JP2008541751A - 目的の生体分子、特に核酸を含む生体試料を標識又は処理する方法 - Google Patents

目的の生体分子、特に核酸を含む生体試料を標識又は処理する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】目的の生体分子、特に核酸を含む生体試料を標識又は処理する方法の提供。
【解決手段】本発明は、生体試料に含まれる目的の生体分子を標識する方法であって、
以下:
a)反応容器を提供する工程、
b)目的の生体分子の標識を結合し得る捕捉分子を、容器の固体支持体に固定化する工程、
c)生体試料、及び、目的の生体分子の少なくとも1つの標識、及び、必要に応じて、目的の分子の標識又は予備標識に必要とされる任意の成分を、当該容器に導入する工程、
d)反応容器の内容物をインキュベートし、かつ、目的の分子と反応しなかった標識を捕捉分子への結合によって固定化する工程、及び
e)標識された目的の分子を次の工程に用いる工程:
を含むことを特徴とする方法に関する。
生体試料を処理する方法についても開示される。当該発明は、手動又は自動式の核酸精製方法において使用されるのが好ましい。
【選択図】図3

Description

本発明は、標識された、目的の核酸、合成又は天然のリボ核酸(RNA)又はデオキシリボ核酸(DNA)を含む生体試料を精製するための新規な方法に関する。
用語「合成RNA又はDNA」は、増幅技術(PCR法、必要に応じて、続けて転写を行う)又は転写増幅技術(TMA又はNASBA)などの、人間が開発した技術により得られるRNA又はRNAを意味するものとする。用語「天然RNA又はDNA」は、例えば、メッセンジャーRNA、リボソームRNA、転移RNA又はゲノムDNAなどの、細胞の抽出により得られるRNA又はDNAを意味するものとする。
先行技術では、そのようなヌクレオチド、オリゴヌクレオチド又は核酸を標識するための多くの方法が存在することが示されている。オリゴヌクレオチド及び核酸は全て、以下でポリヌクレオチドと称する。標識化は、合成中か、又は、少なくとも1つの標識ヌクレオチドの取り込みによるかのいずれかにより、実施することができる。
第1の方法は、塩基が天然又は改変されたもののいずれかにかかわらず、標識を塩基に付けることを含む。提案される第2の方法は、糖が天然か又は改変されたものかのいずれかにかかわらず、同様に標識を糖に付けることである。第3の方法は、標識をリン酸塩に結合することを目的とする。
塩基への標識は、特に、直接的に標識されたヌクレオチドの取り込みにより核酸を標識するアプローチに用いられてきた。
糖への標識は、しばしば、化学合成により調製された核酸プローブの場合に用いられる。
リン酸への標識もまた、オリゴヌクレオチドの化学合成の間に官能基化アーム及び標識を導入するために用いられてきた。
実際に、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ又はポリヌクレオチドの標識を行うべき当業者は、この付着を塩基又は糖について実施する傾向があり、このことにより、当業者にとっては非常に便利となり、また、当業者は多くの代替物を得る。さらに、これは、多くの文献、例えば、塩基については、特許文献1〜9を、糖については、特許文献10を研究して得られたものである。
標識のリン酸塩への結合は、塩基又は糖を官能基化することからなる技術よりも複雑な技術であり、特にリン酸塩の反応性が低いために、広くは用いられていない(例えば、非特許文献1を参照されたい)。同様に、非特許文献2は、プローブをオリゴヌクレオチド断片に導入する方法に関するが、ヌクレオチド間のホスホジエステルの効果的なアルキル化は不可能であると考えられる。
本出願人は、標識収量の点から効率的である新規な試薬に基づく標識技術を既に開発しているが、これは標識位置の点から、具体的には、水素結合による二重らせんの形成に関与する塩基のハイブリダイゼーション特性に影響しないという点から、特異的であり、DNA及びRNAの両方に用いることができ、最終的に、天然ポリヌクレオチド又は酵素増幅により調製されたポリヌクレオチドの区別なく標識することができる。
従って、特許文献11は、上記条件を満たし、かつジアゾメチル官能基を標識のための反応性官能基として用いる多数の標識を記載する。ジアゾメチル官能基(式−C(N)−)は既にリン酸基のアルキル化に用いられてきたが、かなり多くの問題が生じる。第一に、ジアゾ誘導体は、通常、それ自身が不安定であるため、標識キットにおけるこれらの標識試薬の使用には問題がある。第2に、カップリング生成物は不安定であるが、このことは、標識産物の官能基が任意の試料中の標的生体分子の存在を明らかにする場合には、全く容認できるものではない。最後に、ジアゾメチル官能基を有する誘導体は水不溶性であり、その結果、水又は水性緩衝液中でのみ可溶性かつ安定な生体分子とカップリングするための2相条件で使用される。しかし、これらの条件は反応速度を遅くするので、カップリング効率に不利である。特許文献12に記載された本発明の新規な標識試薬もまた、これらの技術的課題を解決する。1つの実施形態によれば、温度安定性標識試薬は、以下の式を有する。
Figure 2008541751
式中、
・Rは、H、あるいはアルキル、アリール又は置換アリール基を表し、
・Rは、検出可能な標識又は少なくとも1つの多量体構造で互いに結合した少なくとも2つの検出可能な標識を表し、
・Lは、少なくとも2つの共有結合の直線系を含むリンカーアームであり、かつ、nは、0又は1に等しい整数であり、
・R及びRは、互いに独立して、H、NO、Cl、Br、F、I、R−(L)−Y−X−、OR、SR、NR、R、NHCOR、CONHR、COOR(Rはアルキル又はアリールである)を表し、
・Aは、ジアゾ官能基の芳香環との共役を可能にする少なくとも1つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、uは、0から2の間の整数、好ましくは0又は1であり、かつ、
・−Y−X−は、−CONH−、−NHCO−、−CHO−、−CHS−を表す。
本出願人により出願されたさらなる特許文献13では、これらのジアゾ官能化系分子がさらに改善されたが、なお温度安定性であり、かつ、以下の式を有する。
Figure 2008541751
式中、
・Rは、H、あるいはアルキル、アリール又は置換アリール基を表し、
・Rは、検出可能な標識又は少なくとも1つの多量体構造で互いに結合した少なくとも2つの検出可能な標識を表し、
・Lは、少なくとも2つの共有結合の直線系を含むリンカーアームであり、かつ、nは、0又は1に等しい整数であり、
・R及びRは、互いに独立して、H、NO、Cl、Br、F、I、R−(L)−Y−X−、OR、SR、NR、R、NHCOR、CONHR、COOR、−CO−NH−(CH−(O−CH−CH−CH−NH−R、−CO−NH−(CH−(O−CH−CH−CH−NH−R(式中、Rはアルキル又はアリールである)であり、
・Aは、ジアゾ官能基の芳香環との共役を可能にする少なくとも1つの共有二重結合を含むリンカーアームであり、uは、0から2の間の整数、好ましくは0又は1であり、
・−Y−X−は、−CONH−、−NHCO−、−CHO−、−CHS−を表し、
・−Z−は、−NH−、−NHCO−、−CONH−又はO−であり、
・mは、1から10の間の整数、好ましくは1から3の間の整数であり、かつ、
・pは、1から10の間の整数、好ましくは1から3の間の整数である。
さらに、この標識化をより効率的にするため、天然又は合成ポリヌクレオチドは断片化されることもまた有利である。これらの核酸のサイズを縮小させることにより、標識がより利用しやすくなる。核酸の断片化については、多くの方法が先行技術に記載されている。第一に、断片化は酵素的であり得る。すなわち、核酸の断片化を、ヌクレアーゼ(DNA分解酵素又はRNA分解酵素)を用いて行うことができる。次いで、3’−OH末端、5’−OH末端、3’−リン酸塩末端又は5’−リン酸塩末端を有する小さい断片を生成する。
第二に、断片化は化学的であり得る。例えば、DNAの場合、当該DNA上で脱プリン化又は脱ピリミジン化が行われ得、これは次いで、「β−除去」と呼ばれる機構により塩基の存在下で断片化され得る。DNAの断片化を、とりわけ、酸化、アルキル化、フリーラジカルの添加の機構により行うことができる。
RNA又はDNAを断片化するため、本出願人の特許である特許文献14及び15にそれぞれ記載されるように、化学的触媒として用いられる有機分子、例えばイミダゾールと結合することの多い金属カチオンが用いられる。この断片化は、好ましくは、アルカリ性媒体中で行われ、3’−リン酸塩末端を有する断片を生成する。この場合、標識の結合は、切断の間に遊離した核酸断片のリン酸塩のみで起こる。特異性はなく、断片化を、任意の型の核酸でランダムに行うことが可能である。事実、本発明者らの方法は、例えば、検出プローブを調製することができる。最後に、リン酸塩は、単に核酸と標識との間のリンカーアームにすぎない。
用語「検出可能な標識」は、検出可能なシグナルを直接的に又は間接的に生成できる、少なくとも1つの標識を意味するものとする。これらの標識の非限定的なリストは以下のとおりである:
・例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスフェート、β−ガラクトシダーゼ又はグルコース−6−ホスフェート脱水素酵素など、比色分析、蛍光又は発光により、検出可能なシグナルを生成する酵素、
・蛍光性、発光性又は色素化合物などの発色団、
・電子顕微鏡により、あるいは誘電率、アンペロメトリー、ボルタンメトリー又はインピーダンスなどの自身の電気的性質により検出され得る高電子密度の基、
・検出可能な基(例えば、その分子は、それらの物理的及び/又は化学的特徴の検出可能な修飾を誘発するのに十分なサイズのものであり、この検出は、回折、表面プラズモン共鳴、表面変動又は接触角変動などの光学的方法、あるいは原子間力分光法又はトンネル効果などの物理的方法により行われ得る)。
32P、35S又は125Iなどの放射性分子。
好ましくは、標識は、これらの標識に関する安全性の問題を回避するために、放射性標識ではない。
例えば、標識は、フルオレセイン、ダンシル、IR型発色団(Li−COR社、米国ネブラスカ州リンカーン)などの立体障害が低い蛍光化合物、Cy5及びCy3(非特許文献3)などのシアニン誘導体、ならびに特にCy5誘導体などであり得、トレーサーは、ビオチン又はアビエタン誘導体などの立体障害が低いハプテンである(特許文献16を参照のこと)。用語「低い立体障害」は、2000g/mol未満(例えば、1064g/molの分子量を有するbis−bioPDAM)の分子量を意味するものとする。フルオロフォアの場合は、励起波長が450nmよりも長い、好ましくは600nmよりも長いフルオロフォアを用いて研究することが好ましい。
トレーサーが、例えば、ビオチンなどのそれ自身がシグナルを生成しないハプテンである場合、検出は、上記の抗リガンド標識を認識することにより行われる。フルオレセインなどの蛍光化合物に結合したビオチン、ストレプトアビジン又は抗ビオチン抗体の場合、Cy5又はフィコエリスリンが用いられる。アビエタンの場合、特許文献16に記載のモノクローナル抗体が用いられる。
これは標識前駆物質と呼ばれるものである。用語「標識前駆物質」は、ジアゾメチル官能基以外の少なくとも1つの必要に応じて保護された反応性官能基を有しかつ当該官能基と適合性を有する化合物を意味するものとし、これにより、引き続いて(すなわち、上記方法のいずれかの工程の後に、特にMnOでの酸化工程の後に)標識を付けることが可能になる。特に、標識前駆物質は、上記化学式に記載されたリンカーアームLを構成し得る。標識前駆物質を用いる方法の例はシグナル増幅のケースと関連する場合が多いが、当業者に周知の多様な保護基を用いて他の改変も可能である。
例えば、抗リガンドと反応し得るリガンドなどの間接的システムもまた用いられ得る。
リガンド/抗リガンド対は当業者に周知であり、例えば以下の対の場合が挙げられる:
・ビオチン/ストレプトアビジン、
・ハプテン/抗体、
・抗原/抗体、
・ペプチド/抗体、
・糖/レクチン、
・ポリヌクレオチド/ポリヌクレオチドに相補的な配列。
この場合、結合剤を有するリガンドである。抗リガンドは、前段落に記載した標識により直接的に検出可能であり得るか、又はリガンド/抗リガンドにより単独で検出可能であり得る。
これらの間接的検出システムは、特定の条件下で、例えば、多量体構造を用いることにより、結果としてシグナル増幅を生成し得る。このシグナル増幅技術は、当業者に周知であり、本出願人の先行特許出願である特許文献17及び18、あるいは非特許文献4が参照され得る。
用語「多量体構造」は、化学的又は生物学的シントンの繰り返し単位から構成されるポリマーを意味する。本発明で用いられ得るそのような構造の多くの変異体が公知であり、例えば
・線状ポリマー(特許文献19及び20)、
・分岐鎖ポリマー(特許文献21)、
・粒子(特許文献22)、
・デンドリマー(特許文献23〜25)、
・ポリヌクレオチド、及び
・ポリペプチド
がある。
間接的システムの他の例は、リガンドと抗リガンドとの間の特定の共有結合、例えば、メチルケトン及びアルコキシアミンを用いる。このシステムの例は、特許文献26及び27に記載されている。これらの間接的検出システムは、特定の条件下で、結果としてシグナル増幅を生成し得、ポリマーを用いる化学的増幅の例として、先行特許出願である特許文献28〜30を、又はスタッキングによる化学的増幅の例として、特許文献31を参照し得る。
シグナル増幅の特別な実施では、少なくとも2つの標識が標識試薬上に存在する。
さらに、本発明の標識試薬は、DMF、DMSO、CHCN、THF、DMA(ジメチルアセトアミド)、NMP(N−メチルピロリドン)又はDME(ジメトキシエタン)などの極性かつ水混和性溶媒に可溶性である。
好ましくは、標識試薬は、DMSO又は水に可溶性である。
用語「水混和性溶媒」は、少なくとも5体積%の比率で、水又は塩を含む水性緩衝液と混和性である溶媒を意味するものとする。
用語「生体分子」は、化合物が生物学的興味のある標的分子と反応することを可能にする少なくとも1つの認識部位を有する化合物を意味するものとする。例えば、生体分子としては、核酸、抗原、抗体、ポリペプチド、タンパク質及びハプテンを挙げることができる。
用語「核酸」は、必要に応じて少なくとも1つの修飾ヌクレオチドを含む、一連の少なくとも2つのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、例えば、イノシン、メチル−5−デオキシシチジン、ジメチルアミノ−5−デオキシウリジン、デオキシウリジン、ジアミノ−2,6−プリン、ブロモ−5−デオキシウリジンなどの修飾塩基、又はハイブリダイゼーションを可能にする任意の他の修飾塩基を含む少なくとも1つのヌクレオチドを意味する。このポリヌクレオチドはまた、ヌクレオチド間結合のレベルで修飾され得る(例えば、ホスホロチオエート、H−ホスホン酸塩又はホスホン酸アルキル)か、又は骨格のレベルで修飾され得る(例えば、α−オリゴヌクレオチド(特許文献32)又はPNA(非特許文献5)又は2’−O−アルキルリボヌクレオチド)。核酸は、天然又は合成の、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸断片、リボソームRNA、メッセンジャーRNA、転写RNA又は以下の酵素増幅技術で得られる核酸である:
・特許文献33〜35に記載のPCR(ポリメラーゼ連鎖反応)及びその派生方法であるRT−PCR(逆転写PCR)、特に、特許文献36に記載の1段階方式、
・例えば、特許文献37に開示のLCR(リガーゼ連鎖反応)、
・特許文献38に記載のRCR(修復連鎖反応)、
・特許文献39に記載の3SR(自己保持配列複製)、
・特許文献40に記載のNASBA(核酸配列系増幅)、及び
・特許文献41に記載のTMA(転写媒介増幅)。
従って、用語「アンプリコン」は、酵素増幅技術により産生される核酸を表すのに用いられる。
これらの修飾のそれぞれは、少なくとも1つのリン酸塩が核酸内に存在する限り、組み合わせて用いられ得る。
用語「ハプテン」は、非免疫原性の化合物、すなわち、それら自身は抗体産生による免疫反応を促進し得ないが、公知の条件下で、特にハプテン−タンパク質複合体を用いる免疫化によって、動物を免疫化することにより得られる抗体によって認識され得る、化合物を表す。これらの化合物は、一般に、3000Da未満の分子量、最も一般的には2000Da未満の分子量を有し、かつ、例えば、グリコシル化されたペプチド類、代謝産物、ビタミン、ホルモン、プロスタグランジン、毒素、又は種々の薬物、ヌクレオシド及びヌクレオチドであり得る。
用語「精製工程」は、特に、微生物の核酸と、核酸精製に先立つ溶解工程で遊離した細胞成分とを分離することを意図する。これらの溶解工程は周知であり、指向的な例としては、以下の特許出願に記載の溶解方法が用いられ得る:
−特許文献42(超音波処理による溶解に関する)、
−特許文献43(磁気的及び機械的混合による溶解に関する)、
−特許文献44(電気的溶解に関する)、及び
−特許文献45(機械的溶解に関する)。
当業者は、他の周知の溶解方法、例えば、熱又は浸透圧ショック、あるいは、特に、本出願人に帰属する特許文献46に記載されたグアニジウム塩などのカオトロピック剤での処理を用い得る。
この工程は、一般に、核酸を濃縮することを可能にする。例えば、磁性粒子を用いることが可能であるので(これに関しては、本出願人の特許:特許文献47及び48を参照されたい)、これらの磁性粒子に付着した核酸を洗浄工程により精製することが可能である。この核酸精製工程は、引き続いて当該核酸を増幅することが望まれる場合に、特に有利である。これらの磁性粒子の特に有利な実施形態は、特許文献49及び50に記載される。
本明細書中で用いられる用語「固体支持体」は、例えば、標識反応の間に遊離した、除去することが必要とされるジアゾ、アジンなどの分解又は転位の生成物などの、ジアゾメチル官能基又はそれから誘導される官能基を有する分子を付着し得る全ての物質を含む。必要に応じて化学的に修飾された合成物質又は天然物質を、固体支持体として用いることができる:
・特に、セルロース系物質(例えば、紙、酢酸セルロース及びニトロセルロースなどのセルロース誘導体)、又はデキストランなどの多糖類、
・特に、スチレン型のモノマーに基づく、綿などの天然繊維、及びナイロンなどの合成繊維;シリカ、水晶、ガラス、セラミックなどの無機物;ラテックス;磁性粒子;金属誘導体、ゲルなど。固体支持体は、マイクロタイタープレート、膜、粒子あるいはガラス又はケイ素又は誘導体の実質的に平面のプレートの形態であり得る。これらの支持体はまた、以下に説明するように、ジアゾ官能基又はそれから誘導される官能基と反応し得る、目的のアニオン性基及び/又は酸性基で官能基化され得る。
上記のように、先行技術はまた、そのリン酸塩基に結合することによって核酸を標識するための、つまり、それらを、特に蛍光読み取りにより検出可能にするための、ジアゾ官能基を有する化合物を用いる方法を記載する。この場合、蛍光分子との共有結合又は非共有結合を可能にする蛍光基(フルオレセイン、Cy5)又は基(ビオチン、ハプテン又は反応性官能基型の基)を有するジアゾ化合物が用いられる。
先行技術は、標識プロセスに伴って多数の精製手段を用いる方法を記載する。これらの手段のなかでも、有機相での抽出、濾過及びゲル濾過が挙げられ得る。しかし、参考技術は、特異的ハイブリダイゼーション(DNAチップだけでなく、ELOSAプレート又は迅速試験形態にも関する)において検出させるプロセスにおいて、標識の前又は後に、核酸を精製するため、シリカを粉末型、ゲル又は磁性粒子の形状で用いる。標識前の精製は、標識の収量をかなり改善することを可能にし、標識後の精製は、ハイブリダイゼーション収量を決定的に改善することを可能にするので、試験の感度を良好とするために必要なシグナル/ノイズ比を改善することを可能にする。実際に、標識する間に使用されるが反応はしない過剰な標識は、ハイブリダイゼーションにかなり影響し得る。
シリカ上での精製は、洗浄工程及び固相の溶出工程を必要とする。3つの工程(付着/洗浄/溶出)では液体を移動させる必要があり、このことは汚染及び物質の損失の潜在的な要因であるため、一般に、適度に自動化可能である。さらに、このプロセスは、工程全体にわたって操作者の介入を必要とし、かつ、カオトロピック性(刺激性)塩を使用する必要がある。
要約すると、精製工程を有する全てのこれらの標識方法に必須の課題は、実際に効率的な標識を得るということであり、全ての核酸が標識され得るよう、過剰な標識を用いる必要がある。処理された液状溶液中に標識核酸が存在している場合のみならず、反応しなかった標識が存在する場合についても、当該液状試料を特定の検出工程で引き続いて用いることができないということになる。過剰に存在する標識は、前もって除去することが必要である。必要に応じて磁性材料を含むシリカ粒子に核酸を結合することによって、標識又は非標識の核酸を固定し、かつ望ましくない成分を除去することによってこれを洗浄すれば、上記の除去を行うことができる。既に上述した本出願人の特許である特許文献46は、この型のプロセスを可能にする。しかしこれは、実施者が時間を費やすという点及び材料の点でコストのかかる、更なる工程を生じる。
欧州特許出願公開第0,329,198号 欧州特許出願公開第0,302,175号 欧州特許出願公開第0,097,373号 欧州特許出願公開第0,063,879号 米国特許第5,449,767号 米国特許第5,328,824号 国際公開第93/16094号 独国特許出願公開第3,910,151号 欧州特許出願公開第0,567,841号 欧州特許出願公開第0,286,898号 特許出願国際公開第02/090319号 国際公開第02/090319号 仏国特許出願第04/50600号(2004年3月26日出願)発明の名称「標識試薬、当該試薬の合成方法及び生体分子の検出方法」 米国特許第6,376,179号 特許出願国際公開第01/44507号 特許出願国際公開第00/07982号 仏国特許出願公開第98/10084号 国際公開第95/08000号 欧州特許出願公開第0,561,722号 欧州特許出願公開第0,669,991号 国際公開第01/92361号 欧州特許出願公開第0827552号 米国特許第4,507,466号 米国特許第4,568,737号 米国特許第6,083,708号 特許出願国際公開第00/40590号 特許出願国際公開第98/05766号 国際公開第00/07982号 国際公開第01/92361号 国際公開第95/08000号 特許国際公開01/44506号 仏国特許出願公開第2607507号 米国特許第4,683,195号 米国特許第4,683,202号 米国特許第4,800,159号 欧州特許第0,569,272号 欧州特許出願公開第0,201,184号 特許出願国際公開第90/01069号 特許出願国際公開第90/06995号 特許出願国際公開第91/02818号 米国特許第5,399,491号 国際公開第00/60049号 国際公開第00/05338号 国際公開第99/53304号 国際公開第99/15621号 米国特許出願第5,234,809号 米国特許第4,672,040号 米国特許第5,750,338号 特許出願国際公開第97/45202号 特許出願国際公開第99/35500号 Jencks W.P.ら,J.Amer.Chem Soc.,82,1778−1785,1960 O’Donnel及びMcLaughlinによる概説 "Bioorganic Chemistry:Nucleic Acids",Ed Hecht S.M.,Oxford University Press,1996の、"Reporter groups for the analysis of nucleic acid structure",p216−243 Randolph J.B.ら,Nucleic Acid Res.,25(14),p2923−2929,1997 論文J.Histochem.Cytochem.45:481−491,1997 M.Egholmら,J.Am.Chem.Soc.,114,1895−1897,1992
従って、本発明は、標識が目的の核酸に優先的に結合できるように、かつ、そのような結合が生じなかった場合には、洗浄相を要さずに固相上で標識を捕捉することが必要に応じてできるように、標識又は標識前駆物質の化学的特徴を用いることから構成される。さらに、刺激性のカオトロピック剤が、精製プロセスに必要とされない。同様に、本発明の方法は、液体を固相に通すことを意図したポンプ又は遠心分離型の追加のシステムを必要としない。上記プロセスは、精製相が(磁性又は非磁性の)粒子から構成される場合、磁化又は濾過システムを必要とする場合がある;しかし、この装置は必須ではなく、完全受動的なプロセス(標識媒体の固相への通過)が用いられ得る。最終的に、本方法は、固相であること及び単純であること(接触、インキュベーション、ハイブリダイゼーションへの移行)から、容易に自動化され得る。本方法は、連続的フローを使用していて、チップ上でのハイブリダイゼーションを用いる核酸の精製用の自動装置(「Lab−on−Card」型の装置、又は、一本のチューブ中に完全に統合された装置)への統合を単純化できるシステム、で使用できる。このことは、汚染危険性が下がるであろうこと、及び、消費性物質の使用数が減るであろうことを意味する。
この効果のために、第1の実施形態では、本発明は、生体試料に含まれる目的の生体分子を標識する方法であって、以下:
a)反応容器を提供する工程、
b)目的の生体分子の標識又は標識前駆物質を結合し得る捕捉分子を、容器又はこの容器に導入された固体支持体の内部表面の全部又は一部に固定化する工程、
c)生体試料、及び以下のものを、当該反応容器に導入する工程、
1)目的の生体分子の少なくとも1つの標識又は標識前駆物質、及び
2)必要に応じて、目的の生体分子を標識するのに、又は予備標識するのに必要とされる任意の成分、
d)反応容器の内容物をインキュベートする工程、
e)目的の生体分子と反応しなかった標識又は標識前駆物質を、捕捉分子への結合によって固定化する工程、及び
f)標識された目的の生体分子(すなわち、当該標識又は標識前駆物質と反応するもの)を次の工程に用いる工程
を含む、方法に関する。
第2の実施形態によれば、本発明はまた、目的の生体分子、及び、目的の生体分子の少なくとも1つの標識又は標識前駆物質の混合物を含む生体試料を、必要に応じて、目的の生体分子を標識するのに必要とされる任意の成分と併用したものを、処理する方法にも関し、当該方法は、以下を含む:
a)反応容器を提供する工程、
b)目的の生体分子の標識又は標識前駆物質を結合し得る捕捉分子を、容器又はこの容器に導入された固体支持体の内部表面の全部又は一部に固定化する工程、
c)生体試料を、当該反応容器に導入する工程、
d)反応容器の内容物をインキュベートする工程、
e)目的の生体分子と反応しなかった標識又は標識前駆物質を、捕捉分子への結合によって固定化する工程、及び
f)標識された目的の生体分子(すなわち、当該標識又は標識前駆物質と反応するもの)を次の工程に用いる工程。
上記の2つの状況において、かつ、好ましい実施形態によれば、目的の生体分子と反応しない標識又は標識前駆物質の捕捉分子への結合は、共有結合により起こる。
特定の実施形態において、かつ、上記工程a)の前には、生体試料を、以下の工程の少なくとも1つに従って処理する:
・上流の他の反応容器からの移動、
・目的の生体分子を利用可能及び/又は検出可能にするための複合体生体物質の溶解、
・目的の生体分子の捕捉又は単離、及び/又は
・目的の生体分子の検出を可能にするか、又はそれらの検出を増強するための、当該目的の生体分子の処理;この処理は、例えば、熱処理からなり得る。
別の特定の実施形態において、上記工程f)の後に、以下の少なくとも1つの次の工程を行う:
・下流の他の反応容器への移動、
・予備標識された目的の生体分子の標識、
・標識された又は予備標識された目的の生体分子の精製、及び/又は
・捕捉プローブにハイブリダイズした、標識された目的の生体分子の検出。
目的の生体分子の検出は、例えば、均一相中で、検出分子(例えば、核酸プローブ)を用いるハイブリダイゼーションを伴って又は伴わずに、有利に実施され得る。
全ての上記の状況において、容器又はこの容器に導入された固体支持体の内部表面は、アニオン性官能基及び/又は酸官能基を有することが可能であり、かつ、標識又は標識前駆物質は、ジアゾ官能基(−N=N)を含むことが可能である。
後者の実施形態では、容器又はこの容器に導入された固体支持体の内部表面が有する官能基は、カルボン酸官能基及び/又はスルホン酸官能基からなる。
全てのこれらの状況において、目的の生体分子は、核酸及び/又は核酸断片からなる。
後者の実施形態では、核酸及び/又は核酸断片は、DNA、RNA、DNA−RNAキメラポリマーからなり、これは、必要に応じて、少なくとも1つのヌクレオチドチオホスフェート、LNA、2’−O−Me及び/又はメチルホスホン酸塩誘導体を含み得る。
目的の生体分子が核酸又は核酸断片である実施形態では、上記で定義した工程a)の前に、生体試料を、少なくとも1つの以下の工程に従って処理する:
・上流の他の反応容器からの移動、
・核酸を利用可能にするための、生体試料に含まれる複合体生体物質の溶解、
・複合体生体物質からの核酸の抽出、
・目的の核酸の特異的増幅、
・当該目的の核酸又はアンプリコンの断片化、及び/又は
・いかなる注目すべき増幅現象もなく、目的の核酸を転写又は逆転写すること。
なお同様の状況では、上記で定義した工程f)の後に、以下の少なくとも1つの次の工程を行う:
・下流の他の反応容器への移動;
・予備標識された核酸の標識;
・標識された又は予備標識された核酸の精製、
・捕捉プローブにハイブリダイズした標識された又は予備標識された核酸の検出;
・いかなる著しい増幅現象もなく、目的の核酸を転写又は逆転写すること;及び/又は
・検出プローブを用いるか又は用いることなく、標識された又は予備標識された核酸を均一相検出すること。
本発明の他の実施形態によれば、捕捉分子は、標識に対して過剰に存在し、かつ、標識は、標識される目的の生体分子に対して過剰に存在する。
より詳細には、捕捉分子は、核酸と反応しない遊離の標識に対して過剰に存在し、かつ、標識は、標識される核酸に対して過剰に存在する。
目的の核酸の検出及び/又は定量及び/又は精製を可能にするために、標識された核酸は、反応条件によって、特に温度又は反応媒体の塩分の条件によって、特異的にハイブリダイズできるよう標的に対して十分に相補性のある複合体を形成し得る。
さらに、反応しなかった標識、すなわち遊離の標識は、それらの反応性官能基を完全な形で保持するため、相補的反応性官能基を有する捕捉分子と引き続いて反応し得るが、この反応は特異的ではない。従って、反応性官能基及び相補的反応性官能基は、共有結合を形成し、それによって遊離の標識の固定化を可能にするので、生体試料は、核酸に関連する標識のみを含む。
添付の図面は、本発明の精製方法の多様な工程を示す。それらは、特定の実施形態を示すが、本発明の範囲を限定するとは考えられ得ない。
図1は、反応容器の横断面における図を表し、ここで、精製方法が実施される。この容器は、上部蓋及び下部本体を含み、当該本体は、本発明の方法が実施され得るスペースを作るように中空になっている。このスペースは、処理すべき生体試料を入れることのできる供給チャネルを左側に有し、かつ、処理された生体試料を排出できる排出チャネルを右側に備える。容器の内部スペースは、処理又は被覆されて、カルボン酸反応性官能基を有する捕捉分子を呈する。蓋の内部スペースについても、処理されていてよい。
上述したように、供給チャネルは、とりわけ、ジアゾ官能基を有する核酸及び標識を含む液体生体試料を矢印の方向に導入することを可能にする。この図で示される場合には、核酸はまだ標識されていないが、それらを前もって標識と接触させることもまた可能である。
図2は、図1と同一の図を表し、ここで、生体試料は、標識核酸及び遊離の標識(すなわち、核酸と反応していない標識)を含む反応容器の内部スペースに存在する。標識が核酸に対して過剰に存在するため、全てのこれらの核酸が標識される一方、多数の遊離の標識が存在する。
図3も図1及び2と同一であるが、着目すべきは、一定の期間後、すなわち通常はbis−BioPDAMの場合、少なくとも10分間程度かつ1時間未満にわたって、遊離の標識が、容器の内部スペースに存在するカルボン酸反応性官能基に優先的に結合する。用語「優先的に」は、遊離の標識が捕捉されて阻害濃度未満(2mM未満)となることを意図する。これらの反応性官能基が、核酸と反応しなかった遊離の標識に対して過剰に存在することはかなり明らかである。
図4も図1〜3と同一である。上記のように、出口チャネルは、とりわけ、標識核酸を含むが遊離の標識は含まない処理された液体生体試料が、図の右側の矢印の方向に放出されることを可能にする。
図5は、N,N’−ビス(13−ビオチノイルアミノ−4,7,10−トリオキサトリデシル)−5−(ジアゾメチル)イソフタルアミド分子の構造式を示すが、文章の理解を容易にするため、これを以下で「bis−BioPDAM」ともいう。
最後に、図6は、N,N’−ビス(13−ビオチノイルアミノ−4,7,10−トリオキサトリデシル)−5−(ジメトキシメチル)イソフタルアミド分子の構造式を示すが、文章の理解を容易にするため、これを以下で「アセタール」ともいう。
実施例1:RT−PCR増幅産物のカルボン酸粒子の標識化及び精製、その後のDNAチップ(Affymetrix社,カリフォルニア州サンタクララ)上での分析
本実施例では、遊離の標識の結合は固体支持体上では直接起こらないが、標識の磁性粒子との反応性を試験することにより、本発明の概念の有効性を制御することができる。
A − B型インフルエンザのPCR:
この実験は、「B型インフルエンザ」モデルで実施される。
この名称は、B型インフルエンザウイルスRNA遺伝子の断片の190塩基の配列からRT−PCRにより生成したアンプリコンを意味する。
試料の調製の条件、ウイルスRNA抽出、当該ウイルスRNAの増幅及びプライマーの配列は、論文“Effectiveness of Reverse Transcription−PCR,Virus Isolation,and Enzyme−linked Immunosorbent Assay for diagnosis of Influenza A Virus Infection in different Age Groups”,Steininger C.ら,J.Clin.microbiol.,(2002):40(6),2051−2056に記載されている。
RT−PCRは、ウイルスRNA(一回増幅あたり10コピー)の調製物を開始テンプレートとして用い、Titan One Tube RT−PCRシステムキット(Roche Diagnostic Corporation社、スイス国バーゼル、参照番号:11 855 476 001)を用い、0.2mMの各デオキシリボヌクレオチド、0.3μMのプライマー及び0.4μlの酵素を用いて行う。
RT−PCRサイクルのパラメータは、以下のとおりである:逆転写反応を実行するために60℃で30分間、40サイクルは以下のプロトコルに従う:94℃で20秒、次いで50℃で30秒、最後に72℃で30秒、次いでサーモサイクラーが停止するまで4℃とする。
上述するRT−PCRに由来するアンプリコンを、以下で、用語「PCR B型インフルエンザ」と称する。
B − 均一相標識(参照プロトコル):
均一相の標識を参照、すなわち、本発明に対する「コントロール」技術として用いる。
プロトコルは、DNAの十分な標識を可能にするが、閾値を超えると遊離の標識がハイブリダイゼーションに影響するその閾値未満である標識の最終濃度(2mM)を用いて開発された。
5μlの容積のPCR B型インフルエンザを、5μlの化合物N,N’−ビス(13−ビオチノイルアミノ−4,7,10−トリオキサトリデシル)−5−(ジアゾメチル)イソフタルアミド(以下で「bis−BioPDAM」と称する、図5参照)と混合し、ジメチルスルホキシド(以下で「DMSO」と称する)及び5μlの水中で6mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。
反応媒体を、引き続いて、供給者のプロトコルを用いて、ハイブリダイゼーション工程用のDNAチップ(Affymetrix社,カリフォルニア州サンタクララ)と接触させる。用いられるDNAチップは、RT−PCRの間に増幅された領域の分析のために設計される。ハイブリダイゼーションプロトコルの説明及び結果の分析に用いられた技術の説明は、A.Troeschら:“Micobacterium species identification and rifampin resistance testing with high−density DNA probe arrays”J.Clin.Microbiol.(1999),37,49−55により説明されている。
標識及びハイブリダイゼーション後のDNAチップの表面で発光する蛍光、ならびにシグナル強度及び相同性%に関するデータの生成は、読み取りシステムにより、ならびにGenechip(登録商標)Instrument System及びGenechip(登録商標)Information System(Affymetrix社,カリフォルニア州サンタクララ)より入手したソフトウェアを用いて行われる。
読み取りシステムは、RFU(相対蛍光単位)で表されるシグナル及びバックグラウンドノイズ強度を提供する。相同性%は、参照配列に対して得られる(配列決定により得られる増幅標的配列に対応する)。
シグナル(I)、バックグラウンドノイズ(B)及び相同性%(%相同性)の中間強度に関する結果を、結果の表に示す。
95%を超える結果が一般に求められるが、90%を超える相同性%は、概して満足な結果であると考えられる。高い強度と低いバックグラウンドノイズ(高いI/B比)は、セットアップで求められる第二の結果である。
C − 阻害標識濃度(コントロール)での均一相標識:
この実験では、bis−BioPDAM標識の最終濃度をより高くする(5mM)。この濃度は、精製をしない場合のハイブリダイゼーションに影響するが、この同じ反応媒体が効率的に精製されるとき、より大きなシグナルを得ることが可能になる(より高い標識収量による)。
5μlの容積のPCR B型インフルエンザを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び5μlの水中で15mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。
反応媒体を、引き続いて、上記段落Bに記載したプロトコルに従って、ハイブリダイゼーション及び検出用チップと接触させる。
D − シリカ膜精製を用いる均一相標識(コントロール):
この実験では、QIAgen社(ドイツ国ヒルデン)により販売されている、シリカ膜含有核酸精製カラムを用いた。この技術は、参照方法を構成する。この場合、標識プロトコルはbis−BioPDAMの最終濃度をより高くして(5mM)行ったが、この標識濃度は、効率的な精製をしていない場合のチップ上でのハイブリダイゼーションに影響する。
5μlの容積のPCR B型インフルエンザを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び5μlの水中で15mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。
反応媒体を、引き続いて、QIAQuickキット(QIAgen社、ドイツ国ヒルデン、参照番号:28 306)を用い、供給者が推奨するプロトコルを用いて精製し、次いで、上記段落Bに既に記載したプロトコルに従って、ハイブリダイゼーション用DNAチップと接触させる。
E − カルボン酸粒子上での精製を用いる均一相標識(本発明):
この実験では、bis−BioPDAM(5mM)の最終濃度をより高くして得られた標識産物を、カルボン酸固相を用いて精製する(本発明)。5mMの標識濃度は、効率的な精製工程を実施しない場合のハイブリダイゼーションに影響する。従って、これは、精製の有効性の研究のために選択された濃度である。
5μlの容積のPCR B型インフルエンザを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び5μlの水中で15mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。
反応媒体を、引き続いて、2.5mgのStandard Carboxyl−Adembeads(参照番号:0213、Ademtech社、フランス国ペサック、以下で「カルボン酸粒子」と称する)を用いて、室温で10分間インキュベートし、粒子を、引き続いて、反応媒体の磁化により分離し、後者を、段落Bで上述したプロトコルに従って、ハイブリダイゼーション工程用のDNAチップと接触させる。
F − 結果及び考察:
相同性%、シグナル(I)及びバックグラウンドノイズ(B)に関する結果を、以下の表1に示す:
Figure 2008541751
表1:シリカ膜上での精製あり又は精製なしで、コントロールと比較した、本発明を用いる方法の比較研究
結果を、相同性%、シグナル(I)及びバックグラウンドノイズ(B)としても表す。
結論として、参照方法を用いて得られた結果は、シリカ膜精製を用いて得られた結果と実質的に同一であった。さらに、「カルボン酸精製」を用いて得られた結果は、精製なしで又はシリカ膜精製を実施して得られた結果よりも、強度(I)がより良好であることが観察される。チップ上でのシグナルの上昇は、バックグラウンドノイズ(例えば、チップ上にみられる粉塵、沈殿物)に局所的に影響を与える要因に依存することが少ない、より良好な試験を可能にする。さらに、精製プロトコルを実施する際の容易度は、操作手順を大いに容易にするであろう。
実施例2:標識の非反応性等価物で汚染された標識RT−PCR増幅産物の、カルボン酸粒子上での標識及び精製
この実施例は、固体支持体と標識分子との間に形成される結合が、実際には標識の共有結合での捕捉の結果であり、当該支持体上への標識の吸着の結果ではないことを実証する。
A − 目的
この実験では、精製した標識産物は、bis−BioPDAMの合成中間体であるN,N’−ビス(13−ビオチノイルアミノ−4,7,10−トリオキサトリデシル)−5−(ジメトキシメチル)イソフタルアミド(本明細書中の以下で、「アセタール」と称する)で汚染されている(図6)。この反応物は、ジアゾメチル官能基を有しないので、カルボン酸官能基と反応し得ない。
一方、これは、bis−BioPDAMの全体構造を有するので、観察される精製現象が、特異的結合を含む現象ではなく非特異的吸着現象である場合、bis−BioPDAMと同様の様式で表面に吸着し得る。
アセタールは、bis−BioPDAMと同じようにして核酸のハイブリダイゼーションに影響を与え、それによってその除去の質を判断できる。
B − 実験
5μlの容積のPCR B型インフルエンザを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び5μlの水中で15mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。反応媒体を、引き続いて、QIAQuickキット(QIAgen社、ドイツ国ヒルデン、参照番号:28 306)を用い、供給者のプロトコルを用いて精製する。
コントロールをいくつか実行するために十分な容積の精製産物を得るために、上記の調製を、等分量のRT−PCR増幅試料のいくつかについて同時に行う。当該試料の調製により誘発される変動を除くため、精製産物を混合する。
混合物のシリカ膜精製による精製後に得られる溶出物の容積に対応する15μlの画分を、以下の方法で引き続いて処理する:
a)実施例1/B(参照)に記載したAffymetrixチップ上での直接的ハイブリダイゼーション。
b)実施例1/B(参照)に記載されるAffymetzixチップ上での5mMのアセタールハイブリダイゼーションの添加(アセタールによる阻害についてのコントロール)。
c)実施例1/Eに記載されるカルボン酸粒子の室温での10分間の精製、次いで実施例1/B(参照)に記載されるAffymetrixチップ上でのハイブリダイゼーション(粒子の標識産物への作用についてのコントロール)。
d)5mMのアセタールの添加、及び次いで実施例1/Eに記載のカルボン酸粒子上での室温での10分間の精製、及び実施例1/B(参照)に記載したAffymetrixチップ上でのハイブリダイゼーション(粒子のアセタールへの作用についてのコントロール)。
C − 結果及び考察:
相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)に関する結果を、以下の表2に示す:
Figure 2008541751
表2:カルボン酸官能基と反応し得ない阻害化合物(B及びD)の存在下で、本発明を用いる方法(C及びD)を、本発明を用いない2つのコントロール(A及びB)と比較した比較研究
結果を、相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)として表す。
結論として、アセタール誘導体は、カルボン酸粒子(D)を用いる前処理の有無とは無関係に、核酸のハイブリダイゼーションに影響する(B及びD)。この結果は、カルボン酸官能基との反応の非存在下では、アセタールは反応し得ないことを示す。従って、アセタール化合物の吸着による著しい除去はない。従って、共有結合を生成するジアゾメチル−カルボン酸の反応は、反応媒体の精製に関与する主要な機構であると結論づけられ得る。
実施例3:標識RT−PCR増幅産物の標識及びカルボン酸膜での精製:
A − 目的:
この実験では、最終濃度5mMのbis−BioPDAMを用いて得られた標識産物を、カルボン酸官能基を有する膜(Biodyne C、参照番号S60314、Pall Gelman Sciences社、米国ニューヨーク:以下、Biodyne Cと称する)を用いて精製する。5mMの標識濃度は、効率的な精製工程を実施しない場合に、ハイブリダイゼーションに影響する。従って、これは、精製の効率を研究するために選択された濃度である。
B − 実験
5μlの容積のPCR B型インフルエンザを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び5μlの水中で15mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。この実験を二回行い、次いで、手順プロトコルの変動により起こり得る不利な影響を制限するために、標識産物を混合して、2つの等容積に分ける。反応媒体を、引き続いて、6mMのBiodyne C(b)を用いて室温で10分間インキュベートするか、又は室温で放置し(参照a)、次いで、上記処理したこの媒体を、実施例1/Bに記載のプロトコルに従って、ハイブリダイゼーション用のDNAチップと接触させる。
C − 結果及び考察:
相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)に関する結果を、以下の表3に示す:
Figure 2008541751
表3:本発明を用いる方法(b)を、本発明を用いない参照(a)と比較した比較研究
結果を再び、相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)として表す。
結論として、カルボン酸官能基を有するBiodyne C膜は、磁性粒子を用いる場合と同程度の試料の精製を可能にする。
実施例4:カルボン酸ポリマーを用いる、標識RT−PCR増幅産物の標識及び精製
A − 目的
この実験では、最終濃度5mMのbis−BioPDAMを用いて得た標識産物を、カルボン酸官能基を有するポリマー(ポリアクリル酸ナトリウム塩)標準28’000、参照番号81124、Fluka社,スイス国ブーフス;以下、APAと称する)を用いて精製する。上記したように、5mMの標識濃度は、効率的な精製工程を実施しない場合に、ハイブリダイゼーションに影響する。
B − Myco 16S PCR:
この実験は、「Myco 16S」モデルで行われるが、これは、ヒト型結核菌の16SリボソームRNAをコードする遺伝子の断片の180塩基配列からPCRにより産生するアンプリコンを意味する。
培養の条件、抗酸菌の抽出及び増幅プライマーは、A.Troeschら:“Micobacterium species identification and rifampin resistance testing with high−density DNA probe arrays”J.Clin.Microbiol.(1999),37,49−55に記載されている。
PCRを、ゲノムDNA(PCR一回当たり10コピー)の調製物を開始テンプレートとして用い、FastStart High Fidelity PCR Systemキット(Roche Diagnostic Corporation社、スイス国バーゼル、参照番号:03 553 426 001)を用い、0.2mMの各デオキシリボヌクレオチド、0.3μMのプライマー及び0.4μlの酵素を用いて行う。
PCRサイクルのパラメータは以下のとおりである:95℃で4分間、次いで以下のプロトコルに従って35増幅サイクル:95℃で30秒間、次いで55℃で30秒間、最後に72℃で30秒間。最後に、室温でアンプリコンが分解するのを防ぐため、混合物を、サーモサイクラーが停止するまで4℃で維持する。
上記のPCR由来アンプリコンを含む溶液を、以下で「PCR 16S」と称する。
C − 実験:
5μlの容積のPCR 16Sを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び15μlの水中で2.5mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。この実験を二回行い、次いで、手順プロトコルの変動によって生じ得る不利な影響を制限するために、標識産物を混合し、2つの等容積に分ける。
反応媒体を、引き続いて、室温で10分間インキュベートするか(a)、又は20%のAPAを含む10μlの溶液のペレットと共に真空下で乾燥させ(b)、次いで、実施例1/Bに記載のプロトコルに従って、ハイブリダイゼーション工程用のDNAチップと接触させる。
D − 結果及び考察:
相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)に関する結果を、以下の表4に示す:
Figure 2008541751
表4:本発明を用いる方法(b)を、本発明を用いない参照(a)と比較した比較研究
結論として、カルボン酸官能基を有するポリマーは、試料の精製を、磁性粒子を用いてできる試料の精製と同程度に実施できる。
実施例5:標識の非反応性等価物で汚染された標識RT−PCR増幅産物の、スルホン酸ポリマーを用いる標識及び精製
A − 目的:
この実験では、最終濃度5mMのbis−BioPDAMを用いて得た標識産物を、スルホン酸官能基を有するポリマー(参照番号29 256−7、Sigma−Aldrich社、米国ミシガン州セントルイス、以下、Nafionと称する)を用いて精製する。
B − 実験:
5μlの容積のPCR 16Sを、5μlのbis−BioPDAMと混合し、DMSO及び15μlの水中で2.5mMに希釈し、次いで、80℃で10分間インキュベートする。この実験を二回行い、次いで、手順プロトコルの変動によって生じ得る不利な影響を制限するために、標識産物を混合し、2つの等容積に分ける。
反応媒体を、引き続いて:
・室温で10分間(a)、又は
・真空中で乾燥した、10μlのNafionのペレット(メタノール中5%)(b)
を用いて、インキュベートし、次いで、実施例1/Bに記載のプロトコルに従って、ハイブリダイゼーション工程用のDNAチップと接触させる。
C − 結果及び考察:
相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)に関する結果を、以下の表5に示す:
Figure 2008541751
表5:本発明を用いる方法(b)を、本発明を用いない参照(a)と比較した比較研究
結果を、相同性%、シグナル強度(I)及びバックグラウンドノイズ(B)として表す。
結論として、スルホン酸官能基を有するポリマーは、試料の精製を、磁性粒子を用いてできる試料の精製と同程度に実施できる。
総括:
本発明者らの方法は、標識工程後の過剰な標識を捕捉する目的で、酸(特に、カルボン酸官能基)に対するジアゾメチル官能基の反応性を用いることに基づく。この反応性は、当業者に公知である。例示として、タンパク質をそれらのカルボン酸結合を介して共有結合するのに用いられる4−(ジアゾメチル)フェノキシメチルポリスチレン(参照番号17338、Fluka社,スイス国ブーフス)を挙げることができる。この樹脂は、本出願人により、核酸の捕捉実験の際に用いられた。標識後の精製プロセスにおける固体支持体に関してジアゾメチル官能基の反応性を用いるという思想は、本出願時に知られていない。
反応は、標識工程後のジアゾ官能基の反応性の保存に基づく。この反応性の保存は少しも明らかではない。なぜなら、いくらかの官能基は、最初の標識工程の間に反応媒体中で加水分解した可能性があったからである。核酸と反応しなかった標識の大部分が依然として反応性であり、かつ、固相上への固定化が、試料をハイブリダイゼーションできる十分な収量で実施されるという結果は、驚くべきものである。
ジアゾ官能基のカルボン酸官能基との高い反応性により、室温で、2、3分の限られた時間での反応が可能になる。共有結合に基づくこのアプローチは、同等の技術と比較して画期的である。
標識分子は、固体支持体又は可溶性ポリマー上で共有結合により捕捉されているので、精製後に洗浄する必要がない。洗浄工程をなくしたことは、既存の精製方法と比較して画期的である。
本発明の主題である方法は化学反応に基づいているので、濾過よりも、相排除精製よりも、又は、固体支持体上への吸着よりも、特異的かつ選択的である。吸着による生体試料の損失のリスクが低減される。
最後に、精製支持体は、手動法における管や自動プロトコル用のカード型の部品などの消耗品にも容易に組み込まれ得る。
反応容器の横断面における図を表す。 反応容器の横断面における図を表す。 反応容器の横断面における図を表す。 反応容器の横断面における図を表す。 N,N’−ビス(13−ビオチノイルアミノ−4,7,10−トリオキサトリデシル)−5−(ジアゾメチル)イソフタルアミド分子の構造式を示す。 図6は、N,N’−ビス(13−ビオチノイルアミノ−4,7,10−トリオキサトリデシル)−5−(ジメトキシメチル)イソフタルアミド分子の構造式を示す。

Claims (13)

  1. 生体試料に含まれる目的の生体分子を標識する方法であって、
    以下:
    a)反応容器を提供する工程、
    b)目的の生体分子の標識又は標識前駆物質を結合し得る捕捉分子を、容器又はこの容器に導入された固体支持体の内部表面の全部又は一部に固定化する工程、
    c)生体試料、及び以下のものを、当該反応容器に導入する工程、
    1)目的の生体分子の少なくとも1つの標識又は標識前駆物質、及び
    2)必要に応じて、目的の生体分子を標識するのに、又は予備標識するのに必要とされる任意の成分、
    d)反応容器の内容物をインキュベートする工程、
    e)目的の生体分子と反応しなかった標識又は標識前駆物質を、捕捉分子への結合によって固定化する工程、及び
    f)標識された目的の生体分子(すなわち、当該標識又は標識前駆物質と反応するもの)を次の工程に用いる工程:
    を含むことを特徴とする方法。
  2. 目的の生体分子、及び、目的の生体分子の少なくとも1つの標識又は標識前駆物質の混合物を含む生体試料を、必要に応じて、目的の生体分子を標識するのに必要とされる任意の成分と併用したものを、処理する方法であって
    以下:
    a)反応容器を提供する工程、
    b)目的の生体分子の標識又は標識前駆物質を結合し得る捕捉分子を、容器又はこの容器に導入された固体支持体の内部表面の全部又は一部に固定化する工程、
    c)生体試料を、当該反応容器に導入する工程、
    d)反応容器の内容物をインキュベートする工程、
    e)目的の生体分子と反応しなかった標識又は標識前駆物質を、捕捉分子への結合によって固定化する工程であって、目的の生体分子と反応しない標識又は標識前駆物質の捕捉分子への結合は共有結合により起こる工程、及び
    f)標識された目的の生体分子(すなわち、当該標識又は標識前駆物質と反応するもの)を次の工程に用いる工程:
    を含むことを特徴とする方法。
  3. 目的の生体分子と反応しない標識又は標識前駆物質の捕捉分子への結合は共有結合により起こる
    ことを特徴とする請求項1に記載の方法。
  4. 工程a)の前には、生体試料を、以下:
    ・上流の他の反応容器からの移動、
    ・目的の生体分子を利用可能及び/又は検出可能にするための複合体生体物質の溶解、
    ・目的の生体分子の捕捉又は単離、及び/又は
    ・目的の生体分子の検出を可能にするか、又はそれらの検出を増強するための、当該目的の生体分子の処理:の工程の少なくとも1つに従って処理する
    ことを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 工程f)の後に、以下:
    ・下流の他の反応容器への移動、
    ・予備標識された目的の生体分子の標識、
    ・標識された又は予備標識された目的の生体分子の精製、及び/又は
    ・捕捉プローブにハイブリダイズした、標識された目的の生体分子の検出:の少なくとも1つの次の工程を行う
    ことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
  6. 容器又はこの容器に導入された固体支持体の内部表面は、アニオン性官能基及び/又は酸官能基を有し、かつ、標識又は標識前駆物質は、ジアゾ官能基(−N=N)を含む
    ことを特徴とする請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
  7. 容器又はこの容器に導入された固体支持体の内部表面が有する官能基は、カルボン酸官能基及び/又はスルホン酸官能基からなる
    ことを特徴とする請求項6に記載の方法。
  8. 目的の生体分子は、核酸及び/又は核酸断片からなる
    ことを特徴とする請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
  9. 核酸及び/又は核酸断片は、DNA、RNA、DNA−RNAキメラポリマーからなり、これは、必要に応じて、少なくとも1つのヌクレオチドチオホスフェート、LNA、2’−O−Me及び/又はメチルホスホン酸塩誘導体を含み得る
    ことを特徴とする請求項8に記載の方法。
  10. 請求項1又は2に記載の工程a)の前に、生体試料を、以下:
    ・上流の他の反応容器からの移動、
    ・核酸を利用可能にするための、生体試料に含まれる複合体生体物質の溶解、
    ・複合体生体物質からの核酸の抽出、
    ・目的の核酸の特異的増幅、
    ・当該目的の核酸又はアンプリコンの断片化、及び/又は
    ・いかなる注目すべき増幅現象もなく、目的の核酸を転写又は逆転写すること:の少なくとも1つの工程に従って処理する
    ことを特徴とする請求項8又は9に記載の方法。
  11. 請求項1又は2に記載の工程f)の後に、以下:
    ・下流の他の反応容器への移動;
    ・予備標識された核酸の標識;
    ・標識された又は予備標識された核酸の精製、
    ・捕捉プローブにハイブリダイズした標識された又は予備標識された核酸の検出;
    ・いかなる著しい増幅現象もなく、目的の核酸を転写又は逆転写すること;及び/又は
    ・検出プローブを用いるか又は用いることなく、標識された又は予備標識された核酸を均一相検出すること:の少なくとも1つの次の工程を行う
    ことを特徴とする請求項8〜10のいずれか1項に記載の方法。
  12. 捕捉分子は、標識に対して過剰に存在し、かつ、標識は、標識される目的の生体分子に対して過剰に存在する
    ことを特徴とする請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
  13. 捕捉分子は、核酸と反応しない遊離の標識に対して過剰に存在し、かつ、標識は、標識される核酸に対して過剰に存在する
    ことを特徴とする請求項12に記載の方法。
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