’-NH₂修饰、3’-SH修饰、3’-Poly T(A、C或G)修饰和3’-生物素修饰等。

所述探针可以有一条或几条，甚至全部都是经过标记的，所述标记包括荧光素标记、生物素标记、放射性元素标记、酶标记和荧光共振能量转移标记。

本发明中所述固相载体可选用领域周知的载体，只要所述载体与所述反应物相容，不会影响检测结果即可。优选的，本发明所述固相载体选材为玻片、硅片、硝酸纤维素膜、尼龙膜和高分子材料中的一种或它们的任意组合。

在本发明的另一方面，提供了一种应用上述芯片检测恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性的方法，包括如下步骤：

(1)在固相载体表面点载与待测恶性疟原虫药物抗性相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针；

(2)抽提待测样品核酸；

(3)制备待测恶性疟原虫药物抗性相关基因目的核苷酸序列；

(4)标记步骤(3)的目的核苷酸序列；

(5)在适于与步骤(1)所述的点载在固相载体上的探针进行杂交的条件下，加入经标记的目的核苷酸序列，并使其反应足够时间；

(6)检测杂交反应的结果。

在本发明的另一方面，还提供了一种应用上述芯片检测恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性的方法，包括如下步骤：

(1)标记与待测恶性疟原虫药物抗性相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交的探针；

(2)抽提待测样品核酸；

(3)制备待测恶性疟原虫药物抗性相关基因目的核苷酸序列；

(4)在固相载体表面点载步骤(3)所述的目的核苷酸序列；

(5)在适于与步骤(4)所述的点载在固相载体上的目的核苷酸序列进行杂交的条件下，加入经标记的探针，并使其反应足够时间；

(6)检测杂交反应的结果。

所述目的核苷酸序列的制备可包括扩增的步骤，用分离的靶样本中含核酸的细胞直接扩增，也可用抽提的靶核酸直接扩增。扩增得到的单链或双链的DNA或RNA可含有荧光或生物素标记，标记的DNA或RNA可不经纯化直接用于杂交。与本发明中所述芯片杂交的优选靶核苷酸分子是单链核酸分子，双链核酸分子经过变性等处理后也与本发明所述芯片杂交。

目的核苷酸序列可使用任何适当的扩增方法进行富集，如：聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)，多重PCR，连接酶链反应(ligase chainreaction，LCR)，滚环扩增(rolling cycle amplification，RCA)，基于核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)，链置换扩增(stranddisplacement amplification，SDA)和转录介导的扩增(transcription medicatedamplification，TMA)等。

在本发明的一个实施例中，目的核苷酸序列的制备采用多重PCR扩增方法。

所述探针或目的核苷酸序列都适合用于标记。探针在合成引入标记，目的核苷酸序列可以在扩增中引入标记，或者扩增后用合适的方法引入标记。

合适的标记包括荧光标记、放射性同位素标记、发色团、发光体、FRET、酶、生物素或有特殊结合配体的配基。

本发明方法的杂交可在任何适当的温度下进行，如25℃～65℃，所述杂交时间为2分钟～18小时。可以改变杂交条件以提高或降低杂交的严谨程度、杂交特异性。

本发明的恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性检测芯片及其应用，能同时进行多个恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性的检测，一次芯片反应完成5个基因21个主要抗性相关单核苷酸多态性的检测，结果准确、通量高。采用本发明的芯片方法检测87份现场标本，其结果与采用传统巢式PCR结合测序方法检测该87份现场标本的结果相比较，一致率为98.7％。本发明芯片内部三次平行检测结果一致率为98.2％，30份标本不同批次芯片两次独立检测，外部一致率为95.7％。模板DNA量达0.06ng即满足扩增和芯片检测要求。5份近缘虫种对照(间日疟原虫、伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫、杜氏利什曼原虫和牛源隐孢子虫)经芯片检测，特异性探针均无阳性信号。

此外，本发明芯片显著提高了恶性疟原虫抗性分子标志的检测效率。以巢式PCR结合测序方法为例，每检测一个抗性基因的多态性需进行2次PCR反应，检测5个抗性相关基因的多态性，则需10次PCR反应，约需5个工作日，加上测序所用时间，至少6个工作目方能完成。运用本发明的方法，从基因扩增到完成基因型判定，整个过程只需约8小时(多重PCR需4小时，DNA片段化和标记2小时、杂交1.5小时，洗片0.25小时，扫描和结果分析0.25小时)。两名实验室技术人员在一个工作日内可完成50份标本的21抗性相关SNP的检测。本发明一张芯片可检测10份标本的21个SNP，每张芯片片基市场价约20元，加上PCR反应、荧光标记、杂交反应等试剂和耗材费用，每检测一个SNP约需4.5元，成本显著低于传统方法。

本发明的芯片可满足大规模多位点SNP同时检测的要求，特别适用于抗性分子标志的现场监测，且本发明芯片能快速掌握恶性疟流行区的多类药物抗性产生情况，指导治疗方案的调整，从而提高恶性疟的防治效果，减轻该病造成的社会、经济负担。

附图说明

图1是本发明芯片的探针排布示意图；

图2是本发明多重PCR扩增后的电泳检测结果图；

图3是本发明实施例1芯片检测的杂交结果图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1反向杂交

1.基因芯片的制备

(1)探针溶解

每条探针用TE溶液稀释，终浓度为50μM。将浓度为50μM的探针与浓度为200mM的PBS溶液(含0.05％SDS)于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心，-20℃保存，以备点样使用。

(2)点样

将预先设计并合成好的探针(见表1)通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。表1所列的探针序列中，名称为A1、B1、C1、D1、E1、F1、G3、H1、I1、J1、K1的探针序列对应的基因型为野生型，其余探针对应的基因型为突变型。所述片基采用北京博奥生物有限公司的晶芯

醛基片基。GeneMachine公司的OmniGrid^TM100型号的点样仪，在湿度：55％-65％，温度为25℃的条件下点样，点样的格式为1×3，每个矩阵为5×10，点样完毕后，放置半小时后，将芯片取出，室温干燥保存。芯片探针排布如图1所示。

表1.芯片所用探针序列

SEQID NO	名称	对应基因型	序列(5’-3’)
				1234567	A1A2A3A4A5A6B1	pfdhfr-50CN-50CI-50CN2-50RN-50RN2-50RI-59C	NH<sub>2</sub>-(T)15-CCATGGAAATGTAATTCCCTAGATATNH<sub>2</sub>-(T)15-CCATGGAAATGTATTTCCCTAGATATNH<sub>2</sub>-(T)15-CATGGAAATGTAACTCCCTAGATATGNH<sub>2</sub>-(T)15-CCATGGAAACGTAATTCCCTAGATATNH<sub>2</sub>-(T)15-CATGGAAACGTAACTCCCTAGATATNH<sub>2</sub>-(T)15-CCATGGAAACGTATTTCCCTAGATATNH<sub>2</sub>-(T)15-ATATGAAATATTTTTGTGCAGTTACAACAT

89101112131415161718192021222324252627282930313233343536373839404142434445

B2B3C1C2C3C4D1D2D3E1E2E3E4F1F2F3G1G2G3G4G5G6G7H1H2H3I1I2I3J1J2J3J4K1K2K3K4K5SPNB

-59R-59control-108s-108N-108T-108control-164I-164L-164controlpfmdr1-86N-86Y-86F-86controlpfATPase6-769S-769N-769controlpfdhps-436AA-436AG-436SA-436SG-436FA-436FG-436CA-540K-540E-540control-581A-581G-581control-613A-613S-613T-613controlpfcrt-72CVMNK-72CVIET-72SVMNT-72CVIEK-72S<sub>2</sub>VMNT定位探针杂交阳性探针杂交阴性探针空白探针

NH<sub>2</sub>-(T)15-ATGAAATATTTTCGTGCAGTTACAACNH<sub>2</sub>-(T)15-ATGAAATATTTTGGTGCAGTTACAACNH<sub>2</sub>-(T)15-GAAGAACAAGCTGGGAAAGCNH<sub>2</sub>-(T)15-GGAAGAACAAACTGGGAAAGCNH<sub>2</sub>-(T)15-GAAGAACAACCTGGGAAAGCNH<sub>2</sub>-(T)15-GGAAGAACAATCTGGGAAAGCNH<sub>2</sub>-(T)15-AAATGTTTTATTATAGGAGGTTCCGTNH<sub>2</sub>-(T)15-AAATGTTTTATTTTAGGAGGTTCCGTNH<sub>2</sub>-(T)15-ATGTTTTATTCTAGGAGGTTCCGNH<sub>2</sub>-(T)15-ATTAAAGAACATGAATTTAGGTGATGA NH<sub>2</sub>-(T)15-ATTAAAGAACATGTATTTAGGTGATGATNH<sub>2</sub>-(T)15-TTAAAGAACATGTTTTTAGGTGATGATANH<sub>2</sub>-(T)15-TTAAAGAACATGCATTTAGGTGATGANH<sub>2</sub>-(T)15-TTTGCTTATAAAAAATTAAGTAGTAAAGATTTAAATATNH<sub>2</sub>-(T)15-CTTTGCTTATAAAAAATTAAATAGTAAAGATTTAAATATNH<sub>2</sub>-(T)15-TTTGCTTATAAAAAATTAACTAGTAAAGATTTAAATATNH<sub>2</sub>-(T)15-AGAATCCGCTGCTCCTTTTGTNH<sub>2</sub>-(T)15-AGAATCCGCTGGTCCTTTTGTNH<sub>2</sub>-(T)15-GAGAATCCTCTGCTCCTTTTGNH<sub>2</sub>-(T)15-GAGAATCCTCTGGTCCTTTTGNH<sub>2</sub>-(T)15-GAGAATCCTTTGCTCCTTTTGTNH<sub>2</sub>-(T)15-GAGAATCCTTTGGTCCTTTTGTNH<sub>2</sub>-(T)15-GAGAATCCTGTGCTCCTTTTGNH<sub>2</sub>-(T)15-CACATACAATGGATAAACTAACAAATTANH<sub>2</sub>-(T)15-CACATACAATGGATGAACTAACAAATTANH<sub>2</sub>-(T)15-CACATACAATGGATCAACTAACAAATTNH<sub>2</sub>-(T)15-GATTAGGATTTGCGAAGAAACATGNH<sub>2</sub>-(T)15-GATTAGGATTTGGGAAGAAACATGANH<sub>2</sub>-(T)15-GATTAGGATTTGAGAAGAAACATGNH<sub>2</sub>-(T)15-AAAAGATTTATTGCCCATTGCATGANH<sub>2</sub>-(T)15-AAAAGATTTATTTCCCATTGCATGAATNH<sub>2</sub>-(T)15-AAAGATTTATTACCCATTGCATGAATNH<sub>2</sub>-(T)15-AAAAGATTTATTCCCCATTGCATGANH<sub>2</sub>-(T)15-GTGTATGTGTAATGAATAAAATTTTTGCTANH<sub>2</sub>-(T)15-TGTATGTGTAATTGAAACAATTTTTGCTAANH<sub>2</sub>-(T)15-TATTTATTTAAGTGTAAGTGTAATGAATACAATTNH<sub>2</sub>-(T)15-GTGTATGTGTAATTGAAAAAATTTTTGCTANH<sub>2</sub>-(T)15-TATTTATTTAAGTGTATCTGTAATGAATACAATTTTTGNH<sub>2</sub>-(T)15-ATTGCTTGCGGCGGTAACGNH<sub>2</sub>-(T)15-TCTGCTTCTGCTTCTGCTTNH<sub>2</sub>-(T)15-TCTGCTTCTCCTTCTGCTT100mM磷酸盐缓冲液(PBS)

2.目的基因扩增

参考文献(张国庆，汤林华，官亚宜，等.中国寄生虫学与寄生虫病杂志.2007，25：451-456)，利用5对引物(见表2)，以恶性疟原虫基因组DNA为模板，扩增产生包含21个SNP位点的5个抗性相关基因目的片段。

表2多重PCR反应所用引物及扩增产物长度

基因	引物(5’-3’)	产物(bp)
			PfcrtPfmdr1PfdhpsPfdhfrPfATPPase6	P1F：GGAGGTTCTTGTCTTGGTAAATP1R：ATATTGGTAGGTGGAATAGATTCTP2F：TGTTGAAAGATGGGTAAAGAGCAGAP2R：TCGTACCAATTCCTGAACTCACTTP3F：GATTCTTTTTCAGATGGAGGP3R：TTCCTCATGTAATTCATCTGAP4F：TGATGGAACAAGTCTGCGACGTTP4R：CTGGAAAAAATACATCACATTCATATGP5F：AAAATAAATACCACATCAACACATP5R：TCAATAATACCTAATCCACCTAAA	315514770594437

多重PCR反应体系为：10×PCR缓冲液(含20mmol/L Mg²⁺)5.0μl，10mmol/L脱氧核苷三磷酸(dNTPs)1.2μl，引物混合物液(组成：3.2μl 12.5μmol/L P1F、3.2μl 12.5μmol/L P1R、2.0μl 12.5μmol/L P2F、2.0μl 12.5μmol/L P2R、2.0μl 12.5μmol/L P3F、2.0μl 12.5μmol/L P3R、2.0μl 12.5μmol/L P4F、2.0μl 12.5μmol/L P4R、2.0μl 12.5μmol/L P5F、2.0μl 12.5μmol/L P5R)1.0μl，模板DNA 2.5μl，5 U/μl Hot Start Taq DNA聚合酶0.4μl，加灭菌双蒸水至50.0μl。扩增参数：94℃预变性15min；94℃变性40s、50℃退火2min、由50℃按0.1℃/s递增至72℃，共40循环；72℃延伸3min。PCR结束后用2.0％琼脂糖凝胶检测扩增结果，如图2所示，5条特异性目标扩增产物长度由下往上依次分别为315bp、437bp、514bp、594bp和770bp。

3.PCR产物纯化和片段化

PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Hilden，德国)纯化。纯化的PCR经测定浓度后，用DNase I(Takara，大连，中国)进行片段化。30μl片段化的反应体系包括：1×DNase I缓冲液，200ng/μl纯化PCR产物，DNase I(0.001U/μg)。反应条件为37℃温浴5min，然后95℃15min。

4.荧光素标记

用脱氧核苷酸末端转移酶(Deoxynucleotidyl Transferase，TDT)进行荧光素标记，25μl反应体系含200mM potassium cacodylate，25mM Tris-HCl(pH7.2)，1mM CoCl₂，0.01％Triton X-100，20μM Cy3-dCTP(GE Healthcare，USA)，20U TDT(Fermentas，Lithuania)，37℃标记1小时，随后于95℃变性10min。

5.杂交、洗涤和结果检测

荧光标记的PCR产物95℃变性5min，立即置于冰上，用于杂交，杂交反应体系包括15μl荧光素标记的PCR产物，1.2μl 20×SSPE，0.2μl 1％Triton，0.9μl10×Denhardts，0.5μl甲酰胺，2.2μl ddH₂O。

反应条件为52℃温浴2小时，杂交后，芯片分别用2×SSC和1％SDS、1×SSC和0.2％SDS的洗液42℃洗涤6min。最后用0.6×SSC洗液于室温洗涤3min，并甩干。

甩干的芯片用GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。以恶性疟原虫国际标准株3D7株为例，扫描杂交后的芯片得到的杂交结果如图3所示，再用GenePix Pro软件处理图像得到数据文件，然后对数据文件进行分析即可确定待测标本各多态性位点的基因型。图3所示的分型结果是pfdhfr 50/51CN，59C，108S，164I；pfmdr1 86N；pfATPase6 769S；pfdhps 436/437SG，540K，581A，613A；pfcrt 72-76CVMNK。其中，pfdhfr 50/51CN说明pfdhfr蛋白第50位氨基酸是C(Cys，半胱氨酸)、第51位氨基酸是N(Asn，天冬酰胺)。其它的分型结果按类似方式解释。

采用本发明的芯片方法检测87份现场标本，其结果与采用传统巢式PCR结合测序方法检测该87份现场标本的结果相比较，一致率为98.7％。本发明芯片内部三次平行检测结果一致率为98.2％，30份标本不同批次芯片两次独立检测，外部一致率为95.7％。模板DNA量达0.06ng即满足扩增和芯片检测要求。5份近缘虫种对照(间日疟原虫、伯氏疟原虫、食蟹猴疟原虫、杜氏利什曼原虫和牛源隐孢子虫)经芯片检测，特异性探针均无阳性信号。这些结果和数据表明，应用本发明芯片检测恶性疟原虫药物抗性相关基因的多态性，准确率高，且速度快，适于恶性疟原虫抗性分子标志的现场监测，为迅速掌握恶性疟流行区的多类药物抗性产生情况并及时调整治疗方案提供了有效的检测手段。

实施例2正向杂交

1.恶性疟原虫药物抗性相关基因的扩增和芯片制备

利用上述表2的5对引物，以恶性疟原虫基因组DNA为模板，扩增产生包含21个SNP位点的5个抗性相关基因目的片段。多重PCR的反应体系和反应条件同实施例1。PCR产物用QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen，Hilden，德国)纯化。将纯化的PCR产物浓度调整至400ng/μl。

将浓度为400ng/μl的PCR产物与100％的DMSO于384孔板中等体积混合，以粘胶片封好384孔板，室温下振荡2分钟，离心。将200ng/μl的PCR产物通过接触式点样或喷墨式点样点载到玻片、硅片等材质的固相载体片基上。采用GeneMachine公司的Ominigrid 100型号的点样仪，在湿度：55％-65％，温度为25℃的条件下点样，点样完毕放置半小时后，将芯片放于饱和食盐水盒中，37℃水化过夜，次日取出，600mJ交联，交联完毕之芯片即可使用。

2.芯片杂交

杂交反应体系包括：2nM荧光标记的寡核苷酸探针(见表1)，1.2μl 20×SSPE，0.2μl 1％Triton，0.9μl 10×Denhardts，0.5μl甲酰胺，2.2μl ddH₂O。反应条件为52℃温浴2小时，杂交后，芯片分别用2×SSC和1％SDS、1×SSC和0.2％SDS的洗液42℃洗涤6min。最后用0.6×SSC洗液于室温洗涤3min，并甩干。用GenePix 4000B共聚焦激光扫描仪进行扫描(也可以用其他的激光扫描仪)。

序列表

<110>中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所

<120>恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性检测芯片及其应用

<130>NP-08-12168

<160>45

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

ccatggaaat gtaattccct agatat       26

<210>2

<211>26

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<213>人工序列

<400>2

ccatggaaat gtatttccct agatat       26

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<212>DNA

<213>人工序列

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catggaaatg taactcccta gatatg       26

<210>4

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

ccatggaaac gtaattccct agatat       26

<210>5

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

catggaaacg taactcccta gatat        25

<210>6

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ccatggaaac gtatttccct agatat       26

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

atatgaaata tttttgtgca gttacaacat   30

<210>8

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<212>DNA

<213>人工序列

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atgaaatatt ttcgtgcagt tacaac       26

<210>9

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<212>DNA

<213>人工序列

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atgaaatatt ttggtgcagt tacaac       26

<210>10

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<212>DNA

<213>人工序列

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gaagaacaag ctgggaaagc              20

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<213>人工序列

<400>11

ggaagaacaa actgggaaag c            21

<210>12

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<213>人工序列

<400>12

gaagaacaac ctgggaaagc              20

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

ggaagaacaa tctgggaaag c            21

<210>14

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

aaatgtttta ttataggagg ttccgt       26

<210>15

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

aaatgtttta ttttaggagg ttccgt       26

<210>16

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

atgttttatt ctaggaggtt ccg                    23

<210>17

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>17

attaaagaac atgaatttag gtgatgat               28

<210>18

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<212>DNA

<213>人工序列

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attaaagaac atgtatttag gtgatgat               28

<210>19

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<212>DNA

<213>人工序列

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ttaaagaaca tgtttttagg tgatgata               28

<210>20

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<212>DNA

<213>人工序列

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ttaaagaaca tgcatttagg tgatga                 26

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>21

tttgcttata aaaaattaag tagtaaagat ttaaatat    38

<210>22

<211>39

<212>DNA

<213>人工序列

<400>22

ctttgcttat aaaaaattaa atagtaaaga tttaaatat   39

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<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<400>23

tttgcttata aaaaattaac tagtaaagat ttaaatat    38

<210>24

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>24

agaatccgct gctccttttg t                      21

<210>25

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<212>DNA

<213>人工序列

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agaatccgct ggtccttttg t                      21

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<212>DNA

<213>人工序列

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gagaatcctc tgctcctttt g                      21

<210>27

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<212>DNA

<213>人工序列

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gagaatcctc tggtcctttt g                  21

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<212>DNA

<213>人工序列

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gagaatcctt tgctcctttt gt                 22

<210>29

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>29

gagaatcctt tggtcctttt gt                 22

<210>30

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>30

gagaatcctg tgctcctttt g                  21

<210>31

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>31

cacatacaat ggataaacta acaaatta           28

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>32

cacatacaat ggatgaacta acaaatta           28

<210>33

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<212>DNA

<213>人工序列

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cacatacaat ggatcaacta acaaatt         27

<210>34

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>34

gattaggatt tgcgaagaaa catg            24

<210>35

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>35

gattaggatt tgggaagaaa catga           25

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<212>DNA

<213>人工序列

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<212>DNA

<213>人工序列

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aaaagattta ttgcccattg catga           25

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<212>DNA

<213>人工序列

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aaaaagattt atttcccatt gcatgaat                28

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<212>DNA

<213>人工序列

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aaaaagattt attacccatt gcatgaat                28

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<212>DNA

<213>人工序列

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aaaagattta ttccccattg catga                   25

<210>41

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<212>DNA

<213>人工序列

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gtgtatgtgt aatgaataaa atttttgcta              30

<210>42

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<212>DNA

<213>人工序列

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tgtatgtgta attgaaacaa tttttgctaa              30

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<212>DNA

<213>人工序列

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tatttattta agtgtaagtg taatgaatac aatt         34

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<212>DNA

<213>人工序列

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gtgtatgtgt aattgaaaaa atttttgcta             30

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<212>DNA

<213>人工序列

<400>45

tatttattta agtgtatctg taatgaatac aatttttg    38

Claims (5)

1.一种恶性疟原虫药物抗性相关基因多态性检测芯片，包括固相载体和探针，其特征在于，所述探针与待测恶性疟原虫药物抗性相关基因的核苷酸序列和/或其互补序列进行杂交。

2.如权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，所述待测恶性疟原虫药物抗性相关基因至少包括一种或两种以上的下述基因：Pfdhfr、Pfmdr1、PfATPase6、Pfdhps和Pfcrt。

3.如权利要求1或2所述的检测芯片，其特征在于，所述探针为DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体或PNA。

4.如权利要求3所述的检测芯片，其特征在于，所述探针为DNA，至少选自下述一种或两种以上的探针：

(1)与待测Pfdhfr基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：16所示序列，(b)SEQ ID NO：1～SEQID NO：16所示序列中每条序列的互补链；

(2)与待测Pfmdr1基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：20所示序列，(b)SEQ ID NO：17～SEQ ID NO：20所示序列中每条序列的互补链；

(3)与待测PfATPase6基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：23所示序列，(b)SEQ ID NO：21～SEQ ID NO：23所示序列中每条序列的互补链；

(4)与待测Pfdhps基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：24～SEQ ID NO：40所示序列，(b)SEQ ID NO：24～SEQ ID NO：40所示序列中每条序列的互补链；

(5)与待测Pfcrt基因杂交的探针，其选自(a)SEQ ID NO：41～SEQ ID NO：45所示序列，(b)SEQ ID NO：41～SEQ ID NO：45所示序列中每条序列的互补链。

5.如权利要求4所述的检测芯片，其特征在于，所述探针选自SEQ ID NO：1～SEQID NO：45所示的序列。

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