JP2004502468A - バイオチップ上のヌクレオチド標的配列の同定及び/又は定量のための反転検出 - Google Patents
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Abstract
本発明は2組のヌクレオチド配列(1及び2)を用いて相互に対して相同性を示す一以上の標的ヌクレオチド配列であってサンプル中に存在する可能性がある一以上の標的ヌクレオチド配列(3)を同定及び/又は定量し、相同である可能性がある配列から区別する方法であって、所望によりラベルされたヌクレオチド配列の第一の組(1)が第一工程において前記標的ヌクレオチド配列(3)に特異的に結合し、ヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされているヌクレオチド配列(1)に対して相補的な配列の少なくとも一部を有する捕獲ヌクレオチド配列の第二の組(2)とのハイブリダイゼーションを通して検出され及び/又は定量され、ただし、前記捕獲ヌクレオチド配列(2)は1cm2当たり少なくとも4個の別個の領域のアレイに従って固体支持体の表面(4)上に固定されており、前記別個の領域のそれぞれは一種類の捕獲ヌクレオチド配列(2)と結合されており、所望によりラベルされたヌクレオチド配列(1)とそれらの対応する捕獲ヌクレオチド配列(2)との間の結合の同定及び定量はサンプル中に存在する標的ヌクレオチド配列(3)の同定及び定量と相互に関連することを特徴とする方法に関する。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
【0001】
発明の分野
本発明はサンプル中に存在する一以上の標的ヌクレオチド配列を同定及び/又は定量し、相同配列とのそれらの区別を可能にする方法を提供する。特に、本発明は同じ科に属する微生物の特定の種を同定及び定量する方法、又は特定生物に属する一般的配列の様々なアイソタイプ(一ヌクレオチド多型(SNP)配列を含む)を検出及び/又は定量する方法を提供する。
【0002】
発明の背景及び技術の現状
多くの特異的捕獲ヌクレオチド配列で作られたバイオチップはサンプル中の検出されるべき対応する様々な相同ヌクレオチド配列の間の区別を行うための良好に適合されたツールである。
【0003】
しかし、微生物間又は一つの微生物においてDNA又はRNA配列の一塩基のみで異なる相違が存在する。これらの配列は極めて類似しているので、一つの所定の標的ヌクレオチド配列と異なる捕獲ヌクレオチド配列(その上でそれがハイブリダイズすることができる)との間で交差反応が生ずるかもしれない。
【0004】
一以上の標的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション及び検出をミニチュア化によって可能とするバイオチップ技術は、バイオチップ上に多数の捕獲ヌクレオチド配列が結合されていると仮定して、一以上の標的ヌクレオチド配列の間の検出(区別)を行うための有用なツールである。それは組織の遺伝子発現パターンの決定も可能にし、それはmRNAをcDNAへとコピーしてこれらの配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含むバイオチップ上でそれらをハイブリダイゼーションさせることによって得られる。cDNA配列は相互に異なっているので交差反応のレベルは高く、捕獲ヌクレオチド配列(それらはかなり長い配列である)は組織からクローニングされたcDNAのバンクから構築され、ハイブリダイゼーションの速度及び収率は高い。
【0005】
小さな捕獲ヌクレオチド配列が用いられた場合、標的配列が小片に切り分けられない限りハイブリダイゼーションのレベルはかなり低い。溶液中ではハイブリダイゼーション速度は鎖長の平方根に比例し、小さいものは制限的である(Wetmur, J.G., Biopolymers 10, 601 (1971); Anderson et Young in“Nucleic acid and hybridization”, IRL Press, Hames, B. and Higgins, S. Editeurs, 73−111, Oxford−Washington DC (1985))。反応が固体表面上で行われる場合、捕獲ヌクレオチド配列の長さの影響は溶液中よりもずっと大きい。従って小さな捕獲ヌクレオチド配列上での所定の標的DNA配列の固定速度と長い捕獲ヌクレオチド配列上での所定の標的DNA配列の固定速度との間の相違は極めて大きい。
【0006】
DNA標的ヌクレオチド配列自体の検出はずっと問題がある。何故ならDNAはまず増幅されなければならないからである(通常PCRによって)。アンプリコン(amplicon)は2本鎖DNAであり、固体表面上に結合されている捕獲ヌクレオチド配列上にハイブリダイズするよりも溶液中で再会合しやすい(WO 98/11253)。この効果は捕獲ヌクレオチド配列の長さに直接依存しており、小さな捕獲ヌクレオチド配列は感受性の欠如に導く。DNAを非特異的な方法で片に切り分けることも可能である(多数の配列がチップ中で分析されると仮定して)。できるかぎり多数の捕獲ヌクレオチド配列を固体支持体の表面上に結合させて反応収率に影響を与えることも可能であるが、結合されることができる濃度に制限がある。配列の選択は最終的に重要である。何故なら、同一長であってもある配列は他の配列よりも高いハイブリダイゼーション収率を与えるからである(第一工程に好ましいか又は第一工程を加速することができ二本鎖形成を導く二次構造の形成)。
【0007】
それ故、良好なハイブリダイゼーション収率を与えつつも標的相同配列の検出を可能にする中程度の長さの捕獲ヌクレオチド配列が妥協として提案されている。
【0008】
しかし、小さな捕獲ヌクレオチド配列は一塩基の小ささで異なる配列間の区別を可能にする。小さな捕獲ヌクレオチド配列を担持するこれらのアレイの一つの適用は一ヌクレオチド多型(SNPs)配列の同定である(WO 98/56954)。
【0009】
発明の目的
本発明は異なる相同標的配列に特異的な捕獲ヌクレオチド配列を担持するアレイを用いて他の可能な相同標的配列の間から標的ヌクレオチド配列を同定及び/又は定量するための新規の改良された解決策であって従来技術の欠点を示さない解決策を提供することを目的とする。
【0010】
発明の概要
本発明はアレイ上にハイブリダイズされるべき配列のハイブリダイゼーションプロセスの反転を行うことによって、サンプル中に同時に存在することがあり得る相同標的配列間の区別を可能にする。
【0011】
本発明による方法は、第一工程において標的に結合するヌクレオチド配列がアレイ上で検出されるべき標的として第二工程において用いられるという二工程の結合プロセスに基づいた標的ヌクレオチド配列の同定(検出及び特性決定)及び/又は定量を可能にする。
【0012】
本発明による方法においては、標的DNA(又はRNA)配列は所望によりラベルされた様々なヌクレオチド配列とまず反応させられ、次に、洗浄後、前記所望によりラベルされたヌクレオチド配列は標的ヌクレオチド配列から分離され、所望によりラベルされたヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を担持するアレイ上のハイブリダイゼーションによって最終的に同定される。本発明によれば、アレイ上にハイブリダイズするのは所望によりラベルされたヌクレオチド配列であり標的ヌクレオチド配列ではない。
【0013】
本発明による方法においては、捕獲ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列は同一であるそれらの配列の少なくとも一部又は部分を有し、一方、所望によりラベルされたヌクレオチド配列はそれらに相補的な配列である。特許請求の範囲に記載されるようなかかる反転方法は相同標的配列の間の有効な区別の問題を有利に解決する。
【0014】
定義
「相同ヌクレオチド配列」は対応する位置に同一ヌクレオチドを有するDNA又はRNA配列を意味する。相同(又は配列同一性)の程度は、比較されるべき二つの配列のうちの一方におけるギャップの如き欠失又は挿入を考慮に入れて配列を最適に整列(全配列)させた後の所定の位置における同一ヌクレオチドの割合として計算される。これは異なる生物種の如き遺伝的に異なる源中に存在する所定の遺伝子の配列の場合に、又は(同一ファミリーからの又は共通の構造ドメインを有する)類似機能を有するタンパク質又は酵素の場合、事実である。相同性(又は配列同一性)の程度は一以上の特定位置のみで又はそれらの配列の全てに沿って相同である配列を用いた場合は大きく変化し得る。両方の配列において同一である配列の一部(又は部分)は「保存されている」と称される。それらの配列において高度の不変性を示す配列は「高度に保存されている」と称され、それらは高度の相同性を示す。一塩基のみで異なる配列は高度の相同配列とみなすことができる。これは一ヌクレオチド多型配列又はSNP配列の原因である配列の場合、事実である。
【0015】
相同性(又は配列同一性)は配列の整列後に計算され、コンピュータ化されている地域的な相同性アルゴリズム(例えば Clustal, Intelligenetics, Mountain View, California, 又は Wisconsin Genetics Software Package, Genetics computer Group Madison, Wisconsin, USA における GAP, BESTFIT, FASTA 及び TFASTA 又は Boxshade を挙げることができるがこれらに限定されない)に基づいている。
【0016】
図面の簡単な説明
図1は本発明による反転バイオチップの模式図である。これは二つの室5及び6から作られており、これらは同一固体支持体4上に存在し、自動化の目的のために連結されている。
【0017】
本発明の詳細な記述
本発明は二つのバイオチップの使用を有利にも含む。そこではサンプルから同定され単離されるべき標的ヌクレオチド配列3を担持する第一の室5、及びバイオチップ7の固体支持体4に対する捕獲ヌクレオチド配列2のさまざまな結合を含む第二の室6が導入されている。前記捕獲ヌクレオチド配列は図1に示される通り、ラベルされたヌクレオチド配列1に特異的である。アッセイを行いやすくするため、標的ヌクレオチド配列3は固体支持体4上に固定されており、従って標的ヌクレオチド配列3は第一の室中の様々なラベルされたヌクレオチド配列1と反応することができる。しかし、この固定は本発明に必須ではない。何故なら第一ハイブリダイゼーションは溶液中で行うことができ、ラベルされたヌクレオチド配列1はその後、アレイ上で検出される(対応する捕獲ヌクレオチド配列2とのハイブリダイゼーション)前に標的ヌクレオチド配列3から分離されることができるからである。
【0018】
本発明による方法の第一の利点は特異性を検出速度と関連させることである。特異性は、相互に異なる標的ヌクレオチド配列の一部において選択されることができるような小さなラベルされたヌクレオチド配列が用いられるという事実によって得られる。それが小さい配列を用いるという事実は一塩基のみ異なる配列(SNP配列)を区別することも可能にする。好ましい実施態様においては、ラベルされたヌクレオチド配列は対応する標的ヌクレオチド配列に特異的な8〜60塩基、好ましくは15〜30塩基の配列を有する。
【0019】
本発明による方法の第二の利点は、固定された標的ヌクレオチド配列3上でのラベルされたヌクレオチド配列1のハイブリダイゼーションは捕獲ヌクレオチド配列2が小さく、溶液中の標的ヌクレオチド配列3が長いフラグメント(これは通常二本鎖になっている)である状況と比較するとかなり迅速なプロセスであるということである。更に、速度は固体支持体への標的ヌクレオチド配列3の結合部位から離れて位置するラベルされたヌクレオチド配列1のハイブリダイゼーションのための配列を選択し、そしてラベルされたヌクレオチド配列1を過剰に加えることによって加速されることができる。好ましい実施態様においては、ラベルされたヌクレオチド配列1は標的ヌクレオチド配列の量の100倍以上の大過剰で加えられる。これは標的ヌクレオチド配列3上へのこれらのラベルされたヌクレオチド配列1の固定速度及び収率を増大させるためである。
【0020】
ラベルされたヌクレオチド配列1は全て標的ヌクレオチド配列3上でのそれらのハイブリダイゼーションのために一緒に存在し、これは反応がそれら自体の間で競争的になることを可能にする。配列は同一又は類似濃度で存在するので、結合収率は標的ヌクレオチド配列の親和性に依存するであろう。たとえ一塩基の小ささによって異なっていても非相補的配列についての方よりも相補的配列についての方が好ましい結合が観察された。相同配列間の区別は極めて良好である。
【0021】
第二の(アレイ)室6においてはハイブリダイゼーション収率は様々なラベルされたヌクレオチド配列1について同様である。何故ならそれらは同一(又は類似)サイズを有し、それらは類似サイズの捕獲ヌクレオチド配列2上でハイブリダイズするからである。スポットの強度は(サンプル中に存在する)第一標的ヌクレオチド配列から離脱したラベルされたヌクレオチド配列1であって第二(アレイ)室6中でのハイブリダイゼーションに利用可能なラベルされたヌクレオチド配列1のレベルを反映する。
【0022】
アレイ中の捕獲ヌクレオチド配列2上での配列の第二ハイブリダイゼーションは迅速なプロセスである。何故なら、小さな配列は迅速な反応を可能とするように設計された捕獲ヌクレオチド配列2上で反応するからである。捕獲ヌクレオチド配列2はかかる反応が速い速度で進行されるように最適化されることができ、固体支持体4への結合点から離れて特定配列を伸長させ、ハイブリダイゼーション速度を増大させる。相補的配列は他の非相補的配列と比較して常に過剰に存在するので、対応するスポットは反応の開始から高いシグナルを与え、標的ヌクレオチド配列の同定を可能にする。もし定性的測定のみが要求されるならば、反応は完了前に停止されることができる。何故なら、スポット上のシグナルレベルは反応の開始から溶液中のそれらの割合を反映するであろうからである。
【0023】
本発明による方法の一つの好ましい実施態様は二本鎖標的DNAの検出である。アレイ上での標的DNA配列の古典的な検出においては、標的DNA配列が溶液中で二本鎖を再形成できるという事実のためハイブリダイゼーション速度は低い。かかる状況に対抗する一つの方法は捕獲ヌクレオチド配列の長さを増大させることであるが、この場合、相同配列が同一捕獲ヌクレオチド配列上に交差ハイブリダイゼーションし、偽の検出を導くことがある。本発明においては標的はラベルされた捕獲ヌクレオチド配列と第二の標的鎖との間のハイブリダイゼーションに対する競争を減少又は除去するため固定前又は固定後に一本鎖にされる。ラベルされたヌクレオチド配列は溶液中でのそれらの再ハイブリダイゼーションを回避するために一本鎖ヌクレオチドであることが好ましい。
【0024】
本発明は相同配列の同定及び/又は定量(サンプル中の微生物の特定株の同定、又は研究において正常又は病気の状況で異なる役割を有するタンパク質をコードする関連遺伝子の集団の間で遺伝子が特異的に同定されなければならない場合)に特に好適である。これはレセプター、キナーゼ、ホスファターゼ、サイクリンの如き調節遺伝子、転写因子又はオンコジーンについて特に真実である。それらの配列の一部が同一であるので、標的相同ヌクレオチド配列はコンセンサスプライマーを用いて増幅又は複製されることができる。多くの適用においては、検出の役割は類似生物の標的ヌクレオチド配列(相同DNA又はRNA配列)の間の区別を行うことである。その場合、保存されている配列の一部又は部分はこれらの相同ヌクレオチド配列(サンプル中に存在するなら)すべてを認識するプライマーの結合のために用いられる。生物の一つの科又は属について一つのプライマー対のみの使用はそれぞれの種又は亜種について特異的なプライマーを使用することと比較して有利である。何故なら生物の科の中には30以上の種を含むものもあるからである。1回の多重PCRでこれらの種すべてを増幅することを可能にする増幅条件を見出すことは(たとえ不可能ではないにしても)困難である。(五つの異なるヌクレオチド配列についての多重PCRですら再現性のある様式でサンプルを取扱うことがすでに困難である。)本発明によれば、各科について一つのプライマー対のみを用いて(細菌科の如き)生物の各科を増幅するためにアッセイを設計することができる。mRNAの反転写の場合のように複製のみが行われるならば、単一のpol−dTが複製を行ってcDNAにする転写酵素として役立つことができる。
【0025】
好ましくは、小さなラベルされたヌクレオチド配列1は第一及び第二ハイブリダイゼーション工程においてハイブリダイゼーションのために用いられる。小さなヌクレオチド配列1の使用は極めて相同な配列(30〜98%の相同性)の区別を可能とする。もしラベルされたヌクレオチド配列が好適に選択されるならば、それらは一塩基で異なる(SNP)二つの配列の間で区別することができ、かくして多型の決定を可能にする。
【0026】
好ましい実施態様においては、ラベルされたヌクレオチド配列1はそれらの標的ヌクレオチド3に特異的なそれらの配列の一部及び標的ヌクレオチド配列3に非特異的でありかつ所定のラベルされたヌクレオチド配列に特異的な追加テールを含む。このテールはアレイ室6上に存在する捕獲ヌクレオチド配列2と相補的である。テールはそれぞれのラベルされたヌクレオチド配列1について異なるので、それらはアレイ上での完全なマッチを安定化させ、その結果、標的ヌクレオチド配列に特異的な配列の一部において例えば一塩基異なる密接に関連したラベルされたヌクレオチド配列はアレイ上でより良好に区別されるであろう。
【0027】
本発明による方法はヌクレオチド配列の改変を用いたSNP配列の検出に適用されることができ、これらはまず標的DNA配列上にハイブリダイズされ、次に第二工程において様々な捕獲ヌクレオチド配列2を担持するアレイ室6上で検出される。
【0028】
一実施態様においては、本発明はSNP配列に隣接する標的ヌクレオチド配列に結合する、異なるヌクレオチドによって停止された二以上のラベルされたヌクレオチド配列の混合物を用いることによるSNP配列の決定に適用され、ヌクレオチド配列の末端ヌクレオチドの一方はSNP配列に完全にマッチされる。ラベルされたヌクレオチド配列以外に結合する他の追加ヌクレオチド配列の存在は、完全にマッチするヌクレオチド配列がリガーゼによりこのヌクレオチド配列に結合されることを可能とする。結合されたヌクレオチド配列は次に第二アレイ上で検出され、かくしてSNP配列が同定される。様々なラベルされたヌクレオチド配列は容易に同定されるようにCy3,Cy5又はCy7の如き異なるラベルを担持してもよい。もしラベルされていないのなら、第二の追加ヌクレオチド配列は生ずる結合生成物がラベルされるようにラベルされる必要がある。
【0029】
本発明の他の実施態様においては、ラベルされたヌクレオチド配列の混合物が用いられ、それぞれの配列は同一SNP上の部位に位置する少なくとも一塩基において異なる。ハイブリダイゼーション後、ミスマッチヌクレオチド配列は一本鎖に特異的であるが二本鎖DNAには影響を与えないヌクレアーゼによって切断され、プロセスが繰返される。未切断の及び切断されたヌクレオチド配列は次にアレイ室6上でのハイブリダイゼーションのために処理される。好適なハイブリダイゼーション条件において及びアレイ室上の良く選択された捕獲ヌクレオチド配列を用いると、それらは長い未切断の又は小さな切断されたヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かくしてSNP配列の同定を可能にする。
【0030】
本発明の他の実施態様においては、標的ヌクレオチド配列に沿って位置するSNP配列の如き標的ヌクレオチド配列の異なる部分を認識した複数のヌクレオチド配列の混合物が用いられ、方法の第二工程においてアレイ上で検出される。多数の捕獲ヌクレオチド配列2がアレイ上に固定されることができ、多数のラベルされたヌクレオチド配列1の間で区別することができる。このようにして、所定の標的ヌクレオチド配列の中に存在する可能性がある突然変異の如き多数の変異について一つのアッセイで調査することが可能である。これはこれらの変異がすべて標的中に潜在的に存在し、これらが病気の状況と関連している場合に特に有利である。これはオンコジーン(P53の如き)に生ずる突然変異について事実である;それらの多くはがん進行に関連しており、HIVウィルス酵素において医薬治療に対する抵抗性に導く。SNPは医薬治療に対する又は病気に対する反応に影響を与える個人的変異にもたぶん関連している。
【0031】
好ましい実施態様においては、所定の問題に対して幅広い応答を得るためにいくつかの標的ヌクレオチド配列が第一ハイブリダイゼーション工程で用いられ、アレイ上で可能な多数の検出という利益が得られる。
【0032】
有利には標的ヌクレオチド配列は複製又は増幅工程によってラベルされることなしに検出されることができ、かくしてDNA又はRNA配列の直接検出を可能にする(多くの従来法においては、標的ヌクレオチド配列は増幅又は転写工程中にラベルされる)。これはバイオチップの最終用途における単純化を可能とする。何故なら、使用者は増幅をいかなる方法においても行うことができ、この工程中のラベルされた試薬の干渉に悩まされる必要がないからである。この特性はサンプルからの抽出後、直接配列を同定することを可能にし、複製又は増幅工程を除去し、それを行いやすくする。この直接検出は十分な材料が利用できるときのみ行うことができる。本発明による適用はリボゾーマルRNA:16s,23s,18s又は25sの如きRNAに適用するがmRNAにも適用する(しかしこれらに限定されない)。これらのRNAは一本鎖ヌクレオチドであるので、支持体上へのそれらの固定後、二本鎖アンプリコンの場合ほど劇的な変性を用いる必要はなく、従って非共有結合をこの工程で用いることができる。RNA(リボゾーマルRNA又はメッセンジャーRNA)の検出は、直接であれそれらの相補的DNA配列へのそれらの複製後であれ、本発明の好ましい実施態様である。何故なら、それらは通常多数のコピー数で細胞中に存在し、多くの適用においてはそれらの検出は増幅なしに行うことができるからである。この直接検出は定量をも容易にする。何故なら、増幅を回避することはこの工程による変異(これは克服することが困難である場合が極めて多い)を減少させるからである。直接検出は長いDNA配列に、それらを抽出及び変性した後、又はそれらを小さい片に切り分けた後に適合されることができる。
【0033】
本発明の好ましい実施態様においては、標的ヌクレオチド配列3はコンセンサスプライマーによって増幅(PCR)される(同一プライマーによって増幅される配列)。相同配列は例えば同一の科又は属の微生物中に存在する遺伝子の配列である。この増幅のためには、プライマーの一方はアミノ化され、従って増幅後アンプリコン鎖の一方はこのアミノ基を担持する。アンプリコンは次にアルデヒド基を担持する表面上でインキュベートされる。アミンとアルデヒトの間の反応は正常条件では自発的であり、他の試薬は不要である。反応後、還元剤(NaBH4)が添加されて反応性二重結合を削除する。次に第二鎖はヌクレオチド配列用の変性条件を用いて除去される。ヌクレオチド配列が標的鎖から分離するように温度をヌクレオチド配列の溶融温度より上に増大させてもよいが、アルカリ溶液の使用の如き他の条件も用いることができる。(二つの鎖を分離するためには0.1又は0.05NのNaOH溶液濃度で十分である。)
【0034】
活性化された表面へのアンプリコンの結合は、増幅後に溶液中になおも存在しているプライマーの存在によって制限され得る。これらのプライマーは活性化された表面と反応することもでき、それ故標的アンプリコンの固定を低下させる。必要ならばアンプリコンを表面上に固定する前にアンプリコンをプライマーから分離させる。(スピンカラム上での分離がかかる分離には好適だが、Nucleo trap PCR purification kit (Clonetech) 又はゲルフィルター上での濾過 (Nucleo Spin Clonetech) の如きシリカ由来の吸着もかかる分離に好適である。)
【0035】
サイズに応じたDNAフラグメントの分離は電気泳動法を用いても良好に得ることができる。かかる技術のミニチュア化は、かかるルーチン適用における必要の如き現在の適用に今や好適であることを可能とする。
【0036】
本発明によれば、アッセイは同一支持体4上で行われるタンデムチップである。第一室5上で標的ヌクレオチド配列は活性化された支持体4上に共有結合によって固定される。共有結合反応は化学において周知であり、それらの多くは例えばチップ表面上に存在するアルデヒド基とアミノ化された標的ヌクレオチド配列との反応によってチップ形成に既に用いられている。他の実施態様においては、標的配列は直接又は複製もしくは増幅工程中にビオチン化(好ましくは一方の鎖上で)されており、標的はストレプトアビジンでコートされた表面上に固定される。他の実施態様においては、ハプテン又はリガンドが標的配列上に固定され、従ってそれは表面上に固定された対応する抗体又は受容体によって固定される。
【0037】
この工程を生じさせるために多くの支持体が適合されることができる。ガラスはアルデヒド基を担持するように活性化される。表面上にアルデヒドをグラフトするためには多くの異なる方法がある。ガラスはアミノシランと反応し、次にグルタルアルデヒドと反応する。カルボキシル基を固体支持体の表面上に結合させて次にそれらをアルデヒドへと還元してもよい。アルコール官能基はアルデヒドへと酸化されることもできる。しかし、SMCC又はDSSの如き二官能性活性化剤の使用も有用である。何故なら、それらはアミノ基を活性化させそれらをそれぞれチオール又はアミノ基と結合させることができるからである。標的ヌクレオチド配列が二本鎖であり変性溶液中で処理されなければならない場合、かかる化学結合は支持体への標的ヌクレオチド配列の特に有用な共有結合固定を与える。しかし、ナイロン、セルロース誘導体の如き表面上への単純な吸着、又は正に帯電された表面(例えばポリリジン又はポリ(phe−lys) の如きコポリマーでカバーされた表面)上への単純な吸着も表面上にヌクレオチド配列を吸着させるための好適な方法である。この場合、条件は小さいプライマーよりもむしろ長い標的DNAフラグメントの吸着のために決定される。
【0038】
もしガラスが不活性でありかつ低い自己蛍光性を有するというような多くの利点を有するなら、他の支持体、特にポリマーは有用であることができる。何故なら、それらはそれらの表面で様々な化学的に良く規定された基を用いて得ることができ、かくして標的DNAの固定を可能とするからである。ポリスチレンは表面上でカルボキシル又はアミノ基を得るために活性化され、アミノ−DNAの共有結合固定を可能とする(Anal. Biochem. 236, 85 (1996))。大部分のポリマーはカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を得るために活性化することができる。ポリスチレンは平坦な支持体としてのみならずマイクロビーズとしても入手可能であり、これは固定された標的上でのラベルされたプローブの第一結合工程を行うために用いるのに有利である。
【0039】
DNAを固定することができる全ての他の支持体(フィルター、シリコン支持体、金属支持体、コンパクトディスク、プラスチック又は電子装置の如き)も用いることができる。有利には前記固体支持体は単独のガラス又はプラスチックプレートであり、これは本発明による方法を改良するための追加の手段(バーコード、マーカー等)又は媒体(被覆等)を含んでいてもよい。プラスチック支持体中に挿入されたガラスの如き支持体の組合せは自動化のためにチップを取扱うのに有用である。
【0040】
結合後及び/又は結合前に標的ヌクレオチド配列は変性され、一本鎖の固定された標的ヌクレオチド配列を生成する。様々なラベルされたヌクレオチド配列を含む溶液が次にこの第一モノチップに加えられ、それらはもしそれらの相補配列が標的ヌクレオチド配列上に存在するなら反応することができる。洗浄後、溶液は加熱され、結合されたヌクレオチド配列は標的ヌクレオチド配列から分離され溶液中に見出される。この溶液は次に特定のチャネル又は他の手段(マイクロポンプ又は弁を利用した洗浄工程)によってラベルされたヌクレオチド配列に特異的な捕獲ヌクレオチド配列を含む第二室6へと移される。第二ハイブリダイゼーションが次に行われ、ラベルされたヌクレオチド配列、従って標的ヌクレオチド配列の同定を可能にする。もし異なる工程が良好に行われるのなら、アッセイは定量的にすることができ、従って標的ヌクレオチド配列の同定のみならず定量をも可能にする。全ての工程は同一表面4上で行われるのでアッセイは使用者にとって行いやすく、自動化を可能とする。
【0041】
本発明の好ましい実施態様においては、コンセンサスプライマーはサンプル中に存在する可能性がある相同配列のPCR増幅において用いられる。NH2の如き官能基又はビオチンは上述の通りそれらを個体表面上に付着させるために組込まれる。LCR,CPR,NASBA,ICR,TMA又はなだれDNAの如き他の増幅方法も可能である。RNA増幅は反転写後、同様の方法で行うことができる。短い配列のDNAも制限酵素を用いた特定開裂によって得ることができ、小さな配列のRNAは熱による又は塩基の存在による非特定開裂によって得ることができる(WO 97/10365)。
【0042】
ビオチン化されたラベルされたヌクレオチド配列(これはその後、蛍光分子又は酵素又はコロイド金粒子を有するストレプトアビジンコンジュゲートと結合する)を用いた間接ラベリングも用いることができる。これらの金粒子はそれ自体によって検出されるか又は銀の還元のための触媒として役立つことができる。沈殿は次に検出され、所望により定量される(EP−99870106.4)。
【0043】
ラベリングはハプテンと抗体の反応を用いても得ることができる。抗体はラベルであるか又はシグナルを与えることができる分子と結合する。
【0044】
DNAチップに適合された蛍光、比色、磁気、電気、電気発光、生物発光又は放射能に基づくDNA検出法は全てアレイの検出に用いることができる。
【0045】
ラベルされたヌクレオチド配列及びそれらの相補的捕獲ヌクレオチド配列の検出の選択は、相同配列が相互から特異的に区別されなければならない場合、全プロセス中で非常に重要な工程である。配列間の相同性が高いほどこれらの配列の選択は一層重要である。相同配列が最も(又は多く)異なる小さな配列領域(又は部分)を選択してこの領域(又は部分)に対する相補物としてラベルされたヌクレオチド配列を設計することが好ましい。配列の長さは相同性によっても変化し、配列が異なれば長く、極めて相同であれば短い。配列は15〜30塩基であることができるが、8塩基の小ささの配列又は60塩基の長さの配列も用いることができる。アレイ上にスポットされた捕獲ヌクレオチド配列はラベルされたヌクレオチド配列に対して相補的である。一つの好ましい実施態様においては、これらの配列2は表面4に結合された非特異的配列を有することによって又は固定用のリンカーを用いることによって表面4から特定の距離に位置する。
【0046】
二つのハイブリダイゼーション工程を行うために単一の表面を使用することはプロセスが自動化及び微小流体光学技術に適合されることを可能とする。表面は二つの室に分けられ、第一の室では標的DNA又はRNAが結合されてラベルされた配列が標的配列上にハイブリダイズし、第二の室はアレイであり、様々な捕獲配列を含む。溶液はチャネル及びポンプによって各室に注入され除去され、これによりインキュベーション及び洗浄を可能とする。室は要求された温度に加熱されることもできる。
【0047】
二つの室は小さなパイプ又はチャネルによって連結されることもでき、従ってラベルされたヌクレオチド配列の標的からの分離後、溶液は第二の室へと移されアレイ上でのハイブリダイゼーションプロセスが行われる。検出をも含む全プロセスが自動化されることができ、この反転チップ検出を容易なプロセスとする。本発明は固定された標的上でのラベルされたヌクレオチド配列の結合及び分離工程を繰返し、かくして特定のヌクレオチド配列が捕獲ヌクレオチド配列上でのそれらの区別のためにアレイに蓄積される。自動機械又は機械によるプロセスの自動化はプロセスを繰返すのに特に好適である。
【0048】
この技術は現存の自動機械に容易に適合されることができる。それらの一つはELISAアッセイ用に開発されたVIDAS(Biomerieux, Lyon, France)である。それはチップ中での抗原/抗体反応を行うことに対する特異性を有しており、チップは次に洗浄及びインキュベーションのために様々な溶液を徐々に通過させられる。このチップ中で得られる最終シグナルが次に記録される。アレイは分配チップの如き装置中に挿入されることができ、かくして溶液は内側にくみ上げられ、反応させられ、洗浄し、アレイ上でインキュベートする。チップ中で反応を行うことは抗体−抗原反応について開発されておりVIDAS機械(Biomerieux, Lyon, France)によって行われるような自動化に良く適合されている。反応が完了した後、シグナルは後述のようにアレイ上で検出される。
【0049】
二重アレイシステムは同様の方法で処理されることができ、各々はマイクロピペット装置中に挿入されてプロトコールによって要求される場合はヌクレオチド配列の溶液を通過させるために相互に連結されている。
【0050】
微小流体工学技術は同一表面上で行われるべき過剰のプライマーからアンプリコンを増幅及び/又は分離する手順全てを可能とし、かくして「チップ上の研究室」をもたらす。最終表面は区画のいくつか又は全てを含むであろう:行われるべきPCR用の室、もし必要ならばアンプリコンを精製するための分離装置、アンプリコンの固定及び様々なラベルされたヌクレオチド配列との第一ハイブリダイゼーションのための室、及び最後にヌクレオチド配列の最終同定及び検出のためのアレイを有する室。全生成物は室間で行われるべき液体のための及び外部溶液を用いたインキュベーション及び洗浄のための必要な連結を担持するであろう。アッセイの十分に自動化された分析を得るために検出器を自動機械に加えることもできる。プライマーからのアンプリコンの分離は例えば ACLARA Biosciences, (Mountain View, Ca, USA)によって提案されているような濾過、吸着−脱吸着プロセス又は微小電気泳動を用いて行うことができる。
【0051】
ハイブリダイゼーション結果の分析
アレイ上でのハイブリダイゼーション結果は、陽性ハイブリダイゼーションによって発されるシグナルに適合された検出システムを用いて機械によって検出及び/又は定量される必要がある。マイクロアレイにおいて用いられる最も一般的なDNAラベリングは蛍光ヌクレオチド配列の使用に基づいている。この場合、蛍光スキャナーが検出器として作用する(即ち共焦点蛍光スキャナー(Genetic Microsystem, Woburn, MA, USA))。
【0052】
陽性スポット上での沈殿の形成、特にナノ金でラベルした後の銀沈殿は簡易な検出に特に好適である。何故なら比色スキャナー又は写真検出器という特に低コストの技術で反応レベルを検出及び/又は定量することができるからである(EP−99870106.4)。
【0053】
像認識用のソフトウェア分析はスポットに適合されてきており、その後、背景レベルが考慮に入れられて各スポット上に存在するシグナルが定量される。他のタイプの分析はスポットの相関分析に基づいており、それはスポットの各ピクセルの形状及びレベルを考慮に入れる。相関レベルに従ったスポットの分類は陽性又は陰性スポットへの分類を可能にし、原サンプル中に標的が存在するか否かについての容易な回答を使用者に与える。
【0054】
ハイブリダイゼーションの定量は内部又は外部標準による従来のアプローチを用いて行われ、それは抽出に始まって、複製または増幅、第一ハイブリダイゼーション及びアレイ上での第二ハイブリダイゼーションへと続くプロセスの様々な工程において得られる異なる収率についての相関を可能にする。好ましい実施態様においては、既知の濃度の外部標準が全工程を適してサンプル及びプロセスに加えられ、全プロセスの効率を訂正する。本発明の方法は複製または増幅方法を通常含むので、競合的標準は本発明の好ましい実施態様である。それらのうちの一つは文献WO 98/11253において提案されている。
【0055】
好ましくは、この特定配列を通した標準のハイブリダイゼーション収率は標的配列のハイブリダイゼーション収率と同一であるかまたはこれから20%より多く異なることはなく、定量はWO 98/11253に記載されたように得られる。
【0056】
前記標準ヌクレオチド配列、外部及び/又は内部標準は本発明によるキット(装置)又は装置に含まれることが有利であり、所望により本発明による様々な工程を行うために必要な全ての媒体及び手段(ハイブリダイゼーション及び培養培地、ポリメラーゼ及び他の酵素、標準配列、ラベリング分子など)も含まれる。
【0057】
実施例
特定 femA 遺伝子の検出による Staphylococcus (スタフィロコッカス)種の同定
FemA 遺伝子は極めて高度に保存されている遺伝子であり、それらは異なるスタフィロコッカス種の間で50〜90%の相同性を有する。サンプル中のスタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)の同定は以下の五つの最も一般的なスタフィロコッカスを増幅することができるコンセンサスプライマーによる予備増幅を用いて行われた:エス・アウレス(S. aureus)、エス・エピデルミディス、エス・へモリティカス(S. haemolyticus)、エス・ホミニス(S. hominis)及びエス・サプロフィティカス(S. saprophiticus)。プライマーの一方はアミノ化され、かくしてアンプリコンの一方の鎖はその5′端にアミノ基を担持していた。アンプリコンは次にアルデヒド基を担持するガラスに共有結合固定され、100℃に加熱することによって変性された。五つのスタフィロコッカス種に特異的なラベルされたヌクレオチド配列は次にこれらの一本鎖化されたアンプリコンと共にインキュベートされた。反応及び洗浄後、NaOH溶液中に回収された。この溶液は次に各ラベルされたヌクレオチド配列に特異的な捕獲ヌクレオチド配列のスポットにより形成されたアレイ上に添加された。反応及び洗浄後、ストレプトアビジン−Cy5コンジュゲートが添加され、続いて共焦点蛍光スキャナー(Genetic Microsystem)を用いて読み取られた。この方法の原理は図1及び図2に示されている。エス・エピデルミディスに特異的な捕獲ヌクレオチド配列を担持するスポットのみが陽性である。
【0058】
コンセンサスプライマーを用いた FemA 遺伝子の増幅
PCR増幅に用いられたプライマーの配列は以下の通りである:
FP 1 : 5’ CCA CTA GCG TAC ATC AAT TTT GA 3’
FP 1HS : 5’ CCC ACT CGC TTA TAT AGA ATT TGA 3’
FP 3 : 5’ GGT TTA ATA AAG TCA CCA ACA TAT T 3’
FP3は5′端にNH2基を有する。これらのプライマーは femA 遺伝子内の487bpの配列を増幅する。
【0059】
表面上でのアンプリコンDNAの固定
アンプリコンは High Pure PCR Product Purification kit (Boehringer, Mannaheim, Germany) 上のクロマトグラフィーによって精製され、アミノ化プライマー及び遊離のヌクレオチドが除去された。表面上での固定のために、150nMの精製されたアンプリコンを含む溶液SSC3X pH5の100μlがハイブリダイゼーション室によって枠にはめられたシリル化顕微鏡スライド(Cell associates, Houston, USA)上で23℃で30分インキュベートされた。インキュベーション後、スライドは0.1%SDSで1回、水で2回洗浄され、次にNaBH4(2.5mgが750μlのPBS及び250μlの100%エタノール中に溶解された)と共に5分間インキュベートされ、次に3分間沸騰水中でインキュベートされ、スライドは使用するまで4℃で貯蔵された。
【0060】
標的からの特定ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション及び除去
五つのスタフィロコッカス種検出のための特異的なビオチン化ヌクレオチド配列は以下の通りである:
S. aureus
ASaur01 : 5’ CTA AAT GAA GAG CGT GAT ATT TTA AAT 3’
S. epidermidis
ASepi01 : 5’ CTA AAT AAT GAA AGA AAT GTG CTT AAT 3’
S. haemolyticus
AShae01 : 5’ TTA CAA AAT GAA CGT GAA ACT TTA AAT 3’
S. hominis
AShom01 : 5’ CTT CAT GCA GAA CGT CAG ACA TTA AAT 3’
S. saprophyticus
ASsap01 : 5’ TTA AAG GCT GAA CGC GAA GTA TTA AGT 3’
【0061】
ビオチン化ヌクレオチド配列コントロールの配列は:
CMV23Biot 5’ GGT TAT CAG AGG CCG CTT GGC CA 3’ である。
【0062】
各プローブはその5′端にビオチンを担持する。
【0063】
ハイブリダイゼーションのため、100μlのハイブリダイゼーション溶液が標的DNAを担持するガラス上に添加される。この混合物は0.5Mのリン酸緩衝液pH7.4,7% SDS,100μg/mlサケ精子DNA,30nMのエス・エピデルミディスのビオチン化ヌクレオチド配列(1ヌクレオチド配列)又は30nMの各ヌクレオチド配列(5ヌクレオチド配列)を含有する。ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション室中で60℃で2時間行われる。サンプルはマレイン酸緩衝液10mM pH7.5,NaCl 15mM,Tween 0.03%を用いて4回洗浄される。
【0064】
ハイブリダイズされたプローブは疎水性のペンで範囲を定められたハイブリダイズした領域中で70μlのNaOH 0.05Nを用いて25℃で5分間インキュベートすることによって解放される。50μlの溶液が次にマイクロチューブに移され、0.7Mリン酸緩衝液pH7.4,10% SDS,200μg/mlサケ精子DNA,10nMのビオチン化されたCMVヌクレオチド配列(ハイブリダイゼーションコントロール)を含む溶液56μlを用いて中和される。
【0065】
アレイ上のラベルされたヌクレオチド配列の検出
五つのスタフィロコッカスについての捕獲ヌクレオチド配列の配列は以下の通りである:
S. aureus
ATaur02 : 5’ ATT TAA AAT ATC ACG CTC TTC ATT TAG 3’
S. epidermidis
ATepi02 : 5’ ATT AAG CAC ATT TCT TTC ATT ATT TAG 3’
S. haemolyticus
AThae02 : 5’ ATT TAA AGT TTC ACG TTC ATT TTG TAA 3’
S. hominis
AThom02 : 5’ ATT TAA TGT CTG ACG TTC TGC ATG AAG 3’
S. saprophyticus
ATsap02 : 5’ ACT TAA TAC TTC GCG TTC AGC CTT TAA 3’
【0066】
捕獲ヌクレオチド配列コントロールの配列は:
CMVNH2 : 5’ TGG CCA AGC GGC CTC TGA TAA CC 3’ である。
【0067】
各捕獲ヌクレオチド配列はその5′端にNH2基を担持する。
【0068】
捕獲プローブの固定
アミノ化DNAのアルデヒドへのグラフトのための Schena らによって記述されるプロトコール (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10614, 1996) は若干変化させて用いられた。
【0069】
アミノ化された捕獲ヌクレオチド配列は1.6μMの濃度でスポットされた。捕獲ヌクレオチド配列はシリル化顕微鏡スライド上に自家製の配列器を用いてプリントされた。捕獲ヌクレオチド配列はラベルされたヌクレオチド配列と相補的であり、それらの5′端でアミノ基によって停止されている。Genetix (UK) からの250μmピン及び Cell Associates (Houston, USA) からのシリル化(アルデヒド)顕微鏡スライドが用いられた。スポットは直径が400μmであり、分配された体積は約1ナノリットルである。スライドは室温で乾燥され、使用されるまで4℃で貯蔵された。
【0070】
ハイブリダイゼーション及び検出
106μlの変性生成物はハイブリダイゼーション室中で30分間50℃でインキュベートされる。スライドは次にマレイン酸緩衝液10mM pH7.5,NaCl 15mM,Tween 0.03%(洗浄緩衝液)で4回洗浄される。ガラスサンプルはマレイン酸緩衝液100mM pH7.5,NaCl 150mM,Gloria ミルク粉末0.1%中で500倍に希釈された800μlのストレプトアビジンラベルされた cyabin5 (Sigma St Louis, Mi) と共に室温で45分間インキュベートされる。スライドは洗浄緩衝液で5回洗浄され、水で1回リンスされて乾燥される。スライドは Genetic Microsystem (Woburn, MA, USA) からの共焦点スキャナーを用いて読み取られる。
【0071】
表1は(A)標的エス・エピデルミディスのアンプリコンが固定され五つのスタフィロコッカス種に特異的なラベルされたヌクレオチド配列1の混合物と共に第一室5中でインキュベートされる場合の、又は(B)標的エス・アウレウスのアンプリコンが固定され特定のラベルされたエス・エピデルミディスのヌクレオチド配列と共にインキュベートされる場合のスタフィロコッカス・エピデルミディスの特定配列の検出について本発明による反転バイオチップで得られた結果を示す。ハイブリダイゼーション後に標的ヌクレオチド配列から分離したヌクレオチド配列1は次に五つのスタフィロコッカス種に特異的な五つの可能なラベルされたプローブのための捕獲プローブ2を担持するアレイ(室6)上に移され、検出される。
【表1】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明による反転バイオチップの模式図である。
発明の分野
本発明はサンプル中に存在する一以上の標的ヌクレオチド配列を同定及び/又は定量し、相同配列とのそれらの区別を可能にする方法を提供する。特に、本発明は同じ科に属する微生物の特定の種を同定及び定量する方法、又は特定生物に属する一般的配列の様々なアイソタイプ(一ヌクレオチド多型(SNP)配列を含む)を検出及び/又は定量する方法を提供する。
【0002】
発明の背景及び技術の現状
多くの特異的捕獲ヌクレオチド配列で作られたバイオチップはサンプル中の検出されるべき対応する様々な相同ヌクレオチド配列の間の区別を行うための良好に適合されたツールである。
【0003】
しかし、微生物間又は一つの微生物においてDNA又はRNA配列の一塩基のみで異なる相違が存在する。これらの配列は極めて類似しているので、一つの所定の標的ヌクレオチド配列と異なる捕獲ヌクレオチド配列(その上でそれがハイブリダイズすることができる)との間で交差反応が生ずるかもしれない。
【0004】
一以上の標的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション及び検出をミニチュア化によって可能とするバイオチップ技術は、バイオチップ上に多数の捕獲ヌクレオチド配列が結合されていると仮定して、一以上の標的ヌクレオチド配列の間の検出(区別)を行うための有用なツールである。それは組織の遺伝子発現パターンの決定も可能にし、それはmRNAをcDNAへとコピーしてこれらの配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を含むバイオチップ上でそれらをハイブリダイゼーションさせることによって得られる。cDNA配列は相互に異なっているので交差反応のレベルは高く、捕獲ヌクレオチド配列(それらはかなり長い配列である)は組織からクローニングされたcDNAのバンクから構築され、ハイブリダイゼーションの速度及び収率は高い。
【0005】
小さな捕獲ヌクレオチド配列が用いられた場合、標的配列が小片に切り分けられない限りハイブリダイゼーションのレベルはかなり低い。溶液中ではハイブリダイゼーション速度は鎖長の平方根に比例し、小さいものは制限的である(Wetmur, J.G., Biopolymers 10, 601 (1971); Anderson et Young in“Nucleic acid and hybridization”, IRL Press, Hames, B. and Higgins, S. Editeurs, 73−111, Oxford−Washington DC (1985))。反応が固体表面上で行われる場合、捕獲ヌクレオチド配列の長さの影響は溶液中よりもずっと大きい。従って小さな捕獲ヌクレオチド配列上での所定の標的DNA配列の固定速度と長い捕獲ヌクレオチド配列上での所定の標的DNA配列の固定速度との間の相違は極めて大きい。
【0006】
DNA標的ヌクレオチド配列自体の検出はずっと問題がある。何故ならDNAはまず増幅されなければならないからである(通常PCRによって)。アンプリコン(amplicon)は2本鎖DNAであり、固体表面上に結合されている捕獲ヌクレオチド配列上にハイブリダイズするよりも溶液中で再会合しやすい(WO 98/11253)。この効果は捕獲ヌクレオチド配列の長さに直接依存しており、小さな捕獲ヌクレオチド配列は感受性の欠如に導く。DNAを非特異的な方法で片に切り分けることも可能である(多数の配列がチップ中で分析されると仮定して)。できるかぎり多数の捕獲ヌクレオチド配列を固体支持体の表面上に結合させて反応収率に影響を与えることも可能であるが、結合されることができる濃度に制限がある。配列の選択は最終的に重要である。何故なら、同一長であってもある配列は他の配列よりも高いハイブリダイゼーション収率を与えるからである(第一工程に好ましいか又は第一工程を加速することができ二本鎖形成を導く二次構造の形成)。
【0007】
それ故、良好なハイブリダイゼーション収率を与えつつも標的相同配列の検出を可能にする中程度の長さの捕獲ヌクレオチド配列が妥協として提案されている。
【0008】
しかし、小さな捕獲ヌクレオチド配列は一塩基の小ささで異なる配列間の区別を可能にする。小さな捕獲ヌクレオチド配列を担持するこれらのアレイの一つの適用は一ヌクレオチド多型(SNPs)配列の同定である(WO 98/56954)。
【0009】
発明の目的
本発明は異なる相同標的配列に特異的な捕獲ヌクレオチド配列を担持するアレイを用いて他の可能な相同標的配列の間から標的ヌクレオチド配列を同定及び/又は定量するための新規の改良された解決策であって従来技術の欠点を示さない解決策を提供することを目的とする。
【0010】
発明の概要
本発明はアレイ上にハイブリダイズされるべき配列のハイブリダイゼーションプロセスの反転を行うことによって、サンプル中に同時に存在することがあり得る相同標的配列間の区別を可能にする。
【0011】
本発明による方法は、第一工程において標的に結合するヌクレオチド配列がアレイ上で検出されるべき標的として第二工程において用いられるという二工程の結合プロセスに基づいた標的ヌクレオチド配列の同定(検出及び特性決定)及び/又は定量を可能にする。
【0012】
本発明による方法においては、標的DNA(又はRNA)配列は所望によりラベルされた様々なヌクレオチド配列とまず反応させられ、次に、洗浄後、前記所望によりラベルされたヌクレオチド配列は標的ヌクレオチド配列から分離され、所望によりラベルされたヌクレオチド配列に対して相補的な捕獲ヌクレオチド配列を担持するアレイ上のハイブリダイゼーションによって最終的に同定される。本発明によれば、アレイ上にハイブリダイズするのは所望によりラベルされたヌクレオチド配列であり標的ヌクレオチド配列ではない。
【0013】
本発明による方法においては、捕獲ヌクレオチド配列及び標的ヌクレオチド配列は同一であるそれらの配列の少なくとも一部又は部分を有し、一方、所望によりラベルされたヌクレオチド配列はそれらに相補的な配列である。特許請求の範囲に記載されるようなかかる反転方法は相同標的配列の間の有効な区別の問題を有利に解決する。
【0014】
定義
「相同ヌクレオチド配列」は対応する位置に同一ヌクレオチドを有するDNA又はRNA配列を意味する。相同(又は配列同一性)の程度は、比較されるべき二つの配列のうちの一方におけるギャップの如き欠失又は挿入を考慮に入れて配列を最適に整列(全配列)させた後の所定の位置における同一ヌクレオチドの割合として計算される。これは異なる生物種の如き遺伝的に異なる源中に存在する所定の遺伝子の配列の場合に、又は(同一ファミリーからの又は共通の構造ドメインを有する)類似機能を有するタンパク質又は酵素の場合、事実である。相同性(又は配列同一性)の程度は一以上の特定位置のみで又はそれらの配列の全てに沿って相同である配列を用いた場合は大きく変化し得る。両方の配列において同一である配列の一部(又は部分)は「保存されている」と称される。それらの配列において高度の不変性を示す配列は「高度に保存されている」と称され、それらは高度の相同性を示す。一塩基のみで異なる配列は高度の相同配列とみなすことができる。これは一ヌクレオチド多型配列又はSNP配列の原因である配列の場合、事実である。
【0015】
相同性(又は配列同一性)は配列の整列後に計算され、コンピュータ化されている地域的な相同性アルゴリズム(例えば Clustal, Intelligenetics, Mountain View, California, 又は Wisconsin Genetics Software Package, Genetics computer Group Madison, Wisconsin, USA における GAP, BESTFIT, FASTA 及び TFASTA 又は Boxshade を挙げることができるがこれらに限定されない)に基づいている。
【0016】
図面の簡単な説明
図1は本発明による反転バイオチップの模式図である。これは二つの室5及び6から作られており、これらは同一固体支持体4上に存在し、自動化の目的のために連結されている。
【0017】
本発明の詳細な記述
本発明は二つのバイオチップの使用を有利にも含む。そこではサンプルから同定され単離されるべき標的ヌクレオチド配列3を担持する第一の室5、及びバイオチップ7の固体支持体4に対する捕獲ヌクレオチド配列2のさまざまな結合を含む第二の室6が導入されている。前記捕獲ヌクレオチド配列は図1に示される通り、ラベルされたヌクレオチド配列1に特異的である。アッセイを行いやすくするため、標的ヌクレオチド配列3は固体支持体4上に固定されており、従って標的ヌクレオチド配列3は第一の室中の様々なラベルされたヌクレオチド配列1と反応することができる。しかし、この固定は本発明に必須ではない。何故なら第一ハイブリダイゼーションは溶液中で行うことができ、ラベルされたヌクレオチド配列1はその後、アレイ上で検出される(対応する捕獲ヌクレオチド配列2とのハイブリダイゼーション)前に標的ヌクレオチド配列3から分離されることができるからである。
【0018】
本発明による方法の第一の利点は特異性を検出速度と関連させることである。特異性は、相互に異なる標的ヌクレオチド配列の一部において選択されることができるような小さなラベルされたヌクレオチド配列が用いられるという事実によって得られる。それが小さい配列を用いるという事実は一塩基のみ異なる配列(SNP配列)を区別することも可能にする。好ましい実施態様においては、ラベルされたヌクレオチド配列は対応する標的ヌクレオチド配列に特異的な8〜60塩基、好ましくは15〜30塩基の配列を有する。
【0019】
本発明による方法の第二の利点は、固定された標的ヌクレオチド配列3上でのラベルされたヌクレオチド配列1のハイブリダイゼーションは捕獲ヌクレオチド配列2が小さく、溶液中の標的ヌクレオチド配列3が長いフラグメント(これは通常二本鎖になっている)である状況と比較するとかなり迅速なプロセスであるということである。更に、速度は固体支持体への標的ヌクレオチド配列3の結合部位から離れて位置するラベルされたヌクレオチド配列1のハイブリダイゼーションのための配列を選択し、そしてラベルされたヌクレオチド配列1を過剰に加えることによって加速されることができる。好ましい実施態様においては、ラベルされたヌクレオチド配列1は標的ヌクレオチド配列の量の100倍以上の大過剰で加えられる。これは標的ヌクレオチド配列3上へのこれらのラベルされたヌクレオチド配列1の固定速度及び収率を増大させるためである。
【0020】
ラベルされたヌクレオチド配列1は全て標的ヌクレオチド配列3上でのそれらのハイブリダイゼーションのために一緒に存在し、これは反応がそれら自体の間で競争的になることを可能にする。配列は同一又は類似濃度で存在するので、結合収率は標的ヌクレオチド配列の親和性に依存するであろう。たとえ一塩基の小ささによって異なっていても非相補的配列についての方よりも相補的配列についての方が好ましい結合が観察された。相同配列間の区別は極めて良好である。
【0021】
第二の(アレイ)室6においてはハイブリダイゼーション収率は様々なラベルされたヌクレオチド配列1について同様である。何故ならそれらは同一(又は類似)サイズを有し、それらは類似サイズの捕獲ヌクレオチド配列2上でハイブリダイズするからである。スポットの強度は(サンプル中に存在する)第一標的ヌクレオチド配列から離脱したラベルされたヌクレオチド配列1であって第二(アレイ)室6中でのハイブリダイゼーションに利用可能なラベルされたヌクレオチド配列1のレベルを反映する。
【0022】
アレイ中の捕獲ヌクレオチド配列2上での配列の第二ハイブリダイゼーションは迅速なプロセスである。何故なら、小さな配列は迅速な反応を可能とするように設計された捕獲ヌクレオチド配列2上で反応するからである。捕獲ヌクレオチド配列2はかかる反応が速い速度で進行されるように最適化されることができ、固体支持体4への結合点から離れて特定配列を伸長させ、ハイブリダイゼーション速度を増大させる。相補的配列は他の非相補的配列と比較して常に過剰に存在するので、対応するスポットは反応の開始から高いシグナルを与え、標的ヌクレオチド配列の同定を可能にする。もし定性的測定のみが要求されるならば、反応は完了前に停止されることができる。何故なら、スポット上のシグナルレベルは反応の開始から溶液中のそれらの割合を反映するであろうからである。
【0023】
本発明による方法の一つの好ましい実施態様は二本鎖標的DNAの検出である。アレイ上での標的DNA配列の古典的な検出においては、標的DNA配列が溶液中で二本鎖を再形成できるという事実のためハイブリダイゼーション速度は低い。かかる状況に対抗する一つの方法は捕獲ヌクレオチド配列の長さを増大させることであるが、この場合、相同配列が同一捕獲ヌクレオチド配列上に交差ハイブリダイゼーションし、偽の検出を導くことがある。本発明においては標的はラベルされた捕獲ヌクレオチド配列と第二の標的鎖との間のハイブリダイゼーションに対する競争を減少又は除去するため固定前又は固定後に一本鎖にされる。ラベルされたヌクレオチド配列は溶液中でのそれらの再ハイブリダイゼーションを回避するために一本鎖ヌクレオチドであることが好ましい。
【0024】
本発明は相同配列の同定及び/又は定量(サンプル中の微生物の特定株の同定、又は研究において正常又は病気の状況で異なる役割を有するタンパク質をコードする関連遺伝子の集団の間で遺伝子が特異的に同定されなければならない場合)に特に好適である。これはレセプター、キナーゼ、ホスファターゼ、サイクリンの如き調節遺伝子、転写因子又はオンコジーンについて特に真実である。それらの配列の一部が同一であるので、標的相同ヌクレオチド配列はコンセンサスプライマーを用いて増幅又は複製されることができる。多くの適用においては、検出の役割は類似生物の標的ヌクレオチド配列(相同DNA又はRNA配列)の間の区別を行うことである。その場合、保存されている配列の一部又は部分はこれらの相同ヌクレオチド配列(サンプル中に存在するなら)すべてを認識するプライマーの結合のために用いられる。生物の一つの科又は属について一つのプライマー対のみの使用はそれぞれの種又は亜種について特異的なプライマーを使用することと比較して有利である。何故なら生物の科の中には30以上の種を含むものもあるからである。1回の多重PCRでこれらの種すべてを増幅することを可能にする増幅条件を見出すことは(たとえ不可能ではないにしても)困難である。(五つの異なるヌクレオチド配列についての多重PCRですら再現性のある様式でサンプルを取扱うことがすでに困難である。)本発明によれば、各科について一つのプライマー対のみを用いて(細菌科の如き)生物の各科を増幅するためにアッセイを設計することができる。mRNAの反転写の場合のように複製のみが行われるならば、単一のpol−dTが複製を行ってcDNAにする転写酵素として役立つことができる。
【0025】
好ましくは、小さなラベルされたヌクレオチド配列1は第一及び第二ハイブリダイゼーション工程においてハイブリダイゼーションのために用いられる。小さなヌクレオチド配列1の使用は極めて相同な配列(30〜98%の相同性)の区別を可能とする。もしラベルされたヌクレオチド配列が好適に選択されるならば、それらは一塩基で異なる(SNP)二つの配列の間で区別することができ、かくして多型の決定を可能にする。
【0026】
好ましい実施態様においては、ラベルされたヌクレオチド配列1はそれらの標的ヌクレオチド3に特異的なそれらの配列の一部及び標的ヌクレオチド配列3に非特異的でありかつ所定のラベルされたヌクレオチド配列に特異的な追加テールを含む。このテールはアレイ室6上に存在する捕獲ヌクレオチド配列2と相補的である。テールはそれぞれのラベルされたヌクレオチド配列1について異なるので、それらはアレイ上での完全なマッチを安定化させ、その結果、標的ヌクレオチド配列に特異的な配列の一部において例えば一塩基異なる密接に関連したラベルされたヌクレオチド配列はアレイ上でより良好に区別されるであろう。
【0027】
本発明による方法はヌクレオチド配列の改変を用いたSNP配列の検出に適用されることができ、これらはまず標的DNA配列上にハイブリダイズされ、次に第二工程において様々な捕獲ヌクレオチド配列2を担持するアレイ室6上で検出される。
【0028】
一実施態様においては、本発明はSNP配列に隣接する標的ヌクレオチド配列に結合する、異なるヌクレオチドによって停止された二以上のラベルされたヌクレオチド配列の混合物を用いることによるSNP配列の決定に適用され、ヌクレオチド配列の末端ヌクレオチドの一方はSNP配列に完全にマッチされる。ラベルされたヌクレオチド配列以外に結合する他の追加ヌクレオチド配列の存在は、完全にマッチするヌクレオチド配列がリガーゼによりこのヌクレオチド配列に結合されることを可能とする。結合されたヌクレオチド配列は次に第二アレイ上で検出され、かくしてSNP配列が同定される。様々なラベルされたヌクレオチド配列は容易に同定されるようにCy3,Cy5又はCy7の如き異なるラベルを担持してもよい。もしラベルされていないのなら、第二の追加ヌクレオチド配列は生ずる結合生成物がラベルされるようにラベルされる必要がある。
【0029】
本発明の他の実施態様においては、ラベルされたヌクレオチド配列の混合物が用いられ、それぞれの配列は同一SNP上の部位に位置する少なくとも一塩基において異なる。ハイブリダイゼーション後、ミスマッチヌクレオチド配列は一本鎖に特異的であるが二本鎖DNAには影響を与えないヌクレアーゼによって切断され、プロセスが繰返される。未切断の及び切断されたヌクレオチド配列は次にアレイ室6上でのハイブリダイゼーションのために処理される。好適なハイブリダイゼーション条件において及びアレイ室上の良く選択された捕獲ヌクレオチド配列を用いると、それらは長い未切断の又は小さな切断されたヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かくしてSNP配列の同定を可能にする。
【0030】
本発明の他の実施態様においては、標的ヌクレオチド配列に沿って位置するSNP配列の如き標的ヌクレオチド配列の異なる部分を認識した複数のヌクレオチド配列の混合物が用いられ、方法の第二工程においてアレイ上で検出される。多数の捕獲ヌクレオチド配列2がアレイ上に固定されることができ、多数のラベルされたヌクレオチド配列1の間で区別することができる。このようにして、所定の標的ヌクレオチド配列の中に存在する可能性がある突然変異の如き多数の変異について一つのアッセイで調査することが可能である。これはこれらの変異がすべて標的中に潜在的に存在し、これらが病気の状況と関連している場合に特に有利である。これはオンコジーン(P53の如き)に生ずる突然変異について事実である;それらの多くはがん進行に関連しており、HIVウィルス酵素において医薬治療に対する抵抗性に導く。SNPは医薬治療に対する又は病気に対する反応に影響を与える個人的変異にもたぶん関連している。
【0031】
好ましい実施態様においては、所定の問題に対して幅広い応答を得るためにいくつかの標的ヌクレオチド配列が第一ハイブリダイゼーション工程で用いられ、アレイ上で可能な多数の検出という利益が得られる。
【0032】
有利には標的ヌクレオチド配列は複製又は増幅工程によってラベルされることなしに検出されることができ、かくしてDNA又はRNA配列の直接検出を可能にする(多くの従来法においては、標的ヌクレオチド配列は増幅又は転写工程中にラベルされる)。これはバイオチップの最終用途における単純化を可能とする。何故なら、使用者は増幅をいかなる方法においても行うことができ、この工程中のラベルされた試薬の干渉に悩まされる必要がないからである。この特性はサンプルからの抽出後、直接配列を同定することを可能にし、複製又は増幅工程を除去し、それを行いやすくする。この直接検出は十分な材料が利用できるときのみ行うことができる。本発明による適用はリボゾーマルRNA:16s,23s,18s又は25sの如きRNAに適用するがmRNAにも適用する(しかしこれらに限定されない)。これらのRNAは一本鎖ヌクレオチドであるので、支持体上へのそれらの固定後、二本鎖アンプリコンの場合ほど劇的な変性を用いる必要はなく、従って非共有結合をこの工程で用いることができる。RNA(リボゾーマルRNA又はメッセンジャーRNA)の検出は、直接であれそれらの相補的DNA配列へのそれらの複製後であれ、本発明の好ましい実施態様である。何故なら、それらは通常多数のコピー数で細胞中に存在し、多くの適用においてはそれらの検出は増幅なしに行うことができるからである。この直接検出は定量をも容易にする。何故なら、増幅を回避することはこの工程による変異(これは克服することが困難である場合が極めて多い)を減少させるからである。直接検出は長いDNA配列に、それらを抽出及び変性した後、又はそれらを小さい片に切り分けた後に適合されることができる。
【0033】
本発明の好ましい実施態様においては、標的ヌクレオチド配列3はコンセンサスプライマーによって増幅(PCR)される(同一プライマーによって増幅される配列)。相同配列は例えば同一の科又は属の微生物中に存在する遺伝子の配列である。この増幅のためには、プライマーの一方はアミノ化され、従って増幅後アンプリコン鎖の一方はこのアミノ基を担持する。アンプリコンは次にアルデヒド基を担持する表面上でインキュベートされる。アミンとアルデヒトの間の反応は正常条件では自発的であり、他の試薬は不要である。反応後、還元剤(NaBH4)が添加されて反応性二重結合を削除する。次に第二鎖はヌクレオチド配列用の変性条件を用いて除去される。ヌクレオチド配列が標的鎖から分離するように温度をヌクレオチド配列の溶融温度より上に増大させてもよいが、アルカリ溶液の使用の如き他の条件も用いることができる。(二つの鎖を分離するためには0.1又は0.05NのNaOH溶液濃度で十分である。)
【0034】
活性化された表面へのアンプリコンの結合は、増幅後に溶液中になおも存在しているプライマーの存在によって制限され得る。これらのプライマーは活性化された表面と反応することもでき、それ故標的アンプリコンの固定を低下させる。必要ならばアンプリコンを表面上に固定する前にアンプリコンをプライマーから分離させる。(スピンカラム上での分離がかかる分離には好適だが、Nucleo trap PCR purification kit (Clonetech) 又はゲルフィルター上での濾過 (Nucleo Spin Clonetech) の如きシリカ由来の吸着もかかる分離に好適である。)
【0035】
サイズに応じたDNAフラグメントの分離は電気泳動法を用いても良好に得ることができる。かかる技術のミニチュア化は、かかるルーチン適用における必要の如き現在の適用に今や好適であることを可能とする。
【0036】
本発明によれば、アッセイは同一支持体4上で行われるタンデムチップである。第一室5上で標的ヌクレオチド配列は活性化された支持体4上に共有結合によって固定される。共有結合反応は化学において周知であり、それらの多くは例えばチップ表面上に存在するアルデヒド基とアミノ化された標的ヌクレオチド配列との反応によってチップ形成に既に用いられている。他の実施態様においては、標的配列は直接又は複製もしくは増幅工程中にビオチン化(好ましくは一方の鎖上で)されており、標的はストレプトアビジンでコートされた表面上に固定される。他の実施態様においては、ハプテン又はリガンドが標的配列上に固定され、従ってそれは表面上に固定された対応する抗体又は受容体によって固定される。
【0037】
この工程を生じさせるために多くの支持体が適合されることができる。ガラスはアルデヒド基を担持するように活性化される。表面上にアルデヒドをグラフトするためには多くの異なる方法がある。ガラスはアミノシランと反応し、次にグルタルアルデヒドと反応する。カルボキシル基を固体支持体の表面上に結合させて次にそれらをアルデヒドへと還元してもよい。アルコール官能基はアルデヒドへと酸化されることもできる。しかし、SMCC又はDSSの如き二官能性活性化剤の使用も有用である。何故なら、それらはアミノ基を活性化させそれらをそれぞれチオール又はアミノ基と結合させることができるからである。標的ヌクレオチド配列が二本鎖であり変性溶液中で処理されなければならない場合、かかる化学結合は支持体への標的ヌクレオチド配列の特に有用な共有結合固定を与える。しかし、ナイロン、セルロース誘導体の如き表面上への単純な吸着、又は正に帯電された表面(例えばポリリジン又はポリ(phe−lys) の如きコポリマーでカバーされた表面)上への単純な吸着も表面上にヌクレオチド配列を吸着させるための好適な方法である。この場合、条件は小さいプライマーよりもむしろ長い標的DNAフラグメントの吸着のために決定される。
【0038】
もしガラスが不活性でありかつ低い自己蛍光性を有するというような多くの利点を有するなら、他の支持体、特にポリマーは有用であることができる。何故なら、それらはそれらの表面で様々な化学的に良く規定された基を用いて得ることができ、かくして標的DNAの固定を可能とするからである。ポリスチレンは表面上でカルボキシル又はアミノ基を得るために活性化され、アミノ−DNAの共有結合固定を可能とする(Anal. Biochem. 236, 85 (1996))。大部分のポリマーはカルボキシル、アミノ又はアルデヒド基を得るために活性化することができる。ポリスチレンは平坦な支持体としてのみならずマイクロビーズとしても入手可能であり、これは固定された標的上でのラベルされたプローブの第一結合工程を行うために用いるのに有利である。
【0039】
DNAを固定することができる全ての他の支持体(フィルター、シリコン支持体、金属支持体、コンパクトディスク、プラスチック又は電子装置の如き)も用いることができる。有利には前記固体支持体は単独のガラス又はプラスチックプレートであり、これは本発明による方法を改良するための追加の手段(バーコード、マーカー等)又は媒体(被覆等)を含んでいてもよい。プラスチック支持体中に挿入されたガラスの如き支持体の組合せは自動化のためにチップを取扱うのに有用である。
【0040】
結合後及び/又は結合前に標的ヌクレオチド配列は変性され、一本鎖の固定された標的ヌクレオチド配列を生成する。様々なラベルされたヌクレオチド配列を含む溶液が次にこの第一モノチップに加えられ、それらはもしそれらの相補配列が標的ヌクレオチド配列上に存在するなら反応することができる。洗浄後、溶液は加熱され、結合されたヌクレオチド配列は標的ヌクレオチド配列から分離され溶液中に見出される。この溶液は次に特定のチャネル又は他の手段(マイクロポンプ又は弁を利用した洗浄工程)によってラベルされたヌクレオチド配列に特異的な捕獲ヌクレオチド配列を含む第二室6へと移される。第二ハイブリダイゼーションが次に行われ、ラベルされたヌクレオチド配列、従って標的ヌクレオチド配列の同定を可能にする。もし異なる工程が良好に行われるのなら、アッセイは定量的にすることができ、従って標的ヌクレオチド配列の同定のみならず定量をも可能にする。全ての工程は同一表面4上で行われるのでアッセイは使用者にとって行いやすく、自動化を可能とする。
【0041】
本発明の好ましい実施態様においては、コンセンサスプライマーはサンプル中に存在する可能性がある相同配列のPCR増幅において用いられる。NH2の如き官能基又はビオチンは上述の通りそれらを個体表面上に付着させるために組込まれる。LCR,CPR,NASBA,ICR,TMA又はなだれDNAの如き他の増幅方法も可能である。RNA増幅は反転写後、同様の方法で行うことができる。短い配列のDNAも制限酵素を用いた特定開裂によって得ることができ、小さな配列のRNAは熱による又は塩基の存在による非特定開裂によって得ることができる(WO 97/10365)。
【0042】
ビオチン化されたラベルされたヌクレオチド配列(これはその後、蛍光分子又は酵素又はコロイド金粒子を有するストレプトアビジンコンジュゲートと結合する)を用いた間接ラベリングも用いることができる。これらの金粒子はそれ自体によって検出されるか又は銀の還元のための触媒として役立つことができる。沈殿は次に検出され、所望により定量される(EP−99870106.4)。
【0043】
ラベリングはハプテンと抗体の反応を用いても得ることができる。抗体はラベルであるか又はシグナルを与えることができる分子と結合する。
【0044】
DNAチップに適合された蛍光、比色、磁気、電気、電気発光、生物発光又は放射能に基づくDNA検出法は全てアレイの検出に用いることができる。
【0045】
ラベルされたヌクレオチド配列及びそれらの相補的捕獲ヌクレオチド配列の検出の選択は、相同配列が相互から特異的に区別されなければならない場合、全プロセス中で非常に重要な工程である。配列間の相同性が高いほどこれらの配列の選択は一層重要である。相同配列が最も(又は多く)異なる小さな配列領域(又は部分)を選択してこの領域(又は部分)に対する相補物としてラベルされたヌクレオチド配列を設計することが好ましい。配列の長さは相同性によっても変化し、配列が異なれば長く、極めて相同であれば短い。配列は15〜30塩基であることができるが、8塩基の小ささの配列又は60塩基の長さの配列も用いることができる。アレイ上にスポットされた捕獲ヌクレオチド配列はラベルされたヌクレオチド配列に対して相補的である。一つの好ましい実施態様においては、これらの配列2は表面4に結合された非特異的配列を有することによって又は固定用のリンカーを用いることによって表面4から特定の距離に位置する。
【0046】
二つのハイブリダイゼーション工程を行うために単一の表面を使用することはプロセスが自動化及び微小流体光学技術に適合されることを可能とする。表面は二つの室に分けられ、第一の室では標的DNA又はRNAが結合されてラベルされた配列が標的配列上にハイブリダイズし、第二の室はアレイであり、様々な捕獲配列を含む。溶液はチャネル及びポンプによって各室に注入され除去され、これによりインキュベーション及び洗浄を可能とする。室は要求された温度に加熱されることもできる。
【0047】
二つの室は小さなパイプ又はチャネルによって連結されることもでき、従ってラベルされたヌクレオチド配列の標的からの分離後、溶液は第二の室へと移されアレイ上でのハイブリダイゼーションプロセスが行われる。検出をも含む全プロセスが自動化されることができ、この反転チップ検出を容易なプロセスとする。本発明は固定された標的上でのラベルされたヌクレオチド配列の結合及び分離工程を繰返し、かくして特定のヌクレオチド配列が捕獲ヌクレオチド配列上でのそれらの区別のためにアレイに蓄積される。自動機械又は機械によるプロセスの自動化はプロセスを繰返すのに特に好適である。
【0048】
この技術は現存の自動機械に容易に適合されることができる。それらの一つはELISAアッセイ用に開発されたVIDAS(Biomerieux, Lyon, France)である。それはチップ中での抗原/抗体反応を行うことに対する特異性を有しており、チップは次に洗浄及びインキュベーションのために様々な溶液を徐々に通過させられる。このチップ中で得られる最終シグナルが次に記録される。アレイは分配チップの如き装置中に挿入されることができ、かくして溶液は内側にくみ上げられ、反応させられ、洗浄し、アレイ上でインキュベートする。チップ中で反応を行うことは抗体−抗原反応について開発されておりVIDAS機械(Biomerieux, Lyon, France)によって行われるような自動化に良く適合されている。反応が完了した後、シグナルは後述のようにアレイ上で検出される。
【0049】
二重アレイシステムは同様の方法で処理されることができ、各々はマイクロピペット装置中に挿入されてプロトコールによって要求される場合はヌクレオチド配列の溶液を通過させるために相互に連結されている。
【0050】
微小流体工学技術は同一表面上で行われるべき過剰のプライマーからアンプリコンを増幅及び/又は分離する手順全てを可能とし、かくして「チップ上の研究室」をもたらす。最終表面は区画のいくつか又は全てを含むであろう:行われるべきPCR用の室、もし必要ならばアンプリコンを精製するための分離装置、アンプリコンの固定及び様々なラベルされたヌクレオチド配列との第一ハイブリダイゼーションのための室、及び最後にヌクレオチド配列の最終同定及び検出のためのアレイを有する室。全生成物は室間で行われるべき液体のための及び外部溶液を用いたインキュベーション及び洗浄のための必要な連結を担持するであろう。アッセイの十分に自動化された分析を得るために検出器を自動機械に加えることもできる。プライマーからのアンプリコンの分離は例えば ACLARA Biosciences, (Mountain View, Ca, USA)によって提案されているような濾過、吸着−脱吸着プロセス又は微小電気泳動を用いて行うことができる。
【0051】
ハイブリダイゼーション結果の分析
アレイ上でのハイブリダイゼーション結果は、陽性ハイブリダイゼーションによって発されるシグナルに適合された検出システムを用いて機械によって検出及び/又は定量される必要がある。マイクロアレイにおいて用いられる最も一般的なDNAラベリングは蛍光ヌクレオチド配列の使用に基づいている。この場合、蛍光スキャナーが検出器として作用する(即ち共焦点蛍光スキャナー(Genetic Microsystem, Woburn, MA, USA))。
【0052】
陽性スポット上での沈殿の形成、特にナノ金でラベルした後の銀沈殿は簡易な検出に特に好適である。何故なら比色スキャナー又は写真検出器という特に低コストの技術で反応レベルを検出及び/又は定量することができるからである(EP−99870106.4)。
【0053】
像認識用のソフトウェア分析はスポットに適合されてきており、その後、背景レベルが考慮に入れられて各スポット上に存在するシグナルが定量される。他のタイプの分析はスポットの相関分析に基づいており、それはスポットの各ピクセルの形状及びレベルを考慮に入れる。相関レベルに従ったスポットの分類は陽性又は陰性スポットへの分類を可能にし、原サンプル中に標的が存在するか否かについての容易な回答を使用者に与える。
【0054】
ハイブリダイゼーションの定量は内部又は外部標準による従来のアプローチを用いて行われ、それは抽出に始まって、複製または増幅、第一ハイブリダイゼーション及びアレイ上での第二ハイブリダイゼーションへと続くプロセスの様々な工程において得られる異なる収率についての相関を可能にする。好ましい実施態様においては、既知の濃度の外部標準が全工程を適してサンプル及びプロセスに加えられ、全プロセスの効率を訂正する。本発明の方法は複製または増幅方法を通常含むので、競合的標準は本発明の好ましい実施態様である。それらのうちの一つは文献WO 98/11253において提案されている。
【0055】
好ましくは、この特定配列を通した標準のハイブリダイゼーション収率は標的配列のハイブリダイゼーション収率と同一であるかまたはこれから20%より多く異なることはなく、定量はWO 98/11253に記載されたように得られる。
【0056】
前記標準ヌクレオチド配列、外部及び/又は内部標準は本発明によるキット(装置)又は装置に含まれることが有利であり、所望により本発明による様々な工程を行うために必要な全ての媒体及び手段(ハイブリダイゼーション及び培養培地、ポリメラーゼ及び他の酵素、標準配列、ラベリング分子など)も含まれる。
【0057】
実施例
特定 femA 遺伝子の検出による Staphylococcus (スタフィロコッカス)種の同定
FemA 遺伝子は極めて高度に保存されている遺伝子であり、それらは異なるスタフィロコッカス種の間で50〜90%の相同性を有する。サンプル中のスタフィロコッカス・エピデルミディス(Staphylococcus epidermidis)の同定は以下の五つの最も一般的なスタフィロコッカスを増幅することができるコンセンサスプライマーによる予備増幅を用いて行われた:エス・アウレス(S. aureus)、エス・エピデルミディス、エス・へモリティカス(S. haemolyticus)、エス・ホミニス(S. hominis)及びエス・サプロフィティカス(S. saprophiticus)。プライマーの一方はアミノ化され、かくしてアンプリコンの一方の鎖はその5′端にアミノ基を担持していた。アンプリコンは次にアルデヒド基を担持するガラスに共有結合固定され、100℃に加熱することによって変性された。五つのスタフィロコッカス種に特異的なラベルされたヌクレオチド配列は次にこれらの一本鎖化されたアンプリコンと共にインキュベートされた。反応及び洗浄後、NaOH溶液中に回収された。この溶液は次に各ラベルされたヌクレオチド配列に特異的な捕獲ヌクレオチド配列のスポットにより形成されたアレイ上に添加された。反応及び洗浄後、ストレプトアビジン−Cy5コンジュゲートが添加され、続いて共焦点蛍光スキャナー(Genetic Microsystem)を用いて読み取られた。この方法の原理は図1及び図2に示されている。エス・エピデルミディスに特異的な捕獲ヌクレオチド配列を担持するスポットのみが陽性である。
【0058】
コンセンサスプライマーを用いた FemA 遺伝子の増幅
PCR増幅に用いられたプライマーの配列は以下の通りである:
FP 1 : 5’ CCA CTA GCG TAC ATC AAT TTT GA 3’
FP 1HS : 5’ CCC ACT CGC TTA TAT AGA ATT TGA 3’
FP 3 : 5’ GGT TTA ATA AAG TCA CCA ACA TAT T 3’
FP3は5′端にNH2基を有する。これらのプライマーは femA 遺伝子内の487bpの配列を増幅する。
【0059】
表面上でのアンプリコンDNAの固定
アンプリコンは High Pure PCR Product Purification kit (Boehringer, Mannaheim, Germany) 上のクロマトグラフィーによって精製され、アミノ化プライマー及び遊離のヌクレオチドが除去された。表面上での固定のために、150nMの精製されたアンプリコンを含む溶液SSC3X pH5の100μlがハイブリダイゼーション室によって枠にはめられたシリル化顕微鏡スライド(Cell associates, Houston, USA)上で23℃で30分インキュベートされた。インキュベーション後、スライドは0.1%SDSで1回、水で2回洗浄され、次にNaBH4(2.5mgが750μlのPBS及び250μlの100%エタノール中に溶解された)と共に5分間インキュベートされ、次に3分間沸騰水中でインキュベートされ、スライドは使用するまで4℃で貯蔵された。
【0060】
標的からの特定ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション及び除去
五つのスタフィロコッカス種検出のための特異的なビオチン化ヌクレオチド配列は以下の通りである:
S. aureus
ASaur01 : 5’ CTA AAT GAA GAG CGT GAT ATT TTA AAT 3’
S. epidermidis
ASepi01 : 5’ CTA AAT AAT GAA AGA AAT GTG CTT AAT 3’
S. haemolyticus
AShae01 : 5’ TTA CAA AAT GAA CGT GAA ACT TTA AAT 3’
S. hominis
AShom01 : 5’ CTT CAT GCA GAA CGT CAG ACA TTA AAT 3’
S. saprophyticus
ASsap01 : 5’ TTA AAG GCT GAA CGC GAA GTA TTA AGT 3’
【0061】
ビオチン化ヌクレオチド配列コントロールの配列は:
CMV23Biot 5’ GGT TAT CAG AGG CCG CTT GGC CA 3’ である。
【0062】
各プローブはその5′端にビオチンを担持する。
【0063】
ハイブリダイゼーションのため、100μlのハイブリダイゼーション溶液が標的DNAを担持するガラス上に添加される。この混合物は0.5Mのリン酸緩衝液pH7.4,7% SDS,100μg/mlサケ精子DNA,30nMのエス・エピデルミディスのビオチン化ヌクレオチド配列(1ヌクレオチド配列)又は30nMの各ヌクレオチド配列(5ヌクレオチド配列)を含有する。ハイブリダイゼーションはハイブリダイゼーション室中で60℃で2時間行われる。サンプルはマレイン酸緩衝液10mM pH7.5,NaCl 15mM,Tween 0.03%を用いて4回洗浄される。
【0064】
ハイブリダイズされたプローブは疎水性のペンで範囲を定められたハイブリダイズした領域中で70μlのNaOH 0.05Nを用いて25℃で5分間インキュベートすることによって解放される。50μlの溶液が次にマイクロチューブに移され、0.7Mリン酸緩衝液pH7.4,10% SDS,200μg/mlサケ精子DNA,10nMのビオチン化されたCMVヌクレオチド配列(ハイブリダイゼーションコントロール)を含む溶液56μlを用いて中和される。
【0065】
アレイ上のラベルされたヌクレオチド配列の検出
五つのスタフィロコッカスについての捕獲ヌクレオチド配列の配列は以下の通りである:
S. aureus
ATaur02 : 5’ ATT TAA AAT ATC ACG CTC TTC ATT TAG 3’
S. epidermidis
ATepi02 : 5’ ATT AAG CAC ATT TCT TTC ATT ATT TAG 3’
S. haemolyticus
AThae02 : 5’ ATT TAA AGT TTC ACG TTC ATT TTG TAA 3’
S. hominis
AThom02 : 5’ ATT TAA TGT CTG ACG TTC TGC ATG AAG 3’
S. saprophyticus
ATsap02 : 5’ ACT TAA TAC TTC GCG TTC AGC CTT TAA 3’
【0066】
捕獲ヌクレオチド配列コントロールの配列は:
CMVNH2 : 5’ TGG CCA AGC GGC CTC TGA TAA CC 3’ である。
【0067】
各捕獲ヌクレオチド配列はその5′端にNH2基を担持する。
【0068】
捕獲プローブの固定
アミノ化DNAのアルデヒドへのグラフトのための Schena らによって記述されるプロトコール (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10614, 1996) は若干変化させて用いられた。
【0069】
アミノ化された捕獲ヌクレオチド配列は1.6μMの濃度でスポットされた。捕獲ヌクレオチド配列はシリル化顕微鏡スライド上に自家製の配列器を用いてプリントされた。捕獲ヌクレオチド配列はラベルされたヌクレオチド配列と相補的であり、それらの5′端でアミノ基によって停止されている。Genetix (UK) からの250μmピン及び Cell Associates (Houston, USA) からのシリル化(アルデヒド)顕微鏡スライドが用いられた。スポットは直径が400μmであり、分配された体積は約1ナノリットルである。スライドは室温で乾燥され、使用されるまで4℃で貯蔵された。
【0070】
ハイブリダイゼーション及び検出
106μlの変性生成物はハイブリダイゼーション室中で30分間50℃でインキュベートされる。スライドは次にマレイン酸緩衝液10mM pH7.5,NaCl 15mM,Tween 0.03%(洗浄緩衝液)で4回洗浄される。ガラスサンプルはマレイン酸緩衝液100mM pH7.5,NaCl 150mM,Gloria ミルク粉末0.1%中で500倍に希釈された800μlのストレプトアビジンラベルされた cyabin5 (Sigma St Louis, Mi) と共に室温で45分間インキュベートされる。スライドは洗浄緩衝液で5回洗浄され、水で1回リンスされて乾燥される。スライドは Genetic Microsystem (Woburn, MA, USA) からの共焦点スキャナーを用いて読み取られる。
【0071】
表1は(A)標的エス・エピデルミディスのアンプリコンが固定され五つのスタフィロコッカス種に特異的なラベルされたヌクレオチド配列1の混合物と共に第一室5中でインキュベートされる場合の、又は(B)標的エス・アウレウスのアンプリコンが固定され特定のラベルされたエス・エピデルミディスのヌクレオチド配列と共にインキュベートされる場合のスタフィロコッカス・エピデルミディスの特定配列の検出について本発明による反転バイオチップで得られた結果を示す。ハイブリダイゼーション後に標的ヌクレオチド配列から分離したヌクレオチド配列1は次に五つのスタフィロコッカス種に特異的な五つの可能なラベルされたプローブのための捕獲プローブ2を担持するアレイ(室6)上に移され、検出される。
【表1】
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明による反転バイオチップの模式図である。
Claims (20)
- 2組のヌクレオチド配列(1及び2)を用いて相互に対して相同性を示す一以上の標的ヌクレオチド配列であってサンプル中に存在する可能性がある一以上の標的ヌクレオチド配列(3)を同定及び/又は定量し、相同である可能性がある配列から区別する方法であって、所望によりラベルされたヌクレオチド配列の第一の組(1)が第一工程において前記標的ヌクレオチド配列(3)に特異的に結合し、ヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされているヌクレオチド配列(1)に対して相補的な配列の少なくとも一部を有する捕獲ヌクレオチド配列の第二の組(2)とのハイブリダイゼーションを通して検出され及び/又は定量され、ただし、前記捕獲ヌクレオチド配列(2)は1cm2当たり少なくとも4個の別個の領域のアレイに従って固体支持体の表面(4)上に固定されており、前記別個の領域のそれぞれは一種類の捕獲ヌクレオチド配列(2)と結合されており、所望によりラベルされたヌクレオチド配列(1)とそれらの対応する捕獲ヌクレオチド配列(2)との間の結合の同定及び定量はサンプル中に存在する標的ヌクレオチド配列(3)の同定及び定量と相互に関連することを特徴とする方法。
- 第一工程と第二工程の間に、ヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされた配列であって標的ヌクレオチド配列(3)に結合されていない配列が除去され、標的ヌクレオチド配列(3)に結合したヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされた配列(1)が第二工程におけるそれらの再使用の前に相互から脱ハイブリダイズされることを特徴とする請求項1記載の方法。
- 標的ヌクレオチド配列(3)がヌクレオチド配列の第一の組の一つ以上の所望によりラベルされた配列(1)とハイブリダイゼーション結合する前に、標的ヌクレオチド配列(3)が好ましくは共有結合によって固体支持体(4)上にまず結合されることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
- 標的ヌクレオチド配列(3)とヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされた配列(1)との間の結合が溶液中で生ずることを特徴とする請求項1又は2記載の方法。
- ヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされた配列(1)がヌクレオチド配列の第二の組の捕獲ヌクレオチド配列(2)の長さと本質的に同一又は類似(好ましくは80%より高く類似)である長さを有することを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
- 同定及び/又は定量されるべき標的ヌクレオチド配列(3)がサンプル中に存在する相同配列と30%より高い、好ましくは60%より高い、より好ましくは80%より高い相同性を示すことを特徴とする請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
- 同定及び/又は定量されるべき標的ヌクレオチド配列(3)が一塩基のみによって相同配列から異なることを特徴とする請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
- 所望によりラベルされたヌクレオチド配列(1)が10〜60塩基のそれらの配列の部分の一部を含み、その配列が標的ヌクレオチド配列(3)に特異的であることを特徴とする請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
- ヌクレオチド配列の第二の組の捕獲ヌクレオチド配列が所望によりラベルされたヌクレオチド配列(1)に相補的な配列を示すことを特徴とする請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
- ヌクレオチド配列の第二の組の捕獲ヌクレオチド配列(2)がそれらの完全配列に加えてヌクレオチド配列の第一の組の所望によりラベルされたヌクレオチド配列(1)に対して相補的な配列を有するか又は10〜200塩基の長さを有するスペーサーを介して固体支持体に結合された配列を有することを特徴とする請求項9記載の方法。
- 所望によりラベルされたヌクレオチド配列(1)が標的には特異的でないがそれらの捕獲プローブに特異的であるそれらの配列の一部を含むことを特徴とする請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
- ラベルされたヌクレオチド配列(1)がSNPに隣接する標的配列に結合する様々なヌクレオチドによって停止された二種以上のラベルされた配列の混合物を含み、末端ヌクレオチドの一方はSNPに完全にマッチし、ラベルされたヌクレオチド配列(1)はSNP標的の他方の部位に結合する予定の他の付加されたプローブをも含み、完全にマッチするプローブは捕獲プローブアレイ上での検出前にリガーゼによってこのプローブに結合されることを特徴とする請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
- ラベルされたヌクレオチド配列(1)がプローブの混合物を含み、前記プローブのそれぞれはSNP部位に位置する少なくとも一塩基が異なり、捕獲プローブアレイ上で検出される前に特定ヌクレアーゼで処理されることを特徴とする請求項1〜12のいずれか一項記載の方法。
- 検出及び/又は定量されるべき一種以上の標的ヌクレオチド配列(3)がrRNA、好ましくは16S,23S,18S及び25S rRNAからなる群から選択されたrRNAであることを特徴とする請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
- 検出及び/又は定量されるべき一種以上の標的ヌクレオチド配列(3)がmRNA、好ましくはコンセンサス配列によってcDNAへと反転写されたmRNAであることを特徴とする請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
- 固体支持体がガラス、電子装置、シリコン支持体、プラスチック支持体、コンパクトディスク、フィルター、金属支持体、ポリリジンコートされた表面又はこれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
- 請求項1〜16のいずれか一項記載の方法を行うための手段を含む、サンプル中に存在する可能性がある一以上の相同標的ヌクレオチド配列の診断及び/又は定量装置。
- 装置が二つの別個の室(5及び6)を含み、それぞれが請求項1〜16のいずれか一項記載の方法において行われる工程の一つに専ら用いられることを特徴とする請求項17記載の装置。
- 室が固体支持体を含み、その上に捕獲ヌクレオチド配列(2)が1cm2当たり少なくとも4個の別個の領域のアレイに従ってその表面上に固定されており、前記別個の領域のそれぞれが一種類のヌクレオチド配列と結合されていることを特徴とする請求項17又は18記載の装置。
- 請求項17〜19のいずれか一項記載の装置上で請求項1〜16のいずれか一項記載の方法の様々な工程を行うための機械又は自動機械。
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