JP2005062074A

JP2005062074A - Ｄｎａチップおよび標的ｄｎａの検出方法。

Info

Publication number: JP2005062074A
Application number: JP2003294862A
Authority: JP
Inventors: Masao Karube; 征夫輕部; Kenji Yokoyama; 憲二横山; Osamu Taira; 修平
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2003-08-19
Filing date: 2003-08-19
Publication date: 2005-03-10
Anticipated expiration: 2023-08-19
Also published as: JP4161053B2

Abstract

【課題】本発明は、優れたハイブリダイゼーション選択性を有するＤＮＡチップを提供することを課題とする。しかもプローブとなるＤＮＡ鎖の選択、準備が簡便で、ＤＮＡ鎖の導入密度の制御が可能なＤＮＡ用チップ用基板を提供することを課題とする。
【解決手段】本発明に係るＤＮＡチップは、基板表面に、ポリマーを介してＤＮＡ鎖が固定されたＤＮＡチップであって、該ＤＮＡ鎖は１本鎖のプローブＤＮＡ部分と２本鎖のリンカーＤＮＡ部分とからなり、前記ＤＮＡ鎖は前記リンカーＤＮＡ部分側で前記ポリマーと結合し、前記ポリマーは基板結合基を介して前記基板の少なくとも１つの表面に固定されていることを特徴としている。
【選択図】なし

Description

本発明は、ＤＮＡチップおよび該ＤＮＡチップを用いる標的ＤＮＡの検出方法に関する。

生物の遺伝子機能を効率的に解析する手段としてＤＮＡチップが開発されている。ＤＮＡチップは基板上にＤＮＡを固定化しハイブリダイゼーションを利用して様々な遺伝子の発現情報を得ることが可能なデバイスである。ＤＮＡチップの製造においては、基板にプローブとなるＤＮＡを固定化する必要がある。しかし、ＤＮＡの基板表面への固定化は非常に難しくこれまでも様々な方法が提案されているが、基板表面で機能するＤＮＡを効率よく導入することができず、ハイブリダイゼーションの選択性、効率の低下が課題となっている。また、固定化技術が煩雑で、コスト面の問題もあった。

たとえば、ＤＮＡの固定化法として、チオールを一本鎖ＤＮＡに結合させ、チオール化した一本鎖ＤＮＡを、金属基板に固定化する方法が試みられている。しかし、この方法では、固定化したＤＮＡ鎖が基板との親和性のため倒れてしまい、選択性が低く、ハイブリダイゼーションの効率も高くないという問題があった。

一方、チオール化一本鎖DNAを固定化した後に、アルカンチオールを用いて非特異的吸着を起こして表面に存在している一本鎖DNAを除去して表面被覆率、活性度を高めるという試みもなされている（非特許文献１）。しかし、アルキル基の導入には多大な手間がかかるという問題があった。
また、基板表面に２重鎖部分と１重鎖部分とを有するＤＮＡ鎖を二重鎖部分側で基板に固定化する試みもなされている（特許文献１）。この方法は、２重鎖部分を密にすることでＤＮＡ鎖の横倒れを防止するとともに、二重鎖のみを有するＤＮＡ鎖を含有させて、基板から離れた場所では一重鎖部分の周囲に空間を生じさせてハイブリダイズ用に利用しやすくするものである。しかしこの方法では、二重鎖のみのＤＮＡと一重鎖および二重鎖を有するＤＮＡとをあらかじめ区別して調製し固定する必要があるなど工程が煩雑であるという問題がある。また、2段階目の固定化に用いるアルカンチオール系の試薬は表面における固定化力がチオール化DNAよりも強いために基板表面に固定化されたチオール化DNAと交換反応をおこしやすい。

このような問題を解決すべく、本件発明者らは、プローブＤＮＡをポリマーに結合し、該ポリマーが金基板に固定化されたＤＮＡチップを開発している（非特許文献２）。この方法によれば、ポリマーが疎水性を有し、ＤＮＡ鎖が親水性となっているため、ＤＮＡ鎖は基板表面に倒れずに溶液側に露出させることができる。また、ポリマーへのＤＮＡの導入を容易に制御できるため、ＤＮＡ鎖の基板への導入密度を容易に制御できるという利点がある。

しかし、この方法の場合、プローブの種類に応じた数のポリマーを準備する必要があり、プローブの配列の種類の選択が容易に行えないという問題があった。また、ポリマーとＤＮＡ鎖とを結ぶリンカーが短く、プローブの自由度が制限されるという課題もあり、さらなるハイブリダイゼーションの選択性の向上が望まれていた。

特開２００３−４３０３７号公報Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９８，１２０，９７８７−９７９２ＡｎａｌｙｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｊａｎｕａｒｙ２００３，ｖｏｌ．１９，１７７−１７９

本発明は、上記のような従来技術に伴う問題を解決しようとするものであって、優れたハイブリダイゼーション選択性、効率を有するＤＮＡチップを提供することを課題とする。また、プローブとなるＤＮＡ鎖の導入が簡便で、しかもＤＮＡ鎖の導入密度の制御が容易なＤＮＡチップを提供することを課題とする。

本件発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究し、ポリマーを介してＤＮＡ鎖を基板に結合させるとともに、ポリマーとプローブＤＮＡとの間に、親水的なＤＮＡリンカーを介在させることにより、ハイブリダイゼーションの選択性、効率を飛躍的に向上させることができることを見いだした。しかも、ＤＮＡ鎖の導入密度の制御が可能となるとともに、１つのポリマー主鎖に少なくとも１種類のリンカーＤＮＡを用いるだけで、無限の種類のプローブＤＮＡ配列を備えさせることができることを見いだし本件発明を完成するに至った。
すなわち、本件発明は以下を含む。
〔１〕基板表面に、ポリマーを介してＤＮＡ鎖が固定されたＤＮＡチップであって、該ＤＮＡ鎖は１本鎖のプローブＤＮＡ部分と２本鎖のリンカーＤＮＡ部分とからなり、
前記ＤＮＡ鎖は前記リンカーＤＮＡ部分側で前記ポリマーと結合し、前記ポリマーは基板結合基を介して前記基板の少なくとも１つの表面に固定されていることを特徴とするＤＮＡチップ。
〔２〕前記リンカーＤＮＡ部分が、共有結合によりポリマーに結合していることを特徴とする〔１〕に記載のＤＮＡチップ。
〔３〕前記リンカーＤＮＡ部分の塩基対数が、１０以上１５０以下であることを特徴とする〔１〕または〔２〕に記載のＤＮＡチップ。
〔４〕前記ポリマーが、疎水性の構成単位からなるポリマー主鎖を有することを特徴とする〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載のＤＮＡチップ。
〔５〕前記ポリマーが、官能基を有することを特徴とする〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載のＤＮＡチップ。
〔６〕前記官能基が、アニオン性官能基を含むことを特徴とする〔５〕に記載のＤＮＡチップ。
〔７〕官能基の合計数に対して、アニオン性官能基が５０％以上含まれることを特徴とする〔６〕に記載のＤＮＡチップ。
〔８〕前記ポリマーが、前記基板結合基中の硫黄原子を介して基板に被覆されていることを特徴とする〔１〕〜〔７〕のいずれかに記載のＤＮＡチップ。
〔９〕下記の工程からなる、標的ＤＮＡの検出方法：
（１）請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡチップ表面のポリマーが結合されている表面に、標的ＤＮＡを接触させる工程（工程１）、
（２）プローブＤＮＡ部分にハイブリダイズした標的ＤＮＡを検出する工程（工程２）。
〔１０〕前記工程１において、ＤＮＡチップ中のポリマーがアニオン性官能基を有し、標的ＤＮＡの接触を塩基性水溶液下で行うことを特徴とする〔９〕に記載の方法。
〔１１〕前記工程１を、塩強度が１Ｍ以下で行うことを特徴とする〔９〕または〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕前記工程１を、２５〜５０℃の温度範囲で行うことを特徴とする〔９〕〜〔１１〕のいずれかに記載の方法。

本発明によれば、ポリマーを介してＤＮＡ鎖を基板に結合させるとともに、ポリマーとプローブＤＮＡとの間に、親水的なＤＮＡリンカーを介在させることにより、ハイブリダイゼーションの選択性、効率を向上させることができる。また、ＤＮＡ鎖の導入密度の制御が可能となる。さらに、１つのポリマー主鎖に少なくとも１種類のリンカーＤＮＡを用いるだけで、無限の種類のプローブＤＮＡ配列を備えさせることができる。また、本発明によれば、ＤＮＡチップを使用後、脱ハイブリダイゼーションすることで、基板を使用前の状態に簡便に戻すことができるのでＤＮＡチップの再利用が可能である。

本発明に係るＤＮＡチップは、基板表面に、ポリマーを介してＤＮＡ鎖が固定されたＤＮＡチップであって、該ＤＮＡ鎖は１本鎖のプローブＤＮＡ部分と２本鎖のリンカーＤＮＡ部分とからなり、前記ＤＮＡ鎖は前記リンカーＤＮＡ部分側で前記ポリマーと結合し、前記ポリマーは基板結合基を介して前記基板の少なくとも１つの表面に固定されている。

ＤＮＡ鎖
本発明のＤＮＡチップのＤＮＡ鎖は、長鎖ＤＮＡと、長鎖ＤＮＡの配列中のリンカー部分の配列と相補的な配列を有する短鎖ＤＮＡとが結合してなる。１本鎖のプローブＤＮＡ部分は標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションする部位であり、２本鎖のリンカーＤＮＡ部分はリンカーとしてポリマーに結合している。前記リンカーＤＮＡ部分は、共有結合によりポリマーに結合していることが好ましい。

リンカーＤＮＡ部分の塩基対の数は、たとえば、下限値が、好ましくは１０塩基（mer）以上、さらに好ましくは１２塩基（mer）以上、より好ましくは１５塩基（mer）以上であることが望ましい。また、塩基対の数の上限値は、好ましくは１５０塩基(mer)以下、さらに好ましくは１００塩基（mer）以下、より好ましくは４０塩基（mer）以下の範囲にあることが望ましい。

リンカーＤＮＡ部分が上記範囲の長さを有すると、プローブＤＮＡ部分の空間的な自由度を確保することができ、ハイブリダイゼーションを効率的に行うことができる。また、塩基対数が上記範囲にあると、常温（たとえば、２０℃程度）において使用時に塩基対の融解を起こすことがない。なお、Ｔ／Ａのみで構成される塩基対の数が、１０merの場合、融解温度(Tm)は２７℃、１２merの場合３８℃、１５merの場合５０℃である（ただし、塩強度が０．３Ｍの場合）。また、Ｇ／Ｃに置き換えることでTmは上昇する。
さらに、上記範囲の長さを有すると、リンカー部分に一定量以上の負電荷を保持させることができる。ＤＮＡは通常負の電荷を有するが、本件発明では、リンカーＤＮＡ部分が二本鎖となっているため、電荷が、理論上、通常の一本鎖ＤＮＡの２倍存在している。このため、ポリマーがアニオン性官能基を有する場合、リンカーＤＮＡが上記範囲の塩基対数を有することにより、電荷の反発が一層増大し、基板上におけるＤＮＡ鎖の転倒をより有為に防止することができる。しかも、非特異的吸着をより排除し、ハイブリダイゼーションの選択性を向上させることができる。

リンカーＤＮＡ部分の塩基配列は特に限定されないが、長鎖ＤＮＡと短鎖ＤＮＡとが結合する配列中のＧ／Ｃ含有量が、好ましくは１３％以上、さらに好ましくは１３％以上２６％以下であることが好ましい。Ｇ／Ｃ含有量が上記範囲にあると長鎖ＤＮＡと短鎖ＤＮＡとのハイブリダイゼーションを特異的に行うことができる。
また、長鎖ＤＮＡと短鎖ＤＮＡとが結合する配列の両末端の塩基対はＧ／ＣまたはＣ／Ｇであることが好ましい。このような配列とすることにより、長鎖ＤＮＡと短鎖ＤＮＡとの結合のズレを防止できる。

プローブＤＮＡ部分の塩基対の数は、標的ＤＮＡの長さにもより、限定されないが、通常、たとえば６塩基（mer）〜１００塩基（mer）の範囲にあることが好ましい。

ポリマー
本発明で用いるポリマーは、ポリマー主鎖にＤＮＡ鎖および基板結合基が結合している。また、ポリマー主鎖に官能基が結合していてもよい。ポリマー主鎖および官能基について具体的に示す。

<ポリマー主鎖>
本発明で用いられるポリマーにおいて、主鎖は疎水性であることが好ましい。疎水性のポリマー主鎖としては、たとえば、炭素−炭素結合による構成単位を有するものであることが好ましい。このような炭素−炭素結合からなる構成単位としては、下記式（Ｉ）で表されるものが挙げられる。

式（Ｉ）中、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴はそれぞれ同一又は異なってもよく、水素原子、官能基、ＤＮＡ鎖または基板結合基を表す。該構成単位は、同一または異なる単位が連続して、ポリマーを形成することができる。

本発明では、ポリマーは、上記炭素−炭素結合による構成単位以外のその他の構成単位を有していてもよい。

主鎖のその他の構成単位としては、たとえば、エチレンオキシ基−（Ｃ₂Ｏ）_n−（ｎは整数）などのアルキレンオキシ基〔−（Ｃ_mＯ）−、ｍは１〜１０の整数を表す。〕などが挙げられる。なお、その他の構成単位においても、側鎖として上記Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴と同様のものが結合しうる。

ポリマー主鎖中の前記炭素−炭素結合による構成単位と、その他の構成単位との含有割合（炭素−炭素結合による構成単位：その他の構成単位）は、ポリマー主鎖中、好ましくは５０：５０〜１００：０（モル／ｇ−ポリマー）、さらに好ましくは８０：２０〜１００：０（モル／ｇ−ポリマー）以上、より好ましくは９０：１０〜１００：０（モル／ｇ−ポリマー）以上、特に好ましくは１００：０（モル／ｇ−ポリマー）であることが望ましい。

炭素−炭素結合による構成単位が上記の範囲にある場合、ポリマー主鎖が疎水性を有しＤＮＡが親水性を有することとなるため、水溶液中でハイブリダイゼーションを行う際、基板表面でＤＮＡのみを水溶液側に露出させることができる。このため、ハイブリダイゼーションを高効率で実施することができる。

<官能基>
本発明で用いられるポリマーは、ＤＮＡ鎖との結合、基板結合基との結合に用いられた官能基以外に、これらと結合せずに残存した官能基（単に「官能基」という場合がある。）を有していてもよい。該官能基が存在すると、ポリマー主鎖とＤＮＡ鎖との反発などにより、標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション選択性等を向上させることができる。

ポリマー上の官能基の種類は、該官能基が、ＤＮＡ鎖、基板結合基を誘導する化合物とポリマーとを結合させる役割を有するため、ＤＮＡ鎖側の結合基、基板結合基側の結合基の種類にも依存する。たとえば官能基としてはアニオン性官能基、ノニオン性官能基、カチオン性官能基が挙げられる。これらのうちでは選択性の向上の観点からは、アニオン性官能基またはノニオン性官能基が含まれることが好ましく、アニオン性官能基がさらに好ましい。また、ハイブリダイゼーション効率の観点からはカチオン性官能基またはノニオン性官能基が含まれることが好ましく、カチオン性官能基がより好ましい。ＳＮＰｓ等の一塩基置換配列の検出には、アニオン性官能基またはノニオン性官能基が含まれることが好ましく、アニオン性官能基がさらに好ましい。

アニオン性官能基
前記アニオン性官能基としては、pHが中性付近およびアルカリ性で負に帯電するような官能基であればいかなるものも使用しうる。

このようなアニオン性官能基としては、具体的には、たとえば、カルボキシル基（-ＣＯＯＨ基）、スルホン酸基（-ＳＯ₃Ｈ基）、スルフィン酸基（-ＳＯ₂Ｈ基）、リン酸基（-ＯＰＯ₃Ｈ₂基（またはそのモノアルキルエステル基、そのジアルキルエステル基））、硫酸基（-ＯＳＯ₃Ｈ基）、フェノール性水酸基などが挙げられる。

これらのうちでは、カルボキシル基が好ましい。特に、ＤＮＡ鎖との結合には、ＤＮＡ鎖の末端がアミノ基である場合、カルボキシル基を用いることが好ましい。

これらのアニオン性官能基は、pHが中性付近およびアルカリ性で負に帯電するのであれば、それぞれその塩、たとえばアルカリ金属塩（たとえばＮａ、Ｋ塩）、アンモニウム塩（たとえば、アンモニア、メチルアミン、ジメチルアミン等との塩）の形をとっていてもよい。

ノニオン性官能基
前記ノニオン性官能基としてはアルキル基、水酸基、アルキルオキシ基など、中性又はアルカリ性の水溶液中でイオン性を示さない基が挙げられる。

カチオン性官能基
前記カチオン性官能基としては、−ＮＨ₃ ^＋、−ＮＨ₂（ＣＨ₃）^＋、−ＮＨ（ＣＨ₃）₂ ^＋、−Ｎ（ＣＨ₃）₃ ^＋など、pHが中性付近およびアルカリ性で正に帯電する基が挙げられる。

前記ポリマーが残存する官能基を含む場合、残存する全官能基のモル数に対して、アニオン性官能基が、好ましくは５０％以上、さらに好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、特に好ましくは、官能基がすべてアニオン性官能基であることが望ましい。

また、官能基を含む場合、ポリマー中の前記アニオン性官能基と前記ＤＮＡ鎖との存在割合〔アニオン性官能基：ＤＮＡ鎖（モル／ｇ−ポリマー）〕は、好ましくは５０：１〜５００：１、さらに好ましくは１００：１〜３００：１の範囲にあることが望ましい。ＤＮＡ鎖の存在割合を疎にすることで、プローブＤＮＡの空間的自由度を確保できるので、ハイブリダイゼーション効率的を向上させることができる。

官能基としてアニオン性官能基以外の官能基を含む場合、ノニオン性官能基、カチオン性官能基が挙げられるが、ＤＮＡ鎖との反発を維持するためにはノニオン性官能基であることがより好ましい。

ＤＮＡは通常アニオン性を有するが、ＤＮＡ鎖のリンカーＤＮＡ部分は二本鎖構造を採っているため、一本鎖構造の２倍のアニオンチャージを有している。ポリマー部分がアニオン性官能基を有していると、リンカーＤＮＡ部分とポリマーのアニオン性官能基との反発が相乗的に大きくなり、ＤＮＡ鎖の転倒を実質的に防止できる。また、特異的吸着と非特異的吸着において、静電反発による非特異的吸着の排除能がより高まる。
すなわち、ポリマーにアニオン性を付与することで、ハイブリダイゼーションの選択性を著しく向上させることができる。

本発明で用いるポリマーの重量平均分子量は、用いるＤＮＡチップのサイズ、密度などにより異なり限定されないが、通常、ＧＰＣ（ゲルパーミエーションクロマトグラフィー）で測定した重量平均分子量（Ｍｗ）が、５万〜１５０万の範囲にあることが好ましい。

<ポリマーの製造方法>
本発明で用いることのできるポリマーは、市販品又は公知の方法によってモノマーの（共）重合により製造することができる。モノマーに存在する官能基は、ＤＮＡ鎖、基板結合基を誘導する化合物との結合に用いられるとともに、結合に用いられずに残存して、ポリマーの官能基となってもよい。

アニオン性モノマー
たとえば、アニオン性官能基を有するポリマーについては、アニオン性モノマーを含むモノマーの重合により得ることができる。
このようなアニオン性モノマーとしては、たとえば、（メタ）アクリル酸、クロトン酸、イタコン酸、マレイン酸、イタコン酸モノアルキル（例えばイタコン酸モノメチル、イタコン酸モノエチルなど）、マレイン酸モノアルキル（例えばマレイン酸モノメチル、マレイン酸モノエチルなど）、シトラコン酸などのカルボキシル基を有するモノマー；

ビニルスルホン酸、スチレンスルホン酸、ビニルベンジルスルホン酸、アクリロイルオキシアルキルスルホン酸（例えば、アクリロイルオキシメチルスルホン酸、アクリロイルオキシエチルスルホン酸、アクリロイルオキシプロピルスルホン酸など）、メタクリロイルオキシアルキルスルホン酸（例えば、メタクリロイルオキシメチルスルホン酸、メタクリロイルオキシエチルスルホン酸、メタクリロイルオキシプロピルスルホン酸など）、アクリルアミドアルキルスルホン酸（例えば、２-アクリルアミド-２-メチルエタンスルホン酸、２-アクリルアミド-２-メチルプロパンスルホン酸、２-アクリルアミド-２-メチルブタンスルホン酸など）、メタクリルアミドアルキルスルホン酸（例えば、２-メタクリルアミド-２-メチルエタンスルホン酸、２-メタクリルアミド-２-メチルプロパンスルホン酸、２-メタクリルアミド-２-メチルブタンスルホン酸など）などのスルホン酸基を有するモノマー；

ビニルスルフィン酸、ビニル硫酸、ビニルリン酸、スチレンリン酸、ビニルフェノール、グルタミン酸、アスパラギン酸などが挙げられる。
これらのうちでは、カルボキシル基を有するモノマーであることが望ましい。

ＤＮＡ鎖、基板結合基の、ポリマーとの結合部位がアミノ基である場合、該アミノ基との結合のためには、ポリマー中にカルボキシル基、アルデヒド基、イソシアナート基（−ＮＣＯ）、イソチオシアナート基（−ＮＣＳ）が存在することが好ましい。
このため、アニオン性モノマーとしては、カルボキシル基を有するモノマーを用いることが好ましい。また、スルホン酸基、スルフィン酸基、硫酸基、リン酸基等を有するモノマーを用いる場合は、カルボキシル基、アルデヒド基、イソシアナート基（−ＮＣＯ）またはイソチオシアナート基（−ＮＣＳ）を有するモノマー（結合用モノマー）を共重合させることが好ましい。
アルデヒド基を有するモノマーとしては、前記カルボキシル基を有するモノマーのカルボキシル基がアルデヒド基であるモノマーが挙げられる。
イソシアナート基を有するモノマーとしては、２−イソシアナートエチル（メタ）アクリレートなどが挙げられる。
これらの結合用モノマーをアニオン性モノマーと共重合する場合、結合用モノマーの含有割合は、後述するように、結合させるＤＮＡ鎖、基板結合基の数に対応する割合を用いればよい。

アニオン性官能基を有するポリマー
このようなアニオン性モノマーを重合させて得られるアニオン性官能基を有するポリマーのうち、カルボキシル基を有するポリマーの具体例を示す。ポリマー中のカルボキシル基に前記ＤＮＡ鎖および基板結合基を結合させることができる。

本発明に用いることのできるカルボキシル基を有するポリマーとしては、たとえば、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリクロトン酸、ポリイタコン酸、ポリマレイン酸、ポリイタコン酸モノメチル、ポリイタコン酸モノエチル、ポリマレイン酸モノメチル、マレイン酸モノエチル、ポリシトラコン酸などのカルボキシル基を有するポリマーが挙げられる。

これらの酸は、たとえばＮａ、Ｋなどのアルカリ金属またはアンモニウムイオンの塩であってもよい。

本発明では、さらに、アニオン性官能基を有するモノマーと、下記のノニオン性官能基を有するモノマー、カチオン性官能基を有するモノマーとを共重合させてもよい。

ノニオン性モノマー
ノニオン性モノマーとしては、たとえば、アクリルアミド、メタクリルアミドなどのアミド類；

アクリル酸メチル、メタクリル酸メチル、酢酸ビニル、酢酸アリル、アセト酢酸アリル、トリメチル酢酸ビニル、ビニル蟻酸、ヘキサン酸ビニル、ラウリン酸ビニル、メタクリル酸ビニル、オクタン酸ビニル、パルミチン酸ビニル、ピバル酸ビニル、プロピオン酸ビニル、ステアリン酸ビニル、ヘキサヒドロフタル酸モノ2-（メタクリロイルオキシ）エチル、フタル酸モノ-2-（メタクリロイルオキシ）エチル、安息香酸ビニル、ｐ-ビニル安息香酸、酪酸ビニル、カプリン酸ビニル、カプロン酸ビニル、クロトン酸ビニル、デカン酸ビニル、けい皮酸ビニル、アリルブチレート安息香酸アリル、n-酪酸アリル、n-カプリン酸アリル、n-カプロン酸アリル、エナント酸アリル、ヘプタン酸アリル、イソフタル酸アリル、イソチオシアン酸アリル、イソ吉草酸アリル、n-吉草酸アリルなどのエステル類；

ビニルメチルケトンなどのケトン類；

ビニルブチルエーテル、アリルエーテル、アリルエチルエーテル、アリルブチルエーテル、ビニルエチルエーテル、n-デカン酸アリルなどのエーテル類；

ビニルアルコール、アリルアルコールなどのアルコール類；

塩化ビニル、塩化アリル、塩化メタクリロイル、クロロ酢酸ビニル、塩化アクリロイル、臭化アリル、よう化アリル、クロロ酢酸アリル、クロロぎ酸アリル、アリルクロロホルメートなどのハロゲン化物；

スチレン、アリルベンゼン、4-メタアクリルオキシ-2-ヒドロキシベンゾフェノン、ビニルトルエン、アリルベンジルエーテル、4-アリル-2,6-ジメトキシフェノール、アリルアリソール、4-アリル-1,2-ジメトキシベンゼンなどのベンゼン環を有する芳香族化合物；

3-メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン、ビニルトリクロロシラン、アリルクロロジメチルシラン、アリルクロロメチルジメチルシランなどのシラン類；

メタクリロニトリル、ビニルアセトニトリル、アクリロニトリル、シアノ酢酸アリル、シアン化アリルなどのシアン類；

2-アリルシクロヘキサノン、1-アリルシクロヘキサノール、アリルシクロペンタンなどのシクロアルカン誘導体；

その他、ビニルアントラセン、ビニルスルホン、アリルアルコールプロポキシレート、アリル-L-システイン、アリルエチレン、アリルグリシジルエーテル、アリルトリフルオロ酢酸、アリルシクロペンタジエニルニッケル、ジエチルホスホノ酢酸アリル、アリルジフェニルホスフィン、アリルジフェニルホスフィンオキシド、アリルジスルフィドなどが挙げられる。

これらのうち、疎水性のノニオン性ポリマーを与えるモノマーとして、スチレンやアリルベンゼンなどを好ましく用いることができる。

カチオン性モノマー
カチオン性モノマーとしては、たとえば、アリルアミン、3-アクリルアミド-N,N- ジメチルプロピルアミン、アリルシクロヘキシルアミン、3-メタクリルアミド-N-ジメチルプロピルアミンなどの第一級アミン；

メチルアリルアミンなどの第二級アミン；

N-アリルジエチルアミン、N-アリルジメチルアミンなどの第三級アミン；

アリルトリエチルアンモニウム、（3-アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド、ビニルトリメチルアンモニウムブロミド、3-（メタクリロイルアミノ）プロピルトリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸エチルトリメチルアンモニウムクロリド、ジアリルジメチルアンモニウムなどの第四級アンモニウムが挙げられる。

前記ポリマーが官能基を有する場合、モノマーの合計モル数に対して、アニオン性モノマーの使用量を、好ましくは５０モル％以上、さらに好ましくは８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上、特に好ましくは、全モノマーがアニオン性モノマーであることが望ましい。また、アニオン性モノマー以外のモノマーを含む場合、ノニオン性モノマーであることが好ましい。

モノマーの重合は、公知の方法により行うことができ、たとえば、溶媒の存在下又は非存在下で、必要に応じ重合開始剤を添加して、モノマーを重合させて行うことができる。重合反応は、たとえば、ランダム（共）重合、ブロック（共）重合、グラフト（共）重合などの方法を採用できる。

溶媒としては、モノマーが溶解するものであればよく、限定されない。たとえばＴＨＦ、メタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯなどを用いることができる。

重合開始剤としては、たとえば２，２’-アゾビス（イソブチロニトリル）（ＡＩＢＮ）、１，１’-アゾビス（シクロヘキサン-１-カルボニトリル）、２，２’-アゾビス（２-メチルブチロニトリル）などを用いることができる。また、このようなアゾ化合物の他に、過酸化物、有機金属化合物などを用いることもできる

重合は、モノマーの種類により異なり限定されないが、通常、たとえば、室温〜１００℃程度の温度範囲で、１〜７２時間程度の時間で実施することができる。

基板
本発明で用いることのできる基板に限定はなく、たとえば、金属、無機材料、有機材料のいずれも用いることができる。これらのうちでは、金属基板を好ましく用いることができる。

金属基板としては、たとえば、金、銀、クロム、ガリウム、ニッケル等が挙げられる。これらのうちでは金を用いることが好ましい。

無機材料基板としては、たとえば、ガラス基板などが挙げられる。

有機材料基板としては、たとえば、シリコン基板、ポリ塩化ビニル、紙などが挙げられる。

基板の形状は限定されず、板状、管状、球状などの形状が挙げられる。このうちでは、板状の形状を好ましく用いることができる。

ＤＮＡチップの製造方法
本発明に係るＤＮＡチップは、ポリマー主鎖にＤＮＡ鎖および基板結合基を導入し、該ポリマーを基板表面に接触、固定化して製造することができる。

このようなＤＮＡチップの製造方法は限定されないが、たとえば、（１）まず、短鎖ＤＮＡ（一本鎖）と基板結合基を誘導する化合物とをポリマーに結合し、次に得られた短鎖ＤＮＡ結合ポリマーを基板に結合させ、さらに長鎖ＤＮＡ（一本鎖）を短鎖ＤＮＡに結合（ハイブリダイズ）させて、ＤＮＡチップを得る方法が挙げられる。

また、（２）まず、長鎖DNAと標的DNAを混合した溶液中を調整し、短鎖DNAコンジュゲートポリマー固定化基板上に滴下する。長鎖DNAと短鎖DNAの融解温度よりも高温の（長鎖DNAの標的配列部分のハイブリダイゼーションのTm）状態にする。長鎖DNAの標的配列部分のハイブリダイゼーションを均一系で行ってから急激に温度を下げる（長鎖と短鎖DNAのTm付近）ことで長鎖DNAと短鎖DNAの表面ハイブリダイゼーションを行う。こうすることで、長鎖DNAの標的配列部分のハイブリダイゼーションを解離させることなく基板表面に標的DNAを存在させることができる。
さらに、プローブＤＮＡ部分と短鎖ＤＮＡと完全相補鎖配列とを有する長鎖ＤＮＡと標的ＤＮＡとをまずハイブリダイゼーションし、その後、ポリマーに結合している短鎖ＤＮＡと、該完全相補鎖配列部分とを位置特異的にハイブリダイゼーションすることもできることから、遺伝子発現解析への応用も可能となる。
以下に製造方法の具体例を示す。

短鎖ＤＮＡ
前記短鎖ＤＮＡは、ポリマーと結合させる末端が、ポリマー中の官能基と反応して結合しうる基を有することが好ましい。たとえば、ポリマー中の官能基がアニオン性官能基であるカルボキシル基、あるいはアルデヒド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基等の官能基を有する場合、短鎖ＤＮＡの末端はアミノ化（−ＮＨ₂）されていることが好ましい。末端のアミノ基は、直接ＤＮＡ鎖に結合していてもよいし、炭素原子数１〜２０のアルキル基を介してＤＮＡ鎖に結合していてもよい。このような末端がアミノ化されたＤＮＡは、市販品を用いることができる。

また、前記末端にアミノ基を有する短鎖ＤＮＡにおいて、さらに必要に応じスペーサーとなる基を付加してもよい。スペーサーを導入することにより、短鎖ＤＮＡのポリマーへの結合を収率よく行うことができる。たとえば、末端がアミノ化されたＤＮＡに、Ｎ−（トリフルオロアセチルカプロイロキシ）スクシンイミドエステル（ＴＦＣＳ）を、中性（ｐＨ７．０）溶媒中で、−１０〜１０℃の温度で反応させ、さらに、ＴＦＣＳのトリフルオロアセチル基の脱保護を行うため、溶液のｐＨを徐々にアルカリ性（ｐＨ８）にしながら室温で反応させることにより、ヒドラジノ基（末端にアミノ基）を有するスペーサーが導入された短鎖ＤＮＡを得ることができる。

基板結合基を誘導する化合物
基板結合基とは、ポリマーを基板に結合させる基であり、基板と結合するための官能基とポリマーと結合するための官能基を有する。前記基板と結合するための官能基としては、基板の種類により異なり限定されないが、たとえば、硫黄原子を有する基を好ましく用いることができる。硫黄原子を有する基としてはチオール基、ピリジルジチオ基、ジスルフィド基、ベンゼンチオール基、ピリジンチオール基、アルカンチオール基などが挙げられる。前記ポリマーは、基板結合基中の硫黄原子を介して基板に被覆されていることが好ましい。

ポリマー中の官能基がアニオン性官能基であるカルボキシル基、スルホン酸基等の酸性官能基である場合、前記短鎖ＤＮＡと同様に、基板結合基中の、前記ポリマーと結合させる基は、アミノ基（−ＮＨ₂）、ヒドラジド基が好ましい。
このような基板結合基を誘導する化合物としては、たとえば、３（２−ピリジルジチオ）プロピオニオルヒドラジド（ＰＤＰＨ）、３−[（２−アミノエチル）ジチオ]プロピオン酸ヒドロクロリド（ＡＥＤＰ）などが挙げられる。

ポリマーと、短鎖ＤＮＡ、基板結合基を誘導する化合物との結合
短鎖ＤＮＡまたは基板結合基を誘導する化合物と、ポリマーとの結合方法は、ポリマーの有する官能基と、短鎖ＤＮＡまたは基板結合基の有する官能基の種類により異なり限定されないが、たとえば、結合前のポリマーにアニオン性官能基であるカルボキシル基、あるいはアルデヒド基、イソシアナート基、イソチオシアナート基が存在し、短鎖ＤＮＡ、基板結合基の有する官能基がアミノ基（−ＮＨ₂）である場合、常法によるアミド化反応により結合させることができる。

具体的には、たとえば、溶媒中、塩の存在下に、ポリマーと短鎖ＤＮＡとを室温下に反応させることができる。

溶媒としては、公知のリン酸緩衝液、
3-[N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)アミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、
3-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]プロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、
2-[4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジニル]エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、
2-モルホリノエタンスルホン酸モノハイドレート（ＭＥＳ）、
3-モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、
2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸(ＭＯＰＳＯ)、
ピペラジン-1,4-ビス(2-エタンスルホン酸)（ＰＩＰＥＳ）、
ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシ-3-プロパンスルホン酸) デハイドレート（ＰＯＰＳＯ）、
N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(ＴＡＰＳ)、
2-ヒドロキシ-N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、
N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）などを用いることができる。塩としてはＮａＣｌ、ＫＣｌなどが挙げられる。

短鎖ＤＮＡの使用量は、残存させる官能基の数にもよるが、ポリマー中の官能基の数に対して（官能基数：短鎖ＤＮＡのモル数）、好ましくは５０：１〜５００：１、さらに好ましくは１００：１〜３００：１の範囲にあることが望ましい。

また、たとえば、基板結合基を誘導する化合物とポリマーとを、溶媒中、塩基の存在下に、室温で反応させることができる。溶媒としては、上記と同様の緩衝液を用いることができ、塩としては、上記と同様の塩を用いることができる。

基板結合基を誘導する化合物の使用量は、残存させる官能基の数にもよるが、ポリマー中の官能基の数に対して（官能基数：基板結合基を誘導する化合物のモル数）、好ましくは５：１〜１００：１、さらに好ましくは５：１〜５０：１の範囲にあることが望ましい。

ポリマーの基板表面への結合
ポリマーの基板表面への結合方法は、基板の種類、基板結合基の有する官能基の種類により異なり限定されないが、たとえば、金属基板表面に、短鎖ＤＮＡと基板結合基を有するポリマーを、酸性の緩衝溶液に溶解させ、室温下、該緩衝溶液を金属基板の所望の位置に滴下し、一定時間静置すればポリマーを金属基板に固定化できる。

前記ポリマーの静置時間（固定化時間）は、好ましくは０．５〜４８時間、さらに好ましくは１〜４８時間であることが望ましい。固定化時間を増加させると、ポリマーの基板への固定化量を増加させることができ、ポリマーの固定化量の増加により、ハイブリダイゼーション量の向上及び選択性を向上させることができる。

チオール基を有する化合物の金属基板への結合は、より具体的には、たとえばJ.Am.Chem.Soc.1998,120,9787-9792に記載の方法に準じて行うことができる。また、たとえば、ピリジルジチオ基を有する化合物の金属基板への結合方法も同文献に記載の方法に準じて行うことができる。

本発明では、ポリマーに複数の基板結合基を誘導する化合物が結合しているため、基板表面への結合を自己組織化的に行うことができる。したがって、単分子のＤＮＡ鎖の結合に比較して、ＤＮＡ鎖の配置の精度よく、しかも極めて簡便に、ＤＮＡ鎖を基板に結合させることができる。
なお、「自己組織化的」とは、一定の配置が自動的に形成されることを意味する。

長鎖ＤＮＡのハイブリダイゼーション
短鎖ＤＮＡと相補的な配列を有し、所望の標的ＤＮＡと相補的な配列を有する長鎖ＤＮＡを、ポリマーに結合している短鎖ＤＮＡ部分にハイブリダイゼーションさせることにより、本発明のＤＮＡチップを得ることができる。ハイブリダイゼーションは、公知の方法により実施できる。たとえば、ハイブリダイゼーションの方法としては、下記の方法が挙げられる。

(I)固体表面ハイブリダイゼーション
(i)使用するDNAを下記の(1)または(2)のハイブリダイゼーションバッファーに溶解させて90〜100℃で10分〜15分アニールする（DNA自己相補鎖をアニールすることで解くため）。アニール後に氷水に浸漬して急冷する（再自己相補鎖の形成を抑制）。
(ii)プローブDNA固定化基板に、標的DNA溶液を滴下し、Tm以上（普通はTm付近）の温度で15分〜24時間インキュベートする。
（ハイブリダイゼーションバッファー）
(1) 10〜50 mM Tris-HCl/NaCl 0.1〜0.5 M /1 mM MgCl₂, pH 8.0
(2) 10〜50 mM Tris-HCl/NaCl 0.1〜0.5 M /1 mM EDTA, pH 8.0
(II)基板洗浄
下記の(3)または(4)の洗浄用バッファーにて基板を5分〜20分程度洗浄する。
（洗浄用バッファー）
(3) 10〜50 mM Tris-HCl/NaCl 0.1〜0.5 M /1 mM MgCl₂/ 0.1〜0.4 % SDS, pH 8.0
(4) 10〜50 mM Tris-HCl/NaCl 0.1〜0.5 M /1 mM EDTA/ 0.1〜0.4 % SDS, pH 8.0
上記のうちでは、(1)ハイブリダイゼーションバッファーと（3）洗浄用バッファーの組み合わせが好ましい。

本発明では、固定化された短鎖ＤＮＡに、標的ＤＮＡと相補的な配列を有する長鎖ＤＮＡを、所望の位置にハイブリダイゼーションにより結合させ、該長鎖ＤＮＡを標的ＤＮＡのハイブリダイゼーションに用いるので、多様な標的ＤＮＡの種類に応じたＤＮＡチップを、極めて簡便に製造できる。
しかも、基板表面に、ポリマーを介してＤＮＡ鎖が固定されている、すなわち、ポリマーが被覆された形でそのポリマー表面にＤＮＡ鎖が結合しているため、ＤＮＡ鎖と基板表面との直接のインターラクションが起こらない。このため、ＤＮＡ鎖の転倒を抑制することができるので、ハイブリダイゼーションの選択性及び効率を向上できる。特に、金などの金属基板とＤＮＡ鎖とはインターラクションが大きくＤＮＡ鎖が転倒しやすいため、基板表面に金属基板を用いるときに有効である。

本発明に係るＤＮＡチップでは、前記ポリマーにＤＮＡ鎖を結合させ、該ポリマーを基板に結合させるので、ポリマーへのＤＮＡ鎖の導入密度を制御することができる。このため、基板表面へのＤＮＡ鎖の導入密度を容易に制御することができる。なお、ポリマー中の官能基の導入量および該官能基とＤＮＡ鎖との反応量を調整することで、ポリマーへのＤＮＡ鎖の導入密度の制御を容易に実施できる。

また、本発明に係るＤＮＡチップは、ハイブリダイゼーション終了後、基板を高温に保つ、またはアルカリ処理することで、長鎖ＤＮＡを基板から脱離させることが可能で、ポリマー固定化された短鎖ＤＮＡは、ポリマーに結合したままの状態で、基板表面に脱離せずに残存させることが可能である。このため、同じ基板を用いて再使用、または新たに長鎖ＤＮＡを結合させ配列を変更して別の標的ＤＮＡの配列決定などを行うことも可能である。

一方、本発明のＤＮＡチップは、ＤＮＡ鎖がポリマーに結合し、該ポリマーは、複数の基板結合基により基板に結合させることができるので、基板からのＤＮＡ鎖を含む剥離を有効に抑制することもできる。

また、本発明では、ポリマーが疎水性を有する場合、ポリマー主鎖が疎水性を示しＤＮＡが親水性を示すため、水溶液中でハイブリダイゼーションを行う際、基板表面でＤＮＡのみを水溶液側に露出させることができる。このため、ハイブリダイゼーションを高効率で実施することができる。

さらに、ポリマー部分がアニオン性官能基を有している場合、リンカーＤＮＡ部分とポリマーのアニオン性官能基との反発が相乗的に大きくなり、ＤＮＡ鎖の転倒防止に寄与する。このため、特異的吸着と非特異的吸着において、静電反発による非特異的吸着の排除能がより高まる。すなわち、ポリマーにアニオン性を有する場合、ハイブリダイゼーションの選択性を著しく向上させることができる。

標的ＤＮＡの検出方法
本発明に係るＤＮＡチップは、固体化されたＤＮＡ鎖のプローブ部分と相補性を有する標的ＤＮＡの検出に用いることができる。標的ＤＮＡとしては標識されたＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片などが挙げられる。標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより、遺伝子発現のモニタリング、塩基配列の決定、変異解析、多型解析等を行うことができる。特に、本発明に係るＤＮＡチップは、ハイブリダイゼーションの選択性および効率に優れているので、ＳＮＰｓなどの多型解析に極めて有効である。

本発明に係る標的ＤＮＡの検出方法は、下記の工程からなる：
（１）前記のＤＮＡチップ表面のポリマーが結合されている表面に、標的ＤＮＡを接触させる工程（工程１）、
（２）プローブＤＮＡ部分にハイブリダイズした標的ＤＮＡを検出する工程（工程２）。

標的ＤＮＡの接触は、前記ハイブリダイゼーション方法などと同様に行うことができる。
前記工程１は、ポリマーがアニオン性官能基を有することが好ましく、この場合に塩基性下で行うことが好ましい。塩基性下でハイブリダイゼーションを行うと、ポリマーがアニオン性官能基を有する場合にアニオン性官能基の負電荷を向上させることができる。

また、前記工程１においては塩強度は、たとえば、リンカーＤＮＡが１２塩基〜４０塩基の範囲にあり、プローブＤＮＡが６塩基〜１００塩基の範囲にある場合、好ましくは０．１〜１．０Ｍ、さらに好ましくは０．２〜０．４Ｍ、特に好ましくは０．２５〜０．３５Ｍの範囲にあることが望ましい。
塩強度の範囲が上記範囲にあると、ポリマーがアニオン性官能基を有する場合に特にアニオン性官能基の負電荷を向上させることができる。このため、ハイブリダイゼーションの選択性の向上、効率の向上を図ることができる。

さらに、前記工程１は好ましくは２５〜５０℃、さらに好ましくは３５〜４５℃の温度範囲で行うことが好ましい。上記温度範囲にあると、ハイブリダイゼーションの選択性を向上させることができる。

標的ＤＮＡの検出は、常法により行うことができ、たとえば、標的ＤＮＡに付した蛍光強度を測定する方法、インターカレーターを用いた電気化学測定（サイクリックボルタンメトリー、インピーダンス測定）などを採用できる。また、本発明のＤＮＡチップは、水晶振動子法（ＱＣＭ）、表面プラズモン法（ＳＰＲ）などと連動させることにより、特定の標的ＤＮＡの結合量を迅速に測定することができる。ＱＣＭの場合、周波数変化から、ＳＰＲの場合共鳴角度の変化から標的ＤＮＡの結合量を求めることができる。

図１は、本発明のＤＮＡチップ等を模式的に示した一例である。
図１−（１）に示すように、たとえば、短鎖ＤＮＡ２、基板結合基５を有するポリマー４が、基板６に結合している。このような短鎖ＤＮＡ結合基板に、長鎖ＤＮＡ３をハイブリダイズさせることにより、図１−（２）に示すように本発明のＤＮＡチップ１が得られる。すなわち、ＤＮＡチップ１は、プローブＤＮＡ部分７とリンカーＤＮＡ部分８を有するＤＮＡ鎖１０が、ポリマー４に結合している。該ポリマー４は基板結合基５により基板６に結合している。図１−（３）に示すように、該ＤＮＡチップ１に標的ＤＮＡ１０をハイブリダイズさせて、標的ＤＮＡ１０の検出を行うことができる。

以下実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。なお、明細書中、「室温」とは１５〜２５℃（好ましくは２０℃）の範囲の温度を意味する。

〔実施例で用いたＤＮＡおよび試薬〕
以下の合成DNAはグライナー社から購入した。
(1)短鎖ＤＮＡ（以下、「P1-DNA」という。）：3'-TA-ATT-CTT-TTT-TTT-TTT-TTG-5'（配列番号：１）
(3'末端アミノ化、20 mer)、
(2)長鎖ＤＮＡ（以下、「P2-DNA」という。）：
5'-GAA-AAA-AAA-AAA-AAC-TT-GAC-GAG-GGG-CGC-ACC-GG-3'（配列番号：２）
(3'末端FITC（フルオレッセインイソチオシアナート）化または未修飾、34 mer。p1-DNAと相補的な配列を組み込んだ。)
(3)標的DNA：
完全相補鎖(5'末端FITC化、17 mer)：
(tG-DNA)：3'-CTG-CTC-CCC-GCG-TGG-CC-5'（配列番号：３）
一塩基置換(SNPs)配列(5'末端FITC化、17 mer)：
(tC-DNA)：3'-CTG-CTC-CCC-CCG-TGG-CC-5'（配列番号：４）
(tT-DNA)：3'-CTG-CTC-CCC-TCG-TGG-CC-5'（配列番号：５）
(tA-DNA)：3'-CTG-CTC-CCC-ACG-TGG-CC-5'（配列番号：６）
非相補鎖：
3'-GGC-ACG-GAG-CAC-ACT-GG -5'（配列番号：７）
(5'末端FITC化、GC含有率は完全相補鎖DNAと同じ。17 mer)。
(4)ポリアクリル酸（PAA）(Mw:1,080,000) （商品番号18,129-3、Aldrich社製）
(5) 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride （EDC）（商品番号[16,146-2]、アルドリッチ社製）
(6)3-(2-pyridyldithio)propionyl hydrazide (PDPH)（商品番号 [22301]、 Pierce社製）
(7)N-(ε-trifluoroacetylcaproyloxy)succinimide ester (TFCS)（商品番号 [22299]、Pierce社製）

〔実施例１〕
ヒドラジド化した短鎖ＤＮＡの調製
TFCSをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、ＤＭＳＯ中の終濃度が１０重量％になるようにP1-DNAを0.1 M−リン酸緩衝液／0.15 M−NaCl（ｐＨ７．０）に溶解させたものに5分間かけて滴下した。全容量は１ｍＬとした。（モル比；TFCS：P1-DNA＝10:1）
これをナスフラスコ中で2時間、4℃で反応させた。反応終了後、限外ろ過により未反応のTFCSを除去した。

次に、TFCSのトリフルオロアセチル基の脱保護を行うため、反応溶液を除々に0.1 M−リン酸緩衝液／0.15 M−NaCl（ｐＨ８．０）に置換し、反応溶液を１時間室温で攪拌した。その後、限外ろ過、凍結乾燥を行い、生成物（ヒドラジド化短鎖ＤＮＡ）を得た。反応のスキームを図２に示す。

DNA(P-1)コンジュゲートポリアクリル酸(PAA)の調製と特性評価
ヒドラジド化短鎖ＤＮＡ（０．２１μモル）、ＰＡＡ（４２モル）、ＥＤＣ（４２０モル）を0.1 M−リン酸緩衝液／1 M−NaCl（ｐＨ８．０）に溶解させたものに滴下した。全容量は10 mlとした。（モル比；PAAのカルボキシル基：ssDNA＝200:1）
これをナスフラスコ中で３日間、室温で反応させた。反応後、限外ろ過により未反応のヒドラジド化短鎖ＤＮＡ、ＥＤＣを除去し、凍結乾燥して、P1-DNA修飾ポリアクリル酸（以下「P1-DNA-PAA」という。)を得た。

P1-DNA-PAA、EDC、PDPHを0.1 M−リン酸緩衝液／1 M−NaCl（ｐＨ８．０）に溶解させ（モル比；PAAのカルボキシル基：PDPH＝10:1）、これをナスフラスコ中で１日間、室温で反応させた。反応後、限外ろ過により未反応のPDPH、EDCを除去し凍結乾燥し、短鎖ＤＮＡとＰＤＰＨで修飾されたポリアクリル酸（P1-DNA-PDPH-PAA）を得た。反応のスキームを図３に示す。

短鎖ＤＮＡおよび基板結合基の導入量の決定
P1-DNA-PDPH-PAA中の短鎖ＤＮＡおよびPDPHの単位質量あたりのモル数の決定は、下記のように、紫外光吸収スペクトル測定の結果より算出した。分光光度計は、DU 7400 (Beckman社製) を使用した。
モル吸光計数をε[L / mol・cm]、モル濃度をＣ_M[mol / L]、分光測定セルの長さをl[cm]とすると、これらの吸光度Aとの間には、次式の関係が成立する。
A＝ε×Ｃ_M×l ・・・(1)
モル吸光係数には、試料と濃度に次式の関係があるので
ε＝（１／Ｃ_M ｌ）ｌｏｇ₁₀（Ｉ₀／Ｉ）・・・(2)
ここでlは吸収層の厚さ、I₀は入射光の強度、Iは吸収層を通過した後の光強度を示している。
PDPHのピリジルジスルフィド基を還元すると、ピリジン-2-チオンが脱離する。この物質の吸収波長である343 nmでの吸光度を測定することでPDPHの導入量を決定した（図４）。PDPHモル吸光係数は、ε＝8.08×10³ [Ｍ^-1cm^-1]である。
単位質量当たりのモル数をa [mol / mg-solid]、重量濃度をCw[ mg-solid / mL] とすると、今回用いた分光測定セルの長さはl=1cmであるので、 (1)は、次式のように簡略化することができる：A=8.08×10⁶a×C_W ・・・(3)
ポリアクリル酸側鎖の短鎖ＤＮＡ、及びPDPHの吸収スペクトルの結果と式(3)の関係からaを決定した。短鎖ＤＮＡの定量については、短鎖ＤＮＡの吸収波長である260 nmの吸収スペクトルからPDPHと同様にaを決定した。*短鎖ＤＮＡは1 OD=33μｇとしてAを決定した。

この結果、(3)式と、343 nmにおける吸収スペクトル測定の結果(０．３１)から、PDPHは2.56 [A.U./mg-solid]となった。したがって、2.56=8.08×10⁶×a の関係から、a=307 [nmol/mg-solid]と決定した。
短鎖ＤＮＡは1 O.D.=33μｇであるので、260nmにおける吸収スペクトル測定の結果（０．２９）より、2.32 [O.D/mg-solid]となる。短鎖ＤＮＡの分子量は6130であるので、a= 20 [nmol/ mg-solid]と決定した。
これらの結果より、P1-DNA-PDPH-PAAのPDPHおよび短鎖ＤＮＡ含量が、それぞれ、307 [nmol/mg-solid]、20 [nmol/ mg-solid]であることを確認した。

金基板の作製
金基板はスパッター装置を用いて作製した。スライドガラスをメタノール中に浸漬し15分間超音波洗浄した後、十分に超純水で洗浄した。スライドガラスをスパッター装置内へ導入し、クロム2.5分間、金10分間の順でスライドガラス基板上に直径2 mmの円になるようにガラスをマスクしてスパッターした。

P1-DNA-PDPH-PAAの金基板への固定化（P1-DNA固定化基板の調製）
金基板は実験直前に5N硝酸を熱したものに１分間浸漬し、超純水で洗浄することを３回繰り返してから使用した。洗浄した基板の金部分へ、50mM MES（２−モルホリノエタンスルホン酸モノハイドレート）緩衝液／1 M NaCl（ｐＨ５．５）に溶かしたP1-DNA-PDPH-PAA （0.4mg/ml）を、２μＬ滴下した。
2時間、室温で基板を静置した。固定化後、10 mM Tris-HCl/0.3 M NaCl/1 mM MgCl₂/0.1 % SDS（ｐＨ８．０）（以下、「洗浄用緩衝液」という。）と超純水で基板を洗浄した。洗浄後基板は、エアロダスター（Futaba社製）を用いて水分を除去、乾燥し、P1-DNA固定化基板（P1-DNA-PDPH-PAA基板）を得た。

P1-DNA−P2-DNA間のハイブリダイゼーション（P2-DNA固定化基板の調製）
P1-DNAとP2-DNAの基板表面でのハイブリダイゼーションを行った。
10 mM Tris-HCl/0.3 M NaCl/1 mM MgCl₂（ｐＨ８．０）に、５‘−末端をFITC化したP2-DNA(100 nM)を溶解させ、P1-DNA固定化基板に2μＬ滴下した。基板からの溶液の蒸発を防ぐため、基板は水分の十分ある容器内で30分間、３５℃で静置してハイブリダイゼーションを行った。

ハイブリダイゼーション後、基板を洗浄用緩衝液で5分間、3回洗浄して非特異的な吸着物を除去して、P1-DNAにP2-DNAがハイブリダイズした、P2-DNA固定化基板（P1P2-DNA-PDPH-PAA基板）を得た。
コントロールとして、５‘−末端をFITC化した標的DNA（3'-CTG-CTC-CCC-GCG-TGG-CCC-CTG-CAC-CAG-CAG-CTC-C-5'（配列番号：８）(34mer)：P1-DNAとの相補部分なし）(100 nM)を金基板へ滴下した。これらのハイブリダイゼーションの確認はScanArray（パーキンエルマー社製）を用いてスキャン速度50μm/min.で行った。
P2-DNA、コントロール配列DNAの蛍光強度は、図５に示すように、それぞれ、３５℃の場合、224 A.U.、1.64 A.U.であった。
これらの値をP2-DNAの値を100％として規格化するとコントロール配列は0.73％であった。

〔実施例２〕
標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション（温度３０℃）
実施例１で製造したP2-DNA固定化基板（P1P2-DNA-PDPH-PAA基板）に、完全相補鎖DNA、SNPs配列(tC-DNA）、非相補鎖DNAを各々２μＬ滴下した。すべて10 mM Tris-HCl/NaCl 0.3 M /1 mM MgCl₂, pH 8.0の溶液で100nMの濃度とした。基板からの溶液の蒸発を防ぐため、基板は水分の十分ある容器内で30分間、３０℃で静置してハイブリダイゼーションを行った。
ハイブリダイゼーション後、基板を洗浄用緩衝液で5分間、3回洗浄した。
それぞれの標的ＤＮＡの蛍光強度をScanArray（パーキンエルマー社製）を用いて実施例１と同様にして測定した。その結果を図６に示す。

〔実施例３〕
標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション（温度３５℃）
実施例２において、ハイブリダイゼーションの温度を３５℃にする以外は、実施例２と同様にしてハイブリダイゼーションを行った。
それぞれの標的ＤＮＡの蛍光強度をScanArray（パーキンエルマー社製）を用いて、実施例１と同様にして測定した。その結果を図７に示す。
図６および図７に示すように蛍光強度は、完全相補鎖DNA、一塩基置換（SNPs）配列（tC-DNA）、非相補鎖DNAに関し、ハイブリダイゼーション温度が３０℃の場合、8.3A.U.、4.7A.U.、2.3A.U.であり、３５℃の場合、145 A.U.、24.5A.U.、20A.U.であった。

コントロール実験として、実施例１で調製したP-1DNA固定化基板に、相補鎖DNAを同様の条件で滴下、インキュベート、洗浄した。この基板からは、蛍光が8.1 A.U.観察された。
これらの蛍光強度（Ｆ．Ｉ．）を完全相補鎖DNAのシグナルを用いて規格化すると、30℃、35℃の場合でそれぞれ、SNPs配列は56%、16.8%、非相補鎖は27.5%、13.7%、コントロール実験の値は5.5 %となった。

以上の結果より、ハイブリダイゼーション温度が３０℃、３５℃のいずれにおいても、ハイブリダイゼーションが選択的に起こっていることが確認され、さらに、これらの比較をすると、ハイブリダイゼーション温度が３５℃の場合、より選択性が向上することが確認された。また、これらの結果から、一塩基の違いでも配列特異的に完全相補鎖DNAの検出が可能であることが確認された。

〔実施例４〕
塩強度0.4 M
前記完全相補鎖のtG-DNA（3'-CTG-CTC-CCC-GCG-TGG-CC-5'）（配列番号：３）（図８中「Ａ」）、
前記一塩基置換(SNPs)配列のtC-DNA（3'-CTG-CTC-CCC-CCG-TGG-CC-5'）（配列番号：４）（図８中「Ｂ」）、tT-DNA（3'-CTG-CTC-CCC-TCG-TGG-CC-5'）（配列番号：５）（図８中「Ｃ」）、tA-DNA（3'-CTG-CTC-CCC-ACG-TGG-CC-5'）（配列番号：６）（図８中「Ｄ」）、および
前記非相補鎖DNA（3'-GGC-ACG-GAG-CAC-ACT-GG -5'）（配列番号：７）（図８中「Ｅ」）（以上、すべて5'末端FITC化）を、それぞれ10 mM Tris-HCl/NaCl 0.3 M /1 mM MgCl₂, pH 8.0に溶解（濃度１００ｎＭ）し、ＮａＣｌを含有する塩強度０．４Ｍの溶液をそれぞれ調製した。

これらを、実施例１で調製したP2-DNA固定化基板（P1P2-DNA-PDPH-PAA基板）に滴下し30分間、35℃でインキュベートして、ハイブリダイゼーションを行った。洗浄後、実施例１と同様のスキャンアレイにてFITCの蛍光を観察した。
図８に蛍光強度のグラフを示す。

この結果、tG-DNA（完全相補鎖DNA）、tC-DNA、tT-DNA、tA-DNA、非相補鎖DNAのそれぞれついて、蛍光強度はそれぞれ65.6 A.U.、36 A.U.、28.1 A.U.、29.9 A.U.、6 A.U.であった。これらをtG-DNAの蛍光強度を用いて規格化すると、それぞれ、100、54.8、42.8、45.5、9.1％となった。
完全相補鎖DNA配列の蛍光強度が最も大きく、他の標的DNAは最大でも54％と定性的に診断するには十分な蛍光強度の差がみられることから、SNPs配列認識能が確認された。

〔実施例５〕
塩強度0.3 M
実施例４において、塩強度を０．３Ｍにした以外は、実施例４と同様にして、ハイブリダイゼーション、洗浄を行った。さらに、実施例４と同様にして蛍光強度を測定した。
図９に蛍光強度のグラフを示す。

その結果、tG-DNA（完全相補鎖（図９中「Ａ」））、tC-DNA（図９中「Ｂ」）、tT-DNA（図９中「Ｃ」）、tA-DNA（図９中「Ｄ」）、非相補鎖DNA（図９中「Ｅ」）の蛍光強度は、それぞれ、61.3 A.U.、9.4 A.U.、5.8 A.U.、3.6 A.U.、7.1 A.U.であった。これらをｔG-DNAの蛍光強度を用いて規格化すると、それぞれ、100、15.3、9.4、5.9、11.5 %となった。
完全相補鎖DNA配列の蛍光強度が最も大きいこと、他の標的DNAは最大でも9.4％と定性的に診断するには十分な蛍光強度の差がみられる。
塩強度を下げたことでポリマー上のアニオン性官能基のマイナス電荷が上がることで、より厳密にSNPs配列の差異を認識、排除したものと推察される。

図１は、本発明のＤＮＡチップの一例を示す模式図であり、図１−（１）は短鎖ＤＮＡが固定化されたポリマーが基板に固定化された短鎖ＤＮＡ固定化基板の例を示し、図１−（２）は本発明のＤＮＡチップを示し、図１−（３）は本発明のＤＮＡチップに標的ＤＮＡをハイブリダイズした例を示す。図２は、ＤＮＡ末端をヒドラジド化する反応スキームの例を示す図である。図３は、短鎖ＤＮＡおよび基板結合基を誘導する化合物をポリマーに導入する反応スキームの例を示す図である。図４は、短鎖ＤＮＡおよび基板結合基を有するポリマーにおける吸光度と吸光波長との関係を示す図である。溶媒としてＭＥＳ／ＮａＣｌ（０．５Ｍ）／ジチオセレイトール（ＤＴＴ）（０．７ｍｇ／ｍｌ）を用い、短鎖ＤＮＡおよび基板結合基が結合したポリマーの濃度は０．１２５ｍｇ／ｍｌであった。図５は、短鎖ＤＮＡおよび基板結合基を有するポリマーに、長鎖ＤＮＡをハイブリダイゼーションしたときの蛍光強度（F.I.(A.U.)）と、コントロール（ハイブリダイゼーションしていない前記ポリマー）の蛍光強度（F.I.(A.U.)）とを示す図である。規格化F.I.（％）は長鎖DNAをハイブリダイゼーションしたときの蛍光強度を用いて規格化した場合の、蛍光強度の割合である。図６は、標的ＤＮＡとして、完全相補鎖ＤＮＡ、一塩基置換（ＳＮＰ）配列ＤＮＡおよび非相補鎖ＤＮＡを、３０℃の温度で長鎖ＤＮＡ固定化基板に接触させてハイブリダイゼーションしたときの蛍光強度（F.I.(A.U.)）を示す図である。規格化F.I.（％）は完全相補鎖DNAをハイブリダイゼーションしたときの蛍光強度を用いて規格化した場合の、蛍光強度の割合である。図７は、標的ＤＮＡとして、完全相補鎖ＤＮＡ、一塩基置換（ＳＮＰ）配列ＤＮＡおよび非相補鎖ＤＮＡを、３５℃の温度で長鎖ＤＮＡ固定化基板に接触させてハイブリダイゼーションしたときの蛍光強度（F.I.(A.U.)）を示す図である。規格化F.I.（％）は完全相補鎖DNAをハイブリダイゼーションしたときの蛍光強度を用いて規格化した場合の、蛍光強度の割合である。図８は、標的ＤＮＡとして、完全相補鎖ＤＮＡ(A)、一塩基置換（ＳＮＰ）配列ＤＮＡ（tC-DNA、tT-DNA、tA-DNA）（B,C,D）および非相補鎖ＤＮＡ(E)を、塩強度０．４Ｍの濃度で長鎖ＤＮＡ固定化基板に接触させてハイブリダイゼーションしたときの蛍光強度（F.I.(A.U.)）を示す図である。規格化F.I.（％）は完全相補鎖DNAをハイブリダイゼーションしたときの蛍光強度を用いて規格化した場合の、蛍光強度の割合である。図９は、標的ＤＮＡとして、完全相補鎖ＤＮＡ(A)、一塩基置換（ＳＮＰ）配列ＤＮＡ（tC-DNA、tT-DNA、tA-DNA）（B,C,D）および非相補鎖ＤＮＡ(E)を、塩強度０．３Ｍの濃度で長鎖ＤＮＡ固定化基板に接触させてハイブリダイゼーションしたときの蛍光強度（F.I.(A.U.)）を示す図である。規格化F.I.（％）は完全相補鎖DNAをハイブリダイゼーションしたときの蛍光強度を用いて規格化した場合の、蛍光強度の割合である。

符号の説明

１ＤＮＡチップ
２短鎖ＤＮＡ
３長鎖ＤＮＡ
４ポリマー
５基板結合基
６基板
７プローブＤＮＡ
８リンカーＤＮＡ
９ＤＮＡ鎖
１０標的ＤＮＡ

Claims

基板表面に、ポリマーを介してＤＮＡ鎖が固定されたＤＮＡチップであって、該ＤＮＡ鎖は１本鎖のプローブＤＮＡ部分と２本鎖のリンカーＤＮＡ部分とからなり、
前記ＤＮＡ鎖は前記リンカーＤＮＡ部分側で前記ポリマーと結合し、前記ポリマーは基板結合基を介して前記基板の少なくとも１つの表面に固定されていることを特徴とするＤＮＡチップ。
前記リンカーＤＮＡ部分が、共有結合によりポリマーに結合していることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡチップ。
前記リンカーＤＮＡ部分の塩基対数が、１０以上１５０以下であることを特徴とする請求項１または２に記載のＤＮＡチップ。
前記ポリマーが、疎水性の構成単位からなるポリマー主鎖を有することを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡチップ。
前記ポリマーが、官能基を有することを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載のＤＮＡチップ。
前記官能基が、アニオン性官能基を含むことを特徴とする請求項５に記載のＤＮＡチップ。
官能基の合計数に対して、アニオン性官能基が５０％以上含まれることを特徴とする請求項６に記載のＤＮＡチップ。
前記ポリマーが、前記基板結合基中の硫黄原子を介して基板に被覆されていることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のＤＮＡチップ。
下記の工程からなる、標的ＤＮＡの検出方法：
（１）請求項１〜８のいずれかに記載のＤＮＡチップ表面のポリマーが結合されている表面に、標的ＤＮＡを接触させる工程（工程１）、
（２）プローブＤＮＡ部分にハイブリダイズした標的ＤＮＡを検出する工程（工程２）。
前記工程１において、ＤＮＡチップ中のポリマーがアニオン性官能基を有し、標的ＤＮＡの接触を塩基性水溶液下で行うことを特徴とする請求項９に記載の方法。
前記工程１を、塩強度が１Ｍ以下で行うことを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
前記工程１を、２５〜５０℃の温度範囲で行うことを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の方法。