JPWO2003027674A1 - リガンド固定化用担体 - Google Patents
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Abstract
あらかじめ活性化された活性化ポリアニオンでコートされたリガンド固定化用担体。
Description
技術分野
本発明は、ＤＮＡチップ、糖チップ、プロテインチップ等のリガンドが固定化された担体の作製に有用な、リガンド固定化用担体の作製法に関する。
背景技術
ゲノム解析技術の進展により、各種生物ゲノムの構造が解明されつつある。これと並行して、ゲノムやそこにコードされているタンパク質等の機能性分子の機能を解析するための技術開発がすすめられており、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）、糖チップ、プロテインチップはその中で注目されている技術である。ＤＮＡチップは、スライドガラス等の固相担体表面に多数の異なる遺伝子あるいはその断片（ＤＮＡ断片）を整列させて固定化したマイクロアレイであり、遺伝子の発現、変異、多型性等の解析を飛躍的に加速させる技術として、糖チップは、スライドガラス等の固相担体表面に単糖あるいはオリゴ糖を整列させて固定化したマイクロアレイであり、糖、糖標的物、それら間の相互作用等の解析を飛躍的に加速させる技術として、プロテインチップは、タンパク質、抗体あるいはそれらの断片を整列させて固定化したマイクロアレイであり、タンパク質、抗体あるいはそれら間の相互作用等の解析を飛躍的に加速させる技術として、非常に有用である。
ＤＮＡの担体への固定化は、ＤＮＡチップを作製するための基本技術であり、大きく分けて２通りの方法が知られている。一つは、担体上に共有結合したリンカーの先端でＤＮＡを化学合成する方法で、例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５１巻、７６７−７７３頁（１９９１）およびヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２０巻、１６７９−１６８４（１９９２）に記載されている。この方法で固定化できるＤＮＡはオリゴヌクレオチドに限られており、また、反応を制御するための特殊な装置を必要とし、必ずしも一般的ではない。
もう一つの方法は、予め合成されたＤＮＡやポリメラーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）で調製されたＤＮＡ（ＰＣＲ増幅産物）を担体に共有結合あるいは非共有結合させる方法で、例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２７０巻、４６７−４７０頁（１９９５）およびヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２２巻、５４５６−５４６５（１９９４）に記載されている。
非共有結合による固定化方法としては、例えば、ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）等の塩溶液に溶解したＤＮＡをそのままあるいは変性処理した後、ポリリジンやポリエチレンイミン等の塩基性ポリ陽イオン、あるいはアミノ基を有する塩基性シランカップリング剤等でコートしたスライドガラス（担体）にスポットし、ＵＶ照射により固定化する方法が知られている。この方法によれば、どのようなＤＮＡも固定化することができるはずである。
しかしながら、この方法では、オリゴヌクレオチドや０．３ｋｂ以下の短鎖ＤＮＡは固定化されにくい。また、長鎖ＤＮＡを非共有結合で担体に固定化する場合においても、洗浄や標的核酸とのハイブリダイゼーションの工程で固定化したＤＮＡが剥離し易く、標的核酸の検出感度を低下させる要因となる。さらには、担体表面に残存する塩基性官能基（陽イオン）と標的核酸との非特異的な結合により、バックグラウンドが高くなり易いという欠点がある。
一方、共有結合による固定化方法では、オリゴヌクレオチドを含むいずれのＤＮＡも固定化することができるが、一般的には、官能基としてアミノ基等の陽イオン基を有する担体を使用するので、前述の如くバックグラウンドが高くなり、検出感度が低下するという欠点があった。残存するアミノ基をアセチル化等によりブロッキングする方法も知られているが、必ずしも十分な効果を発揮していない。
これに対して、官能基としてカルボキシル基等の陰イオン基をその表面に有する担体を使用してバックグラウンドを低くする方法が知られており、これは国際公開第０１／０２５３８号パンフレットに記載されている。この方法で作製された核酸固定化用担体は、前述のようにバックグラウンドを低くできることと、ポリアニオン酸で表面処理されているために多くのＤＮＡ分子を共有結合で固定化することができることから、高感度で目的の核酸を検出するために用いることができる。この方法では、担体を一旦ポリアクリル酸等のポリアニオンで表面処理し、次にその表面にポリアニオンの活性エステル誘導体を生成させた後、ＤＮＡをスポットするという手順で、ＤＮＡを担体に共有結合で固定化している。
しかしながら、上記方法に従ってＤＮＡを担体に共有結合で固定化しようとすると、多数の工程を経る必要がある。従って、本法を用いて目的の高感度核酸検出を可能にする核酸固定化用担体を作製しようとすると、多くの手間と多量の薬剤を要し、当担体を実際に製造し市場に供給するのは、コストの面で不利な状況にあった。
ＤＮＡチップを製造する方法としては、国際公開第０１／０２５３８号パンフレット記載の方法があるが、この方法はアミノプロピルシラン化したスライドガラスに１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１−［（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いポリアクリル酸を脱水縮合固定する。洗浄後Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを形成するため１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を用い脱水縮合反応を行う。すなわち２段階の固相縮合反応をおこなっている。各反応には高価な１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩だけではなく有機溶媒による洗浄が高頻度に行われ多くの作業を行わなければならない。また、縮合反応はすべて固相で行われているため液相反応より効率が悪い。さらに、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩では液性が弱酸性であり縮合反応の効率が悪いという問題点があった。
糖を担体へ固定化するにあたっては、単糖やオリゴ糖の誘導体を調製する上でも非常に重要な中間体としてグリコシルアミンが有効に利用できる。すなわち、還元末端残基の１位の炭素に特異的に導入されたアミノ基は反応性に富み、カルボン酸の活性エステル体、イソチオシアネート基等を有する化合物と穏和な条件下でカップリングさせることができる。グリコシルアミンとカップリングさせる化合物を選択することによって、単糖あるいはオリゴ糖を、例えば、ポリアクリルアミドのような合成ポリマーに導入したり、固相支持体に固定化したり、あるいは単糖、オリゴ糖を蛍光標識したり、あるいは本来は親水性である単糖オリゴ糖に疎水性を付与したりすることができる〔ネオグライココンジュゲート（Ｎｅｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、第１９９〜２２３頁、Ｙ．Ｃ．リー（Ｙ．Ｃ．Ｌｅｅ）、レイコ．Ｃ．リー（Ｒｅｉｋｏ Ｃ．Ｌｅｅ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ）社、１９９４年発行〕。
グリコシルアミンの特長として、その調製法の簡便さにある。グリコシルアミンの調製には一般の糖質合成反応に頻繁に用いられている水酸基の保護・脱保護反応の必要がなく、単糖あるいはオリゴ糖を飽和重炭酸アンモニウム水溶液中に溶解し３日〜６日間放置しておくだけでよい〔ジャーナル オブ カーボハイドレート ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第８巻、第５９７〜６１１頁（１９８９）〕。
タンパク質の担体への固定化は、該タンパク質のＮ末、Ｃ末または内部アミノ酸残基中の官能基、あるいは該タンパク質に付加されている糖鎖を介して行うことができる〔バイオフィジカル ジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．）、第７０巻、２４３７−２４４１（１９９６）〕。また、担体表面の官能基と高い反応性を有する残基を含むリンカー（アフィニティタグともいう）とタンパク質との融合タンパク質として固定化することができる（国際公開第００／０４３８９号パンフレット）。
上記以外の生体分子（例えば脂質など）やその他の化合物（例えば薬剤など）も担体に固定化した上で使用されうる。さらに、細胞（微生物、動物細胞、植物細胞）も担体へ固定化して種々の目的に使用可能であることが知られている。
以上のように、担体へ結合されることが望まれている種々のリガンドが存在しているが、これらリガンドの固定化された固定化物（チップ等）が十分な能力を発揮するためには、高性能なリガンド固定化用担体が必要不可欠である。
発明の目的
本発明の主な目的は、上記の方法で作製したリガンド固定化用担体を用いた場合と同等の高感度リガンド検出能を有するチップを製造でき、さらにコストの面で実際に製造し市場に供給することが可能な実用的なリガンド固定化用担体、該担体の作製方法及び該担体を用いたリガンド固定化物を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、目的の受容体を高感度に検出することができるリガンド固定化用担体を、実際に製造し市場に供給することがコストの面で可能な実用的な製造法を鋭利探求した。その結果、ポリアクリル酸エステル反応液を用いて、その表面を予めアミノ化しておいた担体を直接処理することで、従来の方法よりもずっと少ない工程数と従来よりも少量の薬剤を用いて、従来法で作製したリガンド固定化用担体と同等の高感度リガンド検出能を有するチップ製造が可能であり、実際に製造し市場に供給することがコストの面で可能な実用的なリガンド固定化用担体の製造法を見出し、本発明を完成させた。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、あらかじめ活性化された、活性化ポリアニオンでコートされたリガンド固定化用担体に関する。
本発明の第１の発明において、活性化ポリアニオンは置換あるいは脱離しやすい官能基の付加した活性化カルボン酸であるものが好ましく、該活性化カルボン酸はポリアクリル酸スクシンイミドエステルが好適に使用できる。
本発明の第２の発明は、ポリアニオンをコートしたリガンド固定化用担体において、あらかじめ当該ポリアニオンを活性化させて活性化ポリアニオンとする工程を包含することを特徴とするリガンド固定化用担体の作製方法に関する。
本発明の第２の発明において、活性化ポリアニオンは、置換あるいは脱離しやすい官能基の付加した活性化カルボン酸であるものが好適であり、該活性化カルボン酸はポリアクリル酸スクシンイミドエステルが好適に使用できる。
本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明に記載のリガンド固定化用担体の表面上のあらかじめ定められた領域に核酸が固定化されていることを特徴とするリガンド固定化物に関する。
発明の詳細な説明
本発明において、リガンドとは、特定の受容体により認識、結合されうる分子であれば特に限定はなく、核酸、糖鎖、脂質、ペプチド又はタンパク質が例示される。核酸としては短鎖核酸、長鎖核酸、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。うち、ＤＮＡとしては二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡが例示され、ＲＮＡとしてはｍＲＮＡが例示される。なお、短鎖核酸とは塩基数２〜１００の核酸、長鎖核酸とは塩基数１００超の核酸と定義する。
当該リガンドの例には、細胞膜受容体に対するアゴニスト及びアンタゴニスト、毒素（ｔｏｘｉｎ及びｖｅｎｏｍ）、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、鎮静剤、アヘン剤、ステロイド等）、ホルモン受容体、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬物、レクチン、糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴサッカライド、タンパク質、抗原、モノクローナル抗体、レクチン、細胞、腫瘍細胞、細菌、ウイルス、化学物質、アビジン等が含まれる。
本発明において受容体とは、当該リガンドに結合性を示すものであれば特に限定はなく、天然分子でも人工分子でも良い。例えば核酸、糖鎖、タンパク質、ペプチド、酵素、細胞表面タンパク質（レセプター）、糖タンパク質、抗体等が挙げられる。
すなわち、本発明においてリガンドと当該リガンドに結合性を有する受容体の接触表面特性は相互に相補的である。また、受容体としてはそれぞれ核酸、糖質、ペプチド又はタンパク質に結合性を有する核酸、糖質、ペプチド又はタンパク質が例示される。当該受容体としては標識された受容体を使用することができる。
本発明においてポリアニオンとは酸性官能基を２以上有する化合物であり、核酸を結合させるために使用できるものであれば限定はない。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のリガンド固定化用担体
本発明のリガンドを固定化する担体としては、ＤＮＡチップ、プロテインチップ、糖チップやバイオセンサー等の担体として使用出来るものであれば特に限定はないが、例えば非多孔性で、表面がなめらかな構造を有する蛍光を有しない材質、例えば、無蛍光スライドガラス等のガラスが好適に使用出来る。
当該担体は、予め陰イオン官能基を有する化合物を保持するような表面処理を行うことが好ましい。また、シランカップリング剤等で処理した担体であっても、該表面処理に不都合が無い限り使用することが出来る。
上記担体の表面処理に使用するポリアニオンとしては、核酸との非特異的結合を妨げる効果のあるカルボキシル基、リン酸基、硫酸基等の酸性官能基を有するポリマーが好適に使用できる。該ポリマーとしては、特に限定はされないが、例えばポリアクリル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリン酸等が好適に用いられる。
本発明の核酸固定化用担体は、上記ポリマーの酸性官能基を活性化させた後に、当該担体の表面処理に用いることができる。該官能基を活性化させる方法としては、置換あるいは脱離しやすい官能基を付加させる方法が好ましい。該脱離基としては特に限定はされないが、クラム ハモンド 有機化学 第４版 １９８１年 （ＭｃＧＲＡＷ−ＨＩＬＬ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＢＯＯＫ ＣＰＭＰＡＮＹ）に記載の良い脱離基（ｇｏｏｄ ｌｅａｖｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）等が好適であり、例えばＩ基、Ｂｒ基、Ｃｌ基等のハロゲン基、あるいはメトキシ基、エトキシ基のようなアルコキシ基、スクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）のようなイミド基等のエステルが好適に使用できる。また、ｐ−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール等のフェノール系物質あるいはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン等のヒドロキシアミン系物質を用いて活性化させてもよい。
（２）本発明のリガンド固定化用担体の作製方法
本発明のリガンド固定化用担体の作製方法の一態様を以下に示す。従来のリガンド固定化用担体の作製方法は以下の１２ステップを含む：（１）アミノ化スライド→（２）ポリアクリル酸コーティング→（３）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）洗浄→（４）メタノール洗浄→（５）０．３Ｎ ＮａＯＨ洗浄→（６）蒸留水（Ｄ．Ｗ．）洗浄→（７）アセトン洗浄→（８）乾燥→（５時間）（９）エステル化反応→（１０）ＤＭＦ洗浄→（１１）ジクロロメタン洗浄→（１２）乾燥。本発明のリガンド固定化用担体の作製方法の一態様は以下の６ステップを含む：（１）アミノ化スライド→（２）ポリアクリル酸エステル合成→（３）ポリアクリル酸エステル溶液コーティング→（４）ＤＭＦ洗浄→（５）ジクロロメタン洗浄→（６）乾燥。従来の製造法の全工程数が１２ステップであるのに対して、本発明の作製方法は６ステップで高感度リガンド検出能を有するリガンド固定化用担体を製造することができる。すなわち、従来の製造法の半分の工程数で目的の高感度リガンド検出能を有するチップを製造することができる。
本発明のリガンド固定化用担体の作製方法において、ポリアニオンとしてポリアクリル酸、担体として非多孔性担体、特にガラスを使用することが好ましい。
また、本発明のリガンド固定化用担体に用いる固定化用ＤＮＡの調製法としては、特に限定はされないが例えば、ＤＮＡ合成機等を用いた化学合成された核酸あるいはＰＣＲ法や国際公開公報第００／５６８７７号パンフレット記載のＩＣＡＮ法等の酵素によって調製された核酸のいずれもが好適に使用できる。特に限定はされないが、例えば短鎖核酸の場合には上記ＤＮＡ合成機等を用いた化学合成法を好適に用いることができ、長鎖核酸（ＤＮＡ）の場合には上記の酵素を用いる方法を好適に用いることができる。
本発明のリガンド固定化用担体の作製方法の一態様を以下に説明する。
ステップ１；スライドガラスの表面処理において、例えばアミノプロピルトリエトキシシランカップリング剤等を用い、担体表面をアミノプロピルシラン化する。
ステップ２；ジメチルホルムアミドに溶解したポリアクリル酸にＮ−ヒドロキシスクシンイミド、１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−Ｄｉｍｅｔｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｃａｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（以下ＥＤＣと略す）、および４−ジメチルアミノピリジンを加える。溶解後、トリエチルアミンにてｐＨを７〜８に調整し、攪拌してポリアクリル酸を活性エステル化する。
ステップ３；上記ステップ２で調製した反応液の原液、またはこの原液をジメチルホルムアミドで希釈した希釈液を用いて、上記のアミノプロピルシラン化したスライドガラスの表面を処理する。
ステップ４；ステップ３で作製したスライドガラスをジメチルホルムアミドで洗浄する。
ステップ５；さらにジクロロメタンで洗浄する。
ステップ６；洗浄後のスライドを乾燥させる。
の６ステップで目的のリガンド固定化用担体を得ることができる。
本発明の作製方法においては、ポリアクリル酸スクシンイミドエステルが有するアミドの置換反応によってアミノプロピルシラン化したスライドをコーティングするため高価なＥＤＣの使用量を削減できる。さらに、製造工程のステップ数が半減しているため洗浄に用いる溶媒等も減少させることができ、製造法全体のコストならびに薬剤のコストの観点から、さらに環境に対する負荷を軽減させる観点からも非常に有用なリガンド固定化用担体の作製方法である。
さらに、本発明の作製方法のステップ２において、ポリアクリル酸を活性エステル化してポリアクリル酸スクシンイミドエステルを生成できていることは、例えば以下のようにして検証することができる。
まず、ステップ２の反応液を氷冷水中に滴下し、生ずる沈殿をろ過して回収し、白色粉末を得、この白色粉末の赤外吸収スペクトルを調べることにより検証することができる。すなわち、未反応のカルボキシル基は、１，６１０〜１，５５０ｃｍ−１及び１，４００ｃｍ−１にカルボキシレート特異吸収を示す。これに対して、生成物のポリアクリル酸スクシンイミドエステルでは前記の領域には吸収は認められず、１，７３６ｃｍ−１、１，２０５ｃｍ−１、及び１，０６９ｃｍ−１の領域にエステルカルボニルの特異吸収が認められることから、ポリアクリル酸を活性エステル化できていることを検証することができる。
また、反応前のポリアクリル酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミド、および反応後の反応生成物である白色粉末を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供し、展開後、２５４ｎｍの紫外線を照射した時の吸収を調べることによっても、目的のポリアクリル酸スクシンイミドエステルが生成していることを確認することができる。すなわち、ポリアクリル酸は分子量が大きくスクシンイミドエステルとなっても薄層クロマトグラフィーの移動度（Ｒｆ値）はポリアクリル酸と変化しない。しかしスクシンイミドが付加したことにより紫外吸収が強くなるため未反応のポリアクリル酸と区別でき、ポリアクリル酸スクシンイミドエステルが生成していることが確認できる。
さらに、本発明の作製方法においては使用するポリアクリル酸スクシンイミドエステルを、ポリアクリル酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドを反応させた後、反応液を氷冷水中に滴下し、生ずる沈殿をろ過し、白色粉末の状態にすることができる。その後、白色粉末の状態にある当該ポリアクリル酸スクシンイミドエステルを再びジメチルホルムアミドに溶解し、これを用いてアミノプロピルシラン化したスライドガラスの表面を処理するという工程で、目的の高感度リガンド検出能を有するチップの作製を可能にするリガンド固定化用担体を作製することができる。すなわち、上記粉末状態にすることにより、上記ポリアクリル酸スクシンイミドエステルを安定的に、しかも長期にわたり保存することができる。
（３）リガンドの固定化
上記の本発明の方法で作製されたリガンド固定化用担体に、ＤＮＡ、糖、タンパク質を固定化させるためには、以下のような方法が使用できる。
ＤＮＡを固定化する場合、国際公開第０１／０２５３８号パンフレット記載の方法が応用できる。すなわち、固定化するＤＮＡの５’末端がアミノ基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基などで修飾された誘導体、またはこの修飾した５’末端に架橋剤や、スペーサーとしてのリンカー、例えばアルキルアミンなどを付加した誘導体を作製する。この５’末端の修飾は、オリゴヌクレオチドのような短鎖核酸の固定化に特に有用である。さらに、ＤＮＡ鎖の内部に適切な官能基を導入させて固定化することもできる。この場合には、適当な修飾ヌクレオチドの存在下にＤＮＡの合成を行えば良い。また、ＤＮＡを化学的に修飾してもよく、例えば、Ｍｉｒｕｓ社製のＬａｂｅｌＩｔ試薬を使用して核酸を修飾してもよい。前記修飾核酸を、０．０１〜２．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌとなるように、固定化に好適な溶液、例えば、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．５）、あるいは５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、そのままあるいは変性処理後、表面処理によってカルボン酸が活性化エステルに変換された本発明の担体と接触させることにより、所望の核酸を担体へ固定化することができる。すなわち、前記ＤＮＡ溶液をＤＮＡチップ作製装置（ＤＮＡアレイヤー）を用いて、前記活性化エステルをその表面に有する担体に一定量ずつスポットする。恒湿器中に３０〜６０分間保持した後、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、蒸留水の順で洗浄する。さらに、必要とあれば、核酸を固定化した担体を室温で０．３Ｎ ＮａＯＨに５分間、あるいは沸騰水中に２分間浸漬して核酸を変性させ、蒸留水、無水エタノールの順で洗浄、乾燥させる。この処理によって、核酸と未反応の活性化エステルは、カルボン酸基に加水分解される（すなわち、負に荷電する）。これらの酸性基は、プローブ核酸と担体との非特異的な静電結合を阻害するため、一般的には、ポリリジンスライドに必要な、無水コハク酸ブロッキング操作が省略できる。これらの酸性基はまた、バックグラウンドシグナルを低下させる。
本発明のリガンド固定化用基体には、ＤＮＡ以外にも種々のリガンドを固定化することができる。この場合には、リガンドに応じて、最も効率のよい方法を選択すればよく、用いるリガンドと活性化固相基材のそれぞれの性状に適した方法で行なうことができる。リガンドを固定化する際に、リガンドを溶解あるいは懸濁する目的で使用できる溶媒としては、特に限定はなく、例えば、水溶液、ジメチルスルフォキシド、ジメチルホルムアミド、又はこれらの混合溶媒が好適である。リガンドの溶液又は懸濁液は、界面活性剤を含んでもよい。また、スポットの形状を整えるために、あるいは、スポットの乾燥を防ぐため、例えば、グリセロールやポリエチレングリコール、糖類、塩類を加えることが有効である。
アミノ基又はチオール基を有する糖は、例えば、Ｎ−ヒドロキシルスクシニミドエステル基、あるいはハロゲン基等によって活性化されたカルボン酸を有する固相基材上に固定化することができる。例えば、グリコシルアミンは反応性に富むアミノ基を有しており、本発明の担体への固定化に好適である。
また、架橋剤及び／又は反応促進剤を用いて、糖標的物と固相基材との間の共有結合を形成せしめることができる。
前記架橋剤には多くの市販品があり、例えば、エチレングリコール−ビス−（スクシニミジルスクシネート）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシニミドエステルなどピアス社から様々な反応基や分子長をもつ化合物が市販されている。本発明においては、かかる架橋剤の中から、固相基材と糖標的物との組み合わせにより適宜選択されうる。
反応促進剤としては、特に限定はされないが例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド及びそれらの塩などが好適に使用できる。
リガンドの固相基材への固定化の際、リガンドと、固相基材と、架橋剤及び／又は反応促進剤との３者若しくは４者の接触のタイミングは、特に限定されず、例えば、
▲１▼ ３者若しくは４者を同時に接触させる、
▲２▼ リガンドと固相基材とを接触させた後、架橋剤及び／又は反応促進剤を接触させる、
▲３▼ リガンドと固相基材とのいずれか一方と架橋剤及び／又は反応促進剤とを先に接触させた後、リガンドと固相基材との残る一方を接触させる、
などが挙げられる。
リガンドが、例えば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、カビ、酵母、原虫、蠕虫、動物培養細胞、植物培養細胞等のような細胞である場合、細胞は生存していても、死んでいてもよく、固相表面への固定化法には、上記記載の方法が使用でき、例えば、細胞の表面のアミノ基を利用して本発明のリガンド固定化用担体に固定化することができる。
また、細胞は、一般に用いられている、微生物学的、組織化学的な固定化法により固定化することができる。なお、この場合での固定化とは、細胞を非働化することを意味しており、固相基材上への固定化あるいは固相化とは区別される概念である。微生物学的、組織化学的な固定化法には、例えば、乾燥による固定化、７０％〜９０％のエタノールによる固定化、グルタールアルデヒド、ホルムアルデヒドによる固定化などがあげられる。微生物学的、組織化学的な固定化は、固相基材上への固定化あるいは固相化の前後いずれに行なってもよい。
タンパク質の本発明のリガンド固定化用担体への固定化は、該タンパク質のＮ末、Ｃ末または内部アミノ酸残基中の活性化エステルに対する反応性を有する官能基、あるいは該タンパク質に付加されている糖鎖を介して行うことができる。また、担体表面の活性化エステルと高い反応性を有する残基を含むリンカー（アフィニティタグともいう）と固定化が望まれるタンパク質との融合タンパク質を作製し、これを固定化することができる。なお、リンカーを介すことにより、担体表面におけるタンパク質の不活化を抑えられるという利点が生じる。とくに、抗体またはその断片を固定化する場合、リンカーとの融合タンパク質として固定化することが好ましい。
リンカーは、特に限定するものではないが、２〜１００残基からなり、ヘテロあるいはホモペプチドのいずれであってもよい。ホモペプチドとしては、ポリシステイン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンが例示される。
また、リンカーは、１以上の非天然アミノ酸を含有しても良い。該非天然アミノ酸を導入する方法として、アンバーコドンを認識するサプレッサーｔＲＮＡを用いる方法がある〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４４巻、１８２−１８８（１９８９）；メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ．）、第２０２巻、３０１−３３６（１９９１）；ケミカル バイオロジー（Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．）第３巻、１０３３−１０３８（１９９６）〕。
リンカーとして、ビオチンまたは抗原を用いる場合、これらはタンパク質に化学的に架橋される。
本発明においてリガンドに結合した受容体を検出するために使用される発信物質としては、蛍光物質、発光物質等の発信物質であればよく、特に限定はないが例えば、ＡＭＰＰＤのような化学発光物質、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のような蛍光物質が好適に使用することができる。
以上のように本発明のリガンド固定化用担体は、従来の方法（国際公開第０１／０２５３８号パンフレット記載の方法など）で作製した場合と同等の高感度受容体検出能を有する。また、本発明のリガンド固定化用担体の作製方法は、従来法よりも工程数を少なくすることができるため、製造法全体のコスト、使用する薬剤のコストを抑えることができ、高品質で低価格のリガンド固定化用担体を市場に提供することができる。さらに、使用する薬剤量を抑えることができることから、地球環境に対する負荷を軽減させることができる。
実施例
以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
実施例１ 活性エステル化ポリアクリル酸の調製
（１）ポリアクリル酸（分子量１００万、和光純薬社製）１．０ｇをジメチルホルムアミド２００ｍｌに溶解し氷冷下、４．８ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）、８．０ｇのＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩（ペプチド研究所社製）、及び５２ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ナカライテスク社製）を加えた。前記試薬を溶解後、トリエチルアミンにてｐＨ７〜８に調整し、室温にて一夜攪拌した。該溶液をポリアクリル酸エステル溶液−１と称す。
（２）上記実施例１−（１）の反応液を、氷冷した反応液の３倍量の蒸留水中に滴下し、生ずる沈殿を濾取し水洗した。次いでメタノールで洗浄後、減圧乾燥しポリアクリル酸スクシンイミドエステルの白色粉末１．７ｇ（収率７２．６％）を得た。
（３）上記実施例１−（２）で得られたポリアクリル酸スクシンイミドエステルについて反応産物の赤外吸収スペクトルを測定した。未反応のカルボキシル基は１，６１０〜１，５５０ｃｍ−１及び１，４００ｃｍ−１にカルボキシレート特異吸収を示すが、ここで得られた白色粉末にはこれらの吸収は認められず、１，７３５．８、１，２０５．４及び１，０６８．５ｃｍ−１にエステルカルボニルの特異吸収が認められた。さらにポリアクリル酸スクシンイミドエステルについて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で解析を行った。シリカゲル薄層板（ＭＥＲＣＫ ＴＬＣ ａｌｕｍｉｎｉｕｍｓｈｅｅｔｓ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０Ｆ２５４、メルク社製）にポリアクリル酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び得られた白色粉末をそれぞれジメチルホルムアミドに溶解しスポットした。風乾後、クロロホルム／メタノール／酢酸（９：１：１、ｖ／ｖ）の条件で展開を行った。
ポリアクリル酸は分子量が大きく、スクシンイミドエステルとなっても薄層クロマトグラフィーの移動度（Ｒｆ値）はポリアクリル酸と変化しない。しかしスクシンイミドが付加したことにより紫外吸収が強くなるため、未反応のポリアクリル酸と区別が出来る。展開後の薄層板を風乾し、２５４ｎｍの紫外線を照射したときにＮ−ヒドロキシスクシンイミドは中央付近に強い吸収を示した。上記で得られた白色粉末は原点（Ｒｆ値＝０）に強い吸収を示したが、ポリアクリル酸は吸収を示さなかった。このことにより、ポリアクリル酸スクシンイミドエステルの生成を確認することができた。
実施例２ 活性エステル化ポリアクリル酸によるガラススライドの表面処理
（１）顕微鏡用スライドガラス（松浪ガラス社製）を２Ｍ 硝酸、２Ｍ 水酸化ナトリウム溶液及び蒸留水の順に浸し、それぞれ１０分間ずつ超音波処理を行った。次に最終濃度８％になるように３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ナカライテスク社製）を９５％エタノール溶液に加え、先に処理をしたスライドガラスを２分間浸した後に１００℃のオーブンで１０分間処理することによりスライドガラス表面をアミノプロピルシラン化した。次に実施例１で得たポリアクリル酸エステル溶液−１及びポリアクリル酸スクシンイミドエステルの白色粉末を９９．５％ジメチルホルムアミドに再溶解した溶液（以下、ポリアクリル酸エステル溶液−２と称す）にそれぞれアミノプロピルシラン化したスライドガラスを一夜浸し、ジメチルホルムアミド、塩化メチレンで順次超音波洗浄し減圧乾燥した。
（２）上記実施例２−（１）で作製した核酸固定化用担体を用いてヒトモデルＤＮＡチップを作製し、以下のようにして評価を行った。まず、表１〜２に記載のヒト由来遺伝子２０個を被検核酸とした。該核酸の断片はＰＣＲを用いて調製した。使用したＰＣＲ用プライマーの塩基配列を配列表の配列番号１〜４０に示す。また、各遺伝子と、ＰＣＲで用いたプライマー対の関係について表１〜２に示す。なお、該プライマーのうち、５’側のプライマーは、その５’末端がアミノ基で修飾されている。
ＰＣＲ後の２０種類の増幅断片を常法により精製し、０．３μｇ／μｌになるようにＴａＫａＲａ ＳｏｌｕｔｉｏｎＴ（タカラバイオ社製）に溶解し、これをスポッティング溶液とした。該スポッティング溶液をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４１７ Ａｒｒａｙｅｒ（アフィメトリックス社製）を用いて、上記実施例２−（１）で作製した活性化したポリアクリル酸エステルコートスライドガラス上にスポッティングした。その後、スライドガラスを０．２％ＳＤＳ、次いで蒸留水で２回洗浄し、室温の０．３Ｎ 水酸化ナトリウム溶液中で５分間処理した。その後、蒸留水で５分間洗浄し、９５℃で２分間加熱した後、氷温の１００％エタノールでリンスし、遠心乾燥させた。得られた核酸固定化担体をＤＮＡチップとして以下の反応に用いた。
（３）ハイブリダイゼーションによる確認は以下のようにして行った。すなわち、サケ精子ＤＮＡをＬａｂｅｌ ＩＴ Ｃｙ３ Ｌａｂｅｌ Ｋｉｔ（ミラス社製）を用いて、Ｋｉｔに添付の説明書にしたがってＣｙ３で蛍光標識した後に精製した。この蛍光標識サケ精子ＤＮＡ断片を終濃度が０．１μｇ／μｌとなるようにハイブリダイゼーション溶液で希釈し、滅菌水、Ｌａｂｅｌ ＩＴ ｂｕｆｆｅｒ Ｄ１及びＮ１を用いて変性後、終濃度が０．０１μｇ／μｌとなるようにハイブリダイゼーション緩衝液に溶解した。
上記のハイブリダイゼーション溶液約９μｌをカバーガラス上に滴下し、当該スライドガラス上のＤＮＡが固定されている面を下にして、泡が入らないように静かにかぶせた。カバーガラスがずれないように注意深く反転させ、保湿箱に入れ３７℃で３０分間保温した。保温後、室温の２×ＳＳＣ中でカバーガラスを外し５分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ及び、０．２×ＳＳＣで順次洗浄し、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した。
風乾後のスライドガラスは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４１８ＴＭ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（アフィメトリックス社製）を用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。その結果、いずれのスライドガラスにおいても全てのスポットの位置において蛍光シグナルが確認できた。
実施例３
（１）実施例２に記載の方法でポリアクリル酸エステル溶液−１を用いて調製した核酸固定化用担体と、国際公開第０１／０２５３８号パンフレット記載の方法により作製した核酸固定化用担体との間で、ヒトモデルＤＮＡチップを作製した場合の検出感度の比較を行った。すなわち、実施例２と同じ被検核酸を用い、実施例２で調製したヒト由来遺伝子２０個のスポッティング溶液を使用した。該スポッティング溶液を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４１７ Ａｒｒａｙｅｒを用いて、実施例２において調製した核酸固定化用スライドガラスと従来方法により調製した核酸固定化用スライドガラスにスポッティングした。その後、スライドガラスを０．２％ＳＤＳ、次いで蒸留水で２回洗浄し、室温の０．３Ｎ 水酸化ナトリウム溶液中で５分間処理した。その後、蒸留水で５分間洗浄し、９５℃で２分間加熱した後、氷温の１００％エタノールにてリンスし、遠心乾燥させた。得られた核酸固定化担体をＤＮＡチップとして以下の反応に使用した。
（２）検出用標識ｃＤＮＡの調製とハイブリダイゼーションは、以下のようにして行った。すなわち、ヒトＨＬ−６０細胞（大日本製薬社製）とヒトＡ４３１細胞（大日本製薬社製）から、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）とＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（タカラバイオ社製）を用い、それぞれのキットのプロトコールに従いＰｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを調製した。ＨＬ−６０細胞とＡ４３１細胞のＰｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ １μｇを鋳型として、ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｍ−ＭＬＶ Ｖｅｒｓｉｏｎ）（タカラバイオ社製）を用いて、キットのプロトコールに従い、それぞれＣｙ３とＣｙ５で標識されたｃＤＮＡを調製し精製した。次に、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ（タカラバイオ社製）の取扱説明書に従い、上記実施例３−（１）で作製した２種類のＤＮＡチップと，上記のＣｙ３標識ｃＤＮＡとＣｙ５標識ｃＤＮＡの混合物とのハイブリダイゼーションを行い、洗浄・乾燥の操作を行った。次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４２８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（アフィメトリックス社製）を用いて、Ｃｙ３（励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍ）とＣｙ５（励起波長：６３５ｎｍ、検出波長：６６０ｎｍ）の蛍光画像を取得し、各スポットのシグナル強度とバックグラウンドのシグナル強度を、画像定量解析ソフトＩｍａＧｅｎｅ４．１（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）を用いて定量した。そして、各スポットのシグナル強度からバックグラウンドのシグナル強度を引いた値（ハイブリダイゼーションシグナル強度）と、各スポットのシグナル強度のバックグラウンドのシグナル強度に対する比率（Ｓ／Ｎ比）について、２０遺伝子の平均値を算出した。その結果、本発明の作製方法による核酸固定化用スライドグラスを使用して作製したＤＮＡチップのハイブリダイゼーションシグナル強度とＳ／Ｎ比は、従来法による核酸固定化用スライドグラスを使用して作製したＤＮＡチップのそれと同等以上であった。このことから、本発明の作製方法により製造した核酸固定化用担体は、従来方法により製造した核酸固定化用担体と同様に、高感度核酸検出能を有するＤＮＡチップの作製を可能にする核酸固定化用担体として好適に使用できることを確認した。
実施例４
（１）ポリアクリル酸の活性エステル化
１．０ｇのポリアクリル酸（分子量１００万）を２００ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。氷冷下、この溶液に４．８ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび８．０ｇのＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩および５２ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンを加えた。前記試薬を溶解後、トリエチルアミンにてｐＨ７〜８に調整し、室温にて一夜攪拌した。
（２）コート剤の調製
濾紙をセットしたブフナロートにジメチルホルムアミド洗浄したセライト５４５を敷き詰め、上記実施例４−（１）で得られた反応液を濾過した。得られた濾液をジメチルホルムアミドにて２００ｍｌに調整し、コート剤とした。
（３）スライドガラスの表面処理
顕微鏡用スライドガラスを２Ｍ 硝酸、２Ｍ 水酸化ナトリウム、蒸留水にてそれぞれ１０分間ずつ超音波処理を行った。次に、最終濃度４％になるように３−アミノプロピルトリエトキシシランを９５％エタノール溶液に加え、この溶液に超音波処理をしたスライドガラスを３０分間浸した。その後、１００℃のオーブンで１０分間処理することにより、スライドガラス表面をアミノプロピルシラン化した。
次いで、上記実施例４−（２）で得たコート剤にアミノプロピルシラン化したスライドガラスを１時間浸し、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次超音波洗浄し、減圧乾燥した。
（４）固定化率の測定
あらかじめ合成しておいたＣｙ３標識及び末端にアミノ基を有するプライマーまたは非標識末端にアミノ基を有するプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行い、Ｃｙ３標識末端アミノ化ＤＮＡ断片および非標識末端アミノ化ＤＮＡ断片をそれぞれ調製した。得られたＣｙ３標識末端アミノ化ＤＮＡ断片溶液および非標識末端アミノ化ＤＮＡ断片溶液を、ＴａＫａＲａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（タカラバイオ社製）に混合した。
得られた混合液を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７アレイヤーを用いて上記実施例４−（３）にて調製したそれぞれのスライドガラス上にスポットした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーを用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。その結果、いずれのスライドガラスにおいても全てのスポットの位置において蛍光シグナルが確認できた。
測定後のスライドガラスを０．２％ＳＤＳ、ミリＱ水、０．３Ｎ 水酸化ナトリウム、ミリＱ水、１００℃のミリＱ水および氷冷したエタールで順次洗浄し、１０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した。風乾後のスライドガラスを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーを用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。測定した画像をマイクロアレイ定量ソフトＩｍａＧｅｎｅ４．２にて定量化し、クラスタリングソフトＧｅｎｅＳｉｇｈｔ Ｖ３．０．７にてＤＮＡ固定化率を算出した。
その結果、実施例４−（３）のＤＮＡ固定化率の範囲は１３〜２６％であり、平均約２０％であった。また、上記実施例３のＤＮＡ固定化率の範囲は２３〜３４％、平均約２８％であり、コート剤への浸漬時間が１６時間から１時間へ短縮された場合においても、同等以上のＤＮＡ固定化率を示した。
実施例５
（１）ポリアクリル酸の活性エステル化
３．２５ｇのポリアクリル酸（分子量１００万）を６５０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。氷冷下、この溶液に１４．６ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび２２．７５ｍｌのＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミドを加えた。前記試薬を溶解後、室温にて一夜攪拌した。
（２）コート剤の調製
濾紙をセットしたブフナロートにジメチルホルムアミド洗浄したセライト５４５を敷き詰め、上記実施例５−（１）で得られた反応液を濾過した。得られた濾液をジメチルホルムアミドにて１．３リットルに調整し、コート剤とした。
（３）スライドガラスの表面処理
顕微鏡用スライドガラスを２Ｍ 硝酸、２Ｍ 水酸化ナトリウム、蒸留水にてそれぞれ１０分間ずつ超音波処理を行った。次に、最終濃度４％になるように３−アミノプロピルトリエトキシシランを９５％エタノール溶液に加え、この溶液に超音波処理をしたスライドガラスを３０分間浸した。その後、１００℃のオーブンで１０分間処理することにより、スライドガラス表面をアミノプロピルシラン化した。
次いで、上記実施例５−（２）で得たコート剤にアミノプロピルシラン化したスライドガラスを１時間浸し、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次超音波洗浄し、減圧乾燥した。
（４）固定化率の測定
あらかじめ合成しておいたＣｙ３標識及び末端にアミノ基を有するプライマーまたは非標識末端にアミノ基を有するプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行い、Ｃｙ３標識末端アミノ化ＤＮＡ断片および非標識末端アミノ化ＤＮＡ断片をそれぞれ調製した。得られたＣｙ３標識末端アミノ化ＤＮＡ断片溶液および非標識末端アミノ化ＤＮＡ断片溶液を、ＴａＫａＲａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（タカラバイオ社製）に混合した。
得られた混合液を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７アレイヤーを用いて上記実施例５−（３）にて調製したそれぞれのスライドガラス上にスポットした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーを用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。その結果、いずれのスライドガラスにおいても全てのスポットの位置において蛍光シグナルが確認できた。
測定後のスライドガラスを０．２％ＳＤＳ、ミリＱ水、０．３Ｎ 水酸化ナトリウム、ミリＱ水、１００℃のミリＱ水および氷冷したエタールで順次洗浄し、１０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した。風乾後のスライドガラスを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーを用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。測定した画像をマイクロアレイ定量ソフトＩｍａＧｅｎｅ４．２にて定量化し、クラスタリングソフトＧｅｎｅＳｉｇｈｔ Ｖ３．０．７にてＤＮＡ固定化率を算出した。
その結果、実施例５−（３）のＤＮＡ固定化率は３７〜５０％であった。Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩からＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミドへ変更した場合においても、同等もしくはそれ以上のＤＮＡ固定化率を示した。
実施例６
（１）ポリアクリル酸の活性エステル化
上記実施例５−（１）と同様にしてポリアクリル酸エステルを調製した。
（２）コート剤の調製
上記実施例５−（２）と同様にしてコート剤を調製した。
（３）スライドガラスの表面処理
顕微鏡用スライドガラスを２Ｍ 硝酸、２Ｍ 水酸化ナトリウム、蒸留水にてそれぞれ１０分間ずつ超音波処理を行った。次に、最終濃度４％になるように３−アミノプロピルトリエトキシシランを９５％エタノール溶液に加え、この溶液に超音波処理をしたスライドガラスを３０分間浸した。その後、１００℃のオーブンで１０分間処理することにより、スライドガラス表面をアミノプロピルシラン化した。
次いで、上記実施例６−（２）で得たコート剤にアミノプロピルシラン化したスライドガラスを１時間浸し、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次洗浄し、減圧乾燥した。
（４）コート剤の繰り返し使用（その１）
実施例６−（３）で使用したコート剤に、新たに調製したアミノプロピルシラン化したスライドガラスを１時間浸し、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次超音波洗浄し減圧乾燥した。
（５）コート剤の繰り返し使用（その２）
実施例６−（４）で使用したコート剤に、新たに調製したアミノプロピルシラン化したスライドガラスを１時間浸し、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次超音波洗浄し減圧乾燥した。
（６）コート剤の繰り返し使用（その３）
実施例６−（５）で使用したコート剤に、新たに調製したアミノプロピルシラン化したスライドガラスを１時間浸し、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次超音波洗浄し減圧乾燥した。
（７）固定化率の測定
あらかじめ合成しておいたＣｙ３標識及び末端にアミノ基を有するプライマーまたは非標識末端にアミノ基を有するプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行い、Ｃｙ３標識末端アミノ化ＤＮＡ断片および非標識末端アミノ化ＤＮＡ断片をそれぞれ調製した。得られたＣｙ３標識末端アミノ化ＤＮＡ断片溶液および非標識末端アミノ化ＤＮＡ断片溶液を、ＴａＫａＲａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（タカラバイオ社製）に混合した。
得られた混合液を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７アレイヤーを用いて上記実施例６−（３）、（４）、（５）および（６）にて調製したそれぞれのスライドガラス上にスポットした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーを用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。その結果、いずれのスライドガラスにおいても全てのスポットの位置において蛍光シグナルが確認できた。
測定後のスライドガラスを０．２％ＳＤＳ、ミリＱ水、０．３Ｎ 水酸化ナトリウム、ミリＱ水、１００℃のミリＱ水および氷冷したエタールで順次洗浄し、１０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した。風乾後のスライドガラスを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーを用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。測定した画像をマイクロアレイ定量ソフトＩｍａＧｅｎｅ４．２にて定量化し、クラスタリングソフトＧｅｎｅＳｉｇｈｔ Ｖ３．０．７にてＤＮＡ固定化率を算出した。
その結果、実施例６−（３）のＤＮＡ固定化率の範囲は４１〜４５％、実施例６−（４）のＤＮＡ固定化率の範囲は４２〜４８％、実施例６−（５）のＤＮＡ固定化率の範囲は３９〜４２％、実施例６−（６）のＤＮＡ固定化率の範囲は３９〜４６％であり、いずれの場合においてもその平均は約４０％以上であったことからコート剤を繰り返し使用しても初期と同等のＤＮＡ固定能を保持していることが確認できた。
産業上の利用の可能性
本発明により、目的の受容体を高感度に検出することができる安価なリガンド固定化用担体を提供することができる。また、該基体を用いて標的受容体を高感度に検出・解析可能なリガンド固定化物を提供することができる。
【配列表】
本発明は、ＤＮＡチップ、糖チップ、プロテインチップ等のリガンドが固定化された担体の作製に有用な、リガンド固定化用担体の作製法に関する。
背景技術
ゲノム解析技術の進展により、各種生物ゲノムの構造が解明されつつある。これと並行して、ゲノムやそこにコードされているタンパク質等の機能性分子の機能を解析するための技術開発がすすめられており、ＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）、糖チップ、プロテインチップはその中で注目されている技術である。ＤＮＡチップは、スライドガラス等の固相担体表面に多数の異なる遺伝子あるいはその断片（ＤＮＡ断片）を整列させて固定化したマイクロアレイであり、遺伝子の発現、変異、多型性等の解析を飛躍的に加速させる技術として、糖チップは、スライドガラス等の固相担体表面に単糖あるいはオリゴ糖を整列させて固定化したマイクロアレイであり、糖、糖標的物、それら間の相互作用等の解析を飛躍的に加速させる技術として、プロテインチップは、タンパク質、抗体あるいはそれらの断片を整列させて固定化したマイクロアレイであり、タンパク質、抗体あるいはそれら間の相互作用等の解析を飛躍的に加速させる技術として、非常に有用である。
ＤＮＡの担体への固定化は、ＤＮＡチップを作製するための基本技術であり、大きく分けて２通りの方法が知られている。一つは、担体上に共有結合したリンカーの先端でＤＮＡを化学合成する方法で、例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２５１巻、７６７−７７３頁（１９９１）およびヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２０巻、１６７９−１６８４（１９９２）に記載されている。この方法で固定化できるＤＮＡはオリゴヌクレオチドに限られており、また、反応を制御するための特殊な装置を必要とし、必ずしも一般的ではない。
もう一つの方法は、予め合成されたＤＮＡやポリメラーゼ チェーン リアクション（ＰＣＲ：Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）で調製されたＤＮＡ（ＰＣＲ増幅産物）を担体に共有結合あるいは非共有結合させる方法で、例えば、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２７０巻、４６７−４７０頁（１９９５）およびヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２２巻、５４５６−５４６５（１９９４）に記載されている。
非共有結合による固定化方法としては、例えば、ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）等の塩溶液に溶解したＤＮＡをそのままあるいは変性処理した後、ポリリジンやポリエチレンイミン等の塩基性ポリ陽イオン、あるいはアミノ基を有する塩基性シランカップリング剤等でコートしたスライドガラス（担体）にスポットし、ＵＶ照射により固定化する方法が知られている。この方法によれば、どのようなＤＮＡも固定化することができるはずである。
しかしながら、この方法では、オリゴヌクレオチドや０．３ｋｂ以下の短鎖ＤＮＡは固定化されにくい。また、長鎖ＤＮＡを非共有結合で担体に固定化する場合においても、洗浄や標的核酸とのハイブリダイゼーションの工程で固定化したＤＮＡが剥離し易く、標的核酸の検出感度を低下させる要因となる。さらには、担体表面に残存する塩基性官能基（陽イオン）と標的核酸との非特異的な結合により、バックグラウンドが高くなり易いという欠点がある。
一方、共有結合による固定化方法では、オリゴヌクレオチドを含むいずれのＤＮＡも固定化することができるが、一般的には、官能基としてアミノ基等の陽イオン基を有する担体を使用するので、前述の如くバックグラウンドが高くなり、検出感度が低下するという欠点があった。残存するアミノ基をアセチル化等によりブロッキングする方法も知られているが、必ずしも十分な効果を発揮していない。
これに対して、官能基としてカルボキシル基等の陰イオン基をその表面に有する担体を使用してバックグラウンドを低くする方法が知られており、これは国際公開第０１／０２５３８号パンフレットに記載されている。この方法で作製された核酸固定化用担体は、前述のようにバックグラウンドを低くできることと、ポリアニオン酸で表面処理されているために多くのＤＮＡ分子を共有結合で固定化することができることから、高感度で目的の核酸を検出するために用いることができる。この方法では、担体を一旦ポリアクリル酸等のポリアニオンで表面処理し、次にその表面にポリアニオンの活性エステル誘導体を生成させた後、ＤＮＡをスポットするという手順で、ＤＮＡを担体に共有結合で固定化している。
しかしながら、上記方法に従ってＤＮＡを担体に共有結合で固定化しようとすると、多数の工程を経る必要がある。従って、本法を用いて目的の高感度核酸検出を可能にする核酸固定化用担体を作製しようとすると、多くの手間と多量の薬剤を要し、当担体を実際に製造し市場に供給するのは、コストの面で不利な状況にあった。
ＤＮＡチップを製造する方法としては、国際公開第０１／０２５３８号パンフレット記載の方法があるが、この方法はアミノプロピルシラン化したスライドガラスに１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１−［（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ］−３−ｅｔｈｙｌｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を用いポリアクリル酸を脱水縮合固定する。洗浄後Ｎ−ヒドロキシスクシニミドエステルを形成するため１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩を用い脱水縮合反応を行う。すなわち２段階の固相縮合反応をおこなっている。各反応には高価な１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩だけではなく有機溶媒による洗浄が高頻度に行われ多くの作業を行わなければならない。また、縮合反応はすべて固相で行われているため液相反応より効率が悪い。さらに、１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩では液性が弱酸性であり縮合反応の効率が悪いという問題点があった。
糖を担体へ固定化するにあたっては、単糖やオリゴ糖の誘導体を調製する上でも非常に重要な中間体としてグリコシルアミンが有効に利用できる。すなわち、還元末端残基の１位の炭素に特異的に導入されたアミノ基は反応性に富み、カルボン酸の活性エステル体、イソチオシアネート基等を有する化合物と穏和な条件下でカップリングさせることができる。グリコシルアミンとカップリングさせる化合物を選択することによって、単糖あるいはオリゴ糖を、例えば、ポリアクリルアミドのような合成ポリマーに導入したり、固相支持体に固定化したり、あるいは単糖、オリゴ糖を蛍光標識したり、あるいは本来は親水性である単糖オリゴ糖に疎水性を付与したりすることができる〔ネオグライココンジュゲート（Ｎｅｏｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、第１９９〜２２３頁、Ｙ．Ｃ．リー（Ｙ．Ｃ．Ｌｅｅ）、レイコ．Ｃ．リー（Ｒｅｉｋｏ Ｃ．Ｌｅｅ）編、アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ ｐｒｅｓｓ）社、１９９４年発行〕。
グリコシルアミンの特長として、その調製法の簡便さにある。グリコシルアミンの調製には一般の糖質合成反応に頻繁に用いられている水酸基の保護・脱保護反応の必要がなく、単糖あるいはオリゴ糖を飽和重炭酸アンモニウム水溶液中に溶解し３日〜６日間放置しておくだけでよい〔ジャーナル オブ カーボハイドレート ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第８巻、第５９７〜６１１頁（１９８９）〕。
タンパク質の担体への固定化は、該タンパク質のＮ末、Ｃ末または内部アミノ酸残基中の官能基、あるいは該タンパク質に付加されている糖鎖を介して行うことができる〔バイオフィジカル ジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．）、第７０巻、２４３７−２４４１（１９９６）〕。また、担体表面の官能基と高い反応性を有する残基を含むリンカー（アフィニティタグともいう）とタンパク質との融合タンパク質として固定化することができる（国際公開第００／０４３８９号パンフレット）。
上記以外の生体分子（例えば脂質など）やその他の化合物（例えば薬剤など）も担体に固定化した上で使用されうる。さらに、細胞（微生物、動物細胞、植物細胞）も担体へ固定化して種々の目的に使用可能であることが知られている。
以上のように、担体へ結合されることが望まれている種々のリガンドが存在しているが、これらリガンドの固定化された固定化物（チップ等）が十分な能力を発揮するためには、高性能なリガンド固定化用担体が必要不可欠である。
発明の目的
本発明の主な目的は、上記の方法で作製したリガンド固定化用担体を用いた場合と同等の高感度リガンド検出能を有するチップを製造でき、さらにコストの面で実際に製造し市場に供給することが可能な実用的なリガンド固定化用担体、該担体の作製方法及び該担体を用いたリガンド固定化物を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、目的の受容体を高感度に検出することができるリガンド固定化用担体を、実際に製造し市場に供給することがコストの面で可能な実用的な製造法を鋭利探求した。その結果、ポリアクリル酸エステル反応液を用いて、その表面を予めアミノ化しておいた担体を直接処理することで、従来の方法よりもずっと少ない工程数と従来よりも少量の薬剤を用いて、従来法で作製したリガンド固定化用担体と同等の高感度リガンド検出能を有するチップ製造が可能であり、実際に製造し市場に供給することがコストの面で可能な実用的なリガンド固定化用担体の製造法を見出し、本発明を完成させた。
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、あらかじめ活性化された、活性化ポリアニオンでコートされたリガンド固定化用担体に関する。
本発明の第１の発明において、活性化ポリアニオンは置換あるいは脱離しやすい官能基の付加した活性化カルボン酸であるものが好ましく、該活性化カルボン酸はポリアクリル酸スクシンイミドエステルが好適に使用できる。
本発明の第２の発明は、ポリアニオンをコートしたリガンド固定化用担体において、あらかじめ当該ポリアニオンを活性化させて活性化ポリアニオンとする工程を包含することを特徴とするリガンド固定化用担体の作製方法に関する。
本発明の第２の発明において、活性化ポリアニオンは、置換あるいは脱離しやすい官能基の付加した活性化カルボン酸であるものが好適であり、該活性化カルボン酸はポリアクリル酸スクシンイミドエステルが好適に使用できる。
本発明の第３の発明は、本発明の第１の発明に記載のリガンド固定化用担体の表面上のあらかじめ定められた領域に核酸が固定化されていることを特徴とするリガンド固定化物に関する。
発明の詳細な説明
本発明において、リガンドとは、特定の受容体により認識、結合されうる分子であれば特に限定はなく、核酸、糖鎖、脂質、ペプチド又はタンパク質が例示される。核酸としては短鎖核酸、長鎖核酸、一本鎖核酸、二本鎖核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡが挙げられる。うち、ＤＮＡとしては二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ｃＤＮＡが例示され、ＲＮＡとしてはｍＲＮＡが例示される。なお、短鎖核酸とは塩基数２〜１００の核酸、長鎖核酸とは塩基数１００超の核酸と定義する。
当該リガンドの例には、細胞膜受容体に対するアゴニスト及びアンタゴニスト、毒素（ｔｏｘｉｎ及びｖｅｎｏｍ）、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、鎮静剤、アヘン剤、ステロイド等）、ホルモン受容体、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬物、レクチン、糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴサッカライド、タンパク質、抗原、モノクローナル抗体、レクチン、細胞、腫瘍細胞、細菌、ウイルス、化学物質、アビジン等が含まれる。
本発明において受容体とは、当該リガンドに結合性を示すものであれば特に限定はなく、天然分子でも人工分子でも良い。例えば核酸、糖鎖、タンパク質、ペプチド、酵素、細胞表面タンパク質（レセプター）、糖タンパク質、抗体等が挙げられる。
すなわち、本発明においてリガンドと当該リガンドに結合性を有する受容体の接触表面特性は相互に相補的である。また、受容体としてはそれぞれ核酸、糖質、ペプチド又はタンパク質に結合性を有する核酸、糖質、ペプチド又はタンパク質が例示される。当該受容体としては標識された受容体を使用することができる。
本発明においてポリアニオンとは酸性官能基を２以上有する化合物であり、核酸を結合させるために使用できるものであれば限定はない。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明のリガンド固定化用担体
本発明のリガンドを固定化する担体としては、ＤＮＡチップ、プロテインチップ、糖チップやバイオセンサー等の担体として使用出来るものであれば特に限定はないが、例えば非多孔性で、表面がなめらかな構造を有する蛍光を有しない材質、例えば、無蛍光スライドガラス等のガラスが好適に使用出来る。
当該担体は、予め陰イオン官能基を有する化合物を保持するような表面処理を行うことが好ましい。また、シランカップリング剤等で処理した担体であっても、該表面処理に不都合が無い限り使用することが出来る。
上記担体の表面処理に使用するポリアニオンとしては、核酸との非特異的結合を妨げる効果のあるカルボキシル基、リン酸基、硫酸基等の酸性官能基を有するポリマーが好適に使用できる。該ポリマーとしては、特に限定はされないが、例えばポリアクリル酸、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、ポリリン酸等が好適に用いられる。
本発明の核酸固定化用担体は、上記ポリマーの酸性官能基を活性化させた後に、当該担体の表面処理に用いることができる。該官能基を活性化させる方法としては、置換あるいは脱離しやすい官能基を付加させる方法が好ましい。該脱離基としては特に限定はされないが、クラム ハモンド 有機化学 第４版 １９８１年 （ＭｃＧＲＡＷ−ＨＩＬＬ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＢＯＯＫ ＣＰＭＰＡＮＹ）に記載の良い脱離基（ｇｏｏｄ ｌｅａｖｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）等が好適であり、例えばＩ基、Ｂｒ基、Ｃｌ基等のハロゲン基、あるいはメトキシ基、エトキシ基のようなアルコキシ基、スクシンイミド（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）のようなイミド基等のエステルが好適に使用できる。また、ｐ−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール等のフェノール系物質あるいはＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン等のヒドロキシアミン系物質を用いて活性化させてもよい。
（２）本発明のリガンド固定化用担体の作製方法
本発明のリガンド固定化用担体の作製方法の一態様を以下に示す。従来のリガンド固定化用担体の作製方法は以下の１２ステップを含む：（１）アミノ化スライド→（２）ポリアクリル酸コーティング→（３）ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）洗浄→（４）メタノール洗浄→（５）０．３Ｎ ＮａＯＨ洗浄→（６）蒸留水（Ｄ．Ｗ．）洗浄→（７）アセトン洗浄→（８）乾燥→（５時間）（９）エステル化反応→（１０）ＤＭＦ洗浄→（１１）ジクロロメタン洗浄→（１２）乾燥。本発明のリガンド固定化用担体の作製方法の一態様は以下の６ステップを含む：（１）アミノ化スライド→（２）ポリアクリル酸エステル合成→（３）ポリアクリル酸エステル溶液コーティング→（４）ＤＭＦ洗浄→（５）ジクロロメタン洗浄→（６）乾燥。従来の製造法の全工程数が１２ステップであるのに対して、本発明の作製方法は６ステップで高感度リガンド検出能を有するリガンド固定化用担体を製造することができる。すなわち、従来の製造法の半分の工程数で目的の高感度リガンド検出能を有するチップを製造することができる。
本発明のリガンド固定化用担体の作製方法において、ポリアニオンとしてポリアクリル酸、担体として非多孔性担体、特にガラスを使用することが好ましい。
また、本発明のリガンド固定化用担体に用いる固定化用ＤＮＡの調製法としては、特に限定はされないが例えば、ＤＮＡ合成機等を用いた化学合成された核酸あるいはＰＣＲ法や国際公開公報第００／５６８７７号パンフレット記載のＩＣＡＮ法等の酵素によって調製された核酸のいずれもが好適に使用できる。特に限定はされないが、例えば短鎖核酸の場合には上記ＤＮＡ合成機等を用いた化学合成法を好適に用いることができ、長鎖核酸（ＤＮＡ）の場合には上記の酵素を用いる方法を好適に用いることができる。
本発明のリガンド固定化用担体の作製方法の一態様を以下に説明する。
ステップ１；スライドガラスの表面処理において、例えばアミノプロピルトリエトキシシランカップリング剤等を用い、担体表面をアミノプロピルシラン化する。
ステップ２；ジメチルホルムアミドに溶解したポリアクリル酸にＮ−ヒドロキシスクシンイミド、１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−Ｄｉｍｅｔｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−Ｃａｂｏｄｉｉｍｉｄｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（以下ＥＤＣと略す）、および４−ジメチルアミノピリジンを加える。溶解後、トリエチルアミンにてｐＨを７〜８に調整し、攪拌してポリアクリル酸を活性エステル化する。
ステップ３；上記ステップ２で調製した反応液の原液、またはこの原液をジメチルホルムアミドで希釈した希釈液を用いて、上記のアミノプロピルシラン化したスライドガラスの表面を処理する。
ステップ４；ステップ３で作製したスライドガラスをジメチルホルムアミドで洗浄する。
ステップ５；さらにジクロロメタンで洗浄する。
ステップ６；洗浄後のスライドを乾燥させる。
の６ステップで目的のリガンド固定化用担体を得ることができる。
本発明の作製方法においては、ポリアクリル酸スクシンイミドエステルが有するアミドの置換反応によってアミノプロピルシラン化したスライドをコーティングするため高価なＥＤＣの使用量を削減できる。さらに、製造工程のステップ数が半減しているため洗浄に用いる溶媒等も減少させることができ、製造法全体のコストならびに薬剤のコストの観点から、さらに環境に対する負荷を軽減させる観点からも非常に有用なリガンド固定化用担体の作製方法である。
さらに、本発明の作製方法のステップ２において、ポリアクリル酸を活性エステル化してポリアクリル酸スクシンイミドエステルを生成できていることは、例えば以下のようにして検証することができる。
まず、ステップ２の反応液を氷冷水中に滴下し、生ずる沈殿をろ過して回収し、白色粉末を得、この白色粉末の赤外吸収スペクトルを調べることにより検証することができる。すなわち、未反応のカルボキシル基は、１，６１０〜１，５５０ｃｍ−１及び１，４００ｃｍ−１にカルボキシレート特異吸収を示す。これに対して、生成物のポリアクリル酸スクシンイミドエステルでは前記の領域には吸収は認められず、１，７３６ｃｍ−１、１，２０５ｃｍ−１、及び１，０６９ｃｍ−１の領域にエステルカルボニルの特異吸収が認められることから、ポリアクリル酸を活性エステル化できていることを検証することができる。
また、反応前のポリアクリル酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミド、および反応後の反応生成物である白色粉末を薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）に供し、展開後、２５４ｎｍの紫外線を照射した時の吸収を調べることによっても、目的のポリアクリル酸スクシンイミドエステルが生成していることを確認することができる。すなわち、ポリアクリル酸は分子量が大きくスクシンイミドエステルとなっても薄層クロマトグラフィーの移動度（Ｒｆ値）はポリアクリル酸と変化しない。しかしスクシンイミドが付加したことにより紫外吸収が強くなるため未反応のポリアクリル酸と区別でき、ポリアクリル酸スクシンイミドエステルが生成していることが確認できる。
さらに、本発明の作製方法においては使用するポリアクリル酸スクシンイミドエステルを、ポリアクリル酸とＮ−ヒドロキシスクシンイミドを反応させた後、反応液を氷冷水中に滴下し、生ずる沈殿をろ過し、白色粉末の状態にすることができる。その後、白色粉末の状態にある当該ポリアクリル酸スクシンイミドエステルを再びジメチルホルムアミドに溶解し、これを用いてアミノプロピルシラン化したスライドガラスの表面を処理するという工程で、目的の高感度リガンド検出能を有するチップの作製を可能にするリガンド固定化用担体を作製することができる。すなわち、上記粉末状態にすることにより、上記ポリアクリル酸スクシンイミドエステルを安定的に、しかも長期にわたり保存することができる。
（３）リガンドの固定化
上記の本発明の方法で作製されたリガンド固定化用担体に、ＤＮＡ、糖、タンパク質を固定化させるためには、以下のような方法が使用できる。
ＤＮＡを固定化する場合、国際公開第０１／０２５３８号パンフレット記載の方法が応用できる。すなわち、固定化するＤＮＡの５’末端がアミノ基、チオール基、リン酸基、アルデヒド基などで修飾された誘導体、またはこの修飾した５’末端に架橋剤や、スペーサーとしてのリンカー、例えばアルキルアミンなどを付加した誘導体を作製する。この５’末端の修飾は、オリゴヌクレオチドのような短鎖核酸の固定化に特に有用である。さらに、ＤＮＡ鎖の内部に適切な官能基を導入させて固定化することもできる。この場合には、適当な修飾ヌクレオチドの存在下にＤＮＡの合成を行えば良い。また、ＤＮＡを化学的に修飾してもよく、例えば、Ｍｉｒｕｓ社製のＬａｂｅｌＩｔ試薬を使用して核酸を修飾してもよい。前記修飾核酸を、０．０１〜２．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜１．０ｍｇ／ｍｌとなるように、固定化に好適な溶液、例えば、２０ｍＭ ＭＯＰＳ（３−モルホリノプロパンスルホン酸）緩衝液（ｐＨ７．５）、あるいは５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）に溶解し、そのままあるいは変性処理後、表面処理によってカルボン酸が活性化エステルに変換された本発明の担体と接触させることにより、所望の核酸を担体へ固定化することができる。すなわち、前記ＤＮＡ溶液をＤＮＡチップ作製装置（ＤＮＡアレイヤー）を用いて、前記活性化エステルをその表面に有する担体に一定量ずつスポットする。恒湿器中に３０〜６０分間保持した後、２％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、蒸留水の順で洗浄する。さらに、必要とあれば、核酸を固定化した担体を室温で０．３Ｎ ＮａＯＨに５分間、あるいは沸騰水中に２分間浸漬して核酸を変性させ、蒸留水、無水エタノールの順で洗浄、乾燥させる。この処理によって、核酸と未反応の活性化エステルは、カルボン酸基に加水分解される（すなわち、負に荷電する）。これらの酸性基は、プローブ核酸と担体との非特異的な静電結合を阻害するため、一般的には、ポリリジンスライドに必要な、無水コハク酸ブロッキング操作が省略できる。これらの酸性基はまた、バックグラウンドシグナルを低下させる。
本発明のリガンド固定化用基体には、ＤＮＡ以外にも種々のリガンドを固定化することができる。この場合には、リガンドに応じて、最も効率のよい方法を選択すればよく、用いるリガンドと活性化固相基材のそれぞれの性状に適した方法で行なうことができる。リガンドを固定化する際に、リガンドを溶解あるいは懸濁する目的で使用できる溶媒としては、特に限定はなく、例えば、水溶液、ジメチルスルフォキシド、ジメチルホルムアミド、又はこれらの混合溶媒が好適である。リガンドの溶液又は懸濁液は、界面活性剤を含んでもよい。また、スポットの形状を整えるために、あるいは、スポットの乾燥を防ぐため、例えば、グリセロールやポリエチレングリコール、糖類、塩類を加えることが有効である。
アミノ基又はチオール基を有する糖は、例えば、Ｎ−ヒドロキシルスクシニミドエステル基、あるいはハロゲン基等によって活性化されたカルボン酸を有する固相基材上に固定化することができる。例えば、グリコシルアミンは反応性に富むアミノ基を有しており、本発明の担体への固定化に好適である。
また、架橋剤及び／又は反応促進剤を用いて、糖標的物と固相基材との間の共有結合を形成せしめることができる。
前記架橋剤には多くの市販品があり、例えば、エチレングリコール−ビス−（スクシニミジルスクシネート）、Ｎ−（ε−マレイミドカプロイルオキシ）スクシニミドエステルなどピアス社から様々な反応基や分子長をもつ化合物が市販されている。本発明においては、かかる架橋剤の中から、固相基材と糖標的物との組み合わせにより適宜選択されうる。
反応促進剤としては、特に限定はされないが例えば、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド及びそれらの塩などが好適に使用できる。
リガンドの固相基材への固定化の際、リガンドと、固相基材と、架橋剤及び／又は反応促進剤との３者若しくは４者の接触のタイミングは、特に限定されず、例えば、
▲１▼ ３者若しくは４者を同時に接触させる、
▲２▼ リガンドと固相基材とを接触させた後、架橋剤及び／又は反応促進剤を接触させる、
▲３▼ リガンドと固相基材とのいずれか一方と架橋剤及び／又は反応促進剤とを先に接触させた後、リガンドと固相基材との残る一方を接触させる、
などが挙げられる。
リガンドが、例えば、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、カビ、酵母、原虫、蠕虫、動物培養細胞、植物培養細胞等のような細胞である場合、細胞は生存していても、死んでいてもよく、固相表面への固定化法には、上記記載の方法が使用でき、例えば、細胞の表面のアミノ基を利用して本発明のリガンド固定化用担体に固定化することができる。
また、細胞は、一般に用いられている、微生物学的、組織化学的な固定化法により固定化することができる。なお、この場合での固定化とは、細胞を非働化することを意味しており、固相基材上への固定化あるいは固相化とは区別される概念である。微生物学的、組織化学的な固定化法には、例えば、乾燥による固定化、７０％〜９０％のエタノールによる固定化、グルタールアルデヒド、ホルムアルデヒドによる固定化などがあげられる。微生物学的、組織化学的な固定化は、固相基材上への固定化あるいは固相化の前後いずれに行なってもよい。
タンパク質の本発明のリガンド固定化用担体への固定化は、該タンパク質のＮ末、Ｃ末または内部アミノ酸残基中の活性化エステルに対する反応性を有する官能基、あるいは該タンパク質に付加されている糖鎖を介して行うことができる。また、担体表面の活性化エステルと高い反応性を有する残基を含むリンカー（アフィニティタグともいう）と固定化が望まれるタンパク質との融合タンパク質を作製し、これを固定化することができる。なお、リンカーを介すことにより、担体表面におけるタンパク質の不活化を抑えられるという利点が生じる。とくに、抗体またはその断片を固定化する場合、リンカーとの融合タンパク質として固定化することが好ましい。
リンカーは、特に限定するものではないが、２〜１００残基からなり、ヘテロあるいはホモペプチドのいずれであってもよい。ホモペプチドとしては、ポリシステイン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジンが例示される。
また、リンカーは、１以上の非天然アミノ酸を含有しても良い。該非天然アミノ酸を導入する方法として、アンバーコドンを認識するサプレッサーｔＲＮＡを用いる方法がある〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第２４４巻、１８２−１８８（１９８９）；メソッズ イン エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍ．）、第２０２巻、３０１−３３６（１９９１）；ケミカル バイオロジー（Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．）第３巻、１０３３−１０３８（１９９６）〕。
リンカーとして、ビオチンまたは抗原を用いる場合、これらはタンパク質に化学的に架橋される。
本発明においてリガンドに結合した受容体を検出するために使用される発信物質としては、蛍光物質、発光物質等の発信物質であればよく、特に限定はないが例えば、ＡＭＰＰＤのような化学発光物質、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のような蛍光物質が好適に使用することができる。
以上のように本発明のリガンド固定化用担体は、従来の方法（国際公開第０１／０２５３８号パンフレット記載の方法など）で作製した場合と同等の高感度受容体検出能を有する。また、本発明のリガンド固定化用担体の作製方法は、従来法よりも工程数を少なくすることができるため、製造法全体のコスト、使用する薬剤のコストを抑えることができ、高品質で低価格のリガンド固定化用担体を市場に提供することができる。さらに、使用する薬剤量を抑えることができることから、地球環境に対する負荷を軽減させることができる。
実施例
以下の実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されるものではない。
実施例１ 活性エステル化ポリアクリル酸の調製
（１）ポリアクリル酸（分子量１００万、和光純薬社製）１．０ｇをジメチルホルムアミド２００ｍｌに溶解し氷冷下、４．８ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ナカライテスク社製）、８．０ｇのＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩（ペプチド研究所社製）、及び５２ｍｇの４−ジメチルアミノピリジン（ナカライテスク社製）を加えた。前記試薬を溶解後、トリエチルアミンにてｐＨ７〜８に調整し、室温にて一夜攪拌した。該溶液をポリアクリル酸エステル溶液−１と称す。
（２）上記実施例１−（１）の反応液を、氷冷した反応液の３倍量の蒸留水中に滴下し、生ずる沈殿を濾取し水洗した。次いでメタノールで洗浄後、減圧乾燥しポリアクリル酸スクシンイミドエステルの白色粉末１．７ｇ（収率７２．６％）を得た。
（３）上記実施例１−（２）で得られたポリアクリル酸スクシンイミドエステルについて反応産物の赤外吸収スペクトルを測定した。未反応のカルボキシル基は１，６１０〜１，５５０ｃｍ−１及び１，４００ｃｍ−１にカルボキシレート特異吸収を示すが、ここで得られた白色粉末にはこれらの吸収は認められず、１，７３５．８、１，２０５．４及び１，０６８．５ｃｍ−１にエステルカルボニルの特異吸収が認められた。さらにポリアクリル酸スクシンイミドエステルについて薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）で解析を行った。シリカゲル薄層板（ＭＥＲＣＫ ＴＬＣ ａｌｕｍｉｎｉｕｍｓｈｅｅｔｓ Ｓｉｌｉｃａｇｅｌ ６０Ｆ２５４、メルク社製）にポリアクリル酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド及び得られた白色粉末をそれぞれジメチルホルムアミドに溶解しスポットした。風乾後、クロロホルム／メタノール／酢酸（９：１：１、ｖ／ｖ）の条件で展開を行った。
ポリアクリル酸は分子量が大きく、スクシンイミドエステルとなっても薄層クロマトグラフィーの移動度（Ｒｆ値）はポリアクリル酸と変化しない。しかしスクシンイミドが付加したことにより紫外吸収が強くなるため、未反応のポリアクリル酸と区別が出来る。展開後の薄層板を風乾し、２５４ｎｍの紫外線を照射したときにＮ−ヒドロキシスクシンイミドは中央付近に強い吸収を示した。上記で得られた白色粉末は原点（Ｒｆ値＝０）に強い吸収を示したが、ポリアクリル酸は吸収を示さなかった。このことにより、ポリアクリル酸スクシンイミドエステルの生成を確認することができた。
実施例２ 活性エステル化ポリアクリル酸によるガラススライドの表面処理
（１）顕微鏡用スライドガラス（松浪ガラス社製）を２Ｍ 硝酸、２Ｍ 水酸化ナトリウム溶液及び蒸留水の順に浸し、それぞれ１０分間ずつ超音波処理を行った。次に最終濃度８％になるように３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ナカライテスク社製）を９５％エタノール溶液に加え、先に処理をしたスライドガラスを２分間浸した後に１００℃のオーブンで１０分間処理することによりスライドガラス表面をアミノプロピルシラン化した。次に実施例１で得たポリアクリル酸エステル溶液−１及びポリアクリル酸スクシンイミドエステルの白色粉末を９９．５％ジメチルホルムアミドに再溶解した溶液（以下、ポリアクリル酸エステル溶液−２と称す）にそれぞれアミノプロピルシラン化したスライドガラスを一夜浸し、ジメチルホルムアミド、塩化メチレンで順次超音波洗浄し減圧乾燥した。
（２）上記実施例２−（１）で作製した核酸固定化用担体を用いてヒトモデルＤＮＡチップを作製し、以下のようにして評価を行った。まず、表１〜２に記載のヒト由来遺伝子２０個を被検核酸とした。該核酸の断片はＰＣＲを用いて調製した。使用したＰＣＲ用プライマーの塩基配列を配列表の配列番号１〜４０に示す。また、各遺伝子と、ＰＣＲで用いたプライマー対の関係について表１〜２に示す。なお、該プライマーのうち、５’側のプライマーは、その５’末端がアミノ基で修飾されている。
（３）ハイブリダイゼーションによる確認は以下のようにして行った。すなわち、サケ精子ＤＮＡをＬａｂｅｌ ＩＴ Ｃｙ３ Ｌａｂｅｌ Ｋｉｔ（ミラス社製）を用いて、Ｋｉｔに添付の説明書にしたがってＣｙ３で蛍光標識した後に精製した。この蛍光標識サケ精子ＤＮＡ断片を終濃度が０．１μｇ／μｌとなるようにハイブリダイゼーション溶液で希釈し、滅菌水、Ｌａｂｅｌ ＩＴ ｂｕｆｆｅｒ Ｄ１及びＮ１を用いて変性後、終濃度が０．０１μｇ／μｌとなるようにハイブリダイゼーション緩衝液に溶解した。
上記のハイブリダイゼーション溶液約９μｌをカバーガラス上に滴下し、当該スライドガラス上のＤＮＡが固定されている面を下にして、泡が入らないように静かにかぶせた。カバーガラスがずれないように注意深く反転させ、保湿箱に入れ３７℃で３０分間保温した。保温後、室温の２×ＳＳＣ中でカバーガラスを外し５分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ及び、０．２×ＳＳＣで順次洗浄し、１，０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した。
風乾後のスライドガラスは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４１８ＴＭ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（アフィメトリックス社製）を用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。その結果、いずれのスライドガラスにおいても全てのスポットの位置において蛍光シグナルが確認できた。
実施例３
（１）実施例２に記載の方法でポリアクリル酸エステル溶液−１を用いて調製した核酸固定化用担体と、国際公開第０１／０２５３８号パンフレット記載の方法により作製した核酸固定化用担体との間で、ヒトモデルＤＮＡチップを作製した場合の検出感度の比較を行った。すなわち、実施例２と同じ被検核酸を用い、実施例２で調製したヒト由来遺伝子２０個のスポッティング溶液を使用した。該スポッティング溶液を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４１７ Ａｒｒａｙｅｒを用いて、実施例２において調製した核酸固定化用スライドガラスと従来方法により調製した核酸固定化用スライドガラスにスポッティングした。その後、スライドガラスを０．２％ＳＤＳ、次いで蒸留水で２回洗浄し、室温の０．３Ｎ 水酸化ナトリウム溶液中で５分間処理した。その後、蒸留水で５分間洗浄し、９５℃で２分間加熱した後、氷温の１００％エタノールにてリンスし、遠心乾燥させた。得られた核酸固定化担体をＤＮＡチップとして以下の反応に使用した。
（２）検出用標識ｃＤＮＡの調製とハイブリダイゼーションは、以下のようにして行った。すなわち、ヒトＨＬ−６０細胞（大日本製薬社製）とヒトＡ４３１細胞（大日本製薬社製）から、Ｔｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社製）とＯｌｉｇｏｔｅｘ−ｄＴ３０＜Ｓｕｐｅｒ＞（タカラバイオ社製）を用い、それぞれのキットのプロトコールに従いＰｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを調製した。ＨＬ−６０細胞とＡ４３１細胞のＰｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡ １μｇを鋳型として、ＲＮＡ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔ（Ｍ−ＭＬＶ Ｖｅｒｓｉｏｎ）（タカラバイオ社製）を用いて、キットのプロトコールに従い、それぞれＣｙ３とＣｙ５で標識されたｃＤＮＡを調製し精製した。次に、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅ（タカラバイオ社製）の取扱説明書に従い、上記実施例３−（１）で作製した２種類のＤＮＡチップと，上記のＣｙ３標識ｃＤＮＡとＣｙ５標識ｃＤＮＡの混合物とのハイブリダイゼーションを行い、洗浄・乾燥の操作を行った。次いで、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ４２８ Ａｒｒａｙ Ｓｃａｎｎｅｒ（アフィメトリックス社製）を用いて、Ｃｙ３（励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍ）とＣｙ５（励起波長：６３５ｎｍ、検出波長：６６０ｎｍ）の蛍光画像を取得し、各スポットのシグナル強度とバックグラウンドのシグナル強度を、画像定量解析ソフトＩｍａＧｅｎｅ４．１（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ社製）を用いて定量した。そして、各スポットのシグナル強度からバックグラウンドのシグナル強度を引いた値（ハイブリダイゼーションシグナル強度）と、各スポットのシグナル強度のバックグラウンドのシグナル強度に対する比率（Ｓ／Ｎ比）について、２０遺伝子の平均値を算出した。その結果、本発明の作製方法による核酸固定化用スライドグラスを使用して作製したＤＮＡチップのハイブリダイゼーションシグナル強度とＳ／Ｎ比は、従来法による核酸固定化用スライドグラスを使用して作製したＤＮＡチップのそれと同等以上であった。このことから、本発明の作製方法により製造した核酸固定化用担体は、従来方法により製造した核酸固定化用担体と同様に、高感度核酸検出能を有するＤＮＡチップの作製を可能にする核酸固定化用担体として好適に使用できることを確認した。
実施例４
（１）ポリアクリル酸の活性エステル化
１．０ｇのポリアクリル酸（分子量１００万）を２００ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。氷冷下、この溶液に４．８ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび８．０ｇのＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩および５２ｍｇの４−ジメチルアミノピリジンを加えた。前記試薬を溶解後、トリエチルアミンにてｐＨ７〜８に調整し、室温にて一夜攪拌した。
（２）コート剤の調製
濾紙をセットしたブフナロートにジメチルホルムアミド洗浄したセライト５４５を敷き詰め、上記実施例４−（１）で得られた反応液を濾過した。得られた濾液をジメチルホルムアミドにて２００ｍｌに調整し、コート剤とした。
（３）スライドガラスの表面処理
顕微鏡用スライドガラスを２Ｍ 硝酸、２Ｍ 水酸化ナトリウム、蒸留水にてそれぞれ１０分間ずつ超音波処理を行った。次に、最終濃度４％になるように３−アミノプロピルトリエトキシシランを９５％エタノール溶液に加え、この溶液に超音波処理をしたスライドガラスを３０分間浸した。その後、１００℃のオーブンで１０分間処理することにより、スライドガラス表面をアミノプロピルシラン化した。
次いで、上記実施例４−（２）で得たコート剤にアミノプロピルシラン化したスライドガラスを１時間浸し、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次超音波洗浄し、減圧乾燥した。
（４）固定化率の測定
あらかじめ合成しておいたＣｙ３標識及び末端にアミノ基を有するプライマーまたは非標識末端にアミノ基を有するプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行い、Ｃｙ３標識末端アミノ化ＤＮＡ断片および非標識末端アミノ化ＤＮＡ断片をそれぞれ調製した。得られたＣｙ３標識末端アミノ化ＤＮＡ断片溶液および非標識末端アミノ化ＤＮＡ断片溶液を、ＴａＫａＲａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（タカラバイオ社製）に混合した。
得られた混合液を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７アレイヤーを用いて上記実施例４−（３）にて調製したそれぞれのスライドガラス上にスポットした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーを用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。その結果、いずれのスライドガラスにおいても全てのスポットの位置において蛍光シグナルが確認できた。
測定後のスライドガラスを０．２％ＳＤＳ、ミリＱ水、０．３Ｎ 水酸化ナトリウム、ミリＱ水、１００℃のミリＱ水および氷冷したエタールで順次洗浄し、１０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した。風乾後のスライドガラスを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーを用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。測定した画像をマイクロアレイ定量ソフトＩｍａＧｅｎｅ４．２にて定量化し、クラスタリングソフトＧｅｎｅＳｉｇｈｔ Ｖ３．０．７にてＤＮＡ固定化率を算出した。
その結果、実施例４−（３）のＤＮＡ固定化率の範囲は１３〜２６％であり、平均約２０％であった。また、上記実施例３のＤＮＡ固定化率の範囲は２３〜３４％、平均約２８％であり、コート剤への浸漬時間が１６時間から１時間へ短縮された場合においても、同等以上のＤＮＡ固定化率を示した。
実施例５
（１）ポリアクリル酸の活性エステル化
３．２５ｇのポリアクリル酸（分子量１００万）を６５０ｍｌのジメチルホルムアミドに溶解した。氷冷下、この溶液に１４．６ｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドおよび２２．７５ｍｌのＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミドを加えた。前記試薬を溶解後、室温にて一夜攪拌した。
（２）コート剤の調製
濾紙をセットしたブフナロートにジメチルホルムアミド洗浄したセライト５４５を敷き詰め、上記実施例５−（１）で得られた反応液を濾過した。得られた濾液をジメチルホルムアミドにて１．３リットルに調整し、コート剤とした。
（３）スライドガラスの表面処理
顕微鏡用スライドガラスを２Ｍ 硝酸、２Ｍ 水酸化ナトリウム、蒸留水にてそれぞれ１０分間ずつ超音波処理を行った。次に、最終濃度４％になるように３−アミノプロピルトリエトキシシランを９５％エタノール溶液に加え、この溶液に超音波処理をしたスライドガラスを３０分間浸した。その後、１００℃のオーブンで１０分間処理することにより、スライドガラス表面をアミノプロピルシラン化した。
次いで、上記実施例５−（２）で得たコート剤にアミノプロピルシラン化したスライドガラスを１時間浸し、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次超音波洗浄し、減圧乾燥した。
（４）固定化率の測定
あらかじめ合成しておいたＣｙ３標識及び末端にアミノ基を有するプライマーまたは非標識末端にアミノ基を有するプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行い、Ｃｙ３標識末端アミノ化ＤＮＡ断片および非標識末端アミノ化ＤＮＡ断片をそれぞれ調製した。得られたＣｙ３標識末端アミノ化ＤＮＡ断片溶液および非標識末端アミノ化ＤＮＡ断片溶液を、ＴａＫａＲａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（タカラバイオ社製）に混合した。
得られた混合液を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７アレイヤーを用いて上記実施例５−（３）にて調製したそれぞれのスライドガラス上にスポットした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーを用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。その結果、いずれのスライドガラスにおいても全てのスポットの位置において蛍光シグナルが確認できた。
測定後のスライドガラスを０．２％ＳＤＳ、ミリＱ水、０．３Ｎ 水酸化ナトリウム、ミリＱ水、１００℃のミリＱ水および氷冷したエタールで順次洗浄し、１０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した。風乾後のスライドガラスを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーを用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。測定した画像をマイクロアレイ定量ソフトＩｍａＧｅｎｅ４．２にて定量化し、クラスタリングソフトＧｅｎｅＳｉｇｈｔ Ｖ３．０．７にてＤＮＡ固定化率を算出した。
その結果、実施例５−（３）のＤＮＡ固定化率は３７〜５０％であった。Ｎ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミド塩酸塩からＮ−エチル−Ｎ’−ジメチルアミノプロピル−カルボジイミドへ変更した場合においても、同等もしくはそれ以上のＤＮＡ固定化率を示した。
実施例６
（１）ポリアクリル酸の活性エステル化
上記実施例５−（１）と同様にしてポリアクリル酸エステルを調製した。
（２）コート剤の調製
上記実施例５−（２）と同様にしてコート剤を調製した。
（３）スライドガラスの表面処理
顕微鏡用スライドガラスを２Ｍ 硝酸、２Ｍ 水酸化ナトリウム、蒸留水にてそれぞれ１０分間ずつ超音波処理を行った。次に、最終濃度４％になるように３−アミノプロピルトリエトキシシランを９５％エタノール溶液に加え、この溶液に超音波処理をしたスライドガラスを３０分間浸した。その後、１００℃のオーブンで１０分間処理することにより、スライドガラス表面をアミノプロピルシラン化した。
次いで、上記実施例６−（２）で得たコート剤にアミノプロピルシラン化したスライドガラスを１時間浸し、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次洗浄し、減圧乾燥した。
（４）コート剤の繰り返し使用（その１）
実施例６−（３）で使用したコート剤に、新たに調製したアミノプロピルシラン化したスライドガラスを１時間浸し、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次超音波洗浄し減圧乾燥した。
（５）コート剤の繰り返し使用（その２）
実施例６−（４）で使用したコート剤に、新たに調製したアミノプロピルシラン化したスライドガラスを１時間浸し、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次超音波洗浄し減圧乾燥した。
（６）コート剤の繰り返し使用（その３）
実施例６−（５）で使用したコート剤に、新たに調製したアミノプロピルシラン化したスライドガラスを１時間浸し、ジメチルホルムアミド、アセトニトリルで順次超音波洗浄し減圧乾燥した。
（７）固定化率の測定
あらかじめ合成しておいたＣｙ３標識及び末端にアミノ基を有するプライマーまたは非標識末端にアミノ基を有するプライマーを用いてそれぞれＰＣＲを行い、Ｃｙ３標識末端アミノ化ＤＮＡ断片および非標識末端アミノ化ＤＮＡ断片をそれぞれ調製した。得られたＣｙ３標識末端アミノ化ＤＮＡ断片溶液および非標識末端アミノ化ＤＮＡ断片溶液を、ＴａＫａＲａ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｉ（タカラバイオ社製）に混合した。
得られた混合液を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４１７アレイヤーを用いて上記実施例６−（３）、（４）、（５）および（６）にて調製したそれぞれのスライドガラス上にスポットした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーを用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。その結果、いずれのスライドガラスにおいても全てのスポットの位置において蛍光シグナルが確認できた。
測定後のスライドガラスを０．２％ＳＤＳ、ミリＱ水、０．３Ｎ 水酸化ナトリウム、ミリＱ水、１００℃のミリＱ水および氷冷したエタールで順次洗浄し、１０００ｒｐｍ程度の低速遠心分離により水分を除去後、風乾した。風乾後のスライドガラスを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ４２８アレイスキャナーを用いて、励起波長：５３２ｎｍ、検出波長：５７０ｎｍで測定した。測定した画像をマイクロアレイ定量ソフトＩｍａＧｅｎｅ４．２にて定量化し、クラスタリングソフトＧｅｎｅＳｉｇｈｔ Ｖ３．０．７にてＤＮＡ固定化率を算出した。
その結果、実施例６−（３）のＤＮＡ固定化率の範囲は４１〜４５％、実施例６−（４）のＤＮＡ固定化率の範囲は４２〜４８％、実施例６−（５）のＤＮＡ固定化率の範囲は３９〜４２％、実施例６−（６）のＤＮＡ固定化率の範囲は３９〜４６％であり、いずれの場合においてもその平均は約４０％以上であったことからコート剤を繰り返し使用しても初期と同等のＤＮＡ固定能を保持していることが確認できた。
産業上の利用の可能性
本発明により、目的の受容体を高感度に検出することができる安価なリガンド固定化用担体を提供することができる。また、該基体を用いて標的受容体を高感度に検出・解析可能なリガンド固定化物を提供することができる。
Claims (7)
- あらかじめ活性化された活性化ポリアニオンでコートされたリガンド固定化用担体。
- 活性化ポリアニオンが、置換あるいは脱離しやすい官能基の付加した活性化カルボン酸であることを特徴とする請求項１記載のリガンド固定化用担体。
- 活性化カルボン酸が、ポリアクリル酸スクシンイミドエステルであることを特徴とする請求項２記載のリガンド固定化用担体。
- ポリアニオンをコートしたリガンド固定化用担体において、あらかじめ当該ポリアニオンを活性化させて活性化ポリアニオンとする工程を包含することを特徴とするリガンド固定化用担体の作製方法。
- 活性化ポリアニオンが、置換あるいは脱離しやすい官能基の付加した活性化カルボン酸であることを特徴とする請求項４記載のリガンド固定化用担体の作製方法。
- 活性化カルボン酸が、ポリアクリル酸スクシンイミドエステルであることを特徴とする請求項５記載のリガンド固定化用担体の作製方法。
- 請求項１記載のリガンド固定化用担体の表面上のあらかじめ定められた領域に核酸が固定化されていることを特徴とするリガンド固定化物。
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